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用于高通量核酸分析的珠子
    【技术领域】

    本发明涉及核酸分析领域，具体来说是小型化的、高度平行的核酸序列检测以及核酸序列差异分析。

    本发明基于如下想法：提供固体支持物，其结合有序列特异性引物，所述引物的一种是可裂解的，另一种是不可裂解的，从而分析特定序列或检测SNP、突变或任何所关注的特定DNA或RNA物质的存在。

    背景技术

    最近，公开了一种基于焦磷酸盐测序的超高通量的测序系统，该系统使得能够基本上在不大于一周的时间对细菌基因组进行测序(WO 04/70007；WO 05/03375；Margulies，M.，等人，Nature 437(2005)376-80)。由剪切的基因组DNA开始，单分子片段结合至珠子，该珠子被捕获在油中的PCR反应混合物乳液中。然后，扩增得到克隆扩增的DNA的文库，其中各珠子携带多拷贝的相同片段。

    在乳液破乳(breakage of the emulsion)和PCR产物变性成单链之后，将珠子沉积在光纤皮可滴定板(picotiter plate)的多个孔内，使得一个孔中携带不大于一个的珠子。然后，在通过合成反应进行的测序中，进行引物延伸反应，其中在一连串的反复事件中提供4种不同的A、G、C和T三磷酸核苷或它们各自的类似物，新生链的序列由通过DNA聚合酶催化的延伸反应所衍生的化学产物来推断。具体而言，通过合成反应进行的测序是焦磷酸盐测序反应，其特征在于如下检测焦磷酸盐的生成：

    PPi+腺苷5’磷酸硫酸酯(phosphosulfate)(APS)→ATP，在腺苷三磷酸双磷酸酶(Apyrase)的存在下催化

    ATP+萤光素→光+氧化萤光素，在萤光素酶存在下催化检测氧化萤光素的发光

    使用WO 04/70007和WO 05/03375中所公开的超高通量测序系统，可以同时进行大于1 000 000个的焦磷酸盐测序反应。焦磷酸盐的产生触发发光反应级联，最后用CCD相机检测光。

    关于此技术，WO 04/69849公开了一种在单个反应管中以快速和经济的方式扩增多种核酸的方法(例如，DNA文库、转录组、基因组的各序列)。更具体地，WO 04/69849公开了在一个反应容器中同时进行多个样品(多至几十万)的克隆扩增(例如，通过PCR)。在这方面，WO 04/69849提供了如下的方法：将多个DNA样品各自封装在乳液微胶囊(即，微反应器)中，同时进行多个封装的核酸样品的扩增，从微胶囊释放所述扩增的多种DNA以用于随后的反应。例如，使单拷贝的(各)核酸模板物质杂交到捕获珠子上，所述珠子包含：例如，与核酸模板结合的化学基团或捕获寡核苷酸。将珠子悬浮在完全扩增溶液中，进行乳化以产生微反应器(直径通常为100至200微米)。此后，利用扩增(例如，PCR)来克隆增加微反应器中初始模板物质的拷贝数，这些拷贝结合在微反应器中的捕获珠子上。或者，将捕获珠子添加到包含核酸模板的扩增反应混合物中，将此混合物乳化以产生微反应器。利用扩增(例如，PCR)来克隆增加微反应器中初始模板物质的拷贝数，这些拷贝结合在微反应器中的捕获珠子上。因此，根据WO 05/03375的微反应器使得能够同时克隆和离散扩增许多不同模板而不会交叉污染扩增的产品或试剂或使一种特定的模板或模板组占主导(例如PCR偏向)。

    然而，根据WO 05/03375，需要进行衔接子连接步骤，其中用衔接子序列标记多种不同的核酸分子，该衔接子序列随后可与具有共价连接的互补衔接子序列的珠子结合。

    另一重要的DNA分析技术是分析型聚合酶链式反应(PCR)。然而，目前的PCR定量是基于类似(analogous)测量模式。但是在一些情况下，在诸如下列领域非常需要数字计数原理：

    -癌症检测：在过量的野生型背景中进行的突变体等位基因定量

    -等位基因失衡检测

    -稀有转录本和/或转录本中突变体等位基因的基因表达

    -病毒检测和定量

    因此，DNA/cDNA/mRNA的数字计数的可用性解决了分子医药中未解决的需求，例如，癌症诊断的高度相关性、循环肿瘤细胞、出生前胚细胞，其中具体事件需要在高背景中检测。

    因此，本发明的一个目的是提供同时分析多种核酸分子的改良方法和改良试剂。

    在具体方面，本发明的目的是提供一种固体支持物或多种固体支持物，其可用于改善上述测序流程或能够进行数字PCR计数。

    本领域内已经熟知了多种包含固定的核酸的固体支持物，如包含固定的寡核苷酸的珠子。这些珠子的准确设计和构造取决于使用它们的应用：G.Steinberg-Tatman等人(Bioconjugate Chemistry 2006，17，841-848)描述了合成具有两种不同的寡核苷酸的珠子的方法，所述寡核苷酸经由不可裂解的接头连接在珠子表面。一种寡核苷酸用作序列特异性捕获探针，另一种作为解码序列。

    US 5639603描述了具有一种或多种固定的寡核苷酸解码标签的珠子。

    Xu，X.等人(Journal of the American Chemical Society 128(2006)9286-9287)描述了具有两种不同寡核苷酸的金粒，这两种寡核苷酸连接在金粒表面上用于构建规则的多粒子纳米结构。

    WO 2001062982和US 5641 658描述了在具有两种固定的引物的珠子表面进行的PCR。该PCR方法称为桥式扩增。

    WO 2001012862描述了用于通过裂解经由不同的可裂解接头连接在基质上的不同寡核苷酸产生寡核苷酸库的方法。

    WO 2007111937描述了引物对阵列，其中至少一种引物经由可裂解键连接在所述阵列上，该引物对阵列用于在测序中富集基因组DNA。

    KR 2007044677描述了用于乳液PCR的珠子，其具有第一和第二固定的PCR引物。第一引物是不可裂解的。通过改变pH值实现第二引物的释放。然而，改变pH值具有如下缺点：可能产生不期望的副反应，而且还会使样品的进一步处理更困难。

    【发明内容】

    因此本发明涉及固体支持物，所述固体支持物包含至少两种序列特异性扩增引物，其中至少一种引物经由可诱导裂解的接头结合到所述支持物。在本发明上下文中的可诱导裂解(inducible cleavable)是指可以通过提供外部刺激而触发裂解，该外部刺激会引起立即且基本上完全的裂解反应。优选地，所述可裂解的接头是光可裂解的接头。

    在第一主要实施方式中，所述固体支持物为珠子。根据本发明的这种珠子由选自下列的材料构成：硅、二氧化钛、氧化铝、镧系元素氧化物、玻璃、硅酸盐、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖和聚酰胺。珠子由一种纯的材料构成或由两种或更多种材料构成，其中所述两种或更多种材料以类似芯壳粒子的有序方式混合或组装。珠子的表面以使得可以连接寡核苷酸的方式进行官能化。

    在第二主要实施方式中，本发明涉及上述珠子的文库。

    优选地，经由可裂解接头结合至珠子的多种引物的各成员携带不同的可检测标记或多种标记的独特(unique)混合物。

    在第三主要实施方式中，固体支持物为包含多个孔的微量滴定板或皮可滴定板(PTP)，其特征在于多个所述孔包括具有至少两种序列特异性扩增引物的表面，其中至少一种引物通过可裂解接头结合至接头所述支持物。

    此外，本发明涉及制备任何上述固体支持物的方法。

    具体地，本发明涉及制备固体支持物优选珠子的方法，所述固体支持物或珠子包含至少两种序列特异性引物，其特征还在于至少一种所述引物是可裂解的，所述方法包括下列步骤：

    -提供携带至少一种或多种官能团的固体支持物，和

    -使所述一种或多种官能团与两种序列特异性引物的一种或多种反应性基团反应。

    其中，可裂解的反应性部分存在于连接所述固体支持物与其官能团或其官能团之一的间隔子之一中，或所述可裂解部分存在于连接所述序列特异性引物之一与其反应性基团的间隔子之一中。

    在第一实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供包括两种官能团的固体支持物，所述两种官能团各携带不同的保护基团；

    -使第一官能团去保护，使所述基团与第一引物的反应性基团反应；以及

    -使第二官能团去保护，使所述珠子的所述基团与第二引物的反应性基团反应。

    所述两种官能团经由两个独立的接头连接至珠子，但是在特别的实施方式中，所述两种官能团经由双臂接头连接至珠子。

    在第二实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供只携带一种官能团的固体支持物；

    -使所述官能团去保护；以及

    -使所述基团与第一和第二序列特异性引物的混合物反应，所述第一和第二引物包含相同的反应性基团。

    其特征在于至少一种所述引物经由可裂解部分连接至其反应性基团。

    在第三实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供只携带一种官能团的珠子；以及

    -使所述官能团去保护，使所述基团与寡核苷酸反应，所述寡核苷酸代表通过可裂解部分连接的第一和第二扩增引物。

    在第四实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供携带经保护的OH基团的珠子，所述OH基团经两种不同的正交(orthogonal)保护基团保护，

