一种磁性荧光复合纳米生物探针及其制备方法.pdf

本发明涉及一种多功能纳米复合微球的制备方法，具体涉及一种磁性荧光复合纳米生物探针及其制备方法。本发明中复合纳米微球是以天然有机高分子为基体，通过在交联剂的交联作用将羧甲基壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒和水溶性量子点连接得到，所述荧光量子点分布在磁性纳米颗粒的表面，其中磁性纳米颗粒的粒径大小在10-200nm，量子点的粒径在1.5-10nm；同时复合纳米颗粒经表面官能团修饰后，可与生物分子连接，形成生物探针。本发明反应条件温和，操作方法简单，制备的磁性荧光复合纳米颗粒具有良好的磁性能和荧光性能，在生物标记、生物分离、免疫检测、药物靶向释放、目标成像等领域具有广泛应用前景。

1.  一种磁性荧光复合纳米微球的制备方法，其特征在于，该复合纳米微球是以天然有机高分子为基体，通过在交联剂的交联作用将羧甲基壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒和水溶性量子点连接得到，所述荧光量子点分布在磁性纳米颗粒的表面，其中磁性纳米颗粒的粒径大小在10-200 nm，量子点的粒径在1.5-10 nm。

2.  根据权利要求1所述的一种磁性荧光复合纳米微球，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
（a） 采用共混包埋法制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（CMCH-MNPs）：①称取50-500mg磁性纳米颗粒溶于30 mL pH =7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液中，通氮气去氧，利用超声波清洗机将磁性粒子分散均匀；②称取10-800 mg羧甲基壳聚糖溶于20 mL PBS=7.4的缓冲溶液中，同时加入0.1-0.5 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）活化羧甲基壳聚糖表面的基团；③将①和②两溶液混合，在恒温水浴振荡器中25℃振荡2-6 h，在震荡过程中缓慢滴入浓度为5-20 mg/mL的CaCl₂溶液，进行离子交联共混包覆，反应结束后用磁铁收集产物，再依次用蒸馏水和PBS( pH=7.4)缓冲溶液充分洗涤，即得到羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物；
（b）采用反相微乳液法制备磁性荧光复合纳米微球：
取5-20 mL油相环己烷，1-5 mL表面活性剂曲拉通-100，1-5 mL助表面活性剂正己醇和适量水加入三口瓶中，搅拌30-60min形成均匀的微乳液；将步骤（a）中制备的0.005-0.03 g羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物加入到天然有机高分子的溶液中，超声20-60 min，使磁性纳米微粒分散均匀得到反应溶液A；取制备的浓缩的水相量子点溶于蒸馏水中，得到反应溶液B；将A和B逐滴加入反相微乳液体系中，搅拌30-50 min后加入交联剂，常温下搅拌反应10-30 h，用丙酮破乳，离心分离，再依次用乙醇和蒸馏水交替洗涤，即得到磁性荧光复合纳米微球。

3.  根据权利要求1或2所述的一种磁性荧光复合纳米微球，其特征是，所得到的磁性荧光复合纳米颗粒进行表面官能团修饰，包括以下具体步骤：将磁性荧光复合纳米颗粒分散到水中，加入含有官能团的烷氧基硅烷试剂，搅拌1-36 h，离心分离，得到表面官能团修饰的磁性荧光复合纳米颗粒；所用的含有官能团的烷氧基硅烷试剂包括：氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基三甲氧基硅烷、氨甲基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基三乙氧基硅烷、氨甲基三乙氧基硅烷、氨甲基三丙氧基硅烷、氨乙基三丙氧基硅烷、氨丙基三丙氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、巯乙基三甲氧基硅烷、巯甲基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、巯乙基三乙氧基硅烷、巯甲基三乙氧基硅烷、巯甲基三丙氧基硅烷、巯乙基三丙氧基硅烷、巯丙基三丙氧基硅烷。

