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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610927933.4 (22)申请日 2016.10.31 (71)申请人 中国农业科学院郑州果树研究所 地址 450009 河南省郑州市航海东路与未 来路交叉口南1000米 (72)发明人 鲁振华王志强牛良张南南 崔国朝曾文芳潘磊 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 杨海军 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与桃树矮化基因紧密连锁的SNP标记的应用。
2、 (57)摘要 与桃树矮化基因紧密连锁的SNP标记的应 用， 所述分子标记分别位于桃基因组(Version 2 .0)Scaffold6上28 .1Mb和29 .2Mb处， 为 SNP260k-2和SNP260k-13， 其中SNP260k-2的等位 基因为C和T， 序列如SEQIDNO.1所示， SNP260k- 13的等位基因为G和A， 位点侧翼序列如SEQID NO.2所示。 本发明可依据获得的紧密连锁标记在 含有矮化基因的普通生长型桃中进行早期鉴定， 筛选亲本并应用于矮化观赏桃育种， 建立矮化性 状的分子标记辅助选种体系。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 106。
3、399538 A 2017.02.15 CN 106399538 A 1.与桃树矮化基因紧密连锁的SNP分子标记在桃树育种中的应用， 其特征在于所述分 子标记分别位于桃基因组(Version 2.0)Scaffold 6上28.1Mb和29.2Mb处， 为SNP260k-2和 SNP260k-13， 其中SNP260k-2的等位基因为C和T， 序列如SEQ ID NO.1所示， SNP260k-13的等 位基因为G和A， 位点侧翼序列如SEQ ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述矮化型桃树SNP260k-2位点基因型为纯 合T， SNP260k-13位点基因型为。
4、纯合A。 3.检测权利要求1所述与桃树矮化基因紧密连锁的SNP分子标记的引物对， 其特征在于 SNP260k-2： 5-AGGGTTTCATGGCGTTAAAGC-3 5-AAACTGAACTGCTCTTCCACGG-3 SNP260k-13： 5-CTTTTCTCCGCCGCGTTAAT-3 5-CCCGGGATGTGACAATTTGG-3 。 4.检测杂交后代单株的引物对， 其特征在于 YZ-dw-SNP(F/R)： 5-CTCTGCTTCTTCTGTTTGTGGT-3 5-ACATCTAGCCGGCCAGTG-3 。 5.一种检测矮化桃树的试剂盒， 其特征在于含有权利要求3所述的引物对。。
5、 6.根据权利要求5所述的一种检测矮化桃树的试剂盒， 其特征在于还含有权利要求4所 述的引物对。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106399538 A 2 与桃树矮化基因紧密连锁的SNP标记的应用 技术领域 0001 本发明涉及一个与桃树矮化基因紧密连锁的SNP标记的应用。 背景技术 0002 桃Prunus persica(L.)Batsch是深受消费者欢迎的水果之一。 据联合国粮农组 织数据， 2013年我国桃栽培面积1166万亩， 占世界栽培总面积的50.5， 是我国栽培面积较 大的落叶果树之一。 0003 我国是桃起源中心， 具有丰富的遗传资源。 作为重要的农艺性状之一， 树型种类。
6、多 样， 包括普通生长型(Standard type)、 柱型(Pillar type)、 半矮生型(Semi-dwarf type)、 垂枝型(Weeping type)、 直立型(Upright type)、 短枝型(Spur type)和矮化型(Dwarf type)等几类(Bassi et al.,1994)。 确定不同生长型树体结构的遗传特征是开展后续研究 的关键； 也是建立目标性状的分子辅助选种体系和进行品种遗传改良的前提， 具有十分重 要的科学和产业意义。 近年来随着生物技术的进步， 特别是基于二代测序的标记技术加速 了作物基因的精细定位和分子辅助选种体系的建立(Takagi e。
