与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710157379.0 (22)申请日 2017.03.16 (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路800号 (72)发明人 蔡润潘俊松郭春立孙敬贤 何欢乐吕铎杨义 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 31225 代理人 褚明伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分 子标记 (57)摘要 本发明涉及

2、一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分 离的新型InDel分子标记， 命名为InDel-zym2， 由 SEQIDNO.1所示的核苷酸序列片段和SEQID NO.2所示的核苷酸序列片段组成； 其中SEQID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗性基因共分离， SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因 共分离。 本发明的InDel分子标记具有高稳定性， 可以简便、 快速、 高通量的应用于黄瓜苗期ZYMV 抗性单株的辅助筛选； 根据SEQIDNO.5与SEQ IDNo.6所示， 由插入/缺失突变造成的抗性候选 基因DNA长度的差异， 还可以设计多对共显性的 InDel标记作为ZYMV抗性筛选的分子标记

3、。 本发 明的InDel标记为ZYMV抗性的分子标记辅助育种 奠定了基础， 这将大大加快黄瓜ZYMV抗性分子育 种的进程。 权利要求书1页 说明书11页 序列表6页 附图1页 CN 106868156 A 2017.06.20 CN 106868156 A 1.一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记， 命名为InDel-zym2， 由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成； 其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离， SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感 病基因共分离。 2.根据权利要求1所述

4、的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记， 其特征在 于， 所述InDel-zym2由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物扩增得 到。 3.根据权利要求1所述的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记， 其特征在 于， 所述抗病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。 4.根据权利要求1所述的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记， 其特征在 于， 所述感病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。 5.如权利要求1所述的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记的获得方法， 其特征在于， 由候选

5、基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQ ID NO.5所示序列， 由候选 基因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQ ID NO.6所示序列， 两者之间存在插入/缺失突 变， 根据此插入/缺失突变设计出InDel-zym2。 6.如权利要求1所述的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记的应用， 其特 征在于， 所述的InDel分子标记应用于黄瓜苗期ZYMV抗性单株的辅助筛选。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106868156 A 2 与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术， 尤其是涉及与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的In

6、Del分子 标记。 背景技术 0002 黄瓜(Cucumis sativus L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)一年生草本蔓生攀缘植 物。 原产喜马拉雅山南麓的印度北部地区， 我国已有2000多年的栽培历史， 是黄瓜的次生起 源中心。 黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一， 也是我国主栽蔬菜作物之一， 其作为重要 的蔬菜作物历来备受育种家的重视。 0003 近年， ZYMV(Zucchini Yellow Mosaic Virus， 黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒)对黄 瓜危害愈发严重， 黄瓜感染ZYMV后， 叶片出现黄化、 花叶， 叶片表面有瘤状突起， 发病严重时 叶片皱缩、 畸形， 植株

7、矮化， 甚至死亡， 影响了植株的生长发育， 降低了黄瓜果实的产量与品 质。 ZYMV的防治主要是对其传播媒介的防治， 植物一旦感染ZYMV， 目前尚没有有效的药剂可 以治理， 因此， 要从根本上解决这些问题， 需要培育优质抗病黄瓜新品种， 以满足种植者和 消费者的需求。 0004 常规的抗性育种费时费力， 需要经历多代回交和杂交的过程； 病害发生需要专门 的病圃进行接种鉴定， 且受环境影响较大； 黄瓜ZYMV抗性由一对隐性基因控制， 回交育种过 程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入； 这些都增加了培育黄瓜抗病品种的难度。 分子 育种可以大大加速抗病育种进程， 显著缩短育种周期。 现代生物技术的

8、迅猛发展， 为抗病育 种开辟了新的途径， 利用生物技术培育抗病品种已成为目前的热点。 分子育种的前提是获 得相关性状的功能基因或与其紧密连锁的分子标记。 利用分子标记分析体系， 在遗传群体 上鉴定抗病遗传规律， 定位和克隆ZYMV抗性基因， 研究其功能和抗性的分子调控机制， 可以 为黄瓜抗性基因的分子标记辅助育种及分子设计育种提供理论依据。 利用与抗病基因紧密 连锁或共分离的分子标记， 开展分子标记辅助选择育种， 可将多个抗病基因整合到一个品 种， 显著提高育种效率， 缩短育种时间， 而且大幅度提高了抗病的力度和持久性， 这对于培 育出满足种植者需求的黄瓜抗病新品种具有重要意义。 0005 Z