4.  根据权利要求1或2所述的一种磁性荧光复合纳米微球的制备，其特征在于，所述的磁性荧光复合纳米微球的粒径为10-220 nm；所述的磁性纳米颗粒（MNPs）为超顺磁、顺磁或铁磁性的金属及金属氧化物，选自Fe₃O₄、Fe₂O₃、MeFe₂O₄(Me=Co、Mn、Ni)、化合物钕铁硼、钐钴等、金属Fe、Co、Ni以及合金Fe₂Co、Ni₂Fe的金属氧化物的纳米颗粒；磁性纳米颗粒的制备方法包括共沉淀法、水热法；磁性纳米颗粒表面含有羟基、氨基、羧基中的至少一种。

5.  根据权利要求1或2所述的一种磁性荧光复合纳米微球，其特征在于，所述的量子点为表面带有亲水基团的水溶性量子点，量子点为II-VI，III-V族半导体材料，或者为II-VI和III-V族半导体材料形成的复合材料，所述量子点粒径为1.5-10 nm；优选的量子点为ZnSe、CdSe、CdTe、CdS、ZnSe/ZnS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、Zn_XCd_1-XSe、CdSe_1-XS_X、CdSe_1-XTe_X、CdSe/ZnSe、CdS/ZnSe、CdTe/ZnSe、CdSe/CdS、CdTe/CdS、CdS/Zn_XCd_1-XS、ZnSe/Zn_XCd_1-XS、CdSe/Zn_XCd_1-XS、CdTe/Zn_XCd_1-XS，其中0＜X＜1。

6.  根据权利要求1或2所述的一种磁性荧光复合纳米微球，其特征在于，所述的天然有机高分子包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖、明胶；壳聚糖溶液是将壳聚糖粉末在2%-6%的弱酸溶液中超声分散30min，配成0.002-0.01 g/mL的壳聚糖凝胶溶液；明胶溶液是将明胶粉末在40-70℃的水浴中溶解，配置体积分数为5%-15%的明胶水溶液；羧甲基壳聚糖溶液是将羧甲基壳聚糖溶在蒸馏水中，配成0.002-0.04 g/mL的羧甲基壳聚糖溶液。

7.  根据权利要求2所述的一种磁性荧光复合纳米微球，其特征在于，步骤（a）中羧甲基壳聚糖的分子量为2×10⁵-2.5×10⁵，羧甲基壳聚糖在磁性纳米颗粒表面的厚度为3-10 nm；步骤（b）中交联剂包括甲醛、乙二醛、戊二醛，浓度为4%-15%；步骤（b）中羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物与量子点的摩尔比为1:1-1:20。

8.  根据权利要求5所述的水溶性量子点的制备，其特征是：所述量子点表面含有巯基、羧基、氨基中的至少一种；半导体量子点合成中所使用的亲水基团配体包括3-巯基丙酸、巯基乙酸、L-半胱氨酸、2-巯基丙酸、巯基丁酸、巯基戊酸、巯基己酸、巯基丁二酸、巯基乙醇、巯基丙醇、巯基乙胺。

9.  根据权利要求6所述的天然有机高分子溶液的制备，其特征在于，所述的弱酸溶液包括蚁酸、冰醋酸、酒石酸、柠檬酸。

10.  一种磁性荧光复合纳米生物探针，其特征是，将权利要求1-3中所述的表面官能团修饰的磁性荧光复合纳米颗粒与生物分子连接形成，所述生物分子包括蛋白质分子、抗体抗原分子、DNA分子、酶等；其中磁性荧光复合纳米颗粒的浓度为0.001-0.1 g/mL。

一种磁性荧光复合纳米生物探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种多功能纳米复合微球的制备方法，具体涉及一种磁性荧光复合纳米生物探针及其制备方法，该复合微粒同时具备了量子点的荧光性能和磁性纳米颗粒的磁性能，可用作生物体内靶向定位和生物荧光成像方面。
背景技术
在生物标识方面，发光的半导体量子点显示出很大的优势。与有机发光材料相比，发光的半导体量子点发射谱窄，能够实现从紫外、可见到红外的可调发光，并且具有宽的激发带，可以利用单一波长的光进行激发而得到不同波长的发射光；同时，半导体量子点具有良好的光稳定性和抗光漂白性，其所固有的窄发射带，使其具有良好的测试灵敏度。理想的磁性荧光微球要求具有较高的比饱和磁化强度、能产生较强的荧光且荧光稳定性良好、微球尺寸可控、粒径分布窄、化学稳定性好、表面含有丰富的功能基团，且制备工艺简单、重复性良好、价格便宜等特点，它不仅可以作为核磁共振造影剂用于疾病诊断，还可以作为药物载体用于疾病治疗以及各种蛋白、细胞等的分离。因此，如果将具有荧光的量子点和磁性材料相结合，得到一种新型的双功能磁性荧光纳米粒子，在分离的同时还能进行光学检测，这将在生物标记、生物分离、免疫检测、药物靶向释放、目标成像等方面具有很大的应用潜力。
目前，制备磁性荧光复合纳米颗粒的方法很多，综合国内外研究现状，荧光磁性复合纳米微粒的制备方法主要有以下几种：第一，磁性材料表面包覆荧光物质；第二，荧光颗粒表面包覆一层磁性物质；第三，将分别具有磁性和荧光的两种纳米粒子同时包裹在二氧化硅或其他高分子材料中。