7、t al .2013； Abe et al.2012)。 0004 矮化型桃有多种类型， 由于树体矮小， 是盆栽观赏的重要育种资源， 定位控制桃矮 化基因并获得相关的分子标记是建立分子辅助选种体系并创制新的矮化观赏桃品种的前 提。 基于此本发明对桃矮化基因进行了定位， 并得到了紧密连锁的SNP标记， 可实现对目标 性状进行分子鉴定， 确立目标性状的分子辅助选种体系。 发明内容 0005 解决的技术问题： 本发明针对以上情况， 提供一种与桃树矮化基因紧密连锁的SNP 标记的应用。 0006 技术方案： 与桃树矮化基因紧密连锁的SNP分子标记在桃树育种中的应用， 所述分 子标记分别位于桃基因组(V。
8、ersion 2.0)Scaffold 6上28.1Mb和29.2Mb处， 为SNP260k-2和 SNP260k-13 ， 其中SNP260k-2的等位基因为C和T， 序列如SEQ ID NO .1所示 ： TTTCTTCCTGGAAAACACGTTGAGCTTTTATTGCAGTTAAATCGTACATATTGCAGTTTGCAGTGGCCTGAATTACT GTAGTAACATACTCTTAAAGTAGAAGTGAAAAATTGTCTTACTGGCAGTAGATTCTATGCTGAGAAAATTCTCAGCT AGATGAAAATGTTGAAGGTAAATTAGATAAGGAAAAGCA。
9、TACAAGTTCCACCGGATAAAGAACTCAACTGGATATAA TACATGGCAGTGGATTATAAATACAAGGGCCAACTTAAGAGGGACTAAAAGTGCTAAAAATCAGACACCAACTCATC AACCAAAGAATTTAGTATCTCCTTCTCAATCTCTAGACCCTCCTCAAATGTTTCAATGTCGAAGTCAAGCCATCTCC CATGA ， SNP260k-13的等位基因为G和A ， 位点侧翼序列如SEQ ID NO .2所示 ： GTATTTTTTGAATAGACATAAGCATTATCATCTATAGAAAATAGAATTTAT。
10、TCTCAGGCAGGAAATAAAAACTTCAA ATAAAAGCAAGGAGAACTACGTTGAAAATAAGTAAGTTACTTGGTGTTTTCTCTAGGGGGTAGGCGATTATTCAACA CGCAATCGAGACACCACCAAGA。 下划线表示等位基因位点。 0007 上述矮化型桃树SNP260k-2位点基因型为T， SNP260k-13位点基因型为A。 说明书 1/5 页 3 CN 106399538 A 3 0008 检测与桃树矮化基因紧密连锁的SNP分子标记的引物对： 0009 SNP260k-2： 5-AGGGTTTCATGGCGTTAAAGC-3； 0010 。
11、5-AAACTGAACTGCTCTTCCACGG-3； 0011 SNP260k-13： 5-CTTTTCTCCGCCGCGTTAAT-3； 0012 5-CCCGGGATGTGACAATTTGG-3； 0013 检测杂交后代单株的引物对： 0014 YZ-dw-SNP(F/R)： 5-CTCTGCTTCTTCTGTTTGTGGT-3； 0015 5-ACATCTAGCCGGCCAGTG-3； 0016 一种检测矮化桃树的试剂盒， 含有SNP260k-2和SNP260k-13引物对。 0017 上述检测矮化桃树的试剂盒， 还含有YZ-dw-SNP(F/R)引物对。 0018 与桃矮化基因紧密连。
12、锁的SNP标记， 所获得的SNP标记引物为DwSNP-2F和DwSNP- 13F， 分别位于桃基因组(Version 2.0)Scaffold 6上28.1和29.2Mb处， 主要采用如下方法 得到： 0019 (1)花期前将05-2-144单株人工套布袋自交， 果实成熟后破核取种子， 将种子进行 包衣(包衣剂， 先正达)， 晾干后， 放于湿润的粗砂中置冷库中层积处理， 次年1月取出萌发的 种子， 种植于穴盘中用于表型观察。 0020 (2)对05-2-144单株后代实生苗株高进行目测观察， 区分普通型和矮化型幼苗分 开定植， 继续鉴定表型以确定分离比例； 0021 (3)参考桃基因组(Gen。
13、ome Database for Rosaceae数据库)序列， 采用 primer3Web Version 4.0(http:/primer3.ut.ee/)在Scaffold 1到8上设计引物， 引物退 火温度在60左右， 长度20-23bp， 约每1Mb设计1对引物， 扩增片段长度为约1600bp或 750bp， 用于开发基于Sanger测序的SNP标记； 0022 (4)基因组DNA的提取采用CTAB法， 略作修改； 0023 (5)基于Sanger测序法获得SNP标记， 并根据子代基因型和表型确定候选SNP标记， 并在杂交群体后代单株中进行序列测定， 进行初步定位； 0024 (6)。