9、YMV拥有较长的研究历史， 1973年， Lisa等首次从西葫芦上分离并描述了ZYMV， 可 通过蚜虫进行非持久性传播， 随后Provvidenti等人的研究表明， 黄瓜的ZYMV抗性由一对隐 性基因zym/zym控制。 2013年， Amano等以感ZYMV黄瓜自交系 CS-PMR1 和抗ZYMV黄瓜自交系 A192-18 为亲本构建F2群体， 将zymA192-18定位于黄瓜六号染色体50kb的区间内， 其中包含 六个候选基因， 在亲本间对候选基因的分析结果表明， Vacuolar protein sorting- associated protein 4-like(VPS4-like)基

10、因(Csa6M152960.1)为最有可能的候选基因， 两个亲本间在该基因的第一外显子处存在两个碱基多态性， 该基因可能与病毒的复制和在 细胞间的移动相关。 0006 上述研究表明， 黄瓜ZYMV抗性是单个隐性基因控制， 目前已获得的某些连锁标记 遗传距离较远或者不适用于大规模群体筛选， 不利于分子标记辅助育种的开展。 因此， 寻找 说明书 1/11 页 3 CN 106868156 A 3 与黄瓜ZYMV抗性基因紧密连锁、 共分离的分子标记， 为其抗病分子育种提供良好的技术支 撑。 发明内容 0007 本发明的目的就是为了提供一种基于黄瓜ZYMV抗性候选基因开发的与黄瓜ZYMV 抗性基因共分

11、离的新型InDel分子标记， 此标记利用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以清晰地显示 出差异， 方便应用于ZYMV抗性分子辅助育种。 0008 本发明通过对ZYMV抗感黄瓜材料的抗性候选基因测序发现， 在内含子区域发现抗 病材料中的一个63bp的插入， 利用此插入/缺失突变， 我们开发了一个与黄瓜ZYMV抗性基因 共分离的InDel分子标记， 以便分子标记辅助育种体系的建立。 本发明的分子标记可简便、 快速、 高通量地应用于育种实践。 0009 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 0010 一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记， 命名为InDel-zym2， 由 SEQ ID N

12、O.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成； 其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离， SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与 感病基因共分离。 0011 所述InDel-zym2由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物 扩增得到。 0012 所述抗病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示， 所述感病基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示。 0013 由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQ ID NO.5所示序列， 由候选基 因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQ ID NO

13、.6所示序列； 两者之间存在一个63bp的插 入/缺失突变， 根据此插入/缺失突变， 可以设计多个诸如InDel-zym2与ZYMV抗性共分离的 共显性InDel分子标记。 0014 上述SEQ ID NO.1为InDel-zym2在抗病亲本扩增的序列， 由119个核苷酸组成； SEQ ID NO.2为InDel-zym2在感病亲本扩增的序列， 由182个核苷酸组成。 经过多个抗病、 感病自 交系的分子检测分析， 抗病自交系均扩增出119bp大小的条带， 而感病自交系均扩增出 182bp大小的条带。 通过回交分离群体分析， 此标记与ZYMV抗性基因共分离。 因此， 此共显性 的InDel标记有

14、利于ZYMV抗性育种的分子标记辅助体系的建立， 可简便、 快速、 高通量地应 用于育种实践。 0015 上述上游引物和下游引物由上海华津生物科技有限公司合成， 合成方法为常规生 物学方法。 0016 传统的抗性育种费时费力， 需要通过多代回交和杂交的过程。 病害发生需要专门 的病圃进行接种鉴定， 且受环境影响较大。 黄瓜ZYMV抗性由单一隐性基因控制， 回交育种过 程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入。 这些因素都增加了ZYMV抗性育种的周期和难 度。 0017 与现有技术相比， 本发明的共分离InDel分子标记为共显性， 能够区分纯合子和杂 合子， 在黄瓜苗期即可鉴定植株的基因型， 省去了回