经对现有的技术检索发现，郭广生等（公开号：CN103372407A，名称：一种磁性荧光复合纳米球的制备方法）通过在Fe₃O₄颗粒表面首先包覆SiO₂壳层，再通过硅烷偶联剂KH-550对Fe₃O₄@SiO₂表面进行氨基修饰，然后将CdSe QDs通过羧基与氨基之间的静电力负载到SiO₂表面，得到终产物磁性荧光复合纳米球。这种通过静电吸引作用将量子点与磁性纳米颗粒连接的方法，由于静电作用力相对较弱，量子点容易从磁性纳米颗粒表面脱落，同时，结合后量子点裸露在复合纳米微粒表面，量子点容易受到环境等其他因素的影响，导致荧光强度降低。罗阳等（公开号：CN102703601A，名称：多功能磁性荧光微球及其制备方法和应用）通过桥连DNA连接磁性纳米材料和量子点，同时分别用生物素和链霉亲和素标记DNA和磁性材料，利用生物素与链霉亲和素、氨基与羧基之间的结合力进行连接，制备磁性荧光复合纳米微粒，该方法制备过程需要用不同的生物分子修饰颗粒表面，使其带有不同的功能基团，制备过程复杂，同时DNA、生物素和亲和素对制备和存放环境要求苛刻。
为了克服现有技术的不足，本发明通过反相微乳液法，以天然有机高分子为基体，通过交联剂的交联作用连接羧甲基壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒和水溶性量子点，最终得到生物相容性良好的磁性荧光复合纳米微粒。由于羧甲基壳聚糖对磁性微粒的修饰作用，有效避免了磁性材料的泄漏及对量子点的荧光淬灭作用；以天然有机高分子为基体，将量子点和磁性微粒包裹在微球里面，作为一种良好的生物有机载体，它具有良好的生物相容性，可降解性。同时有机分子上有大量羟基、氨基等可反应性活性基团，可以利用降解、化学改性等方法改善其溶解性能，增加其水溶性。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性荧光复合纳米生物探针的制备方法，该方法制备的复合纳米微粒具有磁响应性强、光稳定性高、制备简单、分散性好且尺寸均匀等优点，与单一功能的荧光材料和磁性材料相比，同时具有荧光和磁性的多功能纳米复合材料在纳米生物技术中具有更广泛的生物医学应用，如细胞分离及识别、细胞多模式成像分析、活体成像、生化标记及传感等。
本发明是通过以下措施实现的：
一种磁性荧光复合纳米生物探针的制备方法，采用以下步骤：
（a） 采用共混包埋法制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（CMCH-MNPs）：①称取50-500mg磁性纳米颗粒溶于30 mL pH =7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液中，通氮气去氧，利用超声波清洗机将磁性粒子分散均匀；②称取10-800 mg羧甲基壳聚糖溶于20 mL PBS=7.4的缓冲溶液中，同时加入0.1-0.5 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）活化羧甲基壳聚糖表面的基团；③将①和②两溶液混合，在恒温水浴振荡器中25℃振荡2-6 h，在震荡过程中缓慢滴入浓度为5-20 mg/mL的CaCl₂溶液，进行离子交联共混包覆，反应结束后用磁铁收集产物，再依次用蒸馏水和PBS( pH=7.4)缓冲溶液充分洗涤，即得到羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物；
（b）采用反相微乳液法制备磁性荧光复合纳米微球：
取5-20 mL油相环己烷，1-5 mL表面活性剂曲拉通-100，1-5 mL助表面活性剂正己醇和适量水加入三口瓶中，搅拌30-60min形成均匀的微乳液；将步骤（a）中制备的0.005-0.03 g羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物加入天然有机高分子溶液中，超声20-60 min，使磁性纳米微粒分散均匀得到反应溶液A；取制备的浓缩的水相量子点溶于蒸馏水中，得到反应溶液B；将A和B逐滴加入反相微乳液体系中，搅拌30-50 min后加入交联剂，常温下搅拌反应10-30 h，用丙酮破乳，离心分离，再依次用乙醇和蒸馏水交替洗涤，即得到磁性荧光复合纳米微球。
本发明中制备的磁性荧光复合纳米颗粒，其表面带有氨基、羟基和羧基，但对于连接生物分子所需的官能团数量来说还是比较少的，羧基、氨基、巯基、聚乙二醇基都能与生物分子进行选择性连接，因此将复合纳米颗粒制成探针时，为了更好的用于生物应用，可在复合纳米颗粒表面再进行表面官能团修饰，增加复合颗粒上原有官能团的数量。