14、在初步定位区间内， 对亲本进行深度测序， 根据基因型和表型开发更多的Aa基 因型的SNP标记， 后扩大分离群体， 开发紧密连锁的SNP标记， 并在其他杂交群体(10-7*96- 5-1)后代单株中进行验证， 以建立目标性状的分子辅助选种体系。 0025 有益效果： 本发明采用基于Sanger技术开发的第三代SNP的标记技术， 以构建的杂 交分离群体为研究材料， 采用图位克隆的方法， 初步定位目标基因。 基于二代测序技术在精 细定为区域内， 开发更多的基因型和表型一致的SNP标记， 继续精细定位以获得与目标性状 紧密连锁的标记。 由于研究的对象为桃矮化性状， 可依据获得的紧密连锁标记在含有矮化 。
15、基因的普通生长型桃中进行早期鉴定， 筛选亲本并应用于矮化观赏桃育种， 建立矮化性状 的分子标记辅助选种体系。 附图说明 0026 图1普通型桃植株表型图； 0027 图2矮化型桃植株表型图； 0028 图3 DNA琼脂糖电泳图(M1为DL 5000 DNA marker； M2为DL 15000 DNA marker， 1- 说明书 2/5 页 4 CN 106399538 A 4 9为部分提取DNA样品)； 0029 图4基于二代测序Aa基因型的SNP标记示意图； 0030 图5与目标性状紧密连锁的SNP标记SNP260k-2的测序峰图和SNP位点； 0031 图6与目标性状紧密连锁的SNP。
16、标记SNP260k-13的测序峰图和SNP位点。 具体实施方式 0032 实施例1 0033 (一)、 表型的鉴定 0034 将05-2-144自交后代桃核经自然干燥后用锤子将外壳敲开， 取种子进行包衣(包 衣剂， 先正达)， 晾干后， 放于湿润的粗砂中进行层积处理， 次年1月取出萌发的种子， 种植于 穴盘中用于表型观察。 0035 (二)、 杂交群体分离比例的鉴定 0036 通过对萌发后种子幼苗观察， 共得到293株自交后代单株， 其中普通型222株， 矮化 型71株， 二者比例接近3:1， P值为0.761， 符合孟德尔遗传规律， 矮化性状为隐性单基因控 制。 同时我们对定植后植株表型进行。
17、了再鉴定， 二者观察结果一致。 0037 (三)、 基因组DNA的提取， SNP标记的开发 0038 (1)基因组DNA的提取 0039 采用CTAB法提取桃叶片基因组DNA， 略作修改， 具体如下： (1)取新鲜的叶子， 放入 1.2ml96孔板中， 加入钢珠和液N2， 在磨样机中进行碾磨， 直至碾磨细粉状为止； (2)加入配 制好的CTAB液400 L， 进行1h长的65水浴， 其间约每10min轻摇匀； (3)加入氯仿和异戊醇 混合液， 体积比为24： 1， 直至2ml的离心管满载线， 后缓慢(防止剪裂)颠倒混匀10分钟。 放入 冷冻离心机(Eppendorf 5810R)4条件下， 4。
18、000rpm， 离心10分钟； (4)吸取上清液， 转入200 L的96孔PCR板， 加入等体积的预冷无水乙醇(混匀),于-20冰箱1小时； (5)将上述1.5ml 离心管放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R)， 4条件下， 4000rpm,离心10分钟， 弃上清液； (6)在带有沉淀的96孔PCR板中加入200 L的70的乙醇， 1000rpm瞬时离心， 洗涤沉淀2次， 加入无水乙醇洗涤沉淀一次， 后自然晾干； (7)在室温下自然风干沉淀后， 加入200 L体积的 0.1TE溶解沉淀DNA， 同时加入0.5 L的RNase， 37放置1h， 祛除RNA污染(长期保存在-20 冰箱,。
19、常用则存于4冰箱)； (8)采用NanoDrop 1000 spectrophotometer(Themo)和1 的琼脂糖胶对提取的DNA的纯度浓度和完整度进行检测， 并稀释成工作液浓度(25ng/ L)， 以用于后续研究。 0040 (2)基于Sanger测序SNP开发的引物设计 0041 参考桃基因组序列(Genome Database for Rosaceae数据库)， 采用primer3Web Version 4.0(http:/primer3.ut.ee/)设计引物， 引物退火温度在60左右， 引物长度20- 23bp， 开发基于Sanger测序的SNP标记， 选择每1Mb设计1对引。
20、物， 扩增片段长度约为1600bp 或750bp。 0042 (3)PCR反应体系以及SNP标记的获得 0043 PCR扩增体系总体积为40 L， 具体组分如下： 说明书 3/5 页 5 CN 106399538 A 5 0044 0045 混匀后， 在离心机(5810R， Eppendorf)离心， 并在PCR仪(Eppendorf)上进行扩增。 PCR扩增程序为953min； 9430s， 5630s， 7270s， 34个循环； 7210min。 0046 对父母本、 后代各两个单株进行PCR扩增， PCR产物送上海生工进行序列测定， 根据 测定序列信息在Contig软件中打开， 序列对。
