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1、(10)申请公布号 CN 102559892 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102559892 A *CN102559892A* (21)申请号 201110452838.0 (22)申请日 2011.12.30 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 北京大北农科技集团股份有限公司 地址 100080 北京市海淀区中关村大街 27 号中关村大厦 14 层大北农集团 申请人 漳州大北农农牧科技有限公司 哈。
2、尔滨大北农牧业科技有限公司 (72)发明人 刘滢 谢飞 胡婷 刘婷 彭子欣 (54) 发明名称 饲料样品中肠毒性大肠杆菌的快速测定引物 及其应用 (57) 摘要 本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术 领域， 具体涉及一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 的快速测定引物及其应用。本发明针对产肠 毒素性大肠杆菌 K88 的菌毛特异基因设计一对引 物， 利用 DNA 的梯度稀释物作为外标准品， 建立针 对产肠毒素性大肠杆菌 K88 的 SYBRGreen I 实时 定量 PCR 检测方法， 该方法可以快速、 特异地对饲 料样品中的产肠毒素性大肠杆菌 K88 进行定量， 在饲料样品中最低能检测到 2。
3、102CFU/g， 操作全 程仅需 5h， 与常规检测方法相比， 本发明具有检 测程序简单、 检测效率高、 准确性好， 检测周期短 等优点， 为开发快速准确的肠毒性大肠杆菌检测 试剂盒奠定基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/2 页 2 1.一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)K88的快速 测定引物， 其特征在于上游引物如 SEQ ID No.1 。
4、所示， 下游引物如 SEQ ID No.2 所示。 2. 权 1 所述的引物在定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 中的应用。 3. 权 2 所述的应用， 其特征在于测定过程如下 ： A. 模板 DNA 的制备 (1) 取待测样品 ： 菌液 5ml 或饲料样品 500-1000mg， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末 ； 将 粉末放入到 2ml 离心管中， 然后加入 1M Tris.Cl 缓冲液 750ul， 充分混匀 ； (2) 将离心管置 于 65水浴中 1-2 小时， 水浴过程中温和混匀几次 ； 取出离心管， 每管加入等体积的酚 - 氯 仿溶液 600-700ul， 混匀后离心， 1000。
5、0rpm， 10 分钟 ； (3) 上清液移入新的离心管中， 加入等 体积的氯仿， 混匀后， 10000rpm， 6 分钟 ； 将上清液移入另一离心管中， 加入 0.6 倍体积的异 丙醇， 轻轻混匀， 静置一段时间， 然后用枪头勾出 DNA， 并用 70乙醇冲洗 2 次 ； (4) 勾出的 DNA， 真空干燥后将其溶于 500ul 1x TE 中 ； 加入 3ul RNA 酶溶液， 37保温 1 小时 ； (5) 加 入等体积的苯酚-氯仿溶液， 轻轻混匀后， 10000rpm离心6分钟 ； (6)取上清液， 加入等体积 的氯仿， 轻轻混匀后， 10000rpm 离心 6 分钟 ； (7) 将上。
6、清液转移至 DNA 吸附柱中， 加入 1/10 体积 3M 醋酸钠， 混匀后， 加入 2 倍体积预冷的无水乙醇 ； (8) 轻轻混匀静置 5min， 10000rpm 离心 30min ； (9) 将 DNA 吸附柱置于新的收集管中， 加入 70乙醇， 10000rpm 离心 30min， 重 复此操作一次 ； (10) 将 DNA 吸附柱置于新的收集管中， 悬空加入 100ul 的 1x TE 溶液， 室温 放置 10-15min ； (11) 将 DNA 吸附柱置于灭菌的 1.5ml 离心管中， 10000rpm 离心 2min， 收集 所得溶液， 即得到待测样品 DNA 模板 ； 在 4。