本发明中所述的磁性荧光复合纳米微球，对所得到的磁性荧光复合纳米颗粒进行表面官能团修饰，包括以下具体步骤：将磁性荧光复合纳米颗粒分散到水中，加入含有官能团的烷氧基硅烷试剂，搅拌1-36 h，离心分离，得到表面官能团修饰的磁性荧光复合纳米颗粒；所用的含有官能团的烷氧基硅烷试剂包括：氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基三甲氧基硅烷、氨甲基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基三乙氧基硅烷、氨甲基三乙氧基硅烷、氨甲基三丙氧基硅烷、氨乙基三丙氧基硅烷、氨丙基三丙氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、巯乙基三甲氧基硅烷、巯甲基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、巯乙基三乙氧基硅烷、巯甲基三乙氧基硅烷、巯甲基三丙氧基硅烷、巯乙基三丙氧基硅烷、巯丙基三丙氧基硅烷。
本发明中所述的磁性纳米颗粒（MNPs）为具有超顺磁、顺磁或铁磁性的金属及金属氧化物，选自Fe₃O₄、Fe₂O₃、MeFe₂O₄(Me=Co、Mn、Ni)、化合物钕铁硼、钐钴等、金属Fe、Co、Ni以及合金Fe₂Co、Ni₂Fe的金属氧化物的纳米颗粒。
本发明中所述的磁性荧光复合纳米微球的粒径为10-220 nm。
本发明中所述的磁性纳米颗粒的制备方法包括共沉淀法、水热法。
本发明中所述的量子点为表面带有亲水基团的水溶性量子点，量子点为II-VI，III-V族半导体材料，或者为II-VI和III-V族半导体材料形成的复合材料，所述量子点粒径为1.5-10 nm；优选的量子点为ZnSe、CdSe、CdTe、CdS、ZnSe/ZnS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、Zn_XCd_1-XSe、CdSe_1-XS_X、CdSe_1-XTe_X、CdSe/ZnSe、CdS/ZnSe、CdTe/ZnSe、CdSe/CdS、CdTe/CdS、CdS/Zn_XCd_1-XS、ZnSe/Zn_XCd_1-XS、CdSe/Zn_XCd_1-XS、CdTe/Zn_XCd_1-XS，其中0＜X＜1。
本发明中所述的天然有机高分子包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖、明胶。
本发明中所述的磁性荧光复合纳米微球，步骤（a）中羧甲基壳聚糖的分子量为2×10⁵-2.5×10⁵，羧甲基壳聚糖在磁性纳米颗粒表面的厚度为3-10 nm。
本发明所述的磁性荧光复合纳米微球，步骤（b）中交联剂包括甲醛、乙二醛、戊二醛，浓度为4%-15%。
本发明所述的磁性荧光复合纳米微球，步骤（b）中羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物与量子点的摩尔比为1:1-1:20。
本发明所述的磁性纳米颗粒表面含有羟基、氨基、羧基中的至少一种。
本发明所述的量子点表面含有巯基、羧基、氨基中的至少一种；半导体量子点合成中所使用的亲水基团配体包括3-巯基丙酸、巯基乙酸、L-半胱氨酸、2-巯基丙酸、巯基丁酸、巯基戊酸、巯基己酸、巯基丁二酸、巯基乙醇、巯基丙醇、巯基乙胺。
本发明所述的天然有机高分子，壳聚糖溶液是将壳聚糖粉末在2%-6%的弱酸溶液中超声分散30min，配成0.002-0.01 g/mL的壳聚糖凝胶溶液；明胶溶液是将明胶粉末在40-70℃的水浴中溶解，配置体积分数为5%-15%的明胶水溶液；羧甲基壳聚糖溶液是将羧甲基壳聚糖溶在蒸馏水中，配成0.002-0.04 g/mL的羧甲基壳聚糖溶液。
本发明所述的弱酸溶液包括蚁酸、冰醋酸、酒石酸、柠檬酸。
本发明中的磁性荧光复合纳米生物探针，是将表面官能团修饰的磁性荧光复合纳米颗粒与生物分子连接形成，所述生物分子包括蛋白质分子、抗体抗原分子、DNA分子、酶等；其中磁性荧光复合纳米颗粒的浓度为0.001-0.1 g/mL。
本发明的有益效果：
（1）本发明通过反相微乳液法，化学交联作用制备磁性荧光复合纳米颗粒，复合颗粒的粒径分布均匀，磁性能和荧光性能优异。所采用的制备方法过程简单，容易操作，可以方便的应用于其它种类的磁性荧光复合纳米球的制备。
（2）本发明通过羧甲基壳聚糖对磁性微粒的修饰作用，有效避免了磁性材料的泄漏及对量子点的荧光淬灭作用；同时以具有良好生物相容性的天然有机高分子为基体，增加了复合纳米微粒的生物活性，使得复合纳米微粒可以广泛应用于生物标记、生物成像及生物分离等领域。
（3）本发明制备的磁性荧光复合纳米生物探针可同时实现对生物分子的荧光标记和磁性分离，有利于生物分子的富集和生物成像，扩大生物探针的应用领域。
附图说明
图1 磁性荧光复合纳米微球的TEM照片
图2 磁性荧光复合纳米微球的荧光光谱和吸收光谱
图3不同摩尔比制备的磁性荧光复合纳米微球
图4 CdTe@ZnS-Fe₂O₃磁性荧光复合纳米微球的荧光光谱和吸收光谱