    -裂解掉所述正交保护基团中的一种，在珠子上合成第一引物，

    -裂解掉所述正交保护基团中的第二种，在珠子上合成第二引物。

    如本领域技术人员已知的，正交保护基团可以依据所应用的条件选择性地去除。

    【附图说明】

    图1图1示出了基于引物的分析原理，所述引物对靶核酸具有特异性并固定于编码的(coded)固体载体(例如珠子)上。固定的(stationary)引物1用于靶标捕获，而引物2则从载体光裂解掉，从而驱动乳液中捕获的靶标的PCR克隆扩增。

    图2 图2示出了N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)结合化学，其中Rx＝1表示光可裂解引物，Rx＝2为固定引物。

    图3A-B 图3A中的吸光度测量表明荧光素修饰的寡核苷酸探针(序列ID#1)当从琼脂糖珠子上光裂解掉时的溶解。

    图3B中的流式细胞测量显示了光裂解，该光裂解由与荧光素修饰的寡核苷酸探针(序列ID#1)结合的琼脂糖珠子在悬浮液或乳液中经受光裂解反应时(发生)的荧光强度降低所指示。

    图4 图4示出了限制性内切酶分析，该分析用于检测常规PCR产物和固定于携带固定和光可裂解引物(序列ID#2、3)的珠子上的PCR产物。

    图5 图5显示在常规PCR后或用在悬浮液中固定在珠子上的引物(序列ID#2、3)进行PCR后所获得的双链DNA的凝胶电泳检测和鉴别。

    图6 图6显示在常规PCR后或用在乳液中固定在珠子上的引物(序列ID#2、3)进行PCR后所获得的双链DNA的凝胶电泳检测和鉴别。

    图7 图7经由限制性内切酶处理和凝胶电泳表明可以用乳液PCR和珠子固定的引物(序列ID#4、5)使用HeLa cDNA或扩增子作为模板获得特异性PCR产物。

    图8 图8示出了限制性内切酶分析，该分析检测在多重PCR之后固定于携带固定引物和光可裂解引物(序列ID#4-9)的一组不同珠子上的PCR产物。

    图9A-B 图9A和B中的电泳图显示在悬浮液和乳液中用一组不同珠子固定的引物(序列ID#4-9)进行的多重PCR之后所获得的双链DNA的检测和鉴别。

    【具体实施方式】

    因此本发明涉及固体支持物，其包含至少两种序列特异性的扩增引物，其中至少一种引物经由可诱导裂解的接头结合到所述支持物。

    具体地，如果所述固体支持物为珠子，则根据本发明的这种珠子尤其可用于通过如下方式分析核酸的方法：使所述核酸与包含一对捕获引物的多个珠子接触，随后进行扩增。一般而言，根据本发明的方法包括如下三个阶段：

    -通过将靶DNA递送给携带各单独序列特异性捕获分子的珠子而选择所关注的一种序列或序列混合库。

    -从统计学上讲每个珠子捕获1个靶分子

    -通过PCR扩增；携带对扩增的基因特异性的材料的珠子数目与序列特异性靶分子数目成比例。

    因此，本发明提供了高度平行和小型化的核酸分析的可能性，并且包括下列应用：例如，定性和/或定量检测所关注的基因、基因表达分析、突变检测，但是并不限于此。

    在本发明上下文中，应使用下列定义。

    “多种核酸分子”应理解为分子群，其特征在于代表至少两种不同的核酸序列。在大多数情况下，代表很多种不同的序列。

    “多个珠子”理解为数目大于1000，优选大于10 000，最优选大于100 000个珠子。

    “序列特异性扩增引物对”理解为两个寡核苷酸分子，它们一起可作为扩增引物对，其方式是在核酸扩增反应期间产生预定长度的扩增产物。

    “可裂解的接头”理解为包含化学键合的化学实体，其在特定的处理后可以分解而分子的剩余部分保持完整。优选地，可裂解接头为“可诱导裂解的接头”，其定义为可以通过提供外部刺激而分解的可裂解接头。可诱导裂解接头的典型实例为光可裂解的接头，其中所述键合通过用指定波长的光处理而分解。

    “捕获”理解为(i)核酸分子群与特定核酸序列杂交，所述特定核酸序列固定于诸如珠子的固体支持物上，且所述特定核酸序列与可存在于所述核酸分子群内的所关注序列至少部分互补，以及(ii)从所形成的杂交复合体上除去未杂交的核酸分子。

    “克隆分离”理解为使多个珠子彼此分离以使各单个珠子位于不同的位置。优选地，此位置为微孔(microwell)或皮可孔(picowell)。

    “克隆扩增”理解为核酸分子群以这样的方式扩增：由不同来源的靶分子产生的扩增产物物理上彼此分离。例如，由相同来源的靶核酸分子产生的所有扩增产物可固定于胶束(micelle)封装的珠子上。

    本发明内容中的“乳液”理解为油包水乳液，其特征在于包含单个珠子的小的亲水液滴包裹在由亲脂液体环绕的胶束中。

    “通过合成测序”理解为测定在引物延伸反应期间，是否掺入了特定的三磷酸核苷，其本身在随后的引物延伸反应步骤中可被延长。

    “经受热梯度”理解为加热或冷却所关注的样品，由第一指定温度开始，在第二指定温度结束。梯度可以是连续梯度，其优选为线性的；或者是阶梯式。如果PCR产物或核酸探针与靶分子的杂交物经受这种梯度，则可以进行熔化曲线分析或监测杂交的温度依赖性。

    “实时PCR”理解为具有如下特征的聚合酶链式反应：扩增反应的进程在一个扩增循环内监测至少一次。优选地，用嵌入的荧光染料或者用如下的扩增子特异性核酸杂交探针监测扩增：例如，5’核酸酶TaqMan探针、分子信标(Molecular Beacon)探针、或FRET杂交探针对。

    “淬灭”理解为降低荧光化合物的荧光发射，该荧光发射是由空间上临近所述荧光化合物的第二化学实体引发。

    “定量突变分析”裂解为包括下列步骤的方法：(i)筛选序列基本上相同的多种核酸分子的序列变异；和(ii)测定至少一种或几种此类序列变异存在于所述多种核酸分子中的(一种或多种)比率。例如，此序列变异可以是单核苷酸多态性。

    制备根据本发明的固体支持物

    本发明需要：第一序列特异性扩增引物经由柔性的可裂解接头分子与固体支持物进行可逆的共价连接，以使得该引物能够杂交到靶分子并被释放到溶液中，以进行靶标扩增和检测；而第二序列特异性扩增引物则在裂解条件下保持共价连接在表面上。可裂解接头分子可以通过酸、碱、光或本领域熟练的技术人员所熟知的任何其他方式裂解。优选地，只有一种引物经由可裂解接头结合到珠子。

    在固体支持物为一个或多个珠子时，所述珠子具有约10μm至约250μm的平均尺寸。优选地，珠子具有约20至约100μm的平均直径。高度优选地，珠子具有约30μm至80μm的平均直径。例如，珠子可以具有约40μm的平均直径。

    两种引物所连接的珠子的材料必须对氧化和水解是稳定的，可以是无机的，例如，硅或二氧化钛或氧化铝或玻璃；或有机的，例如，聚苯乙烯、纤维素、聚酰胺以及其他。珠子是一种纯的材料或由两种或多种材料构成，其中所述两种或多种材料以类似芯壳粒子的有序方式混合或组装。

    珠子表面可以是多孔的或平坦的。珠子的表面以使得寡核苷酸可以连接的方式进行官能化。因此，珠子表面具有包含如下等官能团的官能化表面：氨基-、巯基-、羧基-、马来酰亚胺基-、叠氮基-、炔基-、肼-、羟氨基-、酮-和醛-基团、三吖嗪氯(triazinchloride)-、醌-、二烯-、或本领域熟练的技术人员所熟知的其他反应性官能团。

    引物的对应官能部分可以选自：羧基-、醛-、叠氮-、炔基-、氨基-、巯基-、马来酰亚胺基-、磺酰烯基-、碘乙酰基-、氨基肼-、羟氨基-、以及马来酰亚胺基-。

    更准确地，寡核苷酸的相应修饰由表面官能团确定，反之亦然，如下表所示：

    表1

       寡核苷酸的官能团  珠子上所需的官能团  氨基  羧基或醛  炔  叠氮  叠氮  炔  肼或羟氨基  醛、酮或羧基  三吖嗪氯  氨基或巯基  巯基  马来酰亚胺基、磺酰烯或碘乙酰基  醛或酮  氨基肼基、羟氨基

       寡核苷酸的官能团  珠子上所需的官能团  醌  氨基  二烯  马来酰亚胺

    官能团通过例如用改性的硅烷硅烷化玻璃、硅酸盐、镧系元素氧化物(glass-silicacte lanthanide-oxides)来掺入表面；或者珠子自身含有已有(priori)官能团，这些官能团是在珠子制备期间产生的，例如通过聚苯乙烯和适宜的含官能团的烯烃共聚而产生。先前已存在的官能团可以通过使用异双官能团接头转化成另一官能团。此接头可以为可裂解的或不可裂解的。通过此方法，可以制造具有不同正交官能的珠子。

