技术领域
本发明涉及生物医药和动物繁殖技术领域，具体地说，涉及重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
猪促卵泡素(Porcine Follicle-stimulating hormone，简称pFSH)是猪垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，pFSH可以促进母猪子宫内膜、卵巢和卵泡的生长；促进雌激素的合成与分泌；诱导公猪曲细精管的发育和维持精子生成。pFSH在动物繁殖领域中常用于同期发情、超数排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治疗。
pFSH含有α和β两个亚基，α亚基负责信号转录，β亚基参与受体结合发挥生物功能。pFSH的α亚基与垂体的其他糖蛋白激素，如猪促黄体素(pLH)、猪促甲状腺素(pTSH)的α亚基完全相同，由96个氨基酸残基组成，含有2个N-连接糖基化位点，位于N56和N82。而pFSH、pLH和pTSH的β亚基不同，pFSH β亚基含有109个氨基酸残基，亦含有2个N-连接糖基化位点，位于N5和N22。
目前动物繁殖领域常见的促性腺类激素主要包括猪垂体FSH(pFSH)和孕马血清促性腺激素(PMSG)。pFSH主要从猪脑垂体中提取纯化，如Folltropin-V(加拿大贝尔尼奇公司)，纯度不高，含量少，价格昂贵，且因LH的存在，副作用大。此外半衰期短(大鼠体内半衰期约为5h)，用于家畜同期发情和超数排卵，需要连续注射3-5天，增加了用户的药物投入成本和劳动力，所以在实际应用中受到限制。PMSG是一种马属动物胎盘尿囊绒毛膜细胞分泌的糖蛋白激素，兼具FSH(高)和LH(低)活性，半衰期长(在牛中可达120h以上)，药效持久，仅需注射一次即可获得理想效果。但是PMSG主要是从怀孕母马血清中提取的，来源有限、产品批次差异大，采血过多会导致母马流产、胎马死亡。
基于猪垂体FSH和PMSG在实际应用中的不便和限制，须开发长效FSH制剂，以延长pFSH半衰期，增加pFSH在动物体内的残留时间。
发明内容
本发明的目的是提供重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用。
本发明的构思如下：通过增加FSH的糖基化程度使其分子质量和体积增加，肾小球的肾清除率降低，FSH在体内的作用时间延长。CTP包含了数个O-连接糖基化位点，能增加唾液酸糖基化侧链，提高糖蛋白的分子质量。使用哺乳动物表达体系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达重组蛋白，能获得在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然的蛋白分子。
为了实现本发明目的，本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合。
其中，所述绒毛膜促性腺激素来自于人、灵长类或马属哺乳动物。优选来自人和马。
人CTP由28个氨基酸残基组成，含有4个O-连接糖基化位点；马CTP由35个氨基酸残基组成，含有12个O-连接糖基化位点。
所述融合蛋白为pFSH-hCTP或pFSH-eCTP。
pFSH-hCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-hCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSH α亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；hCTP是指人绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。
优选地，所述融合蛋白pFSH-hCTP中的pFSHβ-hCTP为：
i)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白；或
ii)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由i)衍生的蛋白；或
iii)与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。
pFSH-eCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-eCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；eCTP是指马绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。
优选地，所述融合蛋白pFSH-eCTP中的pFSHβ-eCTP为：
iv)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列构成的蛋白；或
v)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由iv)衍生的蛋白；或
vi)与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。
所述pFSHα的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ ID NO:1同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。
经过修饰的蛋白，包括两种融合蛋白pFSH-hCTP、pFSH-eCTP或猪FSH经过糖基化、聚乙二醇化、乙酰化或与BSA结合等，均属于本发明的保护范围。
经过改造的蛋白，包括两种融合蛋白pFSH-hCTP、pFSH-eCTP或猪FSH蛋白与CTP或与其他蛋白融合构成的不改变猪FSH蛋白活性的融合蛋白，均属于本发明的保护范围。
本发明还提供表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系，其包含编码上述猪FSH-CTP融合蛋白的核酸。
本发明的长效重组猪FSH-CTP融合蛋白可按如下方法制备得到：
所述融合蛋白pFSH-hCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-hCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，
将优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。
所述融合蛋白pFSH-eCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-eCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，
将优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。
其中，优化后的pFSHα、pFSHβ-hCTP和pFSHβ-eCTP的基因序列分别如SEQ ID NO:2、4和6所示。
本发明所述表达载体为真核表达载体，包括但不限于pcDNA3.1，所述宿主细胞为真核细胞，包括但不限于293、CHO细胞。