图5磁性荧光复合纳米微球的数码照片
图6磁性荧光复合纳米微球的磁滞回线。
具体实施方式
下面通过具体实施例说明本发明的技术方案，但是本发明的技术方案不以具体实施例为限。
实施例1：
1.1 采用水相法制备ZnSe量子点。在氮气保护下，将0.01g NaBH₄与0.0061g Se粉溶于2 mL蒸馏水中，加热至40℃，完全溶解后得到NaHSe溶液；取0.0439 g Zn(Ac)₂溶入20 mL蒸馏水中，待其完全溶解后加入还原型谷胱甘肽0.0737g，用1mol/L的NaOH溶液调节pH=11.5，得到Zn的前驱体溶液；将Zn的前驱体转入三口瓶中，在氮气保护下迅速注入NaHSe溶液，油浴100℃回流，磁力搅拌1h后取出放入冰箱中快速冷却至室温，得到无色透明溶液，即为制备好的ZnSe QDs溶液。
1.2 采用水热法制备Fe₃O₄纳米颗粒。称取3 g FeCl₃溶于80 mL乙二醇中搅拌超声溶解，加入分子量为2000的聚乙二醇2 g，醋酸钠7 g，搅拌超声使之溶解，将前驱体溶液转入水热反应釜中，在200℃反应5 h，反应完成后将所得溶液用水与无水乙醇交替洗涤，经真空干燥，得到干燥的Fe₃O₄磁性纳米微粒。
1.3采用共混包埋法制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（CMCH-MNPs）。称取0.2 g Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶于30 mL pH =7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液中，通氮气去氧，利用超声波清洗机将磁性粒子分散均匀，得到分散均匀的Fe₃O₄纳米颗粒溶液；称取0.5 g羧甲基壳聚糖溶于20 mL PBS=7.4的缓冲溶液中，同时加入0.3 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）活化羧甲基壳聚糖表面的基团；之后将羧甲基壳聚糖溶液加入Fe₃O₄纳米颗粒溶液，在恒温水浴振荡器中25℃振荡3 h，在震荡过程中缓慢滴入浓度为10 mg/mL的CaCl₂溶液5 mL，进行离子交联共混包覆，反应结束后用磁铁收集产物，再依次用蒸馏水和PBS( pH=7.4)缓冲溶液充分洗涤，即得到羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物。
1.4 壳聚糖粉末在3%的冰醋酸溶液中超声分散30min，配成0.002 g/mL的壳聚糖凝胶溶液。
1.5采用反相微乳液法制备磁性荧光复合纳米微球。取10 mL油相环己烷，2.5 mL表面活性剂曲拉通-100，2.5 mL助表面活性剂正己醇和1 mL水加入三口瓶中，搅拌30 min形成均匀的微乳液；将步骤1.3中制备的0.01 g羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物加入到0.002 g/mL的壳聚糖凝胶溶液中，超声60 min，使磁性纳米微粒分散均匀，得到反应溶液A；取1.1中制备的水相ZnSe量子点，异丙醇分离提纯后溶于2mL蒸馏水中，得到反应溶液B，其中ZnSe量子点浓度为5×10^-2 mol/L；将A和B加入反相微乳液体系中，搅拌30-50 min后加入10μL戊二醛（浓度为10 %），常温下搅拌反应12 h，用丙酮破乳，离心分离，再依次用乙醇和蒸馏水交替洗涤，即得到磁性荧光复合纳米微球。图1为磁性荧光复合纳米微球的TEM照片。
1.6将步骤1.5制备的磁性荧光复合纳米微球分散到水中，加入氨丙基三甲氧基硅烷，搅拌10h，之后离心分离，得到表面官能团修饰的复合纳米颗粒。
1.7将步骤1.6制备的表面官能团修饰的复合纳米颗粒分散到pH为7.4的PBS缓冲溶液中，其中溶液体积为5mL，复合纳米颗粒的浓度为0.005g/mL，；采用不同的化学方法在复合纳米颗粒表面连接蛋白质分子。
实施例2：
2.1 ZnSe@ZnS量子点溶液的制备。首先采用化学共沉淀法制备ZnSe量子点，制备方法如上述实施例1中所述。取制备好的ZnSe量子点15 mL，其中ZnSe量子点的浓度为2.7×10^-3 mol/L，加入0.0138 g Zn(Ac)₂、0.0277 g还原性谷胱甘肽和0.01 g硫脲，用配置好的浓度为1 mol/L NaOH溶液调节pH值为10.5，在磁力搅拌下，油浴100℃回流，磁力搅拌反应2 h后放入冰箱快速冷却至室温，得到淡黄色水溶性高发光效率的ZnSe@ZnS量子点。
