本发明涉及可以与免疫活性物质偶联的钌络合物、钌络合物有如下通式 式中L1、L2和L3可以相同或不同，每一个代表至少有两个是氮杂环的双环或多环配位体。其中，起码一个配位体至少有一个水溶性取代基，起码一个配位体经任一个间隔基团被至少一个活性基团取代，配位体L1、L2和L3经氮原子与钌相连。
配位体L1和L2可以相同或不同，并含有2，2′-双吡啶，1，10-菲咯啉，苯骈红菲绕啉，特别是红菲绕啉等基团。配位体L1和L2最好相同。
使配位体L1和L2具有水溶性的基团，首先考虑的是磺酸基，最好是其盐类，在此情况下，首先使用的是其钠盐。
配位体L3含有2，2′-双吡啶，1，10-菲咯啉，特别是红菲绕啉等基团。
前述间隔基团最好是至多有8个碳原子的烷撑基，这些烷撑基可以含有-SO2NH-、-S-、-O-、-COO-或-CO-NH-任一基团。
与免疫活性物质偶联的反应基首先考虑的是-COOH，-I-，-NH2--NCS或-SO2HaL等基团。
对于L1、L2和L33个配位体相同的钌络合物来说配位体必须不仅有一个水溶性基团，而且要有一个连接活性基团的间隔基。
满足这一目的的配位体是通式如下的化合物：
钌络合物有两个不同配位体时，一个配位体可以带一个或几个水溶性基团，而另一个配位体连有一个或几个连接基团（通过间隔基团与杂环相连的反应基团）。
在此情况下，最适合的配位体L和L是具有如下通式的化合物：
配位体L3最好是通式如下的化合物：
带有一个或多个基团的配位体L3的合成按照下述过程进行：
a）[（SO2NH｛CH2｝xCOO-t-butyl）2batho]和
[（SO3Na）（SO2NHCH2CH2COO-t-butyl）batho]
这些化合物的合成是以红菲绕啉二磺酸二钠盐为原料而进行。以此原料与PCl5反应，首先制备相应的二磺酰氯（参见F.Muth“Houben-Weyl，Methoden der Organischen chemie”，VolⅨ，P.563，4th edithion 1955，G.Thieme Verlag，Stuttgart）。接着与氨基酸特丁酯（例如：β-丙氨酸，甘氨酸，4-氨基丁酸或6-氨基己酸）反应，生成相应的磺酰胺，其反应过程如下式（参见F.Muth“Houben-Weyl，Methoden der Organischen chemie”，VolⅨ，P.609，4th edithion 1955，G.Thieme Verlag，Stuttgart）：
在此反应中，除了得到二磺酰胺之外，还有付产物单磺酰胺。
此特丁酯的皂化作用只能在相应地钌络合物合成之后进行。
b）[（CH2CH2CH2CH2COOH）batho]或
[（CH2CH2CH2CH2CH2COOH）batho]
用戊酸或己酸作连接基的这些配位体的合成通过Skraup反应进行（见F.H.Case and P.F.Strohm;J.Org.Chem.27，1641（1962））由4-苯基-8-氨基喹啉（见F.H.Case;J.Org.Chem.16，1541（1951））与相应ω-苯基脂肪酸甲酯的对-[β-氯丙酰基]衍生物合成，而后一化合物是按照如下反应示意式由β-氯丙酰氯酰化5-苯基戊酸甲酯（Fluka）或6-苯基己酸甲酯而得（见W.E.Truce and C.E.Olson;J.Amer.Chem.Soc.75，1651（1953））：
反应示意式
n＝4： 5-[对-（7-苯基-1，10-菲咯啉基-4苯基]-戊酸
≡[（CH2CH2CH2CH2COOH）batho]
n＝5： 6-[对（7-苯基-1，10-菲咯啉基-4）苯基]-己酸
≡[（CH2CH2CH2CH2CH2COOH）batho]
c）[（CH2CH2CH2CH2COOH）benzobatho]
此络合物（苯骈-红菲咯啉-戊酸）的合成由2氨基-3-萘甲酸按照如下反应式经几步进行（见E.Koft and F.H.Case;J.Org.Chem.27865（1962））：
具有三个相同配位体的钌络合物的合成，在文献中叙述了两种方法;
根据Braddock和Meyer[J.Am.Chem.Soc.95，3158（1973）]的方法，将水溶性的三氯化钌与配位体在DMF中长时间加热，络合物的形成伴有溶剂的部分分解。
然而，Lin等人的方法[J.Am.Chem.Soc.98，6536（1976）]更好。其方法是，五氯水合钌化钾（K2RuCl5·H2O）在稀盐酸中与三倍化学计算量的配位体一起加热，然后，该溶液与次亚磷酸钠还原。
具有两个不同配位体的钌络合物的制备，是按照已知的文献方法进行，例如，Belser等人发表在Helv.Chim.Acta 63，1675（1980）上的方法。
考虑到在这些络合物中配位体L3不同L1和L2这一事实，该络合物最好分步合成。（当然，该络合物也可以通过统计合成的方法制备，但可能性不大，因为反应难以控制。）第一步是在二甲基甲酰胺中，水溶性三氯化钌与二倍化学计算量的配位体L1或L2反应得到中间体RuL1L2Cl2。此中间体进一步与配位体L3反应，转化为所需要的络合物。
如果配位体L3是一种反应基团以保护形式存在的化合物（例如，在红菲咯啉磺酰胺衍生物情形下的特丁酯），那么，此保护基团的断开最好在相应钌络合物合成以后进行。
生成的钌络合物的分离和提纯可以通过再沉淀，柱色层或制备薄层色谱等方便的方法进行。
被偶联于前述钌络合物上的免疫活性物质，主要有抗原，半抗原或抗体（包括Fab碎片等）。抗体不仅指多克隆抗体，也包括单克隆抗体。
较合适的免疫活性物质是抗癌性胚胎抗原的抗体。最合适的免疫活性物质是抗人体绒膜促性腺激素的抗体，以及抗α-干扰素的抗体。
