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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610819451.7 (22)申请日 2016.09.12 (71)申请人 中国海洋大学 地址 266003 山东省青岛市崂山区松岭路 238号 (72)发明人 汪波张全启王慧贞杨帆 齐洁王志刚王旭波于海洋 贺艳刘金相 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 曾庆国 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方 法 (57)摘。
2、要 本发明提供一种建立稳定转基因的牙鲆胚 胎细胞株方法， 是把牙鲆广泛表达的-actin启 动子启动的增强型绿色荧光蛋白且能表达G418 抗性蛋白的质粒转染牙鲆胚胎细胞。 24h后,荧光 显微镜下观察EGFP表达， 并通过G418筛选得到稳 定遗传表达的胚胎细胞。 本发明方法可将在牙鲆 中广泛表达的 actin启动的外源基因有效转 入牙鲆胚胎细胞， 并且可以在牙鲆胚胎细胞中稳 定遗传表达， 为鲆鲽鱼类基因研究提供了一种新 的方法， 解决了因鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低 而难以进行细胞水平基因功能分析研究的问题， 为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的 技术手段， 提供了用于使海水鱼类细胞系稳定。
3、遗 传转基因方法。 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 附图3页 CN 106399370 A 2017.02.15 CN 106399370 A 1.一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法， 其特征在于， 所述的方法包含如下的 步骤： 1)转基因载体构建： 应用无启动子的pEGFP-1质粒体作为载体， 在外源基因之前插入 -actin基因启动子构 建成转基因质粒； 2)制备脂质体和外源DNA质粒复合物： 将阳离子脂质体溶液与目的转基因质粒溶液混合制成脂质体和外源DNA质粒复合物； 3)转染牙鲆胚胎细胞： 待牙鲆胚胎细胞汇合度达7080时， 把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到细胞 培养基。
4、中对牙鲆胚胎细胞进行转染； 4)G418筛选牙鲆阳性胚胎细胞： 转染24h后用一定浓度的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选， 之后更换 为含有G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤2)中细胞转染中阳离子脂质体溶 液与目的质粒溶液的体积比为1822:1。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤4)中用一定浓度的G418对荧光检 测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选， 是用浓度为600 g/m L的G418对荧光检测呈阳性的牙 鲆胚胎细胞进行筛选。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤4)中含有。
5、G418的DMEM/F12对阳性 细胞进行富集， 是使用含有300 g/mL G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106399370 A 2 一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法 技术领域 0001 本发明属于海洋鱼类遗传学技术领域， 具体涉及一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎 细胞株方法。 背景技术 0002 细胞转染指真核细胞由于外源DNA或RNA掺入而获得新遗传标志的过程。 在研究基 因功能、 调控基因表达、 突变分析和蛋白质生产等生物学试验中， 其应用越来越广泛。 迄今 为止， 多种外源基因转染细胞的方法已被开发。 主要包括以病毒介导的外源基因。
