生料固态发酵生产纤维素酶的方法 【技术领域】
本发明涉及一种生产纤维素酶的方法，尤其涉及一种通过生料固态发酵来生产纤维素酶的方法。
背景技术
纤维素酶用途广泛，纤维素酶被广泛应用于纺织、食品、农牧等领域，有广泛的用途。
目前，纤维素酶的固态发酵方法具有的共同特点是，原料经过高温蒸煮杀菌，之后接种发酵制备出高活力酶剂。由于该过程需要蒸料容器，消耗大量煤、电或蒸气，消毒过程耗时费力，不仅成本高，而且会增加扩大生产的难度。
【发明内容】
本发明人发现采用过碳酸钠对生产培养基进行消毒，就能够在原料不进行高温灭菌的情况下，通过生料固态发酵来生产出纤维素酶。
因此，本发明的目的是提供一种原料无需高温灭菌的由生料固态发酵纤维素酶的方法。
即，本发明提供如下的由生料固态发酵纤维素酶的方法。
[1]一种通过生料固态发酵来生产纤维素酶的方法，其特征在于，包括：制种工序；生产培养基的配制及消毒工序；接种工序；发酵工序。
[2]根据上述[1]所述的生产纤维素酶的方法，其特征在于，在所述生产培养基的配制及消毒工序中使用过碳酸钠。
[3]根据上述[1]所述的生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述生产培养基的配制及消毒工序为，
将0.5～4.0重量份磷酸二氢钾、1.5～5.0重量份硫酸铵、0.01～0.05重量份硫酸镁、1.0～5.0重量份过碳酸钠溶解于100重量份水中配成水溶液；
另行将50～90重量份农作物秸杆粉和10～50重量份麸皮粉混合；
然后将上述水溶液和混合物进行混合。
[4]根据上述[1]所述的生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述制种工序为，
用含有0～2重量％氯化钠的无菌水将菌种从菌种传代培养基上洗下来，用固态发酵的方法扩大培养制成固体曲，用每升含过氧化氢酶1000单位以上的无菌过氧化氢酶溶液对固体曲进行稀释，制成种子液。
[5]根据上述[4]所述的生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述菌种为绿色木霉、黑曲霉、米根霉或斜卧青霉。
[6]根据上述[4]所述的生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述无菌过氧化氢酶溶液是通过将过氧化氢酶溶于自来水后，用膜滤器进行除菌来制得。
[7]根据上述[4]所述的生产纤维素酶的方法，其特征在于，在接种工序中，所述种子液在生产培养基中的添加量以种子液体积(升)：生产培养基重量(公斤)计为1∶1～1∶3。
[8]根据上述[1]所说的方法，其特征在于，在发酵工序中，在装有发酵料的容器上加盖经过防腐剂浸泡的隔离材料。
[9]根据上述[8]所说的方法，其特征在于，所述防腐剂为苯甲酸钠、丙酸钠、那他霉素、山梨酸钾中的一种或其混合物，防腐剂的总浓度为0.001重量％～10重量％。
本发明采用的生料固态发酵法有效避免使用锅炉、大型灭菌设备，具有设备要求简单，容易扩大，能耗和人力费用低，生产成本低等特点，实用价值显著。
此外，本发明还提供一种生料固态发酵法生产纤维素酶用培养基，包括：50～90重量份农作物秸秆粉、10～50重量份麸皮粉、1.0～5.0重量份过碳酸钠、1.5～5.0重量份硫酸铵、0.5～4.0重量份磷酸二氢钾、0.01～0.05重量份硫酸镁、100重量份水。
通过使用该培养基，能够提供原料无需高温灭菌的由生料固态发酵纤维素酶的方法。
本发明所说的生料固态发酵纤维素酶的方法目前未见其它文献报道。
【具体实施方式】
下面对本发明进行详细说明。
本发明的通过生料固态发酵来生产纤维素酶的方法，其特征在于，包括：制种工序；生产培养基的配制及消毒工序；接种工序；发酵工序。
1.制种工序
本发明所用的菌种可以是绿色木霉等木霉、黑曲霉等曲霉、米根霉等根霉、斜卧青霉等青霉等产纤维素酶的菌种。其培养方法为：菌种从菌种传代培养基上用含有0～2重量％氯化钠的无菌水洗下，之后用固态发酵的方法扩大培养制成固体曲。固体曲用每升含过氧化氢酶1000单位以上的无菌过氧化氢酶液稀释成为种子液。
这里，即使采用不含有氯化钠的无菌水也可以同样能够达到本发明目的。优选采用含有1重量％氯化钠的无菌水。
每升含过氧化氢酶1000单位以上的无菌过氧化氢酶液可以如下制作。先将过氧化氢酶(120000国际单位)溶于120升自来水(pH调7.0)，再将此过氧化氢酶液用0.22微米的平板膜过滤器除菌，由此制得无菌过氧化氢酶溶液。