免疫物质偶联于钌络合物上是以熟悉的方法进行的。较好的偶联方法是用水溶性碳二亚胺衍生物（例如，N-环己基-N′-（α-吗啉代乙基）-碳二亚胺-对-甲苯磺酰甲酯）处理钌络合物和免疫活性物质。
本发明的钌络合物可以用荧光光谱法非常灵敏的检定。作为标记分子它们非常适合于高灵敏的荧光免疫测定。特别适合于辨时荧光免疫测定，例如在联邦德国专利说明书（DT-OS）2628158中所述。按照本发明应用钌络合物代替常用的FITC（异硫氰酸酯荧光素），可以改进荧光免疫测定中的灵敏度。这对于测定体液（例如血浆和血清）中的少量抗原是很有利的。这类抗原（例如可以是癌性胚胎抗原（CEA），β-HCG或α-干扰素。
在本发明范围内应用的辨时荧光测定仪示意图，见附图。
图中数字含义是：
1.光源，2.水晶片，3.样品，4.凹透镜，5.边缘滤光器，6.聚焦镜，7.光电倍增管，8.放大器，9.鉴频器，10.计数器，11.光电二极管，12.门电路，13.激发闪光，14.荧光，15.控制门电路的闪光（触发器）
对于此荧光法特作如下说明：
以适宜波长（λ＝453nm）的闪光激发脉冲光源-彩色激光，所测样品发出荧光，闪光时间t＝0.7ns比荧光标记的消失时间短得多。荧光射线通过边缘滤光器（Balzevs610）经一个镜片射到光电倍增管的光电阴极上，此边缘滤光器传送标记的发射波长。单独检定光子产生的电流脉冲，经放大并标准化后，用计数法计算（光子计数法），借助光电二极管，激发闪光同步控制门电路，该门电路在调整延时△t＝2μS之后启动计数器并在测量容器的调整断开时间△t＝3μS之后停止计数过程。选定延时△是为了在此期间使杂散光效应及背景荧光几乎完全消失。在此方法中，脉冲的计数正比于标记的荧光强度，标记物是从背景上独立测量的。
例1
红菲咯啉二磺酰氯的制备
2.2克干燥的红菲咯啉二磺酸二钠盐（Fluka）与3.1克五氯化磷和750微升三氯氧磷在500毫升圆底烧瓶中均匀混合。此烧瓶装有回流冷凝管和氯化钙干燥管，在油浴中加热到110℃，2.5小时。沉积在烧瓶较冷部分的升华五氯化磷，按时刮出。接着，于110℃5小时内，通过水泵减压，全部抽走未反应的五氯化磷和三氯氧磷。
冷至室温后，粗产品磺酰氯先用150毫升苯迅速处理（以除去少量杂质）。然后，用氯仿提取两次，每次150毫升，室温搅拌1小时。
合并氯仿提取液，真空浓缩。残余的磺酰氯于110℃真空干燥4小时（产量：1.8克）。
β-丙氨酸特丁酯的红菲咯啉磺酰胺衍生物的制备
1.32克β-丙氨酸特丁酯和10.5毫升三乙胺溶解在50毫升氯仿中。激烈搅拌下于10分钟内加入2.0克固体红菲咯啉二磺酰氯。于室温搅拌5小时后，此反应混合物在黑暗处静置4天。然后，于40-50℃真空除去溶剂及三乙胺。为了完全除去三乙胺，该残余物以200毫升氯仿处理后，再次减压除去氯仿和三乙胺。这一操作连续做五次，直至再没有三乙胺的气味。
经SiO2层析精制残余物，最后得到两种产品。
a）二磺酰胺的分离
先用8升丙酮洗脱大体上纯的二磺酰胺。产量900毫克。
b）单磺酰胺的分离
用氯仿/甲醇/水（7/3/0.5）混合液3升洗脱另一色区，基于其荧光性质必定是菲咯啉衍生物。根据核磁共振而知是红菲咯啉二磺酸的单磺酰胺，产量：1.2克粗产物。这大概是反应期间，红菲咯啉二磺酰氯部分水解的结果。
为了进一步提纯，将此粗产物溶解在150毫升氯仿中，在所得溶液中每次加100毫升水振摇，共摇取三次。之后，该单磺酰胺重结晶两次。重结晶方法是，将该化合物溶解在50毫升甲醇/氯仿（3/1）中，慢慢滴加200毫升乙醚，使再次沉淀。产量：360毫克。
钌络合物[RC-1]的制备
18.7毫克五氯水合钌钾（K2RuCl5·H2O），于60℃溶解于预先加一滴6NHCl的2毫升水中。此溶液中加入三倍化学计算量的配位体（95.8毫克符合前述化合物b的特丁酯），在氮气流下加热回流此混合物2.5小时。
反应液冷却后，所得Ru3+络合物以250微升1摩尔的NaH2PO2溶液还原成相应的Ru2+络合物，然后，再回流沸腾2小时。
接着，过滤，以900微升10%六氟磷酸铵水溶液处理，4℃静置过夜，络合物沉淀。
抽滤后，以制备型薄层层析法提纯此络合物（四块硅胶板，洗脱剂是CH2Cl2/MeOH/H2O（7/3/0.5）。
分离出前沿的红色区带（50毫克纯产物），于室温以5毫升三氟乙酸处理以皂化，1小时后，用水泵抽除三氟乙酸。
例2
Ru[（SO3Na）2batho]2Cl2的制备
627毫克RuCl3·3H2O，568毫克LiCl和2.36克红菲咯啉二磺酸二钠盐（Fluka）在8毫升DMF中沸腾回流6小时。冷至室温后，以60毫升丙酮慢慢处理此反应液，然后于4℃放置20小时，沉淀出的紫色粗产物，吸滤，以丙酮充分洗涤。首先通过重结晶提纯。为此，将粗产物溶解于50毫升甲醇中，继以500毫升丙酮/乙醚（1/1）再沉淀。重复以上过程。进一步用SiO2色谱提纯，以5升氯仿/甲醇/丙酮（4/3/3）洗脱，得到600毫克纯产品。
混合络合物Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2-NHCH2CH2-COO-t-botyl）2batho]Cl2的制备
76.2毫克Ru[（SO3Na）2batho]2Cl2溶解在1毫升水和4毫升甲醇的混合物中，再与41.0毫克[（SO2-NHCH2CH2COO-t-butyl）2-batho]（见例1a）（溶解在3毫升氯仿中）混合。在氮气流下回流加热此反应混合物3小时，得到橙红色溶液。接着，鼓入氮气，并微微加热，蒸出约90%溶剂。冷至室温，沉淀出产物。提纯方法是，将产物溶解于1.5毫升甲醇和0.5毫升DMF中，上SiO2色谱柱，氯仿/甲醇/水（7/3/0.5）洗脱，产量：75毫克。