15、交渗入过程中每代自交的步骤； 此 InDel标记条带差异大， 用8的聚丙烯酰胺凝胶电泳即可清晰地区分基因型， 用它来跟踪 说明书 2/11 页 4 CN 106868156 A 4 抗性基因， 既准确又省时省力， 可用于黄瓜ZYMV抗性的分子标记辅助育种， 加速黄瓜ZYMV抗 性育种的进程。 附图说明 0018 图1是分子标记InDel-zym2在不同的抗、 感自交系的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果。 抗 病自交系都为119bp大小的条带， 感病自交系都为182bp大小的条带。 0019 图2是分子标记InDel-zym2在回交分离群体的琼脂糖凝胶电泳效果。 图中所示， SA0422为感病亲本， TM

16、G-1为抗病亲本， F1代表杂交一代； R和S分别代表回交分离群体中随 机挑选的抗病和感病植株的检测结果； M代表Marker。 具体实施方式 0020 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 0021 实施例 0022 一、 基于黄瓜ZYMV抗性候选基因的InDel标记的开发与鉴定 0023 1、 多个抗、 感自交系的验证 0024 由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQ ID NO.5所示序列， 由候选基 因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQ ID NO.6所示序列； 两者之间存在一个63bp的插 入/缺失突变， 据此突变， 本发明利用Primer 5.0引物设计软件在突

17、变的两侧设计正反向引 物。 上游引物为SEQ ID NO.3所示， 下游引物为SEQ ID NO.4所示， 抗性材料的扩增条带为 119bp， 感病材料的扩增条带为182bp， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可以快速区分所用材料的 基因型。 根据此原则， 本发明经上游引物与下游引物扩增得到与黄瓜ZYMV抗性基因共分离 的InDel分子标记， 命名为InDel-zym2， InDel-zym2由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段 和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成； 其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗 病基因共分离， SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病

18、基因共分离。 0025 使用TaKaRa公司的Taq DNA Polymerase进行PCR扩增， PCR反应体系为10 L体系。 扩增程序为： 98预变性5min； 98变性10s， 55退火30s， 72延伸20s， 32个循环； 4保 存。 扩增后的产物使用8聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR结果。 0026 利用此InDel标记技术， 我们对多个抗、 感自交系进行了电泳分析验证。 其中抗病 自交系有： SA02、 SA06、 S94、 S1003、 WI7230、 TMG-1， 共6个抗病黄瓜自交系； 感病自交系有： SA03、 SA04、 SA05、 SA07、 SA08、 SA09、 夏

19、美仑、 S52、 S05、 PI197088、 S06、 SA0422， 共12个感病黄 瓜自交系。 结果显示， 在抗病自交系中扩增出119bp的片段， 而感病自交系扩增出182bp的片 段， 结果参见图1， 图1中， 1： TMG-1， 2： SA0422， 3： F1(TMG-1SA0422)， 4： SA02， 5： SA03， 6： SA04， 7： SA05， 8： SA06， 9： SA07， 10： SA08， 11： SA09， 12： S94， 13： WI7230， 14： PI197088， 15： S1003， 16： S06， 17： S05， 18： S52， 19

20、： 夏美仑。 因此， 这个InDel标记可以用来筛选不同的抗、 感品种。 0027 2、 群体共分离验证 0028 为了证明InDel标记InDel-zym2是否与ZYMV抗性基因存在连锁关系， 本发明利用 130株的回交分离群体对此标记进行了群体连锁分析验证。 结果显示， 在群体中与抗病亲本 有一致带型的单株表现为抗病， 与感病亲本有一致带型的植株为感病， 杂合带型的植株也 说明书 3/11 页 5 CN 106868156 A 5 为感病(参见图2)。 此结果说明： 此标记为共显性标记， 能够区分纯合子和杂合子； 标记与 ZYMV抗性共分离。 0029 如图2所示， 电泳条带清晰稳定， 用

21、8的聚丙烯酰胺凝胶电泳可显示出片段差异。 所以， 此InDel标记具有稳定、 快速和使用方便的优点， 同时可以清晰地区分纯合子和杂合 子。 本发明的分子标记可应用于黄瓜苗期ZYMV抗、 感单株的辅助筛选， 为ZYMV抗性的分子标 记辅助育种奠定了基础， 这将大大加快黄瓜ZYMV抗性分子育种的进程。 0030 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改， 并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。 因此， 本发明不限于上述实施例， 本领 域技术人员根据本发明的揭示， 不脱离本发明范畴所

