技术领域
本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的InDel分子标记。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)一年生草本蔓生攀缘植物。原产喜马拉雅山南麓的印度北部地区，我国已有2000多年的栽培历史，是黄瓜的次生起源中心。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一，其作为重要的蔬菜作物历来备受育种家的重视。
近年，ZYMV(Zucchini Yellow Mosaic Virus，黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒)对黄瓜危害愈发严重，黄瓜感染ZYMV后，叶片出现黄化、花叶，叶片表面有瘤状突起，发病严重时叶片皱缩、畸形，植株矮化，甚至死亡，影响了植株的生长发育，降低了黄瓜果实的产量与品质。ZYMV的防治主要是对其传播媒介的防治，植物一旦感染ZYMV，目前尚没有有效的药剂可以治理，因此，要从根本上解决这些问题，需要培育优质抗病黄瓜新品种，以满足种植者和消费者的需求。
常规的抗性育种费时费力，需要经历多代回交和杂交的过程；病害发生需要专门的病圃进行接种鉴定，且受环境影响较大；黄瓜ZYMV抗性由一对隐性基因控制，回交育种过程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入；这些都增加了培育黄瓜抗病品种的难度。分子育种可以大大加速抗病育种进程，显著缩短育种周期。现代生物技术的迅猛发展，为抗病育种开辟了新的途径，利用生物技术培育抗病品种已成为目前的热点。分子育种的前提是获得相关性状的功能基因或与其紧密连锁的分子标记。利用分子标记分析体系，在遗传群体上鉴定抗病遗传规律，定位和克隆ZYMV抗性基因，研究其功能和抗性的分子调控机制，可以为黄瓜抗性基因的分子标记辅助育种及分子设计育种提供理论依据。利用与抗病基因紧密连锁或共分离的分子标记，开展分子标记辅助选择育种，可将多个抗病基因整合到一个品种，显著提高育种效率，缩短育种时间，而且大幅度提高了抗病的力度和持久性，这对于培育出满足种植者需求的黄瓜抗病新品种具有重要意义。
ZYMV拥有较长的研究历史，1973年，Lisa等首次从西葫芦上分离并描述了ZYMV，可通过蚜虫进行非持久性传播，随后Provvidenti等人的研究表明，黄瓜的ZYMV抗性由一对隐性基因zym/zym控制。2013年，Amano等以感ZYMV黄瓜自交系‘CS-PMR1’和抗ZYMV黄瓜自交系‘A192-18’为亲本构建F2群体，将zymA192-18定位于黄瓜六号染色体50kb的区间内，其中包含六个候选基因，在亲本间对候选基因的分析结果表明，Vacuolar protein sorting-associated protein 4-like(VPS4-like)基因(Csa6M152960.1)为最有可能的候选基因，两个亲本间在该基因的第一外显子处存在两个碱基多态性，该基因可能与病毒的复制和在细胞间的移动相关。
上述研究表明，黄瓜ZYMV抗性是单个隐性基因控制，目前已获得的某些连锁标记遗传距离较远或者不适用于大规模群体筛选，不利于分子标记辅助育种的开展。因此，寻找与黄瓜ZYMV抗性基因紧密连锁、共分离的分子标记，为其抗病分子育种提供良好的技术支撑。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种基于黄瓜ZYMV抗性候选基因开发的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，此标记利用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以清晰地显示出差异，方便应用于ZYMV抗性分子辅助育种。
本发明通过对ZYMV抗感黄瓜材料的抗性候选基因测序发现，在内含子区域发现抗病材料中的一个63bp的插入，利用此插入/缺失突变，我们开发了一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的InDel分子标记，以便分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，命名为InDel-zym2，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。
所述InDel-zym2由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物扩增得到。
所述抗病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述感病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQ ID NO.5所示序列，由候选基因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQ ID NO.6所示序列；两者之间存在一个63bp的插入/缺失突变，根据此插入/缺失突变，可以设计多个诸如InDel-zym2与ZYMV抗性共分离的共显性InDel分子标记。
上述SEQ ID NO.1为InDel-zym2在抗病亲本扩增的序列，由119个核苷酸组成；SEQ ID NO.2为InDel-zym2在感病亲本扩增的序列，由182个核苷酸组成。经过多个抗病、感病自交系的分子检测分析，抗病自交系均扩增出119bp大小的条带，而感病自交系均扩增出182bp大小的条带。通过回交分离群体分析，此标记与ZYMV抗性基因共分离。因此，此共显性的InDel标记有利于ZYMV抗性育种的分子标记辅助体系的建立，可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
上述上游引物和下游引物由上海华津生物科技有限公司合成，合成方法为常规生物学方法。
