几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用.pdf

本发明涉及几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明首次从菌株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)中克隆出几丁质蛋白CBP58的编码基因，通过构建原核表达载体、咪唑洗脱获得了具有高活性的表达产物，制备过程简单，为几丁质蛋白CBP58的后续研究提供了简便方法，而且生产成本低、易保存；该几丁质蛋白CBP58具有几丁质结合功能，用于纯化和辅助鉴定几丁质；对于黑曲霉(Aspergillus niger)和苹果树腐烂病(Cytospora mandshurica Miura)具有良好的抑制效果，具有潜在的生物防治功能，为农业领域抗真菌药物研发的提供新的研究方向，具有广阔应用价值，将产生巨大工业效益和经济价值。

1.  一种几丁质结合蛋白CBP58，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.  一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白CBP58的制备方法，其特征在于，以假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas sp.DL-6)基因组DNA为模板，以CBP58-F和CBP58-R引物对进行PCR扩增；所述引物为：上游引物CBP58-F:5’-GGAATTC CATATGCATGGTTATATGGATAGCCCTAAAG-3’下游引物CBP58-R:5’-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3’。

3.  如权利要求2所述的几丁质结合蛋白CBP58的制备方法，其特征在于，几丁质蛋白CBP58的编码基因其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，由531个氨基酸组成。

4.  一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白CBP58表达与纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)碱基序列扩增：以PCR方法扩增如SEQ ID No.1所示的DNA序列；
(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-CBP58：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T simple载体用同样的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T₄DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-CBP58；
(3)构建大肠杆菌重组表达载体：将克隆载体pMD19-T-CBP58质粒转化至E.coli DH5α，得到阳性转化子，用限制性内切酶NdeI和XhoI将CBP58基因片段从pMDl9-T-CBP58质粒上切下，连接到pET-23b表达载体上，转化至E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆，得到重组表达载体pET23b-CBP58；
(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)-pET23b-CBP58：将重组表达载体pET23b-CBP58质粒转化至E.coli BL21(DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET23b-CBP58；
(5)体外诱导表达：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET23b-CBP58接入含氨苄的LB培养基中，于37℃过夜培养14h后，按1％的接种量接种到含氨苄的LB培养基中，当OD_600nm达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于30℃，100rpm低温诱导6h；
(6)几丁质结合蛋白CBP58的纯化：体外诱导表达结束后，于4℃，5,000×g离心5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体；之后置于冰上超声破碎三次，每次30s，每次间隔1min，最后于4℃，8,000×g离心20min，收集上清液，即为 粗蛋白，粗蛋白用Ni²⁺-NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质结合蛋白CBP58。

5.  一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白CBP58在几丁质结合中的应用。

6.  一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白CBP58在抑制黑曲霉(Aspergillus niger)和苹果树腐烂病(Cytospora mandshurica Miura)真菌中的应用。