22、做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。 说明书 4/11 页 6 CN 106868156 A 6 0031 说明书 5/11 页 7 CN 106868156 A 7 0032 说明书 6/11 页 8 CN 106868156 A 8 0033 说明书 7/11 页 9 CN 106868156 A 9 0034 说明书 8/11 页 10 CN 106868156 A 10 0035 说明书 9/11 页 11 CN 106868156 A 11 0036 说明书 10/11 页 12 CN 106868156 A 12 0037 说明书 11/11 页 13 CN 10686

23、8156 A 13 上海交通大学 与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记 6 1 119 DNA 黄瓜 （Cucumis sativus L. ） 1 gtcacaagtg cgtgattccg taggaaggaa caactttacc ttatttaaag aatagttcat 60 ccaagtgtgt ttttatttaa ttttctctca gagaaacaga aaactgattt agcattggt 119 2 182 DNA 黄瓜 （Cucumis sativus L. ） 2 gtcacaagtg cgtgattccg taggaaggaa caactttac

24、c ttatttaaag aatagttcat 60 ccacgagagg aaagtgaaca agaaaacaaa agaaaacaaa atcataaaaa tagttatcta 120 aatccaagtg tgtttttatt taattttctc tcagagaaac agaaaactga tttagcattg 180 gt 182 3 20 DNA 人工序列 3 gtcacaagtg cgtgattccg 20 4 24 DNA 人工序列 4 accaatgcta aatcagtttt ctgt 24 5 4774 DNA 黄瓜 （Cucumis sativus L. ） 5 a

25、tgtatagca atttcaagga gcaagctatt gaatacgtga agcaggcggt acatgaagat 60 aatgctggca attacgcaaa agcctctccg ctgtatataa acgccttgga gtacttcaaa 120 序列表 1/6 页 14 CN 106868156 A 14 actcatttga agtatgagaa aaatcccaag atcaaggaag ctattaccca gaaattcacc 180 gagtatttgc gccgggctga ggagatacgt gctgttttgg atgatggcgg tcctgg

26、tccg 240 gcttccaatg gagatgcagc tgttgcaact aaacccaaga cgaaacctaa ggatggagaa 300 ggaggagatg gagaggatcc agaacaggct aagttacggg ctggtcttaa ttccgcaatc 360 ataagggaga aaccggatgt taagtggaac gatgttgctg gattggagag cgccaagcag 420 gcgttgcaag aggctgtaat attacccgtt aagttccccc agttctttac tggttagttc 480 cattttgctt

27、ctttcgatct actaccgtat tgatttttgt tgtctcatgt cagtacagtt 540 gtgttccccc tttgagctga gattttcttc atttcacgtt tcagtttgat tagatcatta 600 gatgtgtagt gattacaatt atattctagt ttaattataa tggtagtgat tacaattata 660 ttctagttta attataatgg tgcttacttt ttaaataaaa tcatgtcaaa gataattgtc 720 tacctttctt taggtaagag gcgaccatg

28、g cgagctttct tgttatatgg gcctcctgga 780 actggaaagt catacttggc aaaggctgtt gcgacagagg ctgactcgac atttttcagg 840 taacgatcct ctgaggtttg agtatatgaa cttgtcttgt gtgatttgta tggtagccat 900 atatttctta actttcctag ccattatctt ttaacgtgcc tgtgtgagca acttacaacc 960 cttgagttct catgaaactt tttttatgtc atcaacaaca ttcatga

29、act ctgtgttgtt 1020 ttctttattc ttatgaaatt gcagcaagta tgaacaatat cattttaaag tggtgtctct 1080 aattaaatat ttttcatgca ttagagttga ggatattagg aattattagc agatatggcc 1140 gtagggaatt tcattttcta aatgttctat ttaaccattt ctcaagattt aatgattcga 1200 agttagatgg cctgttgctc tactgcttta tgggaggtct cctaggcctt cattcatttt 1

30、260 gttggtatag tgtaatttgt tgtcgtcatt gcaattcttt tgttctattt tgttcattta 1320 ttaattcttg aatttggtgg gctttaaatc ttgtttctat agaagaacaa taatggagat 1380 atttgttgat tactcttaag agttttagat ggttagattg gaccatctgt ttgtttggca 1440 ggaaacttaa gaggaacata tgactaaagg taaaggtaag tgctgaagcc ggaagtttaa 1500 tataatttat a