    正交是指在第二官能团存在下，第一官能团与第一修饰的寡核苷酸反应，第二官能团同时与第二修饰的寡核苷酸反应。一对这种官能团是琥珀酰氨基羧基和炔基，它们需要氨基和叠氮基修饰的寡核苷酸。

    通过使用正交保护基团，两种不同的寡核苷酸与相同类型的表面官能团相继连接(G.Steinberg-Tatman等人Bioconjugate Chemistry2006，17，841-848)。

    如果珠子是金粒或珠子涂覆有金属膜，例如涂覆有金，则巯基修饰的寡核苷酸直接与该表面反应。

    将引物共价结合至固体支持物的一般方法在本领域中是熟知的。例如，首先由标准的氨基磷酸酯化学法合成引物寡核苷酸。这种合成引物可以在寡核苷酸合成期间或寡核苷酸合成之后进一步用可裂解接头分子修饰。可裂解引物和不可裂解引物的连接可以通过微阵列技术的文献中所描述的多种熟知的连接化学法中的任何方法或其他任何已知方法达成。实例公开并综述于：

    -Wittebolle，L.等人，Journal of Chemical Technology and Biotechnology 81(2006)476-480；

    -Steinberg，G.等人，Biopolymers 73(2004)597-605；

    -Di Giusto，D.A.等人，Topics in Current Chemistry 261(2005)131-168；

    -Zatsepin，T.S.等人，Bioconjugate Chemistry 16(2005)471-489。

    根据本发明的固体支持物且优选珠子包含至少两种序列特异性引物，其中至少一种所述引物是可裂解的，所述固体支持物且优选珠子以一种新的不可预测的方式来制备，所述方式组合了固相化学和寡核苷酸合成的不同步骤，固相化学和寡核苷酸合成作为单一的步骤本身在本领域是已知的。因此根据本发明的固体支持物通过包括下列步骤的方法制备：

    -提供携带至少一种或多种官能团的固体支持物；和

    -使所述一种或多种官能团与两种序列特异性引物的(一种或多种)反应性基团反应。

    其中，可裂解的反应性部分存在于连接所述固体支持物与其官能团或其官能团之一的间隔子之一中；或所述可裂解部分存在于连接所述序列特异性引物之一与其反应性基团的间隔子之一中。

    有至少6种替代方式制备此种固体支持物：

    (i)在第一实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供包含两种独立官能团的固体支持物，所述两种官能团各携带不同的保护基团；

    -使第一官能团去保护，使所述基团与第一引物的反应性基团反应，所述引物的特征在于其在其反应性基团和自身的核苷酸序列之间携带可裂解部分，

    以及

    -使第二官能团去保护，使所述珠子的所述基团与第二引物的反应性基团反应。

    (ii)在第二实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供包含两种独立官能团的固体支持物，所述两种官能团各携带不同的保护基团，其中所述官能团之一经由可裂解部分连接至固体支持物；

    -使第一官能团去保护，使所述基团与第一引物的反应性基团反应；以及

    -使第二官能团去保护，使所述珠子的所述基团与第二引物的反应性基团反应。

    (iii)在第三实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供包含两种官能团的固体支持物，所述两种官能团各携带不同的保护基团，所述官能团经由分支的接头连接至固体支持物，

    -使第一官能团去保护，使所述基团与第一引物的反应性基团反应，所述引物的特征在于其在其反应性基团和自身的核苷酸序列之间携带可裂解部分，

    以及

    -使第二官能团去保护，使所述珠子的所述基团与第二引物的反应性基团反应。

    (iv)在第四实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供包含两种官能团的固体支持物，所述两种官能团各携带不同的保护基团，所述官能团经由分支的接头连接至固体支持物，其中所述官能团之一经由可裂解的部分连接至固体支持物，

    -使第一官能团去保护，使所述基团与第一引物的反应性基团反应；以及

    -使第二官能团去保护，使所述珠子的所述基团与第二引物的反应性基团反应。

    (v)在第五实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供只携带一种官能团的固体支持物；

    -使所述官能团去保护；以及

    -使所述基团与第一和第二序列特异性引物的混合物反应，所述第一和第二引物包含相同的反应性基团，

    其特征在于至少一种所述引物经由可裂解的部分连接至其反应性基团

    (vi)在第六实施方式中，根据本发明的方法包括下列步骤：

    -提供只携带一种官能团的珠子；以及

    -使所述官能团去保护，使所述基团与寡核苷酸反应，所述寡核苷酸代表通过可裂解部分连接的第一和第二扩增引物。

    可以使用不同类型的接头来制备根据本发明的珠子。可以使用氨基修饰的接头、生物素修饰的接头(可用于将氨基或生物素连接到寡核苷酸的末端)、内部光可裂解接头(可以与任何其他修饰物(modifier)组合使用)。

    可裂解接头是本领域内所熟知的，可以分为两类。第一类需要反应性物质(如，还原性物质或OH-或H+)以达成裂解。实例为二硫桥，其可以通过用硫醇还原来裂解；或碱不稳定的“接头”，如掺入寡核苷酸末端的RNA单体。第二类通过物理方法裂解，例如，通过辐照如光照或加热。

    光可裂解接头是其中共价键通过用光辐照而破坏的接头。必须以所连接的寡核苷酸的核苷碱基不吸收的方式选择辐照波长以便避免诸如T-T二聚体形成或光氧化之类的副反应。如果有机染料连接在珠子上，例如在检测探针内，则辐照波长不应符合此染料的吸收波长。

    通常适宜的光可裂解接头源自例如邻硝基苄基醇，它们是文献中所熟知的。光裂解通过用波长大于340nm的紫外光辐照来达成。

    光可裂解接头可以在寡核苷酸合成期间引入，其示例性描述于下列参考文献中：

    -WO 92/002528；

    -WO 07/082713；

    -US 5,258,506；

    -Olejnik，J.等人，Nucleic Acids Research 26(1998)3572-3576；

    -Hausch，F.和Jaeschke，A.，Nucleic Acids Research 28(2000)28，e35；

    -Hausch，F.，和Jaeschke，A.，Tetrahedron 57(2001)1261-1268；

    -Wenzel，T.等人，Nucleosides，Nucleotides & Nucleic Acids 22(2003)1579-1581；

    -Dell′Aquila，C.等人，Tetrahedron Letters 38(1997)5289-5292；

    -Ordoukhanian，P.和Taylor，J.-S.，Journal of the American ChemicalSociety 117(1995)9570-9571；

    -Saran，D.等人，Bioconjugate Chemistry 18(2007)275-279；

    -Piggott，A.M.，和Karuso，P.，Tetrahedron Letters 46(2005)8241-8244。

    可以通过诸如H+或OH-等活性物质的光生成来实现间接光裂解的具体模式，其中此类活性物质的形成导致碱或酸不稳定性共价键的裂解。WO2006117556和WO 9941007描述了酸和碱的光生成方法。碱或酸不稳定的接头是本领域内所熟知的(例如，Chitkul，B.，Tetrahedron Letters 42(2001)6211-6214)。

    一种热裂解接头描述于Keller，K.A.，Tetrahedron Letters 46(2005)1181-1184中。

    固定的寡核苷酸在每种情况下都是以有利于初始靶捕获并使PCR在甚至只有一个固定引物时也有效的方式连接到表面上。这通过使珠子表面与引物序列之间具有足够的间隔而达成。因此，将长接头如PEG-接头或多个短接头连接在寡核苷酸上。影响捕获的第二个参数是珠子上的表面加载密度，其可以如下控制：通过适宜的珠子制备工艺；或通过用非核苷酸化合物稀释要固定的寡核苷酸，所述非核苷酸化合物与要固定的寡核苷酸具有相同的官能团。

    根据本发明的固体支持物的用途

    如上所述，本发明固体支持物可以是珠子或多个珠子。根据本发明的珠子可用于分析所关注的多种核酸分子的方法中，所述方法包括下列步骤：

    a)提供多个珠子，其特征在于每个珠子包含至少一对序列特异性扩增引物，其特征还在于至少一个所述引物经由可裂解接头结合至珠子

    b)自样品捕获所关注的核酸分子

    c)克隆分离所述多个珠子

    d)裂解所述至少一个引物

    e)克隆扩增所述核酸，从而产生多种扩增产物

    f)分析所述扩增产物

    示例性的概括示于图1中：将样品施加到珠子群，所述珠子包括一对扩增引物，其中所述扩增引物之一为光可裂解的(步骤a、b)。通过进行乳液PCR达成克隆扩增(步骤c、d、e)。随后，开始分析扩增产物(步骤f)。