这里，pH7.0是用盐酸、硫酸、氢氧化钠、氨水等常规试剂来调节。
上述菌液中含有的过氧化氢酶能够消除因后述过碳酸钠溶于水而生成的过氧化氢的部分残余，有利于纤维素酶的生产。
2.固体培养基地配制及消毒
本实施方式所述的发酵培养基组成为：
农作物秸秆粉(用粉碎机打碎成不超过0.5厘米) 50～90重量份
麸皮(磨成细粉末) 10～50重量份
过碳酸钠 1.0～5.0重量份
硫酸铵 1.5～5.0重量份
磷酸二氢钾 0.5～4.0重量份
硫酸镁 0.01～0.05重量份
水 100重量份
以上发酵培养基的配制方法为：将磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、过碳酸钠渐次溶解于水中配成水溶液；将秸杆粉和麸皮混合；其后将此混合物和上述水溶液混合；将以上混合后的培养基迅速密封于聚丙烯膜中，室温放置3小时以上。
这里，硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁是作营养源用。因此，只要是具有起到营养源作用的化合物，就不限于硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁。例如作为氮源也可以采用蛋白胨、氯化铵；作为钾源也可以采用氯化钾、磷酸钾；作为镁源也可以采用氯化镁等。此外，硫酸镁可以是无水硫酸镁、一水硫酸镁、七水硫酸镁，其量相对于100重量份水为0.01～0.05重量份。
农作物秸秆粉可以是稻草粉、高粱秸秆粉、 玉米秸秆粉等。可以采用锤式粉碎机等粉碎机打碎成不超过0.5厘米。
如上所述，在本发明中采用过碳酸钠对固体培养基进行消毒时，固体培养基的配制和消毒是同时完成的，因此工序简单。
3.接种及发酵
本实施方式的固态发酵优选在浅盘中进行。浅盘可以使用长60厘米、宽30厘米、高6厘米的聚丙烯发酵浅盘。
发酵浅盘要经过消毒，本发明采用的消毒方法是：使用前将浅盘用1％过碳酸钠溶液浸泡10分钟以上(立即使用)。
通常，在固态发酵中，料基表面和外界空气接触，容易引起杂菌的大量繁殖，本发明用一种经过防腐处理的隔离材料例如海绵有效地防止发酵过程中空气杂菌对料基的侵袭。具体地，海绵防腐的处理方法是：选择厚度0.5～1厘米的海绵，将其裁成略大于发酵浅盘的尺寸，浸泡于含0.1～0.5重量％苯甲酸钠的水中，之后将其甩干。如此处理，海绵空隙表面的水膜将含有防腐成分，可抑制料基与海绵接触处的杂菌生长。并同时可对外界杂菌有隔离作用。当然，只要是能够起到防止发酵过程中空气杂菌对料基的侵袭的作用，隔离材料并不限于海绵，也可以是海绵以外的其他材料，例如层叠多片非织造布而成的材料，或者夹有棉花层的织物材料等等。
浅盘和海绵准备好后，将已消毒的固态发酵培养基和液态菌种以“液态生产菌种体积(升)：生产培养基重量(公斤)≈1.2∶2.0”的比例在浅盘中混合，将此混合物料摊平，控制厚度不超5厘米，加盖海绵，控制发酵室的湿度在65％以上，温度20℃～35℃，发酵大约3～5天，见料基表面大片形成黄绿孢子即可收获。本工艺最后可得到酶活在每克干曲500国际单位(IU)以上。
这里，液态生产菌种体积(升)与生产培养基重量(公斤)的比例约为1.2∶2.0，但不限于此，只要在1∶1～1∶3范围内都可以实现本发明的目的。
下面说明酶活检测方法及酶活定义。
<纤维素酶的测定方法>
1.定义
酶在一定温度(50℃)和pH下，每分钟水解1.0％的CMC(羧甲基纤维素钠)产生1微摩尔还原糖(以葡萄糖计)的酶量定义为1.0个酶活单位，单位的符号为U。产品质量指标以比活力表示，产品质量按每克物料中的酶活(比活力)表示，单位为U/g。
2.原理
纤维素酶在一定的温度和pH下，将纤维素底物(羧甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3，5-二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)的量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出CMCA-DNS酶的活力。以此代表纤维素酶的活力。
3.试剂和溶液
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
3.1羧甲基纤维素钠(CMC-Na)