2.2采用水热法制备Fe₃O₄纳米颗粒。取2.78 g FeSO₄·7H₂O、4.32 g FeCl₃·6H₂O溶于30 mL蒸馏水中，磁力搅拌溶解后，再加入30 mL乙二醇，搅拌均匀后在氮气保护下，加入三口瓶中，用配置好的浓度为2 mol/L的NaOH溶液调节pH至9-11，加入表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮0.15 g，充分搅拌后反应30min，制得Fe₃O₄磁性纳米微粒的前驱体。将Fe₃O₄磁性纳米微粒的前驱体转入水热反应釜中，在160℃下反应6h。反应完成后将所得溶液用水与无水乙醇交替洗涤，经真空干燥，得到干燥的Fe₃O₄磁性纳米微粒。
2.3采用共混包埋法制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（CMCH-MNPs）。称取0.3 g Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶于30 mL pH =7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液中，通氮气去氧，利用超声波清洗机将磁性粒子分散均匀，得到分散均匀的Fe₃O₄纳米颗粒溶液；称取0.7 g羧甲基壳聚糖溶于20 mL PBS=7.4的缓冲溶液中，同时加入0.4 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）活化羧甲基壳聚糖表面的基团；之后将羧甲基壳聚糖溶液加入Fe₃O₄纳米颗粒溶液，在恒温水浴振荡器中25℃振荡5 h，在震荡过程中缓慢滴入浓度为15 mg/mL的CaCl₂溶液5 mL，进行离子交联共混包覆，反应结束后用磁铁收集产物，再依次用蒸馏水和PBS( pH=7.4)缓冲溶液充分洗涤，即得到羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物。
2.4 将明胶粉末在60℃的水浴中溶解，配置体积分数为10%的明胶水溶液。
2.5采用反相微乳液法制备磁性荧光复合纳米微球。取15 mL油相环己烷，2.7 mL表面活性剂曲拉通-100，2.7 mL助表面活性剂正己醇和1 mL水加入三口瓶中，搅拌30 min形成均匀的微乳液；将步骤2.3中制备的0.015 g羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物加入到10 %的明胶水溶液中，超声60 min，使磁性纳米微粒分散均匀，得到反应溶液A；取2.1中制备的水相ZnSe@ZnS量子点，异丙醇分离提纯后溶于2mL蒸馏水中，得到反应溶液B，其中ZnSe@ZnS量子点浓度为0.2 mol/L；将A和B加入反相微乳液体系中，搅拌30-50 min后加入15 μL乙二醛（浓度为8 %），常温下搅拌反应15 h，用丙酮破乳，离心分离，再依次用乙醇和蒸馏水交替洗涤，即得到磁性荧光复合纳米微球。图2为制备的磁性荧光复合纳米微球的荧光光谱和吸收光谱。
2.6将步骤2.5制备的磁性荧光复合纳米微球分散到水中，加入巯乙基三甲氧基硅烷，搅拌15h，之后离心分离，得到表面官能团修饰的复合纳米颗粒。
2.7将步骤2.6制备的表面官能团修饰的复合纳米颗粒分散到pH为7.4的PBS缓冲溶液中，其中溶液体积为5mL，复合纳米颗粒的浓度为0.01g/mL，；采用不同的化学方法在复合纳米颗粒表面连接抗原分子。
实施例3：
3.1水相制备CdTe量子点。在氮气保护下，将0.0945g NaBH₄与0.0063g Te粉溶于5 mL蒸馏水中，加热至40℃，完全溶解后得到NaHTe溶液；取0.293 g Cd(Ac)₂溶入100 mL蒸馏水中，待其完全溶解后加入2.0 mmol，用1mol/L的NaOH溶液调节pH=11，得到Cd的前驱体溶液；将Cd的前驱体转入三口瓶中，在氮气保护下迅速注入NaHTe溶液，油浴100℃回流，磁力搅拌6h后取出放入冰箱中快速冷却至室温，得到无色透明溶液，即为制备好的CdTe QDs溶液。
3.2 磁性纳米颗粒的制备。采用专利公开号为CN101597495A的方法制备Fe₃O₄/CoO核壳结构磁性纳米颗粒。
3.3采用共混包埋法制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（CMCH-MNPs）。称取0.4 g Fe₃O₄/CoO磁性纳米颗粒溶于30 mL pH =7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液中，通氮气去氧，利用超声波清洗机将磁性粒子分散均匀，得到分散均匀的Fe₃O₄/CoO纳米颗粒溶液；称取0.8 g羧甲基壳聚糖溶于20 mL PBS=7.4的缓冲溶液中，同时加入0.4 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）活化羧甲基壳聚糖表面的基团；之后将羧甲基壳聚糖溶液加入Fe₃O₄/CoO纳米颗粒溶液，在恒温水浴振荡器中25℃振荡5 h，在震荡过程中缓慢滴入浓度为10 mg/mL的CaCl₂溶液5 mL，进行离子交联共混包覆，反应结束后用磁铁收集产物，再依次用蒸馏水和PBS( pH=7.4)缓冲溶液充分洗涤，即得到羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物。