    详细地讲，一般步骤如下进行：

    a)提供多个珠子

    所述珠子的制备已经在上文中详细公开。

    b)自样品捕获所关注的核酸分子

    然后使靶分子与含有可裂解和不可裂解引物的珠子杂交。就适宜的缓冲体系和适宜的杂交温度而言的合适的杂交条件是本领域内所熟知的，可以根据具体的条件(如具体使用的扩增引物的长度和序列)来优化。优选地，使用与要扩增的一个或多个序列相比摩尔过量的珠子进行杂交以捕获尽可能多的靶核酸。具体地，1∶5-1∶100，优选为1∶10-1∶50的摩尔过量被证明是尤其有利的。如果需要检测和/或分析多个不同的靶序列，则需要使用具有相应的多个不同引物对的珠子文库。

    c)克隆分离所述多个珠子

    为了获得在所分析的多种核酸分子中存在的序列变异的定量数据，克隆分离是先决条件。大体上，有两种不同的克隆分离模式。

    在第一实施方式中，首先将例如下列的PCR试剂加入珠子中：热稳定性DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷以及适宜的缓冲液。随后，产生了油包水乳液，其特征在于各珠子被包裹在单个胶束中，所述胶束含有水溶液，这使得能够进行核酸扩增反应。适宜的条件例如公开于WO 04/069849中。

    在最优选的实施方式中，在1微升水比油为1∶2的乳液中含有约3000个珠子。

    在第二替代性实施方式中，步骤c)包括将所述多个珠子分散到微量滴定板或皮可滴定板的孔中。孔的大小与珠子直径对应方式为一个孔仅能装下一个珠子。

    珠子向孔中的分散可以通过(例如)持续搅拌、均匀摇晃或离心方法来达到。在珠子分散到微量滴定板或皮可滴定板的孔中之前或优选之后，添加诸如热稳定性DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷和适宜的缓冲液等PCR试剂。或者所述PCR试剂的添加可在步骤d)后进行。

    d)裂解所述至少一个引物

    然后将包含所述经由可裂解接头结合的引物的珠子暴露在裂解条件下，以切断连接可裂解引物与珠子的接头。在通过将所述多个珠子分散在微量滴定板或皮克滴定板的孔中而达成克隆分离的情况下，可以通过酸、碱、光或本领域的熟练技术人员所熟知的任何其他方法来裂解可裂解接头分子。优选地，所述接头为光可裂解接头，因为避免了额外试剂的添加。

    在通过产生油包水乳液达成克隆分离的情况下，甚至需要使用基于光活化的裂解方法。在此方面，有几种本领域所已知的方法。

    e)克隆扩增所述核酸，从而产生多种扩增产物

    然后将反应混合物暴露于适当的热循环程序中以进行核酸扩增反应。仍然固定的(不可裂解的)扩增引物与靶核酸分子以及扩增的产物杂交从而将它们保持在珠子表面。从珠子上裂解掉的扩增引物能够在溶液中自由移动，使得可以进行有效的扩增反应。

    因此，本发明还提供了制造多个携带核酸模板的珠子的方法，其中各珠子包含多达和大于1,000,000拷贝的单个核酸序列。在优化的条件下，每个珠子可以包含超过2000万拷贝的单个核酸。

    为了避免非特异性扩增产物的产生，高度有利的是采用所谓的热启动PCR程序。有几种方法是本领域内已知的。例如，可以使用由化学热不稳定修饰而可逆灭活的DNA聚合酶。(US 5,773,258、US 5,677,152)。达成Tag DNA聚合酶的热不稳定性抑制的另一方法是添加由抗经纯化的酶而产生的单克隆抗体(Kellogg，D.E.，等人，Biotechniques 16(1994)1134-7)。或者可以将短的双链DNA片段(Kainz，P.，等人，Biotechniques 28(2000)278-82)或寡核苷酸适体添加到反应混合物中(US 5,693,502)，(Lin，Y.和Jayasena，S.D.，J.Mol.Biol.271(1997)100-11)以产生热启动效应。作为又一替代方式，EP 0799 888公开了将3’封闭的寡核苷酸添加到PCR反应中。由于3’封闭，这些寡核苷酸不能作为引物起作用。将封闭的寡核苷酸设计成与PCR引物竞争/相互作用，这会导致非特异性产物减少。另一替代方式是在PCR反应混合物中使用硫代磷酸寡核苷酸引物与外切酶III的组合(EP 0 744 470)。在这种情况下，通常接受双链以及单链DNA底物的3′外切酶降解双链人为产物(duplexartefacts)，如引物二聚体以及转移(carry over)扩增子，而留下单链扩增引物不被降解。类似地，提出了使用具有碱性修饰的3’端的引物并通过大肠杆菌核酸内切酶IV进行模板依赖性去除(US 5,792,607)。一般观点的具体实施方式见EP 1 275 735。其说明书公开了一种用于进行核酸扩增反应的组合物以及使用此组合物进行PCR反应的方法，所述组合物包含：(i)热稳定性DNA聚合酶；(ii)热稳定性3’-5’外切酶；以及(iii)至少一种用于核酸扩增的引物，该引物具有经修饰的3’末端残基，其不被所述的热稳定性DNA聚合酶延长。

    具体地，克隆扩增可以等位基因特异性PCR的形式进行。在此检测方法中，在扩增期间使用变体特异性的扩增引物，其通常在引物的3’末端具有辨别性末端核苷酸残基，该残基仅与要检测的靶核酸的特定变体互补。例如，US 5,595,890描述了用于等位基因特异性扩增的此类方法以及它们用于在临床上检测相关点突变(例如，在k-ras致癌基因中)的用途。US 5,521,301还描述了对ABO血型系统进行基因分型的等位基因特异性扩增方法。相比之下，US 5,639,611公开了等位基因特异性扩增关于引起镰状细胞贫血的点突变检测的用途。这些用于检测序列变异、多态性以及最重要的点突变的方法需要等位基因特异性扩增，尤其是当与相同核酸部分(或相同基因)的过量存在的变体相比，要检测的序列变体以较低的量存在时。这种情况例如发生在，当目的是借助于等位基因特异性扩增在体液(如血液、血清或血浆)中检测散播性肿瘤细胞的时候(US 5,496,699)。对于此目的，首先从体液(如血液、血清或血浆)中分离DNA，该DNA由相对较少量的来自散播性肿瘤细胞的DNA和过量的来自非增殖细胞的DNA构成。因此，对于肿瘤DNA显著的k-Ras基因突变需要在存在过量野生型DNA的条件下在具有较少拷贝的肿瘤DNA的基础上检测。

    f)分析所述扩增产物

    在步骤c)的克隆分离通过产生油包水乳液达成的情况下，需要在第一步中，将携带扩增产物的多个珠子分散到微量滴定板或皮克滴定板的孔中。随后，存在两种分析产生的扩增产物的替代性实施方式。

    (i)测序

    在第一实施方式中，可以使结合在各珠子上的DNA进行测序反应。优选地，所述测序反应为通过合成反应进行的测序，其特征在于监测特定脱氧核苷向引物延伸反应的新生DNA链中的掺入。更优选地，所述通过合成反应的测序是焦磷酸盐测序反应，其中所述掺入是通过检测焦磷酸盐的生成来监测的(EP 932 700、US 6,210,891)。

    通过提供序列特异性珠子，避免了根据本领域内已知方法所需要的某些靶标的PCR预扩增。而根据本发明，emPCR本身通过多个珠子进行，但是所有珠子都携带相同的扩增引物对。更准确来说，珠子具有一个固定的正向和反向引物，二者均对相同的基因有特异性。不可裂解引物可以在5’端具有额外的序列，其后接基因特异性引物序列。可裂解引物在5’端具有特异性序列，其在测序反应前可以作为测序引物结合位点。所述可裂解引物的3’部分后接基因特异性序列。不够优选但是仍然在本发明的范围内的是对应于测序引物结合位点的序列存在于不可裂解引物的5’端。

    可以汇集各自含有针对不同基因的引物对的许多不同珠子。随后在捕获反应中，使靶标杂交到珠子上。接着，产生适于emPCR的乳液。然后将乳液置于裂解可裂解接头的条件下。然后使珠子进行emPCR“克隆扩增”。在乳液破乳和洗涤后，将珠子物理分离到皮可滴定板上，通过测序对扩增产物进行解码/检测和/或定量，例如使用基因组测序仪FLX仪器(Roche AppliedScience目录号04 896 548 001)。

    概括地说，主要的优点是

    -靶标可以直接添加到珠子上

    -不需要所关注的基因或扩增子的预扩增

    -可能提供序列特异性捕获珠子的文库。可以将序列特异性捕获珠子的文库按照特定应用分组，如肿瘤相关基因的基因表达及其他。

    (ii)终点PCR分析

    在第二替代性实施方式中，可以通过适当的检测方法直接分析仍然结合在珠子上的扩增的DNA。换言之：进行PCR分析，该PCR分析的特征在于对扩增子的产生进行终点测量。

    珠子具有固定的正向和反向引物，两种引物均对一个所关注的基因或核酸序列区域具有特异性。引物之一是可裂解的，第二种引物是不可裂解的。可以汇集各自含有针对不同基因/序列的引物对的许多不同珠子。随后在捕获反应中，使靶核酸样品杂交到珠子上。产生适于emPCR的乳液。然后将乳液置于裂解可裂解接头的条件下。接着使珠子进行emPCR“克隆扩增”。在乳液破乳和洗涤后，将珠子在PTP(皮可滴定板)上物理分离并在终点分析中检测扩增产物。在具体实施方式中，所述检测通过给所产生的扩增子施加热梯度来进行。结果，可以进行熔化曲线分析。(US 6,174,670、US 5,871,908)。