6、转染细胞 方法和非病毒介导的细胞转染方法。 以上方法在植物和哺乳动物上已成功建立多种稳定遗 传表达的细胞株。 0003 然而， 在牙鲆等海水鱼类中高效的细胞转染方法目前尚未见报道， 在海水鱼细胞 中建立稳定转基因的细胞株更是很少涉及， 这已成为在细胞水平上分析和研究海水鱼类基 因功能的主要瓶颈之一。 因此， 探究海水鱼类中高效的细胞转染方法， 建立稳定遗传的海水 鱼类细胞株， 对于研究海水鱼类基因功能分析等至关重要。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法， 即利用脂质 体和外源DNA质粒形成复合物进行转染细胞， 再利用G418对转染后的细胞进行筛选， 。
7、从而获 得可稳定遗传的转基因细胞株。 0005 1)转基因载体构建： 0006 应用无启动子的pEGFP-1质粒体作为载体， 在外源基因之前插入 -actin基因启动 子构建成转基因质粒； 0007 2)制备脂质体和外源DNA质粒复合物： 0008 将阳离子脂质体溶液与目的转基因质粒溶液混合制成脂质体和外源DNA质粒复合 物； 0009 3)转染牙鲆胚胎细胞： 0010 待牙鲆胚胎细胞汇合度达7080时， 把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到 细胞培养基中对牙鲆胚胎细胞进行转染； 0011 4)G418筛选牙鲆阳性胚胎细胞： 0012 转染24h后用一定浓度的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎。
8、细胞进行筛选， 之后 更换为含有G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集； 0013 所述的步骤2)中细胞转染中阳离子脂质体溶液与目的质粒溶液的体积比为22:1。 0014 所述的步骤4)中600 g/m L的G418为筛选牙鲆胚胎细胞的最佳浓度； 使用含有300 g/mL G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。 0015 本发明方法可将在牙鲆中广泛表达的 actin启动的外源基因有效转入牙鲆胚胎 细胞， 并且可以在牙鲆胚胎细胞中稳定遗传表达， 为鲆鲽鱼类基因研究提供了一种新的方 说明书 1/3 页 3 CN 106399370 A 3 法， 解决了因鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低而难。
9、以进行细胞水平基因功能分析研究的问 题， 为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术手段， 提供了用于使海水鱼类细胞 系稳定遗传转基因方法。 附图说明 0016 图1： 本发明构建的质粒图谱， 0017 图2： G418浓度的筛选图， 其中A J分别为用含有0、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900 g/mL G418的DMEM/F12处理两周的结果； 0018 图3： 转染24h后荧光结果图； 0019 图4： G418筛选后荧光结果图； 0020 图5： 传代两个月稳定表达绿色荧光蛋白的牙鲆胚胎细胞图； 0021 图6： DNA检测结果图。
10、。 0022 具体实施方法 0023 申请人在长期的研究中发现， 使用核苷酸序列为SEQ ID NO:1的启动子， 可以使外 源基因在牙鲆鱼的胚胎细胞中高效表达； 并对转染和筛选的方法进行了优化， 最终获得了 本发明。 0024 1.外源质粒的构建 0025 1)在绿色荧光蛋白(EGFP)之前插入牙鲆鱼的 -actin基因启动子(SEQ ID NO:1) 构建成转基因质粒， 在牙鲆 -actin启动子基因上设计一对两端带有限制性内切酶位点的 PCR引物， 其中5 和3 引物上加入了一个Hind和Kpn 的酶切位点， 进行PCR。 其引物如下： 0026 5 -primer:5 -CCCAAGC。
11、TTCGCGTCGTGCCCCAGTGT 0027 3 -primer:3 -CGGGGTACCGGCTGAACTGCAGAGAGGAGAGA 0028 PCR反应程序如下： 95预变性5min， 95变性30sec， 68退火30sec， 72延伸 2min， 循环40次， 72后延伸10min。 0029 2)利用胶回收试剂盒(TM16090646)回收扩增的P.O -actin启动子片段， 连接在 pMD19-T载体上， 利用氨苄抗性筛选带有目的片段的阳性菌。 0030 3)利用限制性内切酶Hind和Kpn 分别切开带有牙鲆 -actin启动子基因的质粒 和带有EGFP绿色荧光的质粒， 。