7、下保存 ； B.PCR 扩增 反应体系 25.0L ： 12.5L 2PCR-mix、 各 1L 10mmol/L 权 1 所述的上、 下游引物、 1L50ng/L DNA 模板、 二次蒸馏水补足至 25.0L ； PCR 反应条件 ： 94预变性 5min， 94 30s， 60 45s， 72 40s， 进行 35 个循环， 72 最终延伸 7min， 得到的 PCR 产物， 在温度 4下保存 ； C. 结果及判断 取 5LPCR 产物， 1琼脂糖凝胶电泳进行检测 ； 以目的扩增片段的胶回收产物作为模 板为阳性对照， 以灭菌水作为模板为阴性对照 ； 根据在 327bp 处出现预期特征条带，。
8、 确定该 饲料样品中含有肠毒性大肠杆菌 K88， 相反地则不含有肠毒性大肠杆菌 K88。 4. 权 1 所述的引物在定量测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 中的应用。 5. 权 4 所述的应用， 其特征在于测定过程如下 ： A. 标准及待测样品模板 DNA 的制备 B. 荧光定量 PCR 反应体系 25.0L， 包括 ： 2SuperReal PreMix 母液 12.5L、 各 20mol/L 0.5L 权1所述的上、 下游引物， DNA模板2.0L、 50ROX Reference Dye 0.5L、 补RNase-free ddH2O 至 25L 体系 ； 荧光定量PCR反应参数 ： 。
9、95预变性10min ； 94变性5s， 60退火15s， 40个循环 ； 4 保存 ； 每个样品重复 3 次 ； C. 外标准品的制备和标准曲线的绘制 外标准品的制备 ： 利用分光光度计将过夜培养的肠毒性大肠杆菌 K88 发酵液稀释至 权 利 要 求 书 CN 102559892 A 2 2/2 页 3 1OD， 制备模板 DNA， 浓度为从 107个菌的 DNA/L 稀释至 1 个菌的 DNA/L， 以此作为外标 准品进行荧光定量 PCR 反应 ； 标准曲线的绘制 ： 以不同浓度的模板的对数为横坐标， 以 PCR 反应过程中到达荧光阈 值的初始循环数为纵坐标， 得肠毒性大肠杆菌 K88 的。
10、标准曲线， 作为待测样品定量测定的 参照标准 ； D. 结果及判断 以待测样品 DNA 和标准品的 DNA 为模板， 用权 1 所述的引物， 以相同的体系同时进行肠 毒性大肠杆菌 K88 的菌毛特异基因的基因片段的荧光定量 PCR 扩增 ； 通过标准曲线和待测 样品的 Ct 值进行饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 的快速定量检测。 权 利 要 求 书 CN 102559892 A 3 1/6 页 4 饲料样品中肠毒性大肠杆菌的快速测定引物及其应用 技术领域 0001 本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域， 具体涉及一种饲料样品中肠毒 性大肠杆菌 (Enterotoxigenic Esch。
11、erichia coli)K88 的快速测定引物及其应用。 背景技术 0002 大肠菌群及其所产生的肠毒素能引起动物和人的食物中毒， 最常见的症状是动物 和人的腹泻。饲料中大肠菌群的存在， 不仅直接危害到畜禽健康， 严重时会引起畜禽中毒 死亡， 造成严重经济损失 ； 致病性大肠杆菌主要有肠毒性大肠杆菌 ( 产肠毒素性大肠杆菌 ) (Enterotoxigenic Escherichia coli， ETEC)， 肠致病性大肠杆菌 (EPEC)， 肠出血性大肠杆 菌(ELEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)。 其中ETEC是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最主 要的致病菌之一。ETEC 本身具备两个。
12、致病因素 ： 一是宿主特异性菌毛 ( 黏附素， 黏附因子， 定植因子 )， 通过菌体粘着于小肠的上皮细胞上， 以抵抗肠道蠕动和肠内容物的冲刷作用， 从而使细菌在定居部位大量繁殖 ； 二是肠毒素， 即耐热肠毒素 (ST) 和不耐热肠毒素 (LT)， ST 具有抗原性， LT 仅有弱抗原性。肠毒性大肠杆菌致病性与其具有粘附性菌毛和产肠毒素 密切相关。致仔猪腹泻肠毒素性大肠杆菌粘附性菌毛主要有 K88， K99， F41 和 987P， 目前检 测肠毒性大肠杆菌菌毛的方法有电子显微镜法、 D 甘露糖抵抗雪凝试验、 细胞粘附试验、 基 因探针技术和免疫血清学反应等， 商品化的快速检测方法主要包括特异性。