31、aacggtttg gcaaagtagc aattttaatt cagaagatgc atttgtgtca 1560 cattttaagt ggtacaagtg caacctaccc tttctttttc tctggataag caaaagacaa 1620 caaatgctat tgaatctttt cttctacaat ttttatagta aaaaacttat atccttttct 1680 gggtgtggcc tttgagacat tgaaataaga aatccctaga ttcaaattgt gatcttccat 1740 tttttacttg cttcttgaac ttatta

32、cggt tcttggcttt gaaaaaaatt tgaggaatac 1800 agtaagctat ctttttaata atttacttta ttgaaataaa gttcaaatgc ctttggtggc 1860 tatggacagt atgaactcat tgagtggcct caagtggata taaagtgcgg aatgcaaaaa 1920 ctcaaatgac ttacaaaata tttccaactt ttggttgtaa aaaaataaac gacagatata 1980 aaaacaagtt ttggttatcc attttctttg ctttcattcc

33、catcctattc aattacaggg 2040 catacccaca ccacattcta tttggatact tttggcggtt gtttgaatgt gtttttaatt 2100 atcagtaagc tctatttgct gtttcctgcc acttgcttta aattgagtat tcttttccat 2160 tttctgttga tagcatttct tcttcggacc ttgtctcgaa atggatgggt gaaagcgaga 2220 agctagtttc aaatcttttt caaatggctc gtgatagcgc gccttctatc atctt

34、tattg 2280 atgaaataga ttcgttgtgt ggtcaacgag gtgaaggtaa tgaaagtgaa gcttcaagac 2340 gcattaagac tgaacttctt gtgcaaatgc aggtattgtt tgtttgtagt gtaaaagcgt 2400 gaatattttg tgtaccaaag aaaggttgtt gattattatt attatatatg cgtcctttgc 2460 序列表 2/6 页 15 CN 106868156 A 15 tcatttcatt gtcttgagaa tgctcatttt cagaaaatat c

35、tcattgctg ctgatctaca 2520 tccaagtgtt tttcagccag ttgaaagttg acttaaatta tatctatagg gttttctgat 2580 agtctaatta cttgtttcta tgattctacc catctatttg ggctttaact gcttaaataa 2640 agctttagaa tatctggctt gtttcatagc ttttcggtat cccaagtttt tcaactttga 2700 tatgtgtatt gggttctcta ccttgttcac attttaaaat ttggtagttg ggcatt

36、gggc 2760 attgggcatt gggcattgat ggggacctgg atgggaaacc ctggggctta ggggctgtaa 2820 ctcattggca ttttctcttt gctcccaacc cttgaacatc tgttccacac gttacgctgt 2880 ttgtttttgt gtttgcttgc gtacaatgtc tgtattgaat aatttgtcag atgaattttg 2940 atgcatggtg aaacttgctc aatggaaatg tagcttaatt tctaattgca attaaataat 3000 ctactc

37、atgc agcaaaaagt tattctgtta ttttattttg aagaagattt gtaattcatt 3060 tcatgaatag attagggaaa ggagttgtaa attattcgga cgtttggaga gagatttttt 3120 ttgtttatgt attatgtttt ttcttttccc tcaaacaatc aagtttaatg atagctgttt 3180 gattggattt gttagaagct tggattttga actattttta agaatggtcg tcacaagtgc 3240 gtgattccgt aggaaggaac

38、aactttacct tatttaaaga atagttcatc caagtgtgtt 3300 tttatttaat tttctctcag agaaacagaa aactgattta gcattggttt taaactagat 3360 ctgcgaatat tatctctacc ttgttattaa ttttacttga aagctgaact atatatctcg 3420 tgcatttata gggtgtagga cacaatgatc aaaaggttct tgttcttgct gcaacaaata 3480 ctccctatgc tttggatcag gtgaagtaga atttg

39、tctat ttccatatca tgtaaaggat 3540 tacaaaagtt gaatatctga ctgatacgtg ttttttacag gccattcgtc gacgattcga 3600 caagcggata tacattcctc tacctgattt gaaagccaga cagcacatgt tcaaagttct 3660 gagaattcta ttttattttc tccaataaaa aagcaagttt ttttgttgtt gtcatctcca 3720 tgaactttgc taatattcat agatgtattt aaataggtgc atctggggga