几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用。
背景技术
几丁质(chitin)，俗称甲壳素、甲壳质，由N-乙酰葡萄糖胺单体以β-1，4-糖苷键连接起来的直链多聚物，是自然界中含量最丰富，海洋环境中仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质广泛存在于甲壳纲动物虾蟹、昆虫的甲壳，以及真菌(酵母，霉菌)、藻类、植物的细胞壁中。据估测，海洋环境每年超过10¹¹吨几丁质形成，其降解主要是通过产几丁质酶的微生物完成。
微生物几丁质降解系统主要由内切几丁质酶(chitinase，EC 3.2.1.14)、外切几丁质酶(chitinase，EC 3.2.1.14)、β-N-乙酰己糖胺酶(β-N-acetylhexosaminidase，EC 3.2.1.52)与几丁质结合蛋白(chitin-binding protein,CBP)等组成。内切几丁质酶在高聚几丁质链内随机切割生成几丁质寡糖(chitooligosaccharides,(GlcNAc)_n,n>2)；外切几丁质酶有两种，分别从高聚几丁质链的还原端和非还原端依次切割下(GlcNAc)₂；β-N-乙酰己糖胺酶将从非还原端将几丁质寡糖切割成为GlcNAc。其中几丁质结合蛋白(chitin-binding protein,CBP)，起到分散几丁质糖链束的作用，对于不溶多糖降解起着决定性的作用。几丁质结合蛋白是一类能与几丁质特异结合的蛋白质，广泛存在于各种微生物、动物和植物中。但是目前人们对于假交替单胞菌及其几丁质酶蛋白的认识还有限，现有的一些几丁质蛋白的生物活性及其表达仍不理想，还有一些几丁质蛋白对活性存在条件苛刻，制备、保存成本高，这些因素对于几丁质蛋白的应用造成限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有高效抗病原真菌活性且制备方法简单、易保存的几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用。
为解决上述问题，本发明采用的构思是：本发明以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株为研究对象，克隆和表达分析了几丁质蛋白的基因，为农业领域抗真菌药物研发的提供新的研究方向，具有广阔的应用价值。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年12月13日，其保藏编号为CGMCC No.8580。
本发明的技术方案如下：一种几丁质结合蛋白CBP58，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白CBP58的制备方法，以假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas sp.DL-6)基因组DNA为模板，以CBP58-F和CBP58-R引物对进行PCR扩增；所述引物为：上游引物CBP58-F:5’-GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGATAGCCCTAAAG-3’下游引物CBP58-R:5’-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3’。
进一步的，上述几丁质蛋白CBP58的编码基因其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，由531个氨基酸组成。
本发明的另一个目的是提供上述几丁质结合蛋白CBP58的表达与纯化方法，包括以下步骤：
(1)碱基序列扩增：以PCR方法扩增如SEQ ID No.1所示的DNA序列；
(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-CBP58：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T simple载体用同样的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T₄DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-CBP58；
(3)构建大肠杆菌重组表达载体：将克隆载体pMD19-T-CBP58质粒转化至E.coli DH5α，得到阳性转化子，用限制性内切酶NdeI和XhoI将CBP58基因片段从pMDl9-T-CBP58质粒上切下，连接到pET-23b表达载体上，转化至E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆，得到重组表达载体pET23b-CBP58；
(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)-pET23b-CBP58：将重组表达载体pET23b-CBP58质粒转化至E.coli BL21(DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET23b-CBP58；
