技术领域
本发明属于农药残留检测方法，特别属于一种生长素类或结构类似物残留的检测方 法。
背景技术
农产品中农药残留问题日益受到人们广泛的关注，而生长素类农药，尤其是二氯喹 啉、2，4-D等除草剂在水稻等作物田连年大量使用，造成这类除草剂在农产品中残留超 标。加强和建立对这类农药残留的检测方法和监测技术研究对保障人们健康，保护生态 环境具有重要意义。
目前农产品中农药残留检测方法，大体上可分为两类。一类是理化检测法，它利用 农药独特理化性质作为指标来确定农药的种类和浓度。如分光光度法、原子吸收光谱法、 薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、毛细管电脉 仪技术（CZE），色质联用技术（GC-MS、HPLC-MS），超临界流体色谱技术（SFC），直接 光谱分析技术等。但是，这些技术方法中最常用的是气相色谱法和液相色谱法，具有灵 敏高、重现性好等优点，但是一些缺点使其应用受到限制，如仪器昂贵、检测成本高、 仪器操作需专业人员，前处理要求较高，检测同期长等缺点。
另外一类是生物检测方法，其原理是利用农药独特的生物学效应作为检测农药的指 标。首先，在个体或组织水平上，利用农药对敏感生物的独特的生长发育影响、如造成 变色、畸形等表观的改变为指标来确定农药的种类和残留量。如用玉米或其它指示植物 根长受抑制来检测土壤中磺酰脲类除草剂等。此法不需要仪器和前处理，对各种毒物都 可以测定，但敏感生物不易获得且敏感性不易保持，不能精确定量分析。其次蛋白质水 平上。如，根据有机磷类农药或氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱碱酯酶（AChE）的抑制效 应，开发的速测卡和速测仪，但该方法只能用于有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂检测，其 灵敏度受温度影响，结果需用标准仪器检验方法进一步确认。再如，利用抗原与抗体的 特异性结合的免疫分析法：酶联免疫法（ELISA法），特异性强，灵敏度高，但抗体制备 比较困难，不能肯定试样中的农药品种时，有一定的盲目性，易出现假阴，假阳性现象。
生物检测方法比理化检测方法更简单环保，所以应该大力发展生物检测方法。
发明内容
本发明小组惊讶的发现，利用植物中GH3(GretchenHagen3)基因可以灵敏的检测 植物中生长素类农药或其结构类似物残留。
本发明选择苗期刚离体的大豆叶片（来自3-5叶期植株）作为检测对象，以离体叶 片的叶柄部接触吸收被检样品的水溶液，1小时后，提取大豆叶片的总RNA，反转录后 用PCR扩增GH3基因，检测处理大豆叶片中GH3表达量变化量。
一方面，本发明提供一种检测液体样本中是否含有生长素类农药或其结构类似物残留的 方法，该方法包括：
（1）、摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄侵入液体样本中1小时，从药液中取出大豆 叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照；
（2）、以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因；检测GH3基因在步骤1处理过 的大豆体内的相对表达量；如果相对表达量大于5以上，则说明书样本中含有生长素类 农药或与生长素农药类似的结构。
在一些优选的方式中，内参SKIP16基因的序列为CD397253；GH3基因的序列为 XM_003543231.1；检测内参基因的引物序列为GAGCCCAAGACATTGCGAGAG和 CGGAAGCGGAAGAACTGAACC；检测GH3基因的引物序列为：CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA 和CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA。
在一些优选的方式中，相对表达量大于10-15。优选的，相对表达量为10或15.