本发明还提供一种促排卵药物或组合物，其活性成分为所述重组猪FSH-CTP融合蛋白pFSH-hCTP和/或pFSH-eCTP。
本发明还提供所述重组猪FSH-CTP融合蛋白的以下任一种应用：
1)促进动物繁殖中的应用，包括同期发情、超数排卵；
2)治疗动物生殖相关疾病的药物制备中的应用。
其中，所述动物为哺乳动物，包括猪、牛、羊、马或狗；优选猪。
本发明还提供上述长效重组猪FSH-CTP融合蛋白在动物繁殖领域中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，纯化后的蛋白纯度高，约95％，质量均一，安全系数高，便于大规模生产。
(二)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，pFSH-hCTP在大鼠中的半衰期约为25.7h，pFSH-eCTP约为36.4h，半衰期大于猪垂体FSH(5h)，一个发情周期只需注射一针，无需连续注射，降低了投药成本和劳动力。
(三)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，促进母猪同期发情和超数排卵，进而提高母猪的产仔性，其中同期发情有效性在80％以上，头均排卵数约为21-24枚，头产仔数约为11-13头，优于PMSG和pFSH。
(四)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，也能提高牛、羊的同期发情和超数排卵，其中荷斯坦母牛的头均胚胎为5.6-6.9枚，pFSH-hCTP和pFSH-eCTP对母山羊的同期发情率达93％和80％，优于PMSG和pFSH。
(五)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，蛋白纯度高、质量均一，安全性高，可有效延长猪FSH的半衰期，减少给药次数；提高猪、牛、羊等的发情率和排卵数，可替代pFSH和PMSG在动物繁殖领域中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中pFSH-hCTP的SDS-PAGE非还原电泳图。其中，MK：蛋白Marker；1：澄清发酵液；2：Capto MMC收集液；3：Butyl收集液；4：Capto Q收集液。
图2为本发明实施例1中pFSH-eCTP的SDS-PAGE非还原电泳图。其中，MK：蛋白Marker；1：澄清发酵液；2：Capto MMC收集液；3：Butyl收集液；4：Capto Q收集液。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中所用pFSH为市售猪垂体促卵泡素产品。
实施例1 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白的制备
在基因库中搜索猪FSHα(GenBank NM-214446.1)、猪FSHβ(GenBank NM-213875.1)、人CGβ(GenBank NM-000737.3)、马CGβ(GenBank NM-001197093.1)的基因序列。进行密码子优化：pFSHα核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示；pFSHβ-hCTP序列，如SEQ ID NO:4所示；pFSHβ-eCTP序列，如SEQ ID NO:6所示。
将人工合成的pFSHα、pFSHβ-hCTP和pFSHβ-eCTP基因，分别克隆到载体pcDNA3.1中。分别将pFSHα和pFSHβ-hCTP、pFSHα和pFSHβ-eCTP的重组载体电转转入293细胞中表达pFSH-hCTP和pFSH-eCTP，对瞬转表达的蛋白进行纯化验证活性。存在活性后分别将pFSHα和pFSHβ-hCTP、pFSHα和pFSHβ-eCTP的重组载体线性化后电转转入CHO细胞中获得pFSH-hCTP和pFSH-eCTP的稳转细胞系。
将稳转细胞接入发酵罐内进行发酵培养，发酵液通过两级深层过滤膜包去除细胞和细胞碎片，然后用0.22μm滤膜过滤，获得澄清的发酵液。澄清的发酵液首先用弱阳离子交换层析(如Capto MMC,GE Healthcare)纯化：用平衡液(20mM乙酸铵，pH5.0)平衡上样，之后用洗脱液(50mM甘氨酸，1M氯化钾，pH8.0)洗脱、收集洗脱液。其次将弱阳离子交换层析收集液用疏水层析(如Butyl,GE Healthcare)纯化：用平衡液(50mM甘氨酸，1M氯化钾，pH8.0)平衡上样，之后用洗脱液(10mM PB，pH8.0)洗脱、收集洗脱液。最后将疏水层析收集液用强阴离子交换(如Capto Q，GE Healthcare)层析进一步纯化：用平衡液(50mM甘氨酸，pH8.0)平衡上样，之后用洗脱液(50mM甘氨酸，1M KCl，pH8.0)洗脱，收集得到纯化的目的蛋白。对目的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(图1和图2)。
实施例2 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白的活性检测
采用大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)测定pFSH-hCTP和pFSH-eCTP的活性。本发明产品可代替PMSG在动物繁殖领域使用，因此参照“血促性素生物检定法”检定药品活性，以PMSG作为标准品。具体实施如下：将pFSH-hCTP(预估比活10000U/mg)、pFSH-eCTP(预估比活10000U/mg)和PMSG均配制成40IU、20IU和10IU高、中、低三个剂量。选取日龄21-23天、体重40-55g雌性SD(Sprague Dawley)大鼠随机分成9组，每组6只。每只大鼠皮下注射0.5ml相应药品，6日后，将大鼠处死，称体重，解剖，摘出卵巢，称重，换算成每100g体重的卵巢重。使用中检所《药典生物检定统计BS2000》软件计算pFSH-hCTP的比活约为7900U/mg，pFSH-eCTP的比活约为8700U/mg。
实施例3 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白的药代动力学研究
选取10只40g左右的雌性SD大鼠，随机分为两组：pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组。皮下注射20IU/kg体重的相应药品，分别在给药0、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144h后取血100μl，3000rpm离心取血清-80℃冻存。使用FSH ELISA试剂盒检测血清中pFSH-hCTP和pFSH-eCTP的含量，每个血样重复分析三次。使用Pksolver软件计算pFSH-hCTP半衰期为25.7h，pFSH-eCTP半衰期为36.4h，高于猪垂体FSH(pFSH在大鼠体内的半衰期约为5h)。
实施例4 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在促进初产和经产母猪同期发情和超数排卵中的应用