40、 tacaccacat 3780 aatttaacag aagcagattt tgaaaactta gcacgcaaga cagatggttt ctcgggttca 3840 gatatttcag tttgtgtaag tgtgtaatat ttgttggatg acgatgaact gaaatctttc 3900 attggtggct tgaatctata tcagatatta gttagaatgt agttcatgga tcccttgaat 3960 ttgcaggtga aggatgtgct ctttgaacct gtacgtaaaa ctcaagatgc tatgttcttc 4020

41、 attatgactc ctgatggtat gtgggtacct tgtggaccaa agcaacaagg agctgtccaa 4080 attagcatgc aagagctagc agccaaagga cttgcctcaa aggtacatca catcttaaca 4140 tcctagatga atgtttagat taaaatttag ttattttcaa ctttcacaaa gtgacaagct 4200 tgcagatatg atatacacag actaatatat tttaacactt cttgcattgt gttcgatttg 4260 atgccacttt gtcg

42、atagct caatggtgat gagtctcatg actgataatt ctatgattga 4320 accacaaaca aaattttgaa actattcatc tttcttctat tggtttattg ggctgttttt 4380 gtatgatttc atattttctt taagaaaaaa aaggcatttt atgcattgtt caaatttaag 4440 tttttataca tgcatatatg ttgaagaaga tctataattc gatgagggaa tgctttatca 4500 taatattttg acaaagtcac tggttgata

43、g gtggaattcc attctttata tcgctaaacg 4560 tttggttatt tgggtgcaga ttcttcctcc accaattaca agaacagatt ttgacaaggt 4620 cttagctaga caaaggccta cggtgagtaa atctgatctg gaaattcatg aaaggtttac 4680 aaaagagttt ggggaggaag gttgaggagt gtgttatagt ttttatcgag tcttatctca 4740 atcatcgctg ttgcatacaa ccaattagag ttaa 4774 序列表

44、3/6 页 16 CN 106868156 A 16 6 4783 DNA 黄瓜 （Cucumis sativus L. ） 6 atgtatagca atttcaagga gcaagctatt gaatacgtga agcaggcggt acatgaagat 60 aatgctggca attacgcaaa agcctttcca ctgtatatga acgccttgga gtacttcaaa 120 actcatttga agtatgagaa aaatcccaag atcaaggaag ctattaccca gaaattcacc 180 gagtatttgc gccgggctga ggag

45、atacgt gctgttttgg atgatggcgg tcctggtccg 240 gcttccaatg gagatgcagc tgttgcaact aaacccaaga cgaaacctaa ggatggagaa 300 ggaggagatg gagaggatcc agaacaggct aagttaaggg ctggtcttaa ttccgcaatc 360 ataagggaga aaccggatgt taagtggaac gatgttgctg gattggagag cgccaagcag 420 gcgttgcaag aggctgtaat attacccgtt aagttccccc ag

46、ttctttac tggttagttc 480 cattttgctt ctttcgatct actaccgtat tgatttttgt tgtctcatgt cagtacagtt 540 gtgttccccc tttgagctga gattttcttc atttcacgtt tcagtttgat tagatcatta 600 gatgtgtagt gattacaatt atattctagt ttaattataa tggtgcttac tttttaaata 660 aaatcatgtc aaagataatt gtctaccttt ctttaggtaa gaggcgacca tggcgagctt

47、720 tcttgttata tgggcctcct ggaactggaa agtcatactt ggcaaaggct gttgcgacag 780 aggctgactc gacatttttc aggtaacgat cctctgaggt ttgagtatat gaacttgtct 840 tgtgtgattt gtatggtagc catatatttc ttaactttcc tagctattat cttttaatgt 900 gcctgtgtga gcaacttaca acccttgagt tctcatgaaa ctttttttat gtcatcaaca 960 acattcatga actctgtgtt gctttcttta ttcttatgaa attgcagcaa gtatgaacaa 1020 tatcatttta aagtggtgtc tctaattaaa tatttttcat gcattagagt tgaggatatt 1080 aggaattatt agcagatatg gc