(5)体外诱导表达：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET23b-CBP58接入含氨苄的LB培养基中，于37℃过夜培养14h后，按1％的接种量接种到含氨苄的LB培养基中，当OD_600nm达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于30℃，100rpm低温诱导6h；
(6)几丁质结合蛋白CBP58的纯化：体外诱导表达结束后，于4℃，5,000×g离心5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体；之后置于冰上超声破碎三次，每次30s，每次间隔1min，最后于4℃，8,000×g离心20min，收集上清液，即为粗蛋白，粗蛋白用Ni²⁺-NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质结合蛋白CBP58。
本发明还请求保护上述几丁质结合蛋白CBP58的新用途。
所述的几丁质结合蛋白CBP58在几丁质结合中的应用。
所述的几丁质结合蛋白CBP58在抑制黑曲霉(Aspergillus niger)和苹果树腐烂病(Cytospora mandshurica Miura)真菌中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次从菌株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)中克隆出几丁质蛋白CBP58的编码基因，通过构建原核表达载体获得了具有高活性的表达产物，制备过程简单，为几丁质蛋白CBP58的后续研究提供了简便方法，而且生产成本低、易保存；
2、本发明提供的几丁质蛋白CBP58具有与几丁质结合的功能，用于纯化和辅助鉴定几丁质；
3、本发明中几丁质蛋白CBP58对于黑曲霉(Aspergillus niger)和苹果树腐烂病(Cytospora mandshurica Miura)具有良好的抑制效果，具有潜在的生物防治功能，为农业领域抗真菌药物研发的提供新的研究方向，具有广阔的应用价值，将产生巨大的工业效益和经济价值。
附图说明
图1.CBP58基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2.CBP58蛋白的SDS-PGAE检测结果；
图3.CBP58蛋白的纯化；
图4.酶活标准曲线和标准曲线方程；
图5.扫描电子显微镜观察CBP58蛋白结合α/β-chitin微粒结果图(其中，A、CBP58处理的α-chitin(×1000)；B、CBP58处理的α-chitin近距离图片(×10000)；C、缓冲液处理的α-chitin(×1000)；D、缓冲液处理的α-chitin近距离图片(×10000)；E、CBP58处理的β-chitin(×1000)；F、CBP58处理的β-chitin的近距离图片(×10000)；G、缓冲液处理的β-chitin(×1000)；H、缓冲液处理的β-chitin近距离图片(×10000))；
图6.CBP58蛋白底物结合实验图(其中，1、对照，2、α型几丁质，3、β型几丁质，4、β几丁质纳米须，5、胶体几丁质，6、微晶纤维素)；
图7.CBP58蛋白抗黑曲霉实验结果(其中，+、阳性对照(噻霉酮乳状液)；－、阴性对照(无菌水)；1、浓度为0.125mg/ml蛋白液；2、浓度为0.25mg/ml蛋白液；3、浓度为0.5mg/ml蛋白液)；
图8.CBP58蛋白抗苹果树腐烂病实验结果(其中，+、阳性对照(噻霉酮乳状液)；－、阴性对照(无菌水)；1、浓度为0.125mg/ml蛋白液；2、浓度为0.25mg/ml蛋白液；3、浓度为0.5mg/ml蛋白液)；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围，实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。如无特殊说明，本发明所使用试剂均市售可得，作为优选，pMD19-T simple，T₄DNA连接酶，限制性内切酶NdeⅠ/XhoⅠ，大肠杆菌感受态细胞DH5α、E.coli BL21(DE3)，购自TaKaRa公司；Ni²⁺-NTA树脂购买自Novagen公司；虾壳α型几丁质、鱿鱼的β型几丁质购自Sigma公司，其它常用化学试剂均为市售分析纯。
实施例1CBP58蛋白溶液的制备
一、CBP58基因的扩增
利用PCR技术以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株的基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用Primer5.0软件设计引物，分别为：上游引物CBP58-F(SEQ ID No.2):5-GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGATAGCCCTAAAG-3，下划线标示NdeI酶切位点，下游引物CBP58-R(SEQ ID No.3):5-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3，下划线标示XhoI酶切位点。
PCR反应体系：