钌络合物[RC-2]的制备
Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2CH2COOH）2batho]Cl2
为了皂化特丁酯，将55毫克Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2CH2COO-t-butyl]2batho]Cl2溶解于5毫升三氟乙酸中。此反应混合物于室温静置一小时。然后，于40℃用水泵减压抽去三氟乙酸。
首先用SiO2柱层析提纯粗产物。洗脱剂是：
300毫升氯仿/丙酮/甲醇（4/3/3）
500毫升氯仿/甲醇/水（50/50/2）
500毫升氯仿/甲醇/水（50/50/5）
250毫升氯仿/甲醇/水（50/50/10）
100毫升甲醇/水（10/1）
100毫升甲醇/水（1/1）
最后用制备薄层层析提纯。为此，将40毫克钌络合物溶解于700微升水中并用于4块PSC板。于60℃干燥过夜，氯仿/甲醇/水（50/50/2）洗脱。刮下主色区，每次用40毫升水提取三次（用离心阀分离硅胶）。浓缩后，溶解于少量甲醇中，除去产物中的微量SiO2，离心分出不溶介的硅胶，产量：38毫克。
例3
连有甘氨酸特丁酯的红菲咯啉二磺酰胺的制备
[（SO2NHCH2COO-t-butyl）2batho]
此磺酰胺的合成以类似例1的方法进行。配料：甘氨酸特丁酯二苯基硫酰亚胺盐（10.3克），三乙胺（28毫升）和红菲咯啉二磺酰氯（4.2克）。
产量[（SO2NHCH2COO-t-butyl）2batho]：49克。
混合型络合物Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2-COO-t-butyl）2batho]Cl2的制备
3.6克Ru[（SO3Na）2batho]Cl2（见例2）溶解于160毫升甲醇和100毫升水的混合物中，然后与溶解在80毫升甲醇中的2.01克[（SO2NHCH2COO-t-butyl）2batho]混合。
此反应混合物在氮气流下回流沸腾5小时，得到深红色的溶液。冷却后，真空浓缩反应液至约70毫升，然后，慢慢滴加1.4升丙酮以沉淀出混合的钌络合物。
将抽滤得到的粗产物重沉淀两次，以进一步提纯。为此，将沉淀溶解于约150毫升甲醇/水/二氯甲烷（2∶1∶0.3）中，然后，慢慢滴加1.5升丙酮，再沉淀出此络合物。最后，用硅胶层析分离两次，洗脱剂是二氯甲烷/甲醇/水（7/3/0.5）。以类似于上述的方法进一步重结晶后，得到纯产物（红色粉末）：3.0克。
特丁酯皂化成标记物[RC-3]
Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2COOH）2batho]Cl2
将500毫克Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2COO-t-butyl）2batho]Cl2分散于40毫升三氟乙酸中。于室温搅拌2.5小时后真空除去三氟醋酸。残留物溶解于1毫升DMF和3毫升水的混合物中，慢慢滴加500毫升丙酮/甲醇（8/2），此络合物从溶液中再沉淀出来。
重复两次上述再沉淀过程，得到红色粉末，于70℃真空干燥，产量：420毫克。
例4
连有4-氨基丁酸特丁酯的红菲咯啉二磺酰胺的制备
[（SO2NHCH2CH2CH2COO-t-butyl]2batho]
此磺酰胺的合成类似于例1的方法。配料：4-氨基丁酸特丁酯1.57克，三乙胺17毫升和红菲咯啉二磺酰氯2.1克。产量[（SO2NHCH2CH2-CH2-COO-t-butyl）2batho]：1.3克
混合型络合物Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2CH2CH2-COO-t-butyl）2batho]Cl2的制备
合成方法类似于例3中叙述的方法。配料：1.28克Ru[（SO3Na）2-batho]2Cl2和0.775克[（SO2NHCH2CH2CH2COO-t-butyl）2batho]得到红色粉末，产量：1.65克。
特丁酯皂化成标记物[RC-4]
Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2CH2CH2-COOH）2batho]Cl2
配料：70毫克特丁酯衍生物Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NH-CH2CH2CH2COO-t-butyl）2batho]Cl2以类似于例3的方法皂化。产量：50毫克。
例5
连有6-氨基己酸特丁酯的红菲咯啉二磺酰胺的制备
[（SO2NHCH2CH2CH2CH2CH2COO-t-butyl）2batho]
此磺酰胺以类似例1的方法合成。
配料：6-氨基己酸特丁酯2.27克，三乙胺17毫升和红菲咯啉二磺酰氯2.1克。得到[（SO2NHCH2CH2CH2CH2CH2COO-t-butyl）2batho]，
产量：1.8克。
混合型络合物
Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2CH2CH2CH2CH2COO-t-butyl）2batho]Cl2的制备
合成方法类似于例3。
配料：2.3克Ru[（SO3Na）batho]2Cl2和1.49克[（SO2NHCH2-CH2CH2CH2CH2COO-t-butyl）2batho]。得到红色粉末，产量：2.8克。