传统的抗性育种费时费力，需要通过多代回交和杂交的过程。病害发生需要专门的病圃进行接种鉴定，且受环境影响较大。黄瓜ZYMV抗性由单一隐性基因控制，回交育种过程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入。这些因素都增加了ZYMV抗性育种的周期和难度。
与现有技术相比，本发明的共分离InDel分子标记为共显性，能够区分纯合子和杂合子，在黄瓜苗期即可鉴定植株的基因型，省去了回交渗入过程中每代自交的步骤；此InDel标记条带差异大，用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳即可清晰地区分基因型，用它来跟踪抗性基因，既准确又省时省力，可用于黄瓜ZYMV抗性的分子标记辅助育种，加速黄瓜ZYMV抗性育种的进程。
附图说明
图1是分子标记InDel-zym2在不同的抗、感自交系的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果。抗病自交系都为119bp大小的条带，感病自交系都为182bp大小的条带。
图2是分子标记InDel-zym2在回交分离群体的琼脂糖凝胶电泳效果。图中所示，SA0422为感病亲本，TMG-1为抗病亲本，F1代表杂交一代；R和S分别代表回交分离群体中随机挑选的抗病和感病植株的检测结果；M代表Marker。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一、基于黄瓜ZYMV抗性候选基因的InDel标记的开发与鉴定
1、多个抗、感自交系的验证
由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQ ID NO.5所示序列，由候选基因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQ ID NO.6所示序列；两者之间存在一个63bp的插入/缺失突变，据此突变，本发明利用Primer 5.0引物设计软件在突变的两侧设计正反向引物。上游引物为SEQ ID NO.3所示，下游引物为SEQ ID NO.4所示，抗性材料的扩增条带为119bp，感病材料的扩增条带为182bp，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可以快速区分所用材料的基因型。根据此原则，本发明经上游引物与下游引物扩增得到与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的InDel分子标记，命名为InDel-zym2，InDel-zym2由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。
使用TaKaRa公司的Taq DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR反应体系为10μL体系。扩增程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；4℃保存。扩增后的产物使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR结果。
利用此InDel标记技术，我们对多个抗、感自交系进行了电泳分析验证。其中抗病自交系有：SA02、SA06、S94、S1003、WI7230、TMG-1，共6个抗病黄瓜自交系；感病自交系有：SA03、SA04、SA05、SA07、SA08、SA09、夏美仑、S52、S05、PI197088、S06、SA0422，共12个感病黄瓜自交系。结果显示，在抗病自交系中扩增出119bp的片段，而感病自交系扩增出182bp的片段，结果参见图1，图1中，1：TMG-1，2：SA0422，3：F1(TMG-1×SA0422)，4：SA02，5：SA03，6：SA04，7：SA05，8：SA06，9：SA07，10：SA08，11：SA09，12：S94，13：WI7230，14：PI197088，15：S1003，16：S06，17：S05，18：S52，19：夏美仑。因此，这个InDel标记可以用来筛选不同的抗、感品种。
2、群体共分离验证
为了证明InDel标记InDel-zym2是否与ZYMV抗性基因存在连锁关系，本发明利用130株的回交分离群体对此标记进行了群体连锁分析验证。结果显示，在群体中与抗病亲本有一致带型的单株表现为抗病，与感病亲本有一致带型的植株为感病，杂合带型的植株也为感病(参见图2)。此结果说明：此标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子；标记与ZYMV抗性共分离。
如图2所示，电泳条带清晰稳定，用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳可显示出片段差异。所以，此InDel标记具有稳定、快速和使用方便的优点，同时可以清晰地区分纯合子和杂合子。本发明的分子标记可应用于黄瓜苗期ZYMV抗、感单株的辅助筛选，为ZYMV抗性的分子标记辅助育种奠定了基础，这将大大加快黄瓜ZYMV抗性分子育种的进程。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
<110> 上海交通大学
<120>与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记
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<210> 1
<211> 119
<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）
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<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）
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<213>黄瓜（Cucumis sativus L.）
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