3.4将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成0.01 g/mL的羧甲基壳聚糖溶液。
3.5采用反相微乳液法制备磁性荧光复合纳米微球。取15 mL油相环己烷，2.7 mL表面活性剂曲拉通-100，2.7 mL助表面活性剂正己醇和1 mL水加入三口瓶中，搅拌30 min形成均匀的微乳液；将步骤3.3中制备的0.02 g羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物加入到0.01 g/mL的羧甲基壳聚糖溶液中，超声60 min，使磁性纳米微粒分散均匀，得到反应溶液A；取3.1中制备的水相CdTe量子点，异丙醇分离提纯后溶于2mL蒸馏水中，得到反应溶液B，其中CdTe量子点浓度为0.4 mol/L；将A和B加入反相微乳液体系中，搅拌30-50 min后加入15 μL乙二醛（浓度为12%），常温下搅拌反应18 h，用丙酮破乳，离心分离，再依次用乙醇和蒸馏水交替洗涤，即得到磁性荧光复合纳米微球。图3为不同摩尔比制备的磁性荧光复合纳米微球。
3.6将步骤3.5制备的磁性荧光复合纳米微球分散到水中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌20h，之后离心分离，得到表面官能团修饰的复合纳米颗粒。
3.7将步骤3.6制备的表面官能团修饰的复合纳米颗粒分散到pH为7.4的PBS缓冲溶液中，其中溶液体积为5mL，复合纳米颗粒的浓度为0.05g/mL，；采用不同的化学方法在复合纳米颗粒表面连接抗体分子。
实施例4：
4.1采用水相法制备CdTe@ZnS量子点. 首先采用化学共沉淀法制备CdTe量子点，制备方法如上述实施例3中所述，不同点是反应时间为2h。取制备好的CdTe量子点溶在30 mL蒸馏水中，其中CdTe量子点的浓度为1.67×10^-3 mol/L，加入0.0352 g Zn(Ac)₂、0.0984 g还原性谷胱甘肽，用配置好的浓度为1 mol/L NaOH溶液调节pH值为8，在磁力搅拌下，油浴100℃回流，磁力搅拌反应2 h后放入冰箱快速冷却至室温，得到水溶性高发光效率的CdTe@ZnS量子点。
4.2 磁性纳米颗粒的制备。采用专利公开号为CN 101928043 A的方法制备α-Fe₂O₃磁性纳米颗粒。
4.3采用共混包埋法制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（CMCH-MNPs）。称取0.3 g α-Fe₂O₃磁性纳米颗粒溶于30 mL pH =7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液中，通氮气去氧，利用超声波清洗机将磁性粒子分散均匀，得到分散均匀的α-Fe₂O₃纳米颗粒溶液；称取0.6 g羧甲基壳聚糖溶于20 mL PBS=7.4的缓冲溶液中，同时加入0.4 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）活化羧甲基壳聚糖表面的基团；之后将羧甲基壳聚糖溶液加入α-Fe₂O₃纳米颗粒溶液，在恒温水浴振荡器中25℃振荡3 h，在震荡过程中缓慢滴入浓度为15 mg/mL的CaCl₂溶液5 mL，进行离子交联共混包覆，反应结束后用磁铁收集产物，再依次用蒸馏水和PBS( pH=7.4)缓冲溶液充分洗涤，即得到羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物。
4.4壳聚糖粉末在4%的柠檬酸溶液中超声分散30min，配成0.005 g/mL的壳聚糖凝胶溶液。
4.5采用反相微乳液法制备磁性荧光复合纳米微球。取20 mL油相环己烷，5 mL表面活性剂曲拉通-100，5 mL助表面活性剂正己醇和1.5 mL水加入三口瓶中，搅拌30 min形成均匀的微乳液；将步骤4.3中制备的0.03 g羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物加入到0.005 g/mL的壳聚糖溶液中，超声60 min，使磁性纳米微粒分散均匀，得到反应溶液A；取4.1中制备的水相CdTe@ZnS量子点，异丙醇分离提纯后溶于2 mL蒸馏水中，得到反应溶液B，其中CdTe@ZnS量子点浓度为0.8 mol/L；将A和B加入反相微乳液体系中，搅拌30-50 min后加入15 μL戊二醛（浓度为15%），常温下搅拌反应24 h，用丙酮破乳，离心分离，再依次用乙醇和蒸馏水交替洗涤，即得到磁性荧光复合纳米微球。图4为制备的CdTe@ZnS-Fe₂O₃磁性荧光复合纳米微球的荧光光谱和吸收光谱；图5为磁性荧光复合纳米微球的数码照片。