特丁酯皂化成标记物[RC-5]
Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2CH2CH2CH2CH2COOH）2-batho]Cl2
配料：100毫克特丁酯衍生物Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO2NHCH2CH2CH2CH2CH2COO-t-butyl）2batho]Cl2以类似于例3的方法皂化。产量：85毫克。
例6
混合型络合物
Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO3Na）（SO2NHCH2CH2COO-t-butyl）batho]Cl2的制备
以类似例3的方法合成。
配料：102毫克Ru[（SO3Na）2batho]Cl2和51毫克[（SO3Na）（SO2NHCH2CH2COO-t-butyl）batho]（见例1）。得到105毫克红色粉末。
特丁酯皂化成标记物[RC-6]
Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO3Na）（SO2NHCH2CH2COOH）-batho]Cl2
配料：105毫克特丁酯衍生物Ru[（SO3Na）2batho]2[（SO3Na）-（SO2NHCH2CH2COO-t-butyl）batho]Cl2以类似例3的方法皂化。以制备薄层色谱提纯（硅胶板，洗脱剂：氯仿/甲醇/丙酮（4/3/3）]。
产量：32毫克。
例7
对-[β-氯丙酰基]-5-苯基戊酸甲酯的制备
装有回流冷凝器和搅拌器的烧瓶中，加入9.3克AlCl3，10毫升CS2和1.98毫升β-氯丙酰氯。于室温下，5分钟内滴加3.61克5-苯基戊酸（以2毫升C.S冲洗）。继续搅拌15分钟，稍稍温热，然后冷却。
将反应混合物移入搅拌着的冰、水和乙醚混合物中。有机相以碳酸氢盐和水洗至中性。用硫酸镁干燥后除去溶剂。得到5.03克结晶产物。
5-[对（7-苯基-1.10-菲咯啉基-4）苯基]-戊酸的合成
[（CH2CH2CH2CH2COOH）batho]
2.54克4-苯基-8-氨基喹啉，11.5毫升磷酸（85%）和2.3毫升砷酸溶液（80%H3AsO4）在氩气流下加入搅拌着的烧瓶中。加热此混合物至120℃以溶解喹啉。然后，于5分钟内加入4.56克对-[β-氯丙酰基]-5-苯基戊酸甲酯。在搅拌下于10分钟内加热反应混合物到140℃，并于此温度下保持1小时。
接着，将反应混合物冷却并移到搅拌着的50毫升水和125毫升二氯甲烷的混合物中去，此混合物已经用冰浴充分地冷却。加氢氧化钠溶液调节至PH5，此时，产物进入有机相。
蒸发掉溶剂后得到粗产物，除含有甲酯外也有游离酸（水解所致）。以重氮甲烷处理（在乙醚/甲醇中），此混合物全部生成甲酯。
用乙酸乙酯在AIOX Ⅲ（以1.5%水去活）两次层析后，得到3.022克甲酯。
为了皂化，该甲酯溶解在20毫升乙醇中，以氢氧化钠溶液（0.950克氢氧化钠溶解在5毫升水中）处理该溶液，并在氩气流下，80℃加热2小时。冷却后加到二氯甲烷/水混合物中去，以85%磷酸调节溶液PH至4-5，然后提取产物。
浓缩的二氯甲烷提取物从苯中重结晶，得到1.35克产物。浓缩母液乙醇中重结晶，又得到0.338克产物。
总产量1.688克。m.P234-235℃
混合型钌络合物[RC-7]的制备
Ru[（SO3Na）2batho]2[（CH2CH2CH2CH2COOH）batho]Cl2
34.6毫克5-[对-（7-苯基-1.10-菲咯啉基-4）-苯基]-戊酸溶解于2毫升甲醇中，将此溶液加到102.4毫克Ru[（SO3Na）batho]2Cl2·2H2O与4毫升甲醇和8毫升水组成的溶液中。此混合物在氮气流下回流加热3小时，得到橙红色溶液。
接着，鼓入氮气以除去大部分溶剂。残留溶剂用旋转蒸发器全部除去。
用制备薄层层析法精制粗产物。为此，将该络合物溶解于少量水中，用6块PSC板（Merck出产的SiO2板）。这些层析板于70℃干燥后，做层析，洗脱剂是氯仿/丙酮/甲醇（4/3/3）。
用水提取主色区产物，再做三次制备薄层层析，使用如下洗脱剂：丙酮/水（9/1），然后用丙酮/水（8.5/1.5），最后用氯仿/甲醇/水（50/50/2）。
为了除去痕迹量的SiO2，将此提取物溶解于少量甲醇中，并离心分出不溶的硅胶。然后，在1毫升甲醇溶液中用50毫升丙酮使产物沉淀。产量：42.6毫克（红色粉末）。
例8
对-[β-氯丙酰基]-6-苯基-己酸甲酯的制备
17.2克三氯化铝，18.5毫升二硫化碳和3.6毫升β-氯丙酰氯加入装有回流冷凝器和搅拌的烧瓶中。在室温下，10分钟内将7.06克6-苯基己酸甲酯滴入此混合物中（用4毫升二硫化碳冲洗滴液漏斗）。继续搅拌15分钟，徐徐温热，然后冷却。
将反应混合物移入搅拌的冰、水和乙醚混合物中。以碳酸氢盐溶液和水洗涤有机相至中性。用硫酸镁干燥后除去溶剂。得到10.2克结晶产物。
6-[对-（7-苯基-1，10-菲咯啉基-4）苯基]-己酸的合成
在氮气流下，将5.9克4-苯基-8-氨基喹啉，27毫升磷酸（85%）和5.35毫升砷酸溶液（80%H3AsO4），加入搅拌着的烧瓶中。加热此混合物至120℃以溶解喹啉。然后，于5分钟内加入11.15克对-[β-氯丙酰基]-6-苯基己酸甲酯。于10分钟内边搅拌边加热反应混合物至140℃，并保持此温度1小时。
反应混合物冷却后，移入搅拌着的100毫升水和250毫升二氯甲烷混合物中，水和二氯甲烷混合物已用冰浴冷却。加氢氧化钠溶液（大约用去45克氢氧化钠与200毫升水所配溶液的三分之二）调节反应混合物至PH