13、检验的培养基、 检测试纸片等， 一般是利用大肠杆菌特异性酶检测鉴定大肠杆菌， 如可利用 Gud 酶底物有 效检测大肠杆菌。法国科玛嘉 CHROM agar Ecoli 是目前应用最广泛的大肠杆菌显色培养 基， 广东环凯公司也开发出了商业化的大肠杆菌显色培养基， 这种利用显色培养基检测大 肠杆菌的方法虽然成本较低， 但得到检测结果需 24h-48h， 时间较长， 且单一方法检测准确 性不高， 需多种方法复合使用， 以提高检测的准确性， 缩短检测时间。 0003 为了有效地控制饲料的产品质量， 进一步加强饲料产品及饲料原料的质量监督管 理， 有必要制定饲料产品中大肠菌群的检测方法及相关饲料产品中大。
14、肠菌群允许量。 目前， 国际标准化组织采用两种大肠菌群检测方法标准来检测食品和饲料中的大肠菌群， 一是最 大或然数法 (Most probable number， MPN) 方法 (ISO 7251 ； 1993(E)， 另一为选择性培养 基菌落 计数法。其中应用最广泛的是 MPN 技术， 如英国、 美国等均采用此法， 但此方法具有 检测时间长， 易出现假阳性， 敏感度低等问题， 国内尚未制定饲料中大肠菌群检测方法。 0004 近 年 来 发 展 起 来 的 实 时 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 式 反 应 (real time polymerasechainreaction， RT-PCR。
15、) 技术以其特异性强、 灵敏度高、 速度快等优点在基因表 达水平分析、 病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用， 并且已经成为当前细菌 快速检测的主要方法。但是， 目前， 国内还未见报道根据肠毒性大肠杆菌 K88 菌毛特异基因 的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 方法。 发明内容 0005 【要解决的技术问题】 说 明 书 CN 102559892 A 4 2/6 页 5 0006 本发明的目的在于提供一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌 ( 产肠毒素性大肠杆菌 ) (Enterotoxigenic Escherichia coli， ETEC)K88 的快速测定引物。该方法避免了传。
16、统 PCR 定量鉴定中交叉污染的问题。本发明的方法不仅具有特异性强、 重复性好、 准确、 快速等优 点， 且没有假阳性和相互交叉反应的发生， 为肠毒性大肠杆菌检测试剂盒的开发奠定基础。 0007 本发明的另一个目的是提供该引物在定性测定和定量测定饲料样品中肠毒性大 肠杆菌 K88 中的应用。 0008 【技术方案】 0009 本发明的目的是通过下述技术方案实现的 ： 0010 本发明提供一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌 (Enterotoxigenic Escherichia coli)K88 的快速测定引物， 其特征在于上游引物为 ： DCf5 -ACAGGTGAAGGTGGAATGG-3 ， 。
17、也 如 SEQ IDNo.1 所示， 下游引物 DCr5 -TTCCTCTTTCCTCTGCGG-3 ， 也如 SEQ ID No.2 所示。 0011 本发明的引物可用于定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88。 0012 其中， 定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 的测定过程如下 ： 0013 A. 模板 DNA 的制备 0014 (1) 取待测样品 ： 菌液 5ml 或饲料样品 500-1000mg， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉 末 ； 将粉末放入到 2ml 离心管中， 然后加入 1M Tris.Cl 缓冲液 750ul， 充分混匀 ； (2) 将离 心管置于 65水浴中 1-2 小。
18、时， 水浴过程中温和混匀几次 ； 取出离心管， 每管加入等体积的 酚 - 氯仿溶液 600-700ul， 混匀后离心， 10000rpm， 10 分钟 ； (3) 上清液移入新的离心管中， 加入等体积的氯仿， 混匀后， 10000rpm， 6 分钟 ； 将上清液移入另一离心管中， 加入 0.6 倍体 积的异丙醇， 轻轻混匀， 静置一段时间， 然后用枪头勾出 DNA， 并用 70乙醇冲洗 2 次 ； (4) 勾出的DNA， 真空干燥后将其溶于500ul 1x TE中 ； 加入3ul RNA酶溶液， 37保温1小时 ； (5) 加入等体积的苯酚 - 氯仿溶液， 轻轻混匀后， 10000rpm 离心。