    扩增产物优选通过荧光检测。例如，扩增混合物可以已经含有双链核酸结合部分，如荧光DNA结合染料，该染料在与双链核酸相互作用后用适宜波长的光激发后发射相应的荧光信号。已经证明染料SybrGreenI和SybrGold(Molecular Probes)或WO 2004/038038中公开的染料尤其适于此应用。可以替代性地使用其他嵌入性染料。

    由于用SybrGreen形式的扩增子检测不能区分特异性产物与扩增的人为产物(如引物/二聚体)这一事实，之后通常进行熔化曲线分析。在PCR反应完成之后，样品温度组成性地(constitutively)增加，只要SybrGreen结合样品中所存在的双链DNA即可检测出荧光。在双链DNA解离后，信号立即降低。用适宜的荧光与温度-时间的曲线图来监测这种降低以便可以检测到第一衍生值，在该值处观察到荧光降低的最大值。由于引物/二聚体双链DNA通常很短，所以与双链特异性扩增产物相比，其在较低的温度下解离成单链DNA。

    或者，扩增混合物可以已经含有一种或多种用至少一种荧光部分标记的杂交探针。在本发明的内容中，尤其可以使用分子信标、FRET杂交探针和单标记探针。

    用第一组分和淬灭物标记分子信标(Molecular Beacon)杂交探针，这两种标记通常位于探针的两端。由于探针二级结构的结果，在溶液中两种组分在空间上很接近。在与靶核酸杂交后，两种组分彼此相互隔开使得在用适宜波长的光激发后，可以测量到第一组分的荧光发射(US 5,118,801)。

    FRET杂交探针测试形式尤其可用于所有类型的同源杂交分析(Matthews，J.，A.，和Kricka，L.，J.，Analytical Biochemistry 169(1988)1-25)。其特征在于具有两条同时使用且与扩增的靶核酸同一链上的临近位点互补的单链杂交探针。两种探针用不同的荧光组分标记。当用适宜波长的光激发时，根据荧光共振能量转移原理第一组分将所吸收的能量转移到第二组分使得在两种杂交探针结合在待检测的靶分子的邻近位置时可以测量到第二组分的荧光发射。除了监测FRET受体组分的荧光增加之外，还可以监测FRET供体组分的荧光降低来作为杂交事件的定量测量。

    单标记探针由在5’或3’端用单种荧光染料标记的单一寡核苷酸构成(WO02/14555)。可以使用两种不同的设计：G-淬灭探针和硝基吲哚-去淬灭(Dequenching)探针。在G-淬灭实施方式中，荧光染料连接在多聚物的5’或3’端的C上。在两个G′位于靶链上与C相对和在互补寡核苷酸探针旁边的1位置的情况下，探针杂交到靶标上时，荧光显著降低。在硝基吲哚去淬灭的实施方式中，荧光染料在连接在寡核苷酸5’或3’端的硝基吲哚上。硝基吲哚以某种方式降低游离探针的荧光信号。当探针杂交到靶DNA上时，由于去淬灭作用荧光增加。

    上文所公开的所有杂交探针均用于熔化曲线分析。在此分析中，靶核酸首先在典型的PCR反应中用适宜的扩增引物扩增。杂交探针可以在扩增反应期间已经存在或者随后添加。在完成PCR反应后，样品的温度组成性地增加，只要杂交探针与靶DNA结合即可检测出荧光。在熔化温度，杂交探针从它们的靶标释放，荧光信号立即降至背景水平。用适宜的荧光与温度-时间的曲线图来监测这种降低以便可以检测到第一衍生值，在该值处观察到荧光降低的最大值。

    在特征为仅扩增一个、两个或几个不同靶基因的应用的情况下，可以通过给所产生的扩增子施加热梯度并进行熔化曲线分析来区别不同的扩增产物。使用SybrGreen检测形式，可能容易地区分至少两种不同的扩增子。使用基于杂交探针的检测形式，可能容易地使用经一种或多种相同荧光化合物标记的一种或多种杂交探针来区分至少4种不同的扩增子序列变异，这些扩增子序列变异通过相同或不同的扩增引物来扩增。在使用不同标签用于不同的杂交探针的情况下，可能分别区分更多不同的扩增子序列变异。

    根据本发明，还有另一种检测方案，该方案基于可检测标签的引入。因此，本发明提供一种或多种含有至少两种序列特异性扩增引物的珠子，其中至少一种引物通过可裂解接头结合在所述支持物上，所述引物还包含可检测标签。

    具体地，本发明还提供珠子文库，其中各珠子含有不同的扩增引物对(两个序列特异性扩增引物)，其中至少一个引物通过可裂解接头结合在所述支持物上，所述引物还含有可检测标签。在很具体的实施方式中，珠子本身为标签，或者在表面上经可检测标签修饰。

    在此上下文中，携带特异性引物序列的珠子用允许特异性检测珠子的任何类型的可检测标签编码(encoded)。例如，可检测标签可以是质量-标签、荧光或颜色标记或e-标签或拉曼(Raman)标签，但是不限于此。另外的实例是半抗原，如洋地黄毒苷或生物素或小肽，它们都可以通过抗体检测。

    对于各序列特异性珠子，可以选择由不同颜色、不同质量或其他(方面)编码的另一种标签或特定数目的多种标签，来用于珠子结合的特定序列。依据不同的可用标记的数目，可以分析多种靶序列。

    优选地，通过可裂解接头结合至珠子的引物携带可检测标签。在裂解和延长“可裂解的”-引物后，标签整合到珠子上的PCR产物中，可以被检测到。可以区分含有不同序列的扩增产物的珠子并计数，从而使得有可能定性和定量地检测特定序列。因此，更优选地，经由可裂解接头结合至珠子的多种引物的各成员携带不同的可检测标签或多种标签。

    在用荧光标签标记可裂解引物的情况下，这可以如下方式进行：只要标签不被聚合酶延长形成PCR扩增子，标签就被淬灭。一种设想的淬灭机制是使用类似于单标记的杂交探针的引物，其中去淬灭在与互补靶链相互作用之后发生。或者，可以使用类似于分子信标的引物，其中去淬灭在寡核苷酸线性化之后发生。结果，淬灭引物的使用使任何背景荧光信号的可能性最小化。

    在用诸如生物素和洋地黄毒苷等半抗原标签标记可裂解引物时，扩增产物可以通过使用抗生物素蛋白或抗Dig的化学发光反应在随后各自的化学发光反应中检测。在具体实施方式中，经由可裂解接头结合在珠子上的多种引物的各成员携带不同数目的生物素或Dig标签，它们可以在级联反应中通过荧光或化学发光检测。因此，使用POD链霉亲和素和抗Dig的Ap与具有不同发射特征的荧光或化学发光底物组合的结合物。对于荧光来说，示例性的实例是使用荧光素和抗荧光素-半乳糖结合物。还可以另外使用荧光或化学发光信号的时间依赖性或信号强度和发射波长来解码。

    或者，用不同数目的Iso-G和Iso-C(它们正交于标准碱基对)修饰可裂解引物和/或不可裂解引物。然后，在扩增反应期间引入生物素和/或Dig标记的iso-G和iso-C，它们最终通过上述级联反应来检测。能够与配对物特异性相互作用但不与连接至引物5’端的DNA或RNA相互作用的正交侧瓣(flap)还可用于在阵列上“通过杂交解码”，其中所述侧瓣的配对物固定于特定的已知位置。适宜的正交侧瓣为核酸类似物，如含isoG、isoC的寡核苷酸、L-DNA、GNA和homoDNA。

    业内还已知许多其他的不同编码策略，它们的一些是市售的。实例公开于下列参考文献中：

    荧光：

    Tong，A.K.等人，Nature Biotechnology 19(2001)756-759

    质量：

    Kokoris，M.等人，Molecular Diagnosis 5(2000)329-340

    拉曼光谱：

    Sun，L.等人，Analytical Chemistry 79(2007)3981-3988

    Ng，P.，Nucleic Acids Research 34(2006)e84/1-e84/10

    多重分析的综述：

    Finkel，N.H.等人，Anal.Chem.76(2004)352A-359A

    Braeckmans，K.等人，Nat.Rev.Drug Discov.1(2002)447-456

    在具体实施方式中，编码的珠子还可以与如上所公开的使用荧光实体(如，dsDNA结合染料)或荧光杂交探针的检测模式组合使用。

    (iii)实时PCR

    在步骤c)的克隆分离通过将所述多个珠子分散到微量滴定板或皮可滴定板的孔中的情况下，PCR反应步骤可以已经在如上所公开的步骤e)期间使用适当的检测形式进行实时监测。换言之，步骤e)和f)通过进行实时PCR分析而同时进行。

    可以汇集各自含有不同基因的引物对的许多不同珠子。使靶标杂交到珠子上。使用微装置(如皮可滴定板(PTP))将各自携带对一个基因特异的两个PCR引物的不同珠子物理分离。固定于珠子上的引物之一含有可裂解接头。将PCR试剂添加到在PTP上物理分离的珠子上。然后将珠子暴露于裂解条件以切断将可裂解引物连接到支持物基质的接头。对反应混合物实施PCR循环。仍然固定(不可裂解)的引物杂交到非常接近的扩增分子上-保持它们在表面。在PTP的单孔中进行PCR，其以实时方式进行。在此实施方式中，随后还使扩增子经受热梯度以进行熔化曲线分析。