蒸发去溶剂后得到15.76克粘稠的油状物，除含有甲酯外，也含有游离酸（水解的结果）。以重氮甲烷处理（在乙醚/甲醇中），混合物又全部转化为甲酯。用乙酯在350克Alox Ⅲ（以1%水去活）上做层析（120毫升为一个馏份）。5-9馏份含有纯产物。
馏份3、4和10也含少量产物。为此这些馏份用乙酸乙酯在氧化铝上两次层析（如上所述）。合并两次层析所得纯馏份，除去溶剂，得到6.979克甲酯。
为了皂化，将所得甲酯溶解于45毫升乙醇中，以氢氧化钠溶液（2.24克氢氧化钠溶解在11毫升水中）处理此溶液，并在氩气流下于80℃加热2小时。用旋转蒸发器除去乙醇，然后，将残留物溶解于二氯甲烷/水混合物中。用3.75毫升（85%）磷酸调节至PH3左右，然后，提取产物。
提取液洗至中性，干燥，浓缩至300毫升。加入3.5克Norit SX-3后，此溶液被搅拌40分钟，过滤，浓缩至少量二氯甲烷。加入20毫升苯，室温静置48小时析出结晶。
抽滤，苯洗，在干燥器中干燥，得到5.393克产物，其结晶中仍含有苯。
无苯的产物，m.P为195℃。
混合型钌络合物[RC-8]的制备
134.2毫克6-[对-（7-苯基-1，10-菲咯啉基-4）苯基]己酸溶解于5.7毫升甲醇中，然后，加到384毫克Ru[（SO3Na2）batho]2Cl2·2H2O与20毫升甲醇和5毫升水的溶液中。在氮气流下，回流加热3小时，得到橙红色溶液。
接着，鼓入氮气除去大部分溶剂。用旋转蒸发器完全除去残余的溶剂。
首先，通过二氧化硅二次柱层析提纯产物，洗脱剂是氯仿/甲醇/水（7/3/0.5）。接着，用制备薄层层析法（Merck的二氧化硅板）进一步提纯此络合物，洗脱剂是氯仿/甲醇/水（7/3/0.5）。刮下主色区，以甲醇提取。产量：162毫克（红色粉末）。
例9
苯骈红菲咯啉基-戊酸的制备
类似于例7叙述的制备[（CH2CH2CH2CH2COOH）batho]的方法，从2-氨基-3-萘甲酸通过Skrap反应合成此化合物。总产量：1.07克。
混合型钌络合物[RC-9]的制备
以类似于例3的方法合成此混合型络合物。
配料：1.28克Ru[（SO3Na）2batho]2Cl2和0.561克[（CH2CH2CH2CH2COOH）benzobatho]。产量：1.1克（红色粉末）。
例10
混合型钌络合物[RC-10]的制备
Ru[（SO3Na）2batho]2[（COOH）2bpy]Cl2
以类似于例3的方法合成此混合型络合物。
配料：256毫克Ru[（SO3Na）2batho]2Cl2，
49毫克4，4′-二羧基-2，2′-联吡啶和60毫克碳酸氢钠（使联吡啶增溶）溶解于35毫升甲醇/水（1/2）中。
产量：290毫克（红色粉末）。
例11
用钌络合物[RC-2]标记抗癌性胚胎抗原anti-CEA
借助于水溶性N-环己基-N′（2-吗啉代乙基）-碳二亚胺-对-甲苯磺酸甲酯的作用，混合型钌络合物[RC-2]偶联于anti-CEA上。由于此络合物每个分子上有两个活性基团，所以，要用两倍摩尔量的碳二亚胺。
下面是为了进行此偶联反应而配制的储液：
1）4.00毫克/毫升钌络合物[RC-2]的水溶液，PH4.5。
2）2.17mg/ml家兔的anti-CEA（DAKO编号A115，批号112B）的200mM NaHCO3溶液;PH8.5。
136微升储液1用264微升水稀释，并以盐酸调节至PH4.5。在旋转搅拌器中短间混合0.27毫克N-环己基-N′-（2-吗啉代乙基）-碳二亚胺-对-甲苯磺酸甲酯。2分钟后加入400微升anti-CEA储液2，此混合物再于旋转搅拌器中充分混合。以少量1N盐酸调节至PH8.5。此反应混合物于室温暗处静置17小时。
为了分离被标记的anti-CEA，500微升反应混合物用LKB的丙烯酰胺凝胶ACA-54做柱层析（柱长30cm，直径9mm;洗脱剂：150mM NaCl，10mM磷酸钠，0.02%NaN3，PH7.0）。含标记的canti-CEA量最高的馏份合并后，总量为5.2毫升。此溶液中anti-CEA的含量和钌络合物的含量通过紫外光谱测定（anti-CEA和钌络合物的吸收在278nm，钌络合物的单独吸收在445nm。于是得到如下浓度：
钌络合物0.66×10-6M/L
anti-CEA0.58×10-6M/L
这相当于标记度为1.1。
例12
用CEA标准液进行荧光免疫分析的操作方法
为了定量测定CEA标准液，用单克隆CEA抗体和多克隆CEA抗体（自DAKO得到的标记抗体）进行的夹层试验，方法如下：
a）于必要数量的试管中（10×75mm），每管加入0.250ml的CEA标准溶液（0ng/ml CEA;2.5ng/ml;CEA;5ng/ml CEA;10ng/ml CEA和20ng/ml CEA于150mM NaCl，10mM Na3PO4和209/l牛血清蛋白中），各管加入一粒聚苯乙烯园珠（直径6.5mm），用单克隆抗CEA抗体致敏，并于37℃温孵24小时。然后将聚苯乙烯园珠用蒸馏水洗三次，每次2-5毫升，并转移到有1×10M/l标记的家兔抗CEA抗体的0.250毫升缓冲溶液（标记度1.1）中。
37℃温孵24小时后，该园珠再用蒸馏水洗三次，每次用水2-5毫升，然后转移到试管中，每管含0.09N硫酸2毫升。30分钟后，将硫酸溶液移至测量池中，用荧光光谱法测定钌络合物的含量（激发光波长453nm，发射光波长612nm）。
测量是在前述仪器上进行，用Balzers的边缘过滤器B610，荧光测定的周期性延迟是2微秒（基于发射光脉冲），测量孔的打开时间为3微秒。
表Ⅰ例出了用Roche公司的一系列CEA标准液测定的数值。