21、齐后寻找多态性SNP标记。 0047 (4)基于二代测序SNP标记的开发 0048 构建好文库后对亲本05-2-144进行深度测序， 在仪器HiSeq 4000(Illumina， CA) 上进行， 测序深度约为60X。 在定位区域内采用Integrative Genomics Viewer 2.3(IGV)对 Bam格式数据进行分析， 确定目标区域内基因型为Aa的SNP， 以确定候选标记， 用于连锁SNP 标记的开发。 0049 (四)、 目标性状紧密连锁标记的开发与目标性状的定位 0050 根据表型鉴定结果， 我们在矮化和普通型各两个子代和亲本中寻找连锁的SNP标 记， 具体基因型表现为，。
22、 自交亲本05-2-144基因型为Aa， 矮化型子代基因型为aa， 普通型子 代基因型为AA和Aa， 在4个子代中获得连锁的SNP标记后， 扩大至分离后代各20个单株中， 确 定连锁后进一步扩大至全部样品中， 完成初步定位。 同时结合亲本二代测序结果开发的SNP 标记， 在群体所有后代单株中进行SNP分析， 确定交换单株获得紧密连锁的SNP标记。 0051 (五)、 基于分子标记的植株表型鉴定 0052 根据已经获得的紧密连锁的SNP标记的物理位置， 参考桃基因组数据在新的亲本 (10-7*96-5-1)中开发基因型和表型一致的SNP标记(YZ-dw-SNP F/R)。 即在同一位点， 双亲 。
23、基因型均为Aa， 目的是利用分子标记对杂交后代单株的表型进行鉴定。 通过标记基因型和 表型比较， 显示验证符合率为100。 0053 表1本发明所采用紧密连锁SNP标记的引物信息 说明书 4/5 页 6 CN 106399538 A 6 0054 说明书 5/5 页 7 CN 106399538 A 7 SEQUENCE LISTING 中国农业科学院郑州果树研究所 与桃树矮化基因紧密连锁的SNP标记的应用 8 PatentIn version 3.3 1 390 DNA 人工序列 1 tttcttcctg gaaaacacgt tgagctttta ttgcagttaa atcgtacata。
24、 ttgcagtttg 60 cagtggcctg aattactgta gtaacatact cttaaagtag aagtgaaaaa ttgtcttact 120 ggcagtagat tctatgctga gaaaattctc agctagatga aaatgttgaa ggtaaattag 180 ataaggaaaa gcatacaagt tccaccggat aaagaactca actggatata atacatggca 240 gtggattata aatacaaggg ccaacttaag agggactaaa agtgctaaaa atcagacacc 300 aactc。
25、atcaa ccaaagaatt tagtatctcc ttctcaatct ctagaccctc ctcaaatgtt 360 tcaatgtcga agtcaagcca tctcccatga 390 2 176 DNA 人工序列 2 gtattttttg aatagacata agcattatca tctatagaaa atagaattta ttctcaggca 60 ggaaataaaa acttcaaata aaagcaagga gaactacgtt gaaaataagt aagttacttg 120 gtgttttctc tagggggtag gcgattattc aacacgcaa。
26、t cgagacacca ccaaga 176 3 21 DNA 人工序列 3 agggtttcat ggcgttaaag c 21 4 22 DNA 人工序列 4 aaactgaact gctcttccac gg 22 序列表 1/2 页 8 CN 106399538 A 8 5 20 DNA 人工序列 5 cttttctccg ccgcgttaat 20 6 20 DNA 人工序列 6 cccgggatgt gacaatttgg 20 7 22 DNA 人工序列 7 ctctgcttct tctgtttgtg gt 22 8 18 DNA 人工序列 8 acatctagcc ggccagtg 18 序列表 2/2 页 9 CN 106399538 A 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 10 CN 106399538 A 10 图4 图5 说明书附图 2/3 页 11 CN 106399538 A 11 图6 说明书附图 3/3 页 12 CN 106399538 A 12 。