在另一些优选的方式中，所述的生长素农药为苯氧羧酸类，二氯喹啉酸或多菌灵中的 一种或几种。在另一些优选的方式中，所述的生长素农药为二氯喹啉酸。
在一些优选的方式中，相对表达量的检测采用Real-TimePCR，其条件如下：
内参基因的反应体系如下：总体积为25ul，其中ddH2O:10.5ul；SYBRPremixex TaqTM(2×):12.5ul；PCR-F(10uM):0.5ul；PCR-R(10uM):0.5ul；模板cDNA： 1.0ul；标志基因的反应体系如下：总体积为25ul，其中ddH2O:10.5ul；SYBRPremix exTaqTM(2×):12.5ul；PCR-F1(10uM):0.5ul；PCR-R1(10uM):0.5ul；模板cDNA： 1.0ul；反应条件：95℃，1min；45个循环：95℃，10sec；62℃,在25sec收集荧光 熔点曲线分析，55℃to95℃。
在另一些优选的方式中，所述的液体样本来自植物组织的提取液，或者环境土壤、 水、或者其他组织的提取液体。
在另一方面，本发明提供一种GH3基因的新用途，一种把GH3基因作为检测生长素类农 药或其结构类似物残留的用途。
优选的方式中，根据所述的用途，其中，检测GH3基因的表达量来检测液体样本中是否 含有生长素类农药或其结构类似物残留，其中检测方法如下：
（1）、摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄浸入液体样本中1小时，从液体样本中取出大豆 叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照；
（2）、以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因，检测GH3基因在步骤1处理过 的大豆体内的相对表达量；如果相对表达量大于5以上，则说明书液体样本中含有生长 素类农药或与生长素农药类似结构的农药残留。
有益效果
标志基因法检测农产品中残留农药具有一定的优势，首先它可实现大规模、高通量 的样品量检测，检测周期短、出结果快，只需要几个小时便可得结果。本发明的方法可 迅速排除绝大多数非生长素类农药，确定被测样品中是否含有生长素类农药，可大幅度 缩小盲样的检测范围，基本上可定性决断存在生长素类农药，因而可以作为仪器检测前 的补充方法。可减少仪器检测的盲目性。另外，本发明的方法可以极大的提高检测的灵 敏度，那些依靠液相色谱仪器不能检测的农药残留，通过本发明的方法也可以检测得出 来。
附图说明
图1为标志基因只被激素类农药或其结构类似物诱导10倍以上的比较图，其中1. 清水对照；2.草甘膦；3.2甲4氯；4.乙草胺；5.二甲戊灵；6.甲磺隆；7.莠去津； 8.盖草能；9.百草枯；10.二氯喹啉酸；11.氟虫腈；12.毒死蜱；13.阿维菌素；14.吡 虫啉；15.氯氟氰菊酯；16代森锰锌；17.戊唑醇；18.多抗霉素；19.井冈霉素；20.百 菌清；21.多菌灵。
图2为标志基因GH3的相对表达量与目标农药二氯喹啉酸浓度之间的关系。浓度0 为清水对照，浓度1为最高浓度（常规浓度0.5g/L），8为最低渡，6为二氯喹啉酸的 HPLC的检出限。
具体实施方式
实施例1
此部分的材料与方法用于证明，GH3基因只受生长素类农药或其类似物的诱导表 达量达10倍以上。证明GH3基因表达与生长素类农药或其类似物的定性关系，也就是 要证明GH3基因可以作为检测生长素类农药或其类似物的标志基因。
1.1材料
植物：3-5叶期大豆植株（浙春3号）。
农药：根据作用机理不同，市购20种生产上常用农药。其中包括9种除草剂、5种 杀虫剂和6种杀菌剂（表1）。
表1本实验中使用的农药
1.2大豆叶片与农药的接触方法
根据农药使用说明书标明的推荐用量，按照上表所示，把20种不同作用机制农药 配成相同浓度的药液。摘取大豆叶片，立即以叶柄浸入药液中1小时，把大豆叶片从药 液中取出大豆叶片，立即保存在液氮中，或直接用于总RNA提取。同时取清水处理大豆 叶片作对照。
1.3模板cDNA的合成
根据多糖多酚RNA提取试剂盒（杭州浩基生物科技有限公司）说明书，提取大豆总 RNA，用SuperscriptTMIIRTase(Invitrogen)试剂在PCR仪上以AnchoredOlig(dT)20 为引物逆转录合成cDNA第一条链，以把大豆RNA反转录成cDNA于-20℃保存。 1.4标志基因表达量的测定
1.4.1荧光引物设计与合成
采用PrimerPremier6.0和Beacondesigner软件进行荧光引物的设计，以： SKIP16(GeneBankAccession（基因库中登录的编号）:CD397253)基因为内参，以GH3.6 (GeneBankAccessionnumber:XM_003543231.1)为标志基因，由上海生物工程有限公司 合成，内参、引物及其各自产物信息如下：
标志基因GH3.6(GeneBankAccessionnumber:XM_003543231.1)
F1:CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA
R1:CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA
产物长度：189bp
内参基因：SKIP16GBAccession:CD397253
F:GAGCCCAAGACATTGCGAGAG
R：CGGAAGCGGAAGAACTGAACC