用这样两步检验方法测定CEA的灵敏度是60pg/ml。CEA也可用“一锅煮”的方法进行测定，其方法如下，
b）于必要数量的试管中（10×75mm），每管加入CEA标准液0.125毫升（0ng/ml CEA;2.5ng/ml CEA;5ng/ml CEA;10ng/ml CEA;20ng/ml CEA于胎牛血清中）和浓度为2×10m/l的家兔抗CEA抗体溶液0.125毫升，该抗CEA抗体用钌络合物标记（标记度为1.25，稀释用的PH7.1缓冲液含有0.1m/l Tris，20%胎牛血清，0.05%乙基汞硫代水杨酸钠和0.02%吐温20）。然后各管内加入一粒聚苯乙烯园珠（直径6.5mm，用单克隆抗CEA抗体致敏），37℃温孵24小时。
然后，该园珠用蒸馏水洗三次，每次2-5毫升，并移至有0.09N硫酸2毫升的试管中。30分钟后，将硫酸溶液移入测量池中，用荧光光谱法测定钌络合物的含量（测量条件与a）项所述的相同）。
该CEA测定结果列于表Ⅱ。“一锅煮”方法测定CEA的灵敏度为430pg/ml
表Ⅰ
荧光光谱法测定CEA标准液（两步法）
CEA浓度（Roche标准液） 相对荧光强度
0 ng/ml CEA 0.071
2.5 ng/ml CEA 0.532
5 ng/ml CEA 1.041
10 ng/ml CEA 1.846
20 ng/ml CEA 4.121
表Ⅱ
荧光光谱法测定CEA标准液（“一锅煮”法）
CEA浓度（Roche标准液） 相对荧光强度
0 ng/ml CEA 0.27
2.5 ng/ml CEA 1.21
5 ng/ml CEA 2.66
10 ng/ml CEA 5.13
20 ng/ml CEA 9.74
例13
抗HCG抗体的标记
用钌络合物[RC-2]标记抗-HCG抗体的方法与例11中所述的抗CEA抗体的标记方法相一致。
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）4.00mg/ml的钌络合物[RC-2]水溶液，PH4.5。
2）家兔抗HCG（DAKO编号A231，批号032A）与200mMNaHCO3的溶液，其浓度为10.83mg/ml，PH8.5。
150微升储液1用250微升水稀释，用HCl调节至PH4.5。将0.3mg N-环己基-N′-（2-吗啉代乙基）-碳二亚胺-对甲苯磺酸甲酯加入溶液中。混合物在涡流振动器上混合片刻。两分钟后加入抗HCG抗体溶液（222微升储液2用178微升200nM NaHCO3溶液稀释，PH8.5），混合物在涡流振动器上充分混合。用少量HCl调节PH值到8.5，反应混合物在常温下暗处放置17小时。
为分离被标记的抗HCG抗体，将500微升反应混合液进行柱层析（柱长30cm，直径9mm），填充物为丙烯酰胺凝胶ACA-54（LKB产品）（洗脱剂：150mM NaCl，10mM磷酸钠，0.02%NaN3，PH7.0）。含标记抗HCG抗体高的馏分合并，共5.2毫升。用紫外光谱法测定该溶液中抗-HCG抗体和钌络合物的含量，得到如下的浓度：
钌络合物2.01×10-6M/l
抗HCG抗体2.04×10-6M/l
这相当于1.0标记度
例14
β-HCG标准液进行荧光免疫测定
为定量测定β-HCG标准液，用单克隆β-HCG抗体和多克隆HCG抗体进行夹层试验（标记抗体来自DAKO）方法如下：
于必要数量的试管（10×75mm）中，每管加入0.050毫升的β-HCG标准液（0m IU/ml;10m IU/ml;25m IU/ml;50m IU/ml;100m IU/ml;200m IU/ml），0.050毫升5.12×10-8M/l的抗HCG抗体溶液，该抗体用钌络合物标记（标记度1.0;缓冲稀释液PH7.1，含0.1M/l Tris，20%胎牛血清，0.05%乙基汞硫代水扬酸钠和0.02%吐温20），每管还加入0.150毫升缓冲液（150mM NaCl，10mM磷酸钠，20g/l牛血清蛋白）。然后每管中加入一粒聚苯乙烯园珠（直径6.5mm，用单克隆抗β-HCG抗体致敏），在37℃温孵16小时。
然后，此园珠用蒸馏水洗三次，每次2-5毫升，并转入每支含有2毫升硫酸（0.09N）的试管中。30分钟后，将硫酸溶液移入测量池中，用荧光光谱测定钌络合物的含量（测定条件与例12所述的相同）。
表Ⅲ列出了该β-HCG测定的结果。这种“一锅煮”的方法测定β-HCG的灵敏度是2.2m IU/ml。
表Ⅲ
荧光光谱法测定β-HCG标准液（“一锅煮”法）
β-HCG的浓度（Roche标准液） 相对荧光强度
0mIU/ml 0.44
10mIU/ml 0.34
25mIU/ml 0.80
50mIU/ml 1.56
100mIU/ml 2.78
200mIU/ml 5.81
例15
抗α-干扰素抗体的标记
用钌络合物[RC-2]标记单克隆抗α-干扰素抗体（取自Roche诊断药厂），其方式与例11所述的抗CEA抗体的标记法一致。
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）3.75毫克钌络合物[RC-2]溶于水中，PH4.5。
2）6.0毫克的单克隆抗α-干扰素抗体溶于200mM NaHCO3中;PH8.5。
将0.81毫克的水溶性碳化二亚胺衍生物加到400微升的储液1中，并在涡流振动器上混合片刻。
二分钟后，加400微升的抗α-干扰素抗体的储液2，于涡流振动器上再将混合物混合片刻，室温下暗处放置17小时。
为了分离标记的抗α-干扰素抗体，将500微升的反应混合物进行柱层析（柱长30cm，直径9mm），填充物是LKB生产的丙烯酰胺凝胶ACA-54（洗脱剂：150mM NaCl，10mM磷酸钠，0.02%NaN3，PH7.0）。