分别选取80头初产大白母猪、断奶2周后没有发情的经产大白母猪，体重85-100kg，品种相同，体征接近。随机分为4组：pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组；各组组内再分为初产母猪组和经产母猪组。分别在pFSH-hCTP、pFSH-eCTP和PMSG组供体猪耳后颈部肌肉注射1000IU相应药品，间隔72h后注射500IU HCG。pFSH组供体猪每日早晚两次肌肉注射400IU pFSH，注射4天，每天100IU，最后一次72h后注射500IU HCG。注射pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG或首次注射pFSH 5天后观察记录各组母猪的发情情况。将发情母猪与同系公猪配种3次，每次间隔12h。在第一次配种36h后，对供体猪手术采卵，计算排卵数。
结果如表1所示，各组供体母猪发情良好，pFSH-hCTP组初产和经产母猪发情率分别为80％和85％，pFSH-eCTP组初产和经产母猪发情率分别为65％和60％，均高于PMSG组(50％和55％)和pFSH组(60％和55％)，且pFSH-hCTP组与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)。
各组母猪的排卵数均高于正常自然发情母猪的排卵数(8-14枚/头)，pFSH-hCTP组初产和经产母猪的头均排卵数分别为23.7枚和22.9枚，pFSH-eCTP组初产和经产母猪的头均排卵数分别为21.3枚和21.5枚，两组母猪的头均排卵数均高于PMSG组(19.1枚和19.4枚)和pFSH组(20.6枚和20.3枚)，且pFSH-hCTP组初产母猪和经产母猪与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)，pFSH-eCTP组初产母猪和经产母猪与PMSG组比差异显著(P<0.05)。
实施例5 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在提高母猪产仔数的应用
选择40头初产大白母猪，体重85-100kg，品种相同，体征接近。分4组：pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组，依实施例4中方法对各组母猪注射相应药品。母猪发情后，选择发情的母猪与同系公猪配种3次，每次间隔12h。详细记录各组母猪的发情率和产仔数。
结果如表2所示pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母猪总产仔数分别为100头和64头，均高于PMSG组(49头)和pFSH组(53头)，且pFSH-hCTP组与PMSG组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组的胎均产仔数分别为12.5头和10.7头，亦高于PMSG组(9.8头)和pFSH组(8.8头)。
表2 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对初产母猪产仔数的比较
注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
实施例6 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在治疗乏情母猪中的应用
选择60头断奶后21天以上仍未发情的乏情大白母猪，随机分成4组pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组，依实施例4的方法对供体猪注射相应药品。观察母猪的发情特征：如阴户红肿、有粘液；压背时出现静立反应。将发情后的母猪与公猪进行配种，记录受胎情况。
结果如表3所示，乏情母猪对药品反应敏感，pFSH-hCTP和pFSH-eCTP组母猪的发情率分别为87％和67％，均高于PMSG组(53％)和pFSH组(53％)，且pFSH-hCTP组与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP和pFSH-eCTP组母猪的受孕率分别为85％和80％，亦均高于PMSG组(75％)和pFSH组(63％)。
表3 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对诱导乏情母猪的发情比较
注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
实施例7 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在促进母牛超数排卵中的应用
选择40头3-6岁龄体质健康、无疾病的荷斯坦母牛，随机分为pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组。各组母牛在原有饲喂基础上加喂1kg精料，同时肌肉注射VA、VD和VE。每头供体牛埋植孕酮阴道栓CIDR(含黄体酮1.56g/支)。放栓当天记为0天，pFSH-hCTP、pFSH-eCTP和PMSG组供体牛分别肌肉注射1000IU相应药品(Day5)，同时再注射0.5mg氯前列烯醇(PG)，撤栓(Day10)。pFSH组供体牛于Day6至Day9天开始依每日两次递减肌肉注射370IU pFSH，注射剂量分别为Day6 80/80IU、Day7 50/50IU、Day8 35/35IU、Day9 20/20IU，Day9注射pFSH的同时注射0.4mg PG，Day10撤栓。观察各组供体牛的发情情况，以供体牛接受公牛爬跨为准。站立发情12h后第一次输精，24h后第二次输精。16天非手术冲洗采集胚胎，统计胚胎数。
结果如表4所示，各给药组供体牛超排效果显著(自然情况下，一头母牛一次只产生一枚胚胎)，pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母牛头均胚胎数分别为6.9枚和5.6枚，高于pFSH组(4.4枚)，且pFSH-hCTP组与PMSG组(5.6枚)和pFSH组比差异显著(P<0.05)，pFSH-eCTP组与pFSH组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母牛头均可用胚胎数分别为5.4枚和4.1枚，均高于PMSG组(3.9枚)和pFSH组(3.1枚)，且pFSH-hCTP组与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)，pFSH-eCTP组与pFSH组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母牛头均不可用胚胎数均为1.5枚，均低于PMSG组(1.7枚)但高于pFSH组(1.3枚)。
表4 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对荷斯坦母牛超数排卵的比较
注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
实施例8 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在促进母山羊同期发情中的应用