    为了实时鉴别扩增产物，本领域内的技术人员应了解可以使用相同的编码珠子模式。本领域的技术人员还应了解对于扩增产物的检测，可以使用如上所公开的用于终点PCR分析的双链DNA结合染料或荧光杂交探针。

    此外，可以使用实时PCR领域内已知的任何类型的检测形式。具体地，还可以使用熟知的TaqMan 5’核酸酶形式。在这种情况下，单链杂交探针经两种组分标记。当用适宜波长的光激发第一组分时，根据荧光共振能量转移原理所吸收的能量被转移到第二组分，所谓的淬灭物。在PCR反应的退火步骤中，杂交探针结合至靶DNA，并在随后的延长阶段被Taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性降解。由于激发的荧光组分与淬灭物在空间上彼此间隔，所以可以测量第一组分的荧光发射(US 5,804,375)。然而，这种分析形式不适于随后的熔化曲线分析。

    (iv)文库制备

    除了直接分析多种核酸分子的方法外，本发明还提供通过本发明方法制备的文库。文库可以通过使用下列物质作为扩增的起始材料来制备：例如，基因组DNA、全细胞cDNA、基因组DNA文库、cDNA文库、或质粒文库。文库可以衍生自任何核酸群，例如，生物或合成起源的。

    因此，更准确地讲，本发明还涉及用于扩增多种所关注的核酸分子的方法，该方法包括下列步骤：

    a)提供多个珠子，其特征在于每个珠子包含至少一对序列特异性扩增引物，其特征还在于至少一个所述引物经由可裂解接头结合至珠子。

    b)自样品捕获所关注的核酸分子

    c)克隆分离所述多个珠子

    d)裂解所述至少一个引物

    e)克隆扩增所述核酸，从而产生多种扩增产物

    f)将所述多种扩增产物克隆储存在微量滴定板或皮可滴定板的孔中。

    在根据本发明步骤c)通过制备乳液进行的情况下，步骤f)包括在开始时将所述多个珠子分散到微量滴定板或皮可滴定板的孔中的步骤。在步骤c)包括将所述多个珠子分散到微量滴定板或皮可滴定板的孔中的步骤的情况下，扩增产物可以直接储存在相同的微量滴定板或皮可滴定板中。

    在根据本发明扩增之前所制备的文库的情况下，可能使用一种类型的具有一个特异性扩增引物对的珠子。在根据本发明扩增基因组DNA或全细胞cDNA的情况下，珠子必须包含随机的正向和反向引物序列群。

    此外，本发明还涉及通过上文所公开的方法制备的文库。

    本发明的应用

    (i)测序

    根据本发明的测序分析可以用于多种不同的应用。

    在许多情况下，需要分析可能的序列变异的多拷贝的特定靶标。根据本发明，避免了根据本领域的已知方法所需要的某些靶标的PCR预扩增。相反，根据本发明，emPCR本身通过相同类型的多个珠子进行，这些珠子的特征在于所有珠子都携带相同的扩增引物对。

    因此，在一个方面，根据本发明的测序分析可用于定量突变分析。在此方面，自多个不同的测序反应所获得的数据表明在已扩增的样品中的靶核酸中出现了多种不同的变异。此外，所得数据提供了定量信息，以百分数形式揭示各序列变异最初在分析的样品中所存在的频率。

    此外，此分析还可在多重方法中进行。在此情况下，测定样品中存在的几种不同靶核酸的序列变异。可以通过此方法分析的不同靶标的数目仅受不同珠子数目限制，其方式是各珠子携带特定的扩增引物对。

    在另一方面，还可以分析复杂(complex)基因或基因座，它们的序列不能通过进行单次PCR反应来扩增。在此情况下，提供多种不同的珠子，其特征在于各珠子携带特定的扩增引物对，所述扩增引物对设计用于扩增要分析的靶DNA的特定区域。在此上下文中，引物设计方式必须使得：所产生的扩增产物的大小不超过在随后的测序步骤中不能够完全测序的长度。因此，优选地，所产生的扩增子大小低于1000个核苷酸，最优选低于500个核苷酸。还优选地，所产生的扩增子序列包含彼此之间的重叠区以便最终所产生的序列信息含有高的置信度而没有任何缺口。

    具体地，此分析可以用于分析多种多态性，所述多态性是在已证明与某种疾病的素因或疾病的预后相关的特定基因或基因座中所发现的。例如，本发明方法可用于分析人基因，如编码肌营养不良的基因或HNPCC基因。

    在另一个方面，根据本发明的测序分析可用于监测基因表达。在此方面使用制备成下列方式的cDNA：其5’端具有能够作为随后扩增反应的引物结合位点的靶序列。至于所述扩增反应中的第二引物，可以使用寡聚-dT引物。cDNA 5’端引物结合位点的引入可以通过本领域内已知的任何方法进行。例如，对于第二链cDNA合成，可能使用包含5’部分和3’部分的引物。5’部分包含引物结合位点，其本身不与第一链cDNA杂交。3′部分包含至少部分且优选全部随机的序列，使得能够与基本上所有的第一链cDNA分子杂交。

    或者，如果仅要扩增有限数目的靶核酸的表达，则第一链和第二链cDNA合成使用包含有限数目的引物序列的群进行。对于第一链cDNA合成，使用引物组合物，该组合物具有对应于第一扩增引物结合位点的第一共同5’部分，但对应于不同数目的要监测的靶标，(这些引物)均具有不同的3’部分。类似地，对于第二链cDNA合成，使用引物组合物，该组合物具有对应于第一扩增引物结合位点的第二共同5’部分，但对应于不同数目的要监测的靶标，均具有不同的3’端。

    与定量突变分析方法类似，通过随后的测序所获得的数据还表明了在原始样品中所存在的哪些cDNA的频率的定量信息。

    在另一方面，可以用完全随机的引物群来替代序列特异性扩增引物对。如果是这样的情况，则根据本发明的方法还可以用于具有许多不同序列的核酸分子群(如基因组DNA样品或全cDNA样品)的测序。

    (ii)终点PCR和实时PCR

    根据本发明的PCR实施方式可用于绝对或相对的核酸定量。

    在相对定量的情况下，使用至少两对序列特异性扩增引物以扩增样品中所存在的两种不同的核酸序列。光可裂解引物优选包含用于随后检测的不同标签，即，经由可裂解接头结合在珠子上的多个引物的各个成员携带不同的可检测标签。或者，如果只要分析有限数目的靶标，则扩增产物通过熔化曲线分析、通过使用不同标记的杂交探针或通过使用洋地黄毒苷或生物素编码的引物来区分。样品可以是：例如，基因组DNA样品、cDNA样品或RNA样品。在后一情况下，需要进行一步式RT-PCR。

    在绝对定量的情况下，向样品中掺加已知量的标准核酸，该标准核酸可如上所述用引物扩增并通过适当加标签的引物或适当标记的探针来检测。

    在终点PCR监测的情况下，测定各类型扩增靶标序列的阳性信号的丰度，并将其彼此相比较以获得相对或(在使用已知标准物的情况下)绝对的定量数据。

    在实时PCR的情况下，在扩增过程中根据本领域内熟知和常用的方法来获得定量数据。

    因此，对于根据本发明的终点PCR监测和实时PCR监测，有可能比较原始样品中不同RNA的丰度，换言之，有可能以相对的方式监测基因表达。

    在另一方面，本发明的终点PCR以及实时PCR方法可用于根据基于等位基因特异性扩增的方法进行的突变分析，其还称为ARMS技术(US5,137,806、US 5,595,890、US 5,639,611)。在此具体实施方式中，使用具有3’辨别性核苷酸残基的引物，该引物仅能够扩增特定靶序列的一个特定序列变异，但不扩增第二已知序列变异。

    实施例

    实施例1：

    引物和光可裂解引物的制备

    寡核苷酸合成以4×1μmol规模在ABI 394合成仪上进行。使用市售的tacCPG(Proligo)作为支持物材料。用于标准合成反应的所有其他化学品得自Glen Research。使用Proligo的具有叔丁基苯氧基-乙酰基保护基团的亚磷酰胺(Phosphoramidite)(称为“tac”或“Expedite”单体)。对于封端剂，使用在四氢呋喃中的叔丁基苯氧基乙酰基乙酸酐(tac2O)。

    使用下列市售修饰剂：

    -5’氨基修饰剂C6：(6-(4-一甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺

    -间隔子亚磷酰胺18(18-O-二甲氧基三苯甲基六亚乙基乙二醇、1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺

    -光可裂解间隔子[4-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)丁酰氨基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺

    -生物素dT亚磷酰胺(5′-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[N-((4-叔丁基苯甲酰基)-生物素基)-氨基己基)-3-丙烯基亚胺基]-2′-脱氧尿苷-3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)

    -生物素亚磷酰胺(1-二甲氧基三苯甲基氧基-2-(N-生物素基-4-氨基丁基)-丙基-3-O-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺)