化学纯(中国亨达精细化学品有限公司，上海)，25度，2％水溶液，粘度800～1200mPa·s。(每批羧甲基纤维素钠在使用前用标准酶加以校正)。
3.2 pH4.8醋酸缓冲液
称取三水乙酸钠8.16g溶于750ml水中，加入乙酸2.31ml，用水定容到1000ml，调节溶液的pH到(4.8±0.05)备用。
3.3 CMC-Na溶液
称取2.0克CMC-Na，精确到1mg，缓缓加入相应的缓冲液(3.2)约200毫升
并加热到大约80～90℃，边加热变搅拌，直至全部溶解，冷却后用相应的缓冲溶液稀释到300毫升，用2mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到4.8±0.05，最后定容到300毫升，搅拌均匀，贮存于冰箱中一周后使用。
3.4 DNS试剂
称取DNS(10±0.1)g，置于约600毫升水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中搅拌溶解后，依次加入酒石酸钾钠200克，苯酚2克，和无水亚硫酸钠5克，待全部溶解并澄清后，冷却到室温，用水定容至1000毫升，过滤，贮于棕色瓶中，于暗处放置7天后使用。
3.5葡萄糖标准贮备溶液
称在105℃烘干2～3小时至恒重的无水葡萄糖1克，精确至0.1毫克，用水定容至100毫升，盖塞，摇匀备用。
3.6葡萄糖标准使用溶液
分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50毫升于10毫升容量瓶中，用水定容到10毫升，摇匀，备用。
上述系列浓度应根据需要自行调整。
4.仪器
恒温水浴锅，分光光度计等
5.分析步骤
5.1绘制标准曲线
按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(3.5)、缓冲溶液(3.2)和DNS试剂(3.3)于各管中(每管平行作3个样)，混匀。
将标准管同时置于沸水浴中，反应10分钟后取出，迅速冷却到室温，用水定容到25毫升，塞盖，混匀。用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。以葡萄糖为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
表1 葡萄糖标准曲线
5.2样品的测定
5.2.1待测酶液的制备
取酶样1.0毫升，用醋酸缓冲液(pH4.8)将酶稀释。稀释到按下述“5.2.2”测出的试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.33～0.35范围之内为止。
5.2.2操作程序
取四支25毫升具塞试管(一支空白管儿，三支样品管)；
分别向四支试管中，准确加入用相应pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶液(3.2)2.00毫升；
分别准确加入稀释好的待测酶液的上清液(4.2.1)0.50毫升于三支样品管中(空白管不加)；
将四支试管同时置于(50±0.1)℃水浴中，准确计时，反应30分钟，取出；
迅速、准确地向各管中加入DNS试剂(3.3)3.0毫升，于空白管中加入稀释好的待测酶液0.50毫升，摇匀；将四支管同时放入水浴中，沸腾开始准确计时，加热10分钟，取出，迅速冷却到室温，用水定容到25毫升；
以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。
6.CMCA-DNS酶活力计算
CMCA-DNS酶活力，按下式计算
X＝A×n×1/30×1000×5.56
式中，X为酶活力，U/g；A为吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg；n为酶样的稀释倍数；1/30为时间换算成1分钟；1000为转换成微克；5.56为转换成微摩尔数。
实施例
下面，采用实施例详细说明本发明，以便更好地了解本发明。但这些详细内容并不能被解释为是用于实现本发明的必要技术特征，也就是说，只要不脱离本发明权利要求书的范围，即使对实施例中的某些特征进行变更，也同样能达到本发明的效果。
1.试验材料
菌种传代培养基：
硫酸铵2克、磷酸二氢钾2克、麸皮5克、玉米芯粉(30目左右)5克、琼脂粉20克，水1000毫升、用盐酸、氢氧化钠调pH为6.0，以上培养基在100℃溶解，之后分装成于20毫升的试管(每管装量不超过5毫升)，用棉塞封口，121℃灭菌20分钟，之后制成斜面作为菌种传代培养基。