19、 6 分钟 ； (6) 取上清液， 加入 等体积的氯仿， 轻轻混匀后， 10000rpm 离心 6 分钟 ； (7) 将上清液转移至 DNA 吸附柱中， 加 入 1/10 体积 3M 醋酸钠， 混匀后， 加入 2 倍体积预冷的无水乙醇 ； (8) 轻轻混匀静置 5min， 10000rpm 离心 30min ； (9) 将 DNA 吸附柱置于新的收集管中， 加入 70乙醇， 10000rpm 离心 30min， 重复此操作一次 ； (10) 将 DNA 吸附柱置于新的收集管中， 悬空加入 100ul 的 1x TE 溶液， 室温放置 10-15min ； (11) 将 DNA 吸附柱置于灭菌的。
20、 1.5ml 离心管中， 10000rpm 离心 2min， 收集所得溶液， 即得到待测样品 DNA 模板 ； 在 4下保存 ； 0015 B.PCR 扩增 0016 反应体系 25.0L ： 12.5L 2PCR-mix、 各 1L 10mmol/L 所述的上、 下游引物、 1L 50ng/LDNA 模板、 二次蒸馏水补足至 25.0L ； 0017 PCR 反应条件 ： 94预变性 5min， 94 30s， 60 45s， 72 40s， 进行 35 个循环， 72最终延伸 7min， 得到的 PCR 产物， 在温度 4下保存 ； 0018 C. 结果及判断 0019 取 5LPCR 产。
21、物， 1琼脂糖凝胶电泳进行检测 ； 以目的扩增片段的胶回收产物作 为模板为阳性对照， 以灭菌水作为模板为阴性对照 ； 根据在 327bp 处出现预期特征条带， 确 定该饲料样品中含有肠毒性大肠杆菌 K88， 相反地则不含有肠毒性大肠杆菌 K88。 0020 本发明的引物也可用于定量测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88。 0021 其中， 定量测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 的测定过程如下 ： 说 明 书 CN 102559892 A 5 3/6 页 6 0022 A. 标准及待测样品模板 DNA 的制备 0023 制备方法与定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88的测定过程中的模板DNA的。
22、 制备方法相同。 0024 B. 荧光定量 PCR 0025 反 应 体 系 25.0L，包 括 ： 2SuperReal PreMix 母 液 12.5L、各 20mol/ L 0.5L 所述的上、 下游引物， DNA 模板 2.0L、 50ROX Reference Dye 0.5L、 补 RNase-free ddH2O 至 25L 体系 ； 0026 荧光定量 PCR 反应参数 ： 95预变性 10min ； 94变性 5s， 60退火 15s， 40 个循 环 ； 4保存 ； 每个样品重复 3 次 ； 0027 C. 外标准品的制备和标准曲线的绘制 0028 外标准品的制备 ： 利用。
23、分光光度计将过夜培养的肠毒性大肠杆菌 K88 发酵液稀释 至 1OD， 制备模板 DNA， 浓度为从 107个菌的 DNA/L 稀释至 1 个菌的 DNA/L， 以此作为外 标准品进行 荧光定量 PCR 反应 ； 0029 标准曲线的绘制 ： 以不同浓度的模板的对数为横坐标， 以 PCR 反应过程中到达荧 光阈值的初始循环数为纵坐标， 得到肠毒性大肠杆菌 K88 的标准曲线， 作为待测样品定量 测定的参照标准 ； 0030 D. 结果及判断 0031 以待测样品 DNA 和标准品的 DNA 为模板， 用权 1 所述的引物， 以相同的体系同时进 行肠毒性大肠杆菌 K88 的菌毛特异基因的基因片段。
24、的荧光定量 PCR 扩增 ； 通过标准曲线和 待测样品的 Ct 值进行饲料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 的快速定量检测。 0032 【有益效果】 0033 本发明以肠毒性大肠杆菌 K88 菌毛特异基因为靶基因， 应用普通 PCR 技术和 SYBR GreenI 荧光定量 PCR 技术建立快速准确地检测肠毒性大肠杆菌 K88 的方法， 避免了传统 PCR 定量鉴定中交叉污染的问题。本发明利用产肠毒素性大肠杆菌 K88 的 DNA 的梯度稀释 物作为外标准品可以更准确的检测待测样品中的活菌数， 可准确地定性、 定量检测饲料样 品中的产肠毒素性大肠杆菌 K88， 检测效率高、 检测周期短。本发明所提。