将标记的抗α-干扰素抗体含量高的馏分合并，共5.2毫升。用紫外光谱法沉淀该溶液中的抗α-干扰素抗体和钌络合物的含量，得到如下浓度：
钌络合物11.5×10-6M/l
抗α-干扰素抗体（单克隆）1.8×10-6M/l
这相当于6.4标记度。
例16
α-干扰素标准液荧光免疫测定方法
为定量测定干扰素-r αA标准（重组白细胞干扰素），用Roche诊断药厂开发的夹层试验法作为EIA。不过不用酶标记的第二抗体，而是用钌络合物[RC-2]标记的单克隆干扰素抗体（标记度6.4）。
各种干扰素-r αA标准液的定量测定是按如下方法进行的（一步试验）：
于必要数量的试管（10×75mm）中，每管加入0.100毫升的干扰素-r αA标准液（0U/ml r IFN αA;25U/ml r IFN αA;50U/mlr IFN αA;100U/ml r IFN αA;150U/ml r IFN αA;200U/ml r IFN αA;于加有乙基汞硫代水扬酸钠的正常人的血清中），并加入含有5.26×10M/l单克隆抗α-干扰素抗体的0.500毫升溶液，该抗体是由钌络合物标记（标记度6.4，缓冲液是;150mMNaCl，10mM磷酸钠，PH7.5）。然后每管中加入一粒聚苯乙烯园珠（直径6.5mm;用单克隆抗α-干扰素抗体致敏），室温（26℃）下温孵24小时。
然后，此园珠用蒸馏水洗三次，每次2-5毫升，并转入每支含有2毫升硫酸（0.09N）的试管中。30分钟后，将硫酸溶液移入测量池中，用荧光光谱测定钌络合物的含量（测定条件与例12所述的相同）。
表Ⅳ列出了该r IFN αA的测定结果。
浓度在0-200U/ml范围内，r IFN αA浓度与荧光强度间有近似的线性关系。测定r IFN αA的灵敏度达0.46U/ml。
表Ⅳ
荧光光谱法测定r IFN αA标准液
r IFN αA浓度（Roche标准液） 相对荧光强度
0 U/ml 0.14
25 U/ml 0.51
50 U/ml 0.89
100 U/ml 1.80
150 U/ml 2.77
200 U/ml 4.01
例17
用钌络合物[RC-7]标记多克隆抗HCG抗体
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）5.4mg/ml的钌络合物[RC-7]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/ml家兔的多克隆抗-HCG抗体（DAKO编号A231，批号032A）的200mM NaHCO3溶液;PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。为此，每管加入储液1和2各400微升，以及0.56毫克水溶性碳化二亚胺。
用例11所述凝胶层析法将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-7]分离。
紫外光谱法测定的钌络合物和抗HCG抗体的含量如下：
钌络合物3.81×10-6M/l
抗HCG抗体（多克隆）1.87×10-6M/l
这相当于标记度为2.0。
例18
用钌络合物[RC-8]标记多克隆抗CEA抗体
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）1.71mg/ml的钌络合物[RC-8]水溶液，PH4.5。
2）2.71mg/ml家兔的多克隆抗CEA抗体（DAKO编号A115，批号112B）的200mM NaHCO3溶液，PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。为此，每管加入储液1和2各400微升以及0.19毫克的水溶性碳化二亚胺。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-8]分离的方法用凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱法测定钌络合物和抗CEA抗体的含量，得出如下的数值：
钌络合物0.43×10-6M/l
抗CEA抗体0.94×10-6M/l
这相当于标记度为0.5。
例19
用钌络合物[RC-6]标记h-IgG
为进行偶联反应，制备如下储液;
1）3.6mg/ml的钌络合物[RC-6]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/mlh-IgG的200mM NaHCO溶液;PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。每管用储液1和2各400微升以及0.37毫克水溶性碳化二亚胺。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-6]分离的方法是用凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱法测定钌络合物和h-IgG的含量，得出如下的数值：
钌络合物2.31×10-6M/l
h-IgG1.62×10-6M/l
这相当于标记度为1.4。
例20
用钌络合物[RC-1]标记h-IgG
为进行偶联反应，制备下面的储液：