PCR反应条件：用94℃ 2min，1个循环，然后30个循环的94℃ 30s、55℃ 30s和68℃ 7min；最后用68℃ 15min，1个循环进行扩增。PCR反应结束以1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，在1596bp处有明亮单一条带，即为目的基因CBP58，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(Genbank登录号为：KF234015)。本发明所述的CBP58编码531个氨基酸，估算其分子相对质量为58.517KDa，蛋白的pI值为4.35，具有如SEQ ID No.4所述的氨基酸序列。该序列首次在菌株(Pseudoalteromonas sp.DL-6)中克隆。
二、大肠杆菌克隆载体pMDl9-T-CBP58的制备
1、CBP58基因与pMDl9-T的连接
使用TaKaRa公司的试剂盒(TaKaRa DNA Ligation Kit<Mighty Mix>)将PCR扩增产物进行纯化回收，将回收的CBP58PCR产物与pMD19-T simple克隆载体连接。
连接反应体系为：

连接反应的条件为：在T₄DNA连接酶作用下16℃过夜连接，构建克隆载体pMDl9-T-CBP58。
2、克隆载体(pMDl9-T-CBP58)的转化
(1)取冰上冻融的100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α，于上述10μl的连接反应液中，轻柔混合均匀；
(2)冰中放置30min后再于42℃热激处理1min，然后立即转移冰中放置1min；
(3)加入900μl的SOC培养液，于37℃振荡培养1h；
(4)取100μl上清均匀涂布于(LB/Amp/X-gal/IPTG)培养基表面，于37℃过夜培养，筛选阳性转化子。
LB/Amp/X-gal/IPTG培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g至于1L烧杯中，加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解。滴加5N NaOH溶液(约0.2ml)，调节pH值至7.0。用去离子水定容至1L后，加入15g琼脂。高温高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入1mL氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)(100mg/mL)、1mL X-gal(20mg/ml)、1mL IPTG(24mg/ml)后均匀混合，铺制平板(30ml培养基/90mm培养皿)，4℃保存。
3、克隆载体(pMDl9-T-CBP58)的提取
用TaKaRa公司的TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification试剂盒提取克隆载体(pMDl9-T-CBP58)。
三、大肠杆菌表达载体pET23b-CBP58的制备
1、CBP58基因的制备
已构建的重组质粒pMDl9-T-CBP58用Nde Ⅰ/Xho Ⅰ两种限制性内切酶酶切鉴定，反应体系如下：

反应体系于37℃水浴中酶解2-3h，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。酶解产物用TaKaRa公司的TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0，回收基因CBP58。
2、表达载体pET-23b的制备
将表达载体pET-23b利用同样的限制性内切酶NdeⅠ/XhoⅠ进行双酶切鉴定，反应体系如下：