25、供的引物具有特异 性强， 扩增效率高的特点， 可用于快速定性鉴定产肠毒素性大肠杆菌 K88， 可简化产肠毒素 性大肠杆菌 K88 的检测程序、 提高检测效率。本发明的方法不仅具有特异性强、 重复性好、 准确、 快速等优点， 还具有操作简便， 可同时检测多个样品的优点， 为肠毒性大肠杆菌检测 试剂盒的开发奠定基础。 附图说明 ： 0034 图 1 ： 经本发明的肠毒性大肠杆菌 K88 的种属特异性引物 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电 泳检测结果。 0035 图 2 ： 以 DNA 为模板的实时荧光定量检测肠毒性大肠杆菌 K88 的标准曲线。 0036 图 3 ： 以 DNA 为模板的实时荧光定量检。
26、测模拟临床样品的扩增曲线。 0037 通过下列实施例将更具体的说明本发明， 但是应理解所述实施例仅是为了说明本 发明， 而不是以任何方式限制本发明的范围。 说 明 书 CN 102559892 A 6 4/6 页 7 具体实施方式 ： 0038 下述实施例中所用的菌株遗传资源可为现有技术中的任何一株同类菌株， 不影响 本发明目的的实现及效果。 0039 实施例 1 ： 预测料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 的快速定性检测 0040 该实施例使用目的扩增片段的胶回收产物作为阳性对照 ； 无菌水作阴性对照 ； 另 外使用 粪肠球菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌作为样品进行。 0041 A. 模板 D。
27、NA 的制备方法 0042 (1) 取一定量待测样品 ( 菌液一般为 5ml， 饲料样品为 1000mg)， 在液氮冷冻下迅 速研磨成粉末 ； 将粉末放入到 2ml 离心管中， 然后加入 1MTris.Cl 缓冲液 750ul， 充分混匀 ； (2) 将离心管置于 65水浴中 1 小时， 水浴过程中温和混匀 ； 取出离心管， 每管加入等体积 的酚 - 氯仿 (V/V 1 1) 溶液 700ul， 混匀后离心， 10000rpm， 10 分钟 ； (3) 上清液移入另 一离心管中， 加入等体积的氯仿， 混匀后， 10000rpm， 6 分钟 ； 将上清液移入另一离心管中， 加入0.6倍体积的异丙。
28、醇， 轻轻混匀， 静置一段时间， 然后用枪头勾出DNA， 并用70乙醇冲 洗2次 ； (4)勾出的DNA， 真空干燥后将其溶于500ul 1x TE中 ； 加入3ul RNA酶溶液， 37保 温 1 小时 ； (5) 加入等体积的苯酚 - 氯仿溶液， 轻轻混匀后， 10000rpm 离心 6 分钟 ； (6) 取上 清液， 加入等体积的氯仿， 轻轻混匀后， 10000rpm离心6分钟 ； (7)将上清液转移至DNA吸附 柱中， 加入 1/10 体积 3M 醋酸钠， 混匀后， 加入 2 倍体积预冷的无水乙醇 ； (8) 轻轻混匀静置 5min， 10000rpm离心30min ； (9)将DNA。
29、吸附柱置于新的收集管中， 加入70乙醇， 10000rpm 离心 30min， 重复此操作一次 ； (10) 将 DNA 吸附柱置于新的收集管中， 悬空加入 100ul 的 1xTE 溶液， 室温放置 15min ； (11) 将 DNA 吸附柱置于灭菌的 1.5ml 离心管中， 10000rpm 离心 2min， 收集所得溶液， 即得到待测样品 DNA 模板 ； 样品在 4下保存备用。 0043 B.PCR 扩增 0044 反应体系 25.0L ： 12.5L 2PCR-mix、 各 1L 10mmol/L 上、 下游引物、 1L 50ng/L DNA 模板、 二次蒸馏水补足至 25.0L 。
30、； 0045 PCR 反应条件 ： 94预变性 5min， 94 30s， 60 45s， 72 40s， 进行 35 个循环， 72最终延伸 7min， 得到的 PCR 产物， 在温度 4下保存 ； 0046 取 5LPCR 产物， 1琼脂糖凝胶电泳进行检测 ； 0047 C. 结果及判断 0048 经产肠毒素性大肠杆菌 K88 的种属特异性引物 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测结 果见图 1。泳道 5 为以目的片段的纯化 PCR 产物作为阳性对照， 泳道 4 以灭菌水作为阴性对 照。一般认为阳性特征在 327bp 处出现预期扩增条带， 说明此样本中含有产肠毒素性大肠 杆菌 K88 ； 阴。