1）4.0mg/ml钌络合物[RC-1]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/ml h-IgG的200mM NaHCO3溶液，PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。每管用储液1和2各400微升以及1.11毫克水溶性的碳化二亚胺。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-1]分离的方法是凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱法测定h-IgG与钌络合物的含量，得出如下数值：
钌络合物10.4×10-6M/l
h-IgG1.8×10-6M/l
这相当于标记为5.8。
例21
用钌络合物[RC-10]标记h-IgG
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）29.0mg/ml钌络合物[RC-10]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/ml h-IgG的200mM NaHCO3溶液，PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。每管加储液1 526微升，储液2 400微升以及水溶性碳化二亚胺7.45毫克。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-10]分离的方法是凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱阀测定的h-IgG与钌络合物的含量，得出如下数值：
钌络合物0.81×10-6M/l
h-IgG0.78×10-6M/l
这相当于标记度为1.0。
例22
用钌络合物[RC-3]标记h-IgG
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）3.7mg/ml钌络合物[RC-3]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/ml h-IgG的200mM NaHCO3溶液，PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。每管中加入储液1和2各400微升，以及0.75毫克水溶性的碳化二亚胺。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-3]分离的方法是凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱法测定h-IgG与钌络合物的含量，得出如下数值：
钌络合物4.41×10-6M/l
h-IgG1.21×10-6M/l
这相当于标记度为3.6。
例23
用钌络合物[RC-4]标记h-IgG
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）3.81mg/ml钌络合物[RC-4]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/ml h IgG的200mM NaHCO3溶液，PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。每管中加入储液1和2各400微升，以及0.75毫克水溶性的碳化二亚胺。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-4]分离的方法是凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱法测定h-IgG与钌络合物的含量，得出如下数值：
钌络合物5.51×10-6M/l
h-IgG1.17×10-6M/l
这相当于标记度为4.70。
例24
用钌络合物[RC-5]标记h-IgG
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）3.87mg/ml钌络合物[RC-5]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/ml h-IgG的200mM NaHCO3溶液，PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。每管中加入储液1和2各400微升，以及0.75毫克水溶性的碳化二亚胺。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-5]分离的方法是凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱法测定h-IgG与钌络合物的含量，得出如下数值：
钌络合物11.7×10-6M/l
h-IgG1.04×10-6M/l
这相当于标记度为11.2。
例25
用钌络合物[RC-9]标记h-IgG
为进行偶联反应，制备如下储液：
1）3.45mg/ml钌络合物[RC-9]水溶液，PH4.5。
2）6.0mg/ml h-IgG的200mM NaHCO3溶液，PH8.5。
偶联反应按例11所述的方法进行。每管中加入储液1和2各400微升，以及0.375毫克水溶性的碳化二亚胺。
将标记的抗体与过量的钌络合物[RC-9]分离的方法是凝胶层析，如例11所述。
紫外光谱法测定h-IgG与钌络合物的含量，得出如下数值：
钌络合物5.69×10-6M/l
h-IgG0.45×10-6M/l
这相当于标记度为12.8。