    -荧光素亚磷酰胺(1-二甲氧基三苯甲基氧基-2-(N-硫脲-(二-O-特戊酰基-荧光素)-4-氨基丁基)-丙基-3-O-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺)

    -荧光素dT亚磷酰胺(5′-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[N-((3′，6′-二特戊酰基荧光素基)-氨基己基)-3-丙烯基亚胺基]-2′-脱氧尿苷-3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)

    使用标准方法进行合成。在室温下用33％的氨处理2h将产物从支持物上断裂下来，通过在多孔寡聚R34.6×50mm柱子上进行反相色谱来纯化。色谱：缓冲液A：在水中的0.1M三乙基乙酸铵，pH 6.8；缓冲液B：在1∶1的水/乙腈中的0.1M三乙基乙酸铵，梯度：2分钟0％B，在45分钟内达到100％B。洗脱液的紫外吸光度在260nm处测量。获得了含有氨基修饰的寡核苷酸的主要部分。真空离心除去溶剂。

    下表显示固定于经N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)活化的琼脂糖珠子上的寡核苷酸引物的序列和修饰。大写字母表示用于珠子编码、扩增、富集和焦磷酸测序的通用(generic)衔接子序列，而小写字母表示基因特异性序列。

    表2：

       序  列  ID  靶基因  序列(5′-＞3′)  #1  -  5’-AmMC6-(isp18)₃-PCL-C-^FAMdT-  GTGCGTCCCTACTCTACC  #2  -  5’-AmMC6-(isp18)₃-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG  #3  -  5’-AmMC6-(isp18)₃-PCL-T^B-CCATCTCATCCCTGCGTGTC  #4  NM_004048  (B2M)  5’-AmMC6-(isp18)₃-  GCCTCCCTCGCGCCATCAGcctggtctttctatctcttgtactac  #5  NM_004048  (B2M)  5’-AmMC6-(isp18)₃-PCL-T^B-  GCCTTGCCAGCCCGCTCAGgcatcttcaaacctccatga  #6  NM_199166  (ALAS)  5’-AmMC6-(isp18)₃-  GCCTCCCTCGCGCCATCAGcctggaatgagtcgccacccacg  #7  NM_199166  (ALAS)  5’-AmMC6-(isp 18)₃-PCL-T^B-  GCCTTGCCAGCCCGCTCAGcagctcccgctctaagtcca  #8  NM_000194  (HPRT)  5’-AmMC6-(isp 18)₃-  GCCTCCCTCGCGCCATCAGcctggactgtagattttatcagactga  #9  NM_000194  (HPRT)  5’-AmMC6-(isp18)₃-PCL-T^B-  GCCTTGCCAGCCCGCTCAGtggattatactgcctgaccaa  #10  NM_000190  (PBGD)  5’-AmMC6-(isp18)₃-  GCCTCCCTCGCGCCATCAGgcggagccatgtctggtaa  #11  NM_000190  (PBGD)  5’-AmMC6-(isp18)₃-PCL-T^B-  GCCTTGCCAGCCCGCTCAGccagggtacgaggctttcaa

    5’-AmMC6…5’-氨基-修饰剂C6

    isp18…内部间隔子18，六亚乙基乙二醇

    PCL…2-硝基苄基光可裂解接头

    FAMdT…荧光素脱氧胸苷

    TB＝生物素脱氧胸苷

    MvaI限制性位点由下划线表示

    实施例2：

    珠子的制备和光裂解

    根据标准方法将分别含有固定的(stationary)和光可裂解的接头的氨基修饰的寡核苷酸(序列ID#1-9)结合在N-羟基琥珀酰胺酯(NHS)官能化的琼脂糖珠子上(Roche/454-Life Sciences，Branford，CT，USA)。化学反应机制由图2表示。

    为了触发硝基苄基接头的光裂解，使这些珠子在QS1.000石英比色皿(1-cm路径长度)中经受紫外辐照，该辐照使用8W双波长紫外灯(Camag，Berlin，Germany)在366nm进行。石英比色皿和紫外灯之间的距离为2cm。

    实施例3：

    光裂解反应的分析

    (对应于图3)

    该实施例描述了固定于琼脂糖珠子上的荧光修饰的寡核苷酸探针的光裂解检测。

    将结合有荧光素修饰的寡核苷酸探针(序列ID#1)的5×10⁶个珠子充分洗涤，然后悬浮在100μl 50mM Tris/HCl pH 7.5缓冲液中，如实施例2中所述辐照15分钟。然后离心珠子，通过使用NanoDrop 1000分光光度计(ThermoScientific，Waltham，MA，USA)进行吸光度测量来分析上清液中的光裂解的荧光素修饰的寡核苷酸(FAM)(图3A)。

    此外，将携带荧光素修饰的寡核苷酸探针(序列ID#1)的0.6×10⁶个珠子悬浮于800μl PCR反应混合物中(表3)。

    表3：

       试剂  终浓度  吐温-80  0.01   ％  BSA  0.10   ％  MgSO₄  2.5    mM  甘油  3.6    ％  Tris-H₂SO₄pH 8.9  58.1   mM  NH₄-SO₄  17.4   mM  dATP、dGTP、dCTP、dTTP  各0.40 mM  Expand HiFi-Taq聚合酶  0.04   U/μl

    或者，将相同量的珠子悬浮于190μl PCR反应混合物中，然后根据厂家的说明书(GS emPCR试剂盒使用者手册，Roche/454-Life Sciences，Branford，CT，USA)将其乳化。按照实施例2中所述将悬浮的或乳化的珠子辐照15分钟。此后，用异丙醇和50mM Tris/HCl pH 7.5缓冲液充分洗涤珠子。在辐照前后使用标准的流式细胞仪测量珠子的荧光强度从而分析光裂解(图3B)。如可由图中所推断，通过在两种情况下的紫外辐照进行的光裂解导致珠子群荧光强度显著丧失。

    实施例4：

    光活化的珠子PCR

    (对应于图4和5)

    此实施例描述了使用珠子PCR和固定于珠子的光可裂解引物进行的特定PCR产物的检测。珠子PCR和标准对照PCR的模板是人工的239bp扩增子。扩增子以使其含有Mva I和Nla III限制位点的方式设计。预计在珠子PCR或对照PCR之后此扩增子的限制性内切酶处理会导致不同长度片段的特征谱，如图4所示。

    将携带固定的和光可裂解的寡核苷酸探针(序列ID#2、#3)的0.3×10⁶个珠子悬浮在100μl含有1pg人工239bp扩增子的PCR反应混合物中(表3)。扩增子包含与珠子上的寡核苷酸互补的序列。如实施例2所述将悬浮液辐照15分钟。然后将该悬浮液转移到PCR反应室(即，PCR管)中。在标准的热循环器中如下进行PCR：

    ●1个循环(94℃4分钟)-热启动开始；

    ●40个循环(94℃30秒、58℃60秒、68℃90秒)-变性、退火、聚合；

    ●25个循环(94℃30秒、58℃6分钟)-变性、聚合；

    ●在10℃储存。

    在PCR反应完成后，将携带扩增材料的珠子移出，在50mM Tris/HCl pH7.5缓冲液中洗涤，并在37℃进行限制性内切酶处理(ca.5U)2h。随后，离心珠子，通过琼脂糖凝胶电泳对上清液进行特定PCR产物的分析(图5，右侧)。使用非固定的寡核苷酸探针进行对照PCR反应(图5，左侧)。如图5可见，珠子PCR产生了预期的大的和小的DNA片段，这表明光裂解和珠子PCR反应均成功地进行。

    实施例5：

    光活化的珠子乳液PCR

    (对应于图6)

    此实施例描述了使用珠子乳液PCR和固定于珠子的光可裂解引物进行的特定PCR产物的检测。

    将携带固定的和光可裂解的寡核苷酸探针(序列ID#2、#3)的0.4×10⁶个珠子悬浮在30μl含有4pg人工239bp扩增子的捕获缓冲液(2mM Tris/HClpH 7.5，0.5mM Mg(CH₃-COO)₂)中。扩增子包含与珠子上的寡核苷酸互补的序列。在标准热循环器中如下将扩增子杂交到珠子上：

    ●1个循环(80℃5分钟)-变性；

    ●1个循环(以0.1℃/秒降至70℃，70℃1分钟)-退火；

    ●1个循环(以0.1℃/秒降至60℃，60℃1分钟)-退火；

    ●1个循环(以0.1℃/秒降至50℃，50℃1分钟)-退火；

    ●1个循环(以0.1℃/秒降至20℃，20℃5分钟)-退火；

    随后，根据厂家的说明书(GS emPCR试剂盒使用者手册，Roche/454-LifeSciences，Branford，CT，USA)将珠子乳化。如实施例2所述将乳液辐照30分钟。然后将该乳液转移到PCR反应室(即，PCR管)中。在标准的热循环器中如下进行PCR：