31、性对照无特征条带。泳道 1-3 为产肠毒素性大肠杆菌 K88 外的沙门氏菌、 金黄 色葡萄球菌和粪肠球菌， 结果为阴性， 说明引物特异性好， 与预期结果一致。 0049 实施例 2 ： 预测料样品中肠毒性大肠杆菌 K88 的外标准品的制备和标准曲线的绘 制 0050 将已知浓度的肠毒性大肠杆菌 K88 做 10 倍梯度稀释后， 制成菌浓度为 107-1CFU/ ml 按照 0051 实施例 1 中的方法提取细菌 DNA， 实时荧光 PCR 进行检测， 步骤如下 ： 0052 A. 荧光定量 PCR 说 明 书 CN 102559892 A 7 5/6 页 8 0053 反应体系 25.0L， 。
32、包括 ： 2SuperReal PreMix 母液 12.5L、 上下游引物 DCf 和 DCr 各 0.5L(20mol/L)， DNA 模 板 2.0L、 50ROX Reference Dye 0.5L、补 RNase-free ddH2O 至 25L 体系 ； 0054 荧光定量 PCR 反应参数 ： 95预变性 10min ； 94变性 5s， 60退火 15s， 40 个循 环 ； 4保存 ； 每个样品重复 3 次 ； 0055 B. 外标准品的制备和标准曲线的绘制 0056 外标准品的制备 ： 利用分光光度计将过夜培养的产肠毒素性大肠杆菌 K88 发酵液 稀释至 1OD， 按照上。
33、述提取 DNA 步骤获得 DNA， 进行 10 倍系列稀释， 梯度稀释至 107-1 个产 肠毒素性大肠杆菌 K88 DNA/L 的浓度， 以此作为外标准品进行荧光定量 PCR 反应 ； 0057 标准曲线的绘制 ： 以不同浓度的模板的对数为横坐标， 以 PCR 反应过程中到达荧 光阈值的初始循环数为纵坐标得到的产肠毒素性大肠杆菌 K88 的标准曲线， 作为待测样品 定量测定的参照标准 ； 0058 C. 结果及判断 0059 由图 2 可见， Ct 值和不同梯度稀释的模板浓度的对数值呈较好的线性关系， 以不 同浓度的模板的对数值为横坐标， Ct 值为纵坐标， 绘制出的荧光定量 PCR 标准曲。
34、线方程 ： Ct -4.146lgX+35.619( 标准曲线的线性方程 )(Y 代表 Ct 值， X 代表模板初始 DNA 浓度 )， 模 板初始 DNA 的浓度与 Ct 值之间线性相关系数为 0.998， 斜率为 -4.146， 所建立的标准曲线 符合 Real-Time PCR 定量的要求。 0060 实施例 3 ： 准确性、 稳定性和重复性实验 0061 用相同浓度的样品作为模板， 分别采用国家标准 GB/T 4789.38-2008 中的方法和 实施例 2 中的方法对样品进行检测， 对两种方法进行比较。为了评估试验的重复性和稳 定性， 同批重复两次进行荧光定量反应。每组试验样品做 5。
35、 个梯度的反应管， 模板浓度分 2107、 2106、 2105、 2104、 2103CFU/L。结果表明， 所有稀释度的变异系数较小 (CV 5)， 说明批间差异较小， 本实验建立的荧光定量PCR反应体系批内重复性、 稳定性较好 ( 表 1)。 0062 将表 1 中所示的 Ct 值代入实施例 2 中的标准曲线， 所得结果与采用国家标准 GB/ T4789.38-2008 中的方法基本一致， 说明本专利所建立的方法准确可行， 与国家标准 GB/ T4789.38-2008 中的方法相比， 该方法只需 5h 即可全部完成， 操作简便， 而国家标准 GB/ T4789.38-2008 中的方法。
36、检测样品需耗时 4-5d。 0063 表 1 0064 说 明 书 CN 102559892 A 8 6/6 页 9 0065 实施例 4 ： 临床样品的模拟检验 0066 取用传统方法检测后不含大肠杆菌的饲料样品 1# 分成相等的六份， 编号为 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6， 在样品中接入培养过夜的肠毒性大肠杆菌 K88， 将其制备成含有肠毒性大 肠杆菌 K88 菌浓度为 2101CFU/g、 2102CFU/g、 2103CFU/g、 2104CFU/g、 2105CFU/g、 2106CFU/g 的样品， 按实施例 1 中的方法进行样品 DNA 的提取， 按照实施例 2 中的方法进 行定量测定。 0067 结果如图 3 所示， 所得曲线平滑， 将得到的 Ct 值代入实施例 2 中所得标准曲线进 行计算， 可知该方法最低检测限度为 102CFU/g。 说 明 书 CN 102559892 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 102559892 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102559892 A 11 2/2 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102559892 A 12 。