12、并使用胶回收试剂盒(TM16090646)回收切开的质粒片段； 0031 4)使用T4连接酶将牙鲆 -actin启动子基因片段和带有EGFP绿色荧光的质粒链接 起来， 构建成转基因的外源DNA质粒(图1)。 0032 2.确定G418筛选牙鲆胚胎细胞的最佳浓度 0033 1)所用细胞为实验室培养的牙鲆胚胎细胞， 已稳定传至135代。 培养液为DMEM/ F12。 0034 2)在细胞汇合度达7080时， 用1m L 0.25胰酶消化贴壁牙鲆胚胎细胞， 在 显微镜检测约70细胞悬浮时， 用等体积血清终止反应并收集细胞； 然后按1 2的比例进行 传代培养， 选取生长均一稳定的细胞进行转染、 筛选实。
13、验。 0035 3)取牙鲆胚胎细胞以1.0105个/孔接种于12孔板,每3孔为1组,加入DMEM/F12培 养24h后， 分别更换含有0、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900 g/m LG418的DMEM/ F12， 每隔3d换含有相同浓度G418的培养液1次。 说明书 2/3 页 4 CN 106399370 A 4 0036 4)连续在显微镜下检测两周， 用G418筛选6d后细胞开始有大量死亡， 两周左右全 部死亡为筛选标准,选取达此标准的最小G418浓度为筛选牙鲆胚胎细胞的最佳浓度。 0037 5)通过以上方法的筛选,发现在G418的浓。
14、度600 g/m L以下的培养皿中浓度越低 存活的细胞越多； G418的浓度在600 g/m L以上的培养皿中胚胎细胞接近全部死亡， 并且浓 度越高， 牙鲆胚胎细胞存活时间越短。 最终选择600 g/m L的G418为筛选牙鲆胚胎细胞的最 佳浓度(见图2)。 0038 3.制备脂质体和外源DNA质粒复合物 00391)吸取3ul3000试剂加入50ul的培养基中充分混 匀； 00402)吸取1ug的外源DNA质粒试剂加入50ul的培养基中稀释DNA， 制备 DNA预混液， 然后添加2ul的P3000TM试剂充分混匀； 00413)把已稀释的3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)； 然后迅。
15、速 吹吸混匀， 室温孵育5分钟即可形成脂质体 DNA复合物。 0042 4.转染牙鲆胚胎细胞 0043 1)取牙鲆胚胎细胞以1.0105个/孔接种于12孔板， 待细胞融和度达80时， 按照 3000转染试剂说明书进行对牙鲆胚胎细胞转染。 0044 2)将脂质体 DNA复合物缓缓加入细胞培养基中孵育6h,更换为含10FBS的DMEM 培养液培养， 12d后,荧光检测转染效率为20(见图3)。 0045 5.G418筛选牙鲆阳性胚胎细胞 0046 1)对转染后检测具有绿色荧光的培养孔， 应用600 g/m L的G418进行筛选， 每隔3d 换含有相同浓度G418的培养液1次， 筛选15天左右， 荧。
16、光倒置显微镜下观察,可见阴性对照 细胞几乎全部死亡(见图4)。 0047 2)之后更换为含有300ug/mL G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集， 同2)在富集 的过程中每隔3d换含有相同浓度G418的培养液1次， 进而获得大量能够稳定表达绿色荧光 的牙鲆胚胎细胞。 0048 6.外源基因整合检测 0049 1)对富集的牙鲆阳性细胞进行正常传代培养， 传至20代， 约两个月的时间(每隔3 天传一代)， 荧光检测仍能看到很亮的荧光(见图5)， 说明外源EGFP已经能在牙鲆胚胎细胞 中稳定的表达。 0050 2)针对转基因质粒的 actin启动子区和EGFP基因区设计特异性PCR引物， 。
17、提取筛 选出来的阳性细胞株DNA做模板， 进行PCR扩增， 能扩增出质粒上的特异性片段， 从基因层面 说明外源EGFP可以在牙鲆胚胎基因中稳定存在(见图6)。 0051 通过以上检测说明通过本方法成功构建出稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株。 说明书 3/3 页 5 CN 106399370 A 5 0001 序列表 1/2 页 6 CN 106399370 A 6 0002 序列表 2/2 页 7 CN 106399370 A 7 图1 图2 说明书附图 1/3 页 8 CN 106399370 A 8 图3 图4 图5 说明书附图 2/3 页 9 CN 106399370 A 9 图6 说明书附图 3/3 页 10 CN 106399370 A 10 。