选择60只1.5-3岁，体重30-45kg、体质健康、无疾病的母山羊，随机分为pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组。于发情周期任一天给供体羊放置孕酮阴道栓并记为0天，pFSH-hCTP、pFSH-eCTP和PMSG组供体羊分别肌肉注射300IU相应药品(Day10)，撤栓(Day12)。pFSH组于Day10和Day11分别注射25IU pFSH。观察母山羊的发情表现，并用试情公羊进行试情。以母羊外阴发红、流黏液并接受爬跨视为发情，计算发情率。
结果如表5所示，各组母羊发情明显，pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母羊发情率分别为均93％和80％，均高于PMSG组(67％)和pFSH组(67％)。
表5 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对母山羊的发情比较
注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京伟杰信生物科技有限公司
<120> 重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用
<130> KHP181112396.2
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 1
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Val Ile Leu Ala Ile Leu Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Gln Ile Leu His Ser Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met
20 25 30
Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys
35 40 45
Leu Gly Ala Pro Ile Tyr Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala
50 55 60
Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn
65 70 75 80
Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala
85 90 95
Thr Val Met Gly Asn Ala Arg Val Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys
100 105 110
Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
115 120
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ttctcccggg cttaccctac ccctgcccgg tccaagaaga ccatgctggt gcccaagaac 240
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val
85 90 95
Ala Thr Glu Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys
100 105 110
Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys
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Glu Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
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Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
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<212> DNA
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atcaacacca cctggtgcgc tggctactgc tacaccaggg acctggtgta caaggacccc 180
gccaggccca acatccagaa gacctgcacc ttcaaggagc tggtctacga gaccgtcaag 240
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cactgcggaa agtgcgactc cgactccacc gactgcacag tgaggggcct cggccctagc 360
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ccttcccctt ccaggctgcc tggcccttcc gataccccca tcctgcccca a 471
<210> 5
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys
20 25 30
Glu Glu Cys Asn Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly
35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn
50 55 60
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Ser Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser Ser His Pro Leu Pro
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<210> 6
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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tgcgagctga ccaacatcac catcaccgtg gagaaggagg agtgcaactt ctgcatcagc 120
atcaacacca cctggtgcgc cggctactgc tacaccaggg acctggtgta caaggaccct 180
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gtgcccggct gtgcccacca tgccgattcc ctgtacacct accccgtggc taccgagtgc 300
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