产物长度60bp
1.4.2Real-timePCR实验
采用PremixExTaqTM(PerfectRealTime)（TaKaRa公司）（CatalogNo. DRR041A）试剂，在仪器iQTM5多重实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）上，用 以上设计好荧光引物，进行Real-TimePCR，其条件如下：
内参基因的反应体系如下：总体积为25ul，其中ddH2O:10.5ul；SYBRPremixex TaqTM(2×):12.5ul；PCR-F(10uM):0.5ul；PCR-R(10uM):0.5ul；模板cDNA： 1.0ul。标志基因的反应体系如下：总体积为25ul，其中ddH2O:10.5ul；SYBRPremix exTaqTM(2×):12.5ul；PCR-F1(10uM):0.5ul；PCR-R1(10uM):0.5ul；模板cDNA： 1.0ul。
反应条件：95℃，1min；45个循环：95℃，10sec；62℃,25sec，55℃to95℃之 间进行（收集荧光）熔点曲线分析。其中SYBRPremixexTaqTM(2×)是该试剂盒本身 自带的试剂，在该试剂盒的产品说明书中有具体的说明和记载。
每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2(Ct内参基因－Ct目的基因）进行统计分析。 1.5标志基因只被生长素类农药或其结构类似物选择性诱导
用离体大豆幼苗叶片分别吸收20种不同作用机理的农药，1小时后，Real-timePCR 检测标志基因转录水平的表达量，发现该基因受生长素类农药特异诱导，而其它种类农 药对GH3基因的表达量影响不大（图1）。从图中可以看出，标号为3、10和21号的农 药溶液可以明显大量使GH3基因的表达，相对表达量达到了5-15以上，而那些非生长 素的农药几乎不诱导GH3基因的表达。从这些结果可以明显看出，该用该方法可以定性 的检测样本中是否含有生长素农药或与生长素类似的农药。
该实验验证了GH3基因在转录水平的表达特征与激素类农药之间存在定性关系，可 以作为检测激素类农药的标志基因。
同样，本发明把上述编号为2-9号的农药混合成水溶液作为处理1，把编号为2,4-9 （除3号外）的农药混合配成水溶液作为处理2，处理1和处理2的终浓度一样，而且 各个农药在水中的浓度都一样，采用与上述实施例子1中的方法进行处理并检测GH3基 在立体大豆叶片中的表达量，发现处理1的GH3基因的相对表达量为15，而处理2中的 GH3基因的相对表达量为4。这进一步充分说明书了，处理1样本中含有生长素类农药， 而处理2中不含有生长素类农药。这样为进一步检测样本中是否含有那类农药提供了便 捷的方法（具体数据略）。
为了验证以上方法是否可行，把编号为2-21的农药分别处理在小麦上，按照上述农 药的说明书进行，然后采用小麦的叶片来检测小麦叶片中是否含有生长素农药，在处理 前，把上述农药进行随机编号并进行随机处理，即处理的时候并不知道该编号对应的是 那种具体的农药。在检测的时候，把小麦叶片搅碎，按照常规方法配置成水溶液，然后 按照实施例子1中的采用立体大豆叶片的柄浸入到溶液中1个小时后，其他检测步骤与 实施例子1相同。从检测的结果来看，那些具有相对表达量为5以上的处理都为生长素 类农药，而那些小于5的处理都为非生长素农药（具体数据略）。
另外，经过我们的实验，发现用大豆叶片处理的方式进行检测对象的效果最好，这 里所说的大口叶片是指含有叶柄的叶片，被处理后提取RNA的对象可以是包括叶柄在内 的叶片，也可以是只包括叶片（叶柄被除掉）本身。
在处理时间上，处理1个小时是最佳的处理时间，一般在45-90分钟为最好的处理 时间，可以到达最佳的区分检测。我们的实验表明，在处理时间小于40分钟和大于100 分钟，都不能显著到达定性区分是样本中是否具有生长素农药或非生长素农药（具体实 验略）。
经过我们的实验，发现任意品种的大豆立体叶片都可以很好的进行GH3基因的表达 检测，而PCR的条件也基本一致，可以做一些细微的调整。
实施例2
（二）此部分的材料与方法用于证明，生长素类农药(以二氯喹啉酸为例)的浓度与 GH3基因的表达量之间的定量关系。
1.1材料
植物：3-5叶期大豆植株（浙春3号）
农药：市购二氯喹啉酸（美丰农化有限公司产品）。
1.2二氯喹啉酸浓度设置与处理
选择农业生产实践中用量较大的二氯喹啉酸作为该生长素类农药的代表，用它来确 定标志基因表达量与生长素类农药浓度的关系。二氯喹啉酸的大田常规用量为20ga.i. /亩，喷雾兑水量为40kg/亩，则田间施用浓度为：0.5g/L。二氯喹啉酸的HPLC检出极 限为0.002mg/kg=0.002mg/L。根据这两个浓度设置二氯喹啉酸的系列浓度梯度（表2）：
表2.二氯喹啉酸的浓度设置
1.3植物与农药的接触方法
摘下大豆叶片，立即以叶柄浸入不同浓度的二氯喹啉酸溶液1小时后，取出立即置 于液氮中保存，或直接用于总RNA提取
1.4模板cDNA的合成
方法同实施例子1
1.5标志基因表达量的测定
方法同实施例子1
2.2标志基因表达量与目标农药浓度之间的定量关系
大豆叶片离体后以叶柄立即吸收不同浓度二氯喹啉酸，1小时后，标志基因表达量 均被诱导表达，农药浓度与标志基因的表达量的关系见图2。由图可以看出，标志基因 法的检出限至少比HPLC（高效液相色谱）法灵敏10倍，可以检测除常规用HPLC不能检 测的浓度，大大提高了检测的灵敏度。