4.6将步骤4.5制备的磁性荧光复合纳米微球分散到水中，加入巯丙基三乙氧基硅烷，搅拌25h，之后离心分离，得到表面官能团修饰的复合纳米颗粒。
4.7将步骤4.6制备的表面官能团修饰的复合纳米颗粒分散到pH为7.4的PBS缓冲溶液中，其中溶液体积为5mL，复合纳米颗粒的浓度为0.08g/mL，；采用不同的化学方法在复合纳米颗粒表面连接DNA分子。
实施例5：
5.1采用水相法制备CdSe量子点. 在氮气保护下，将0.0106 g NaBH₄与0.0063 g Se粉溶于2 mL蒸馏水中，加热至40℃，完全溶解后得到NaHSe溶液；取0.0533 g Cd(Ac)₂溶入20 mL蒸馏水中，待其完全溶解后加入1.0 mmol，用1mol/L的NaOH溶液调节pH=11.5，得到Cd的前驱体溶液；将Cd的前驱体转入三口瓶中，在氮气保护下迅速注入NaHSe溶液，油浴100℃回流，磁力搅拌1h后取出放入冰箱中快速冷却至室温，得到无色透明溶液，即为制备好的CdSe QDs溶液。
5.2 磁性纳米颗粒的制备。取1.39 g FeSO₄·7H₂O、2.16 g FeCl₃·6H₂O溶于50 mL蒸馏水中，磁力搅拌溶解后，在氮气保护下，加入三口瓶中，水浴加热至80℃，机械搅拌下，加入表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮0.1 g，用配置好的浓度为15%的氨水溶液调节pH至9-11，充分搅拌后反应60min，制得Fe₃O₄磁性纳米微粒。反应完成后将所得溶液用水与无水乙醇交替洗涤，经真空干燥，得到干燥的Fe₃O₄磁性纳米微粒。
5.3采用共混包埋法制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（CMCH-MNPs）。称取0.3 g Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶于30 mL pH =7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液中，通氮气去氧，利用超声波清洗机将磁性粒子分散均匀，得到分散均匀的Fe₃O₄纳米颗粒溶液；称取0.8 g羧甲基壳聚糖溶于20 mL PBS=7.4的缓冲溶液中，同时加入0.4 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）活化羧甲基壳聚糖表面的基团；之后将羧甲基壳聚糖溶液加入Fe₃O₄纳米颗粒溶液，在恒温水浴振荡器中25℃振荡4 h，在震荡过程中缓慢滴入浓度为10 mg/mL的CaCl₂溶液5 mL，进行离子交联共混包覆，反应结束后用磁铁收集产物，再依次用蒸馏水和PBS( pH=7.4)缓冲溶液充分洗涤，即得到羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物。
5.4壳聚糖粉末在3%的冰醋酸溶液中超声分散30min，配成0.01 g/mL的壳聚糖凝胶溶液。
5.5采用反相微乳液法制备磁性荧光复合纳米微球。取20 mL油相环己烷，5 mL表面活性剂曲拉通-100，5 mL助表面活性剂正己醇和1.5 mL水加入三口瓶中，搅拌30 min形成均匀的微乳液；将步骤5.3中制备的0.03 g羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物加入到0.01 g/mL的壳聚糖溶液中，超声60 min，使磁性纳米微粒分散均匀，得到反应溶液A；取5.1中制备的水相CdSe量子点，异丙醇分离提纯后溶于2 mL蒸馏水中，得到反应溶液B，其中CdSe量子点浓度为1.0 mol/L；将A和B加入反相微乳液体系中，搅拌30-50 min后加入15 μL乙二醛（浓度为15%），常温下搅拌反应24 h，用丙酮破乳，离心分离，再依次用乙醇和蒸馏水交替洗涤，即得到磁性荧光复合纳米微球。图6为制备的磁性荧光复合纳米微球的磁滞回线。
5.6将步骤5.5制备的磁性荧光复合纳米微球分散到水中，加入氨甲基三乙氧基硅烷，搅拌30h，之后离心分离，得到表面官能团修饰的复合纳米颗粒。
5.7将步骤5.6制备的表面官能团修饰的复合纳米颗粒分散到pH为7.4的PBS缓冲溶液中，其中溶液体积为5mL，复合纳米颗粒的浓度为0.1g/mL，；采用不同的化学方法在复合纳米颗粒表面连接酶分子。