固体曲菌种培养基：
麸皮49.0重量％、硫酸铵0.5重量％、磷酸二氢钾0.5重量％、自来水50重量％，混匀。装于1000毫升的三角瓶，每瓶可装此培养基大约200克，用棉塞封口，121℃灭菌60分钟。
无菌水：自来水用1000毫升三角瓶分装，每瓶装600毫升，用棉塞封口，121度灭菌20分钟。
聚丙烯塑料袋装：60厘米(长)×30厘米(宽)。
无菌吸管：5毫升规格。
聚丙烯发酵浅盘(长60厘米、宽30厘米、高6厘米)：使用前用1％过碳酸钠溶液浸泡10分钟后捞出使用。
小孔径海绵(长65厘米、宽32厘米、厚1厘米)：用0.1％苯甲酸钠水溶液浸泡后甩干而使用。
平板膜过滤器及配套的蠕动泵(配备0.22微米的滤膜，过滤器在使用前用1升1％过碳酸钠溶液滤过，以使滤器消毒)。
2.实验步骤及结果
(1)制种
1)固体曲菌种的制备
本实施例所用的菌种为绿色木霉。取一管含有大量绿色孢子的斜面菌种传代培养基菌种，按无菌操作常规要求，用无菌吸管吸取5毫升含有1重量％氯化钠的无菌水，轻轻晃动使孢子从斜面菌种传代培养基进入水中，此液体为孢子悬液。取此悬液4毫升，接入一瓶装于1000毫升三角瓶的固体曲菌种培养基中，在28℃培养5天左右，见料基表面生成黄绿色孢子，此时菌种即培养成功，此菌种即为固体曲菌种。此菌种即使在室温、干燥通风处保存1月以上也不影响使用效果。
2)将固体曲菌种制备成液态菌种
固体曲菌种中含有大量的孢子，要进行稀释，以利于和固体培养基混合接种。由固体曲菌种制备液态菌种的步骤如下：
先将过氧化氢酶(120000国际单位)溶于120升自来水(用盐酸、氢氧化钠调pH为7.0)，再将此过氧化氢酶液用0.22微米的平板膜过滤器除菌，制得无菌过氧化氢酶溶液。
在2瓶上述装有固体曲菌种的三角瓶中各自加入500毫升无菌水，在室温下搅拌10分钟后，将上述2瓶溶解有固体曲菌种的无菌水全部加入到120公斤无菌过氧化氢酶溶液中，制得液态菌种。此液体菌种的浓度较高，可有效抑制少量杂菌的污染。此菌液在室温保存不应超过5小时。
(2)发酵用培养基的制备及消毒
本实施例所述的生产培养基即发酵用培养基组成为：
稻草粉(锤式粉碎机打碎，长度不超过0.5厘米) 60公斤
麸皮(磨成细粉末) 40公斤
过碳酸钠 3.0公斤
硫酸铵 2.0公斤
磷酸二氢钾 2.5公斤
七水硫酸镁 0.01公斤
水 100公斤
以上发酵用培养基的配制方法为：将稻草粉和麸皮单独混合，将过碳酸钠、硫酸铵、七水硫酸镁和磷酸二氢钾溶于100公斤水中使其溶解，将此水溶液加入到稻草粉和麸皮的混合物中，迅速搅拌混合，装于聚丙烯塑料袋中密封3小时后开始接种。
(3)接种
按清洁生产要求，将种子液即在上述(1)中制得的液态菌种与生产培养基即在上述(2)中制得的发酵用培养基，按“液态菌种体积(升)：发酵用培养基重量(公斤)≈1.2∶2.0”的比例迅速混合。
(4)浅盘发酵
迅速将接种后的物料摊置于发酵浅盘中，厚度不超过4厘米，其上立即加盖海绵。发酵条件：发酵浅盘置25～30℃、环境湿度控制65％以上自然通风发酵72～96小时。从料面出现白色菌丝开始计时，大约发酵50小时，此时酶活较高，即可出料。此时发酵纤维素酶干曲的活力可达500IU/g(国际单位/克)以上。
3.关于其他菌种的实验
本发明的方法还适用于其他能够生产出纤维素酶的菌种，例如采用黑曲霉、米根霉、斜卧青霉进行与上述同样的实验，其结果，发酵纤维素酶干曲的活力分别为黑曲霉120IU/g、米根霉42IU/g、斜卧青霉76IU/g。
这些结果表明，只要是能够生产出纤维素酶的菌种，都可适用本发明的方法，也就是说本发明的方法并不仅限于上述实施例的绿色木霉、黑曲霉、米根霉、斜卧青霉。
而且，通过上述实施例可以知道，在纤维素酶的发酵工艺中，采用生料发酵工艺是可行的。其中，发酵原料(稻草和麸皮等)不经过湿热灭菌而采用过碳酸钠来消毒，之后通过菌液中高浓度的过氧化氢酶来消除过氧化氢的部分残余(过碳酸钠溶于水生成过氧化氢)是可行的。由于过氧化氢酶来源可靠，价格便宜，本工艺克服“高温消毒”工序能耗高、固定设备投资昂贵和成本高的问题，且突破传统固态发酵纤维素酶扩大生产时灭菌的瓶颈，在大规模生产纤维素酶的实践中具有很强的实用意义。
工业实用性
本发明提供的由生料固态发酵纤维素酶的方法，原料无需高温灭菌，因此能够有效避免使用锅炉、大型灭菌设备，具有设备要求简单，容易扩大，能耗和人力费用低，生产成本低等特点，实用价值显著。