    ●1个循环(94℃4分钟)-热启动开始；

    ●40个循环(94℃30秒、58℃60秒、68℃90秒)-变性、退火、聚合

    ●25个循环(94℃30秒、58℃6分钟)-变性、聚合；

    ●在10℃储存。

    在完成PCR反应之后，首先使用过量的异丙醇，其次使用过量的乙醇缓冲液(10mM Tris/HCl pH 7.5，70％乙醇)，再次使用50mM Tris/HCl pH 7.5缓冲液进行一系列的洗涤和离心步骤从而回收乳化的珠子。然后在37℃对经洗涤的珠子进行限制性内切酶(ca.5U)处理2h。随后，离心珠子，通过琼脂糖凝胶电泳对上清液进行特定PCR产物的分析。作为对照，使用非固定的寡核苷酸探针进行PCR反应。如图6中所示，珠子乳液PCR和随后的限制性内切酶处理导致了预期的DNA片段产生，这表明光裂解和随后的emPCR反应均成功地进行。

    实施例6：

    使用cDNA作为模板的光活化的珠子乳液PCR

    (对应于图7)

    此实施例描述了使用珠子乳液PCR和固定于珠子的光可裂解引物进行的来自人cDNA的特定PCR产物检测。

    将携带对β-2微管蛋白基因特异性的固定的和光可裂解的寡核苷酸探针(序列ID#4、#5)的0.4×10⁶个珠子悬浮在30μl捕获缓冲液(2mM Tris/HClpH 7.5、0.5mM Mg(CH₃-COO)₂)中，该捕获缓冲液含有自HeLa细胞系获得的人cDNA。

    使用实施例5的杂交方法将cDNA与珠子一起孵育。随后，将珠子乳化、辐照并通过实施例5所述进行PCR扩增。

    在完成PCR反应之后，如实施例5所述回收乳化的珠子。然后将经洗涤的珠子进行限制性内切酶处理，通过琼脂糖凝胶电泳进行特定PCR产物分析。作为对照，使用2.4pg的β-2微管蛋白基因的147bp扩增子作为模板进行光活化的珠子乳液PCR。如图7中所示的预期DNA片段表明使用人cDNA作为模板进行的光裂解和随后的emPCR反应均已成功进行。使用HeLacDNA和携带对胆素原(prophobilinogen)脱氨酶基因特异性的固定的和光可裂解的寡核苷酸探针(序列ID#10、#11)的珠子获得了类似的结果。

    实施例7：

    多重光活化的珠子PCR

    (对应于图8和9)

    下列程序在单个管中进行，这些程序包括多模板DNA的捕获、DNA扩增、结合在相应扩增模板上的一组不同珠子的回收。

    a)在悬浮液中的多重光活化的珠子PCR

    此实施例描述了使用在悬浮液中的光活化的珠子PCR进行多种特定PCR产物的同时检测(图8)。

    将一组不同的珠子(各有0.2×10⁶个珠子)悬浮在100μl PCR反应混合物中，所述珠子共价连接在对氨基酮戊酸(aminolaevulinate)合成酶、β-2微管蛋白和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶特异性的固定的和光可裂解寡核苷酸探针(序列ID#4、#5、#6、#7、#8、#9)上(表3)。用氨基酮戊酸合成酶的扩增子(127bp)、β-2微管蛋白基因的扩增子(174bp)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的扩增子(181bp)(各为ca.0.5pg)补充此悬浮液。如实施例4中所述辐照该悬浮液，进行PCR扩增。

    完成PCR反应之后，按照实施例4所述洗涤珠子并进行限制性内切酶处理。离心珠子，然后使用微流色谱芯片(2100生物分析仪，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)对上清液进行特定PCR产物的分析。

    结果显示在图9a中，很清楚的是得到了3个不同的峰，它们代表的片段大小对应于127bp、174bp和181bp扩增子理论上预期的片段大小。

    b)在乳液中的多重光活化的珠子PCR

    此实施例描述了使用在乳液中的光活化的珠子PCR进行多种特定PCR产物的检测(图8)。

    将一组不同的珠子(分别为0.2×10⁶个珠子)悬浮在30μl捕获缓冲液(2mM Tris/HCl pH 7.5、0.5mM Mg(CH₃-COO)₂)中，所述珠子共价连接在对氨基酮戊酸合成酶、β-2微管蛋白和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶特异性的固定的和光可裂解的寡核苷酸探针上(序列ID#4、#5、#6、#7、#8、#9)。捕获缓冲液含有氨基酮戊酸合成酶基因的扩增子(127bp)、β-2微管蛋白基因的扩增子(174bp)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的扩增子(181bp)(各为ca.0.5pg)。

    根据实施例5的方法将DNA杂交到珠子上。然后如实施例5所示将珠子乳化、辐照并进行PCR扩增。在PCR反应完成后，如实施例5中所述回收经乳化的珠子。然后将经洗涤的珠子在37℃进行限制性内切酶处理(ca.5U)2h。离心珠子，然后使用微流色谱芯片(2100生物分析仪，AgilentTechnologies，Santa Clara，CA，USA)对上清液进行特定PCR产物的分析(图9B)。

    结果显示在图9b中，再次很清楚地得到了3个不同的峰，它们代表的片段大小对应于127bp、174bp和181bp扩增子理论上预期的片段大小。因此，结果清楚地证明了本发明对于溶液中以及乳液PCR形式的多重应用具有高度价值。

    实施例8：

    使用单重光活化的珠子乳液PCR的核酸测序

    进行下列试验以测试使用基于焦磷酸盐测序(Margulies，M.，，Nature437(2005)376-80)的高通量测序系统对在珠子乳液PCR后所获得的靶序列进行的特异性检测。

    对于此方法，将平均直径为25-35μm的0.4×10⁶个琼脂糖珠子共价连接到固定的和光可裂解的探针(序列ID#2、#3)上。将这些珠子与4pg的人工239bp扩增子混合。扩增子包含与珠子上的寡核苷酸互补的序列。

    使用实施例5的方法将扩增子退火到珠子上，乳化、辐照并进行PCR扩增。完成PCR反应后，如实施例5所述回收经乳化的珠子。使经洗涤珠子上的DNA变为单链并根据厂家的说明书(GS emPCR试剂盒使用者手册，Roche/454-Life Sciences，Branford，CT，USA)退火测序引物。然后，使用得自Roche/454-Life Sciences(Branford，CT，USA)的基因组序列仪FLX对250000个珠子同时进行焦磷酸盐测序。使用软件GS扩增子变体分析仪(GSAmplicon Variant Analyzer)进行数据处理，确定了所提及的扩增子的排他性检测。

    实施例9：

    使用多重光活化的珠子乳液PCR的核酸测序

    进行下列试验以测试使用基于焦磷酸盐测序(Margulies，M.，等人，Nature437(2005)376-80)的高通量测序系统对在多重珠子乳液PCR后所获得的靶序列同时进行的检测和解码。

    对于此方法，使用平均直径为25-35μm的一组不同珠子，其中各珠子类型共价连接在对氨基酮戊酸合成酶基因、β-2微管蛋白基因和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因特异性的固定的和光可裂解的寡核苷酸探针(序列ID#4、#5、#6、#7、#8、#9)上。将每种珠子类型为0.2×10⁶个珠子的0.6×10⁶个珠子与氨基酮戊酸合成酶基因的扩增子(127bp)、β-2微管蛋白基因的扩增子(174bp)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的扩增子(181bp)(各为ca.0.5pg)混合。使用实施例5的方法将扩增子退火到珠子上，乳化、辐照并进行PCR扩增。完成PCR反应后，如实施例5所述回收经乳化的珠子。

    使经洗涤珠子上的DNA变为单链并根据厂家的说明书(GS emPCR试剂盒使用者手册，Roche/454-Life Sciences，Branford，CT，USA)将测序引物退火。然后，使用得自Roche/454-Life Sciences(Branford，CT，USA)的基因组序列仪FLX对250 000个珠子同时进行焦磷酸盐测序。使用软件GS扩增子变体分析仪进行数据处理，确定同时检测了不同扩增子的混合物。

    【序列表】

    <110>霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)

     

    <120>用于高通量核酸分析的珠子

     

    <130>25935FT

     

    <150>EP09002628

    <151>2009-02-25

     

    <160>11

     

    <170>PatentIn 3.2版

     

    <210>1

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>1

    tgtgcgtccc tactctacc                                              19

     

    <210>2

    <211>20

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>2

    cctatcccct gtgtgccttg                                             20

     

    <210>3

    <211>20

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>3

    ccatctcatc cctgcgtgtc                                             20

    <210>4

    <211>45

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>4

    gcctccctcg cgccatcagc ctggtctttc tatctcttgt actac                      45

     

    <210>5

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>5

    gccttgccag cccgctcagg catcttcaaa cctccatga                             39

     

    <210>6

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>6

    gcctccctcg cgccatcagc ctggaatgag tcgccaccca cg                         42

     

    <210>7

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>7

    gccttgccag cccgctcagc agctcccgct ctaagtcca                             39

     

    <210>8

    <211>46

    <212>DNA

    <213>人工

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>8

    gcctccctcg cgccatcagc ctggactgta gattttatca gactga                    46

     

    <210>9

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>9

    gccttgccag cccgctcagt ggattatact gcctgaccaa                           40

     

    <210>10

    <211>38

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>10

    gcctccctcg cgccatcagg cggagccatg tctggtaa                             38

     

    <210>11

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工

     

    <220>

    <223>单链DNA

     

    <400>11

    gccttgccag cccgctcagc cagggtacga ggctttcaa                            39