反应体系于37℃水浴中酶解2-3h，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。酶解产物用TaKaRa公司的试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0)，回收表达载体pET-23b。
3、原核重组表达载体pET23b-CBP58的构建
使用DNA Ligation Mix试剂盒，将NdeⅠ/XhoⅠ限制性内切酶酶切产生的CBP58基因亚克隆至同样酶切处理的表达载体pET-23b中，反应体系：克隆载体(pMDl9-T-CBP58)酶切产物CBP58基因(30ng/μl)1μl，pET-23b(20ng/μl)2μl，5μl Ligation Mix，2μl dH₂O。反应条件为：16℃过夜连接。
4、重组原核表达质粒pET23b-CBP58的转化
(1)取冰上冻融的100μl大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)(购自TaKaRa公司)，于上述10μl的连接反应液中，轻柔混合均匀；
(2)冰中放置30分钟后，在42℃热激处理1min，然后立即转移冰中放置1min；
(3)加入900μl的SOC培养液，37℃振荡培养1h；
(4)取100μl涂于(LB/Amp)培养基表面,37℃过夜培养筛选阳性转化子。
LB/Amp培养基：在950ml去离子水中加入：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解。用5N NaOH溶液(约0.2ml)调pH至7.0。用去离子水定容至1L，加入15g琼脂。高温高压灭菌冷却至室温。加入1mL氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)(100mg/ml)后混合均匀，4℃保存。
5、重组原核表达载体pET23b-CBP58的提取
用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification试剂盒提取表达载体pET23b-CBP58。
四、构建大肠杆菌重组表达菌株
1、种培养：将含有重组原核表达载体pET23b-CBP58及空融合表达载体pET-23b的E.coli BL21(DE3)细胞挑1-2个单菌落接种到含氨苄终浓度为50ug/ml的2ml LB/Amp培养基中，37℃过夜培养。
2、主培养：培养14小时后按1％接种量转移至100ml LB/Amp培养基中，37℃振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8。
3、诱导表达：加入终浓度0.2mM的IPTG在30℃下诱导表达6h。
4、收集全细胞：于4℃，5,000×g，离心10min收集菌体，并用300μl的PBS悬浮菌体细胞，混匀后取200μl菌悬液超声波处理10s/2～3次，直至液体透明，取出50μl作为全细胞样品。
5、可溶蛋白的抽提：将上述菌液的残余部分于12,000×g，4℃离心5min，取50μl上清液即为可溶蛋白。
6、不可溶蛋白的抽提：添加150μl PBS缓冲液于步骤5离心后的沉淀中，充分振荡混匀即为不可溶蛋白。
7、SDS-PAGE电泳检测表达的目的蛋白，见附图2所示。
五、CBP58蛋白的纯化
1、CBP58蛋白的大量诱导表达
(1)挑取一个重组大肠杆菌菌落接入50ml含氨苄(50ug/ml)的LB培养液，在250ml摇瓶中于37℃过夜培养。
(2)将50ml过夜培养物接入500ml含氨苄(50ug/ml)的LB培养液，在2L摇瓶中于37℃振荡过夜培养，至对数中期(OD_600nm＝0.6-0.8)。
(3)以终浓度为0.2mM IPTG、30℃下诱导表达靶蛋白6h。
(4)于4℃以3,500g，离心15min收集菌体(约3.5g)。
(5)将菌体沉淀重悬于8倍体积的PBS缓冲液中，4℃超声波破碎10s×3次，共直至液体透明。
(6)于4℃，12,000×g，离心20min收集上清液进行CBP58蛋白纯化研究。
2、CBP58蛋白通过Ni²⁺-NTA树脂进行大规模纯化
(1)用二次水清洗Ni²⁺-NTA树脂；
(2)用PBS清洗Ni²⁺-NTA树脂；
(3)将大量诱导表达的融合蛋白粗提取物上柱；
(4)用10倍体积20mM-300mM bufferA/咪唑洗脱(Elute)结合的重组蛋白，每份800ul分布收集，监测OD₂₈₀。用20μl等份的蛋白进行10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析CBP58蛋白的分布情况。如附图3所示。
(5)蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(碧云天)检测。CBP58蛋白溶液的浓度为0.5mg/ml。
六、CBP58对照蛋白溶液的制备
用质粒pET23b代替pET23b-CBP58进行步骤四，得到对照蛋白溶液。用BCA蛋白测定试剂盒(碧云天)检 测蛋白浓度。对照蛋白溶液的浓度为1.2mg/ml。
实施例2CBP58蛋白的几丁质酶酶活
一、胶体几丁质的配制：称取1g粉状来自虾壳α型几丁质于研钵中加入4ml丙酮，研磨至糊状，如果粉状不是很细腻，相对粗糙，期间则可以加入丙酮并充分研细至糊状；在4℃下边研磨边加入浓盐酸40ml用玻璃纤维过滤。然后将滤液缓缓加入到装在烧杯中剧烈搅拌的放置于冰上的50％乙醇中，将烧杯4℃置于层析柜中磁力搅拌器上过夜搅拌。用小分子量的透析袋过夜透析清洗至中性，最后4℃保存于PBS缓冲液中备用。
二、酶活测定标准曲线的建立
取1mL样品溶液，加入1mL铁氰化钾试剂(配制1L 0.5M碳酸钠溶液，加入0.5g铁氰化钾)，在沸水中煮10min，然后用自来水冷却至室温，测量OD₄₂₀nm，具体如下表1。
表1.酶活测定标准曲线的建立(铁氰化钾法测定还原糖含量)

所有试验需反复取三次平均值；标准曲线及方程如图4所示。
三、CBP58蛋白的几丁质酶活性
①对照：先将0.2mL的1N的氢氧化钠溶液与0.9mL 1％的胶体几丁质混合后，再加入0.1mL CBP58，于37℃水浴中温浴2小时，离心取上清，测OD₄₂₀。
②酶活测定(铁氰化钾法检测还原糖含量)：先将0.1mL CBP58与0.9mL 1％的胶体几丁质混合，并在37℃水浴中温浴2小时。然后再加入0.2mL 1N氢氧化钠溶液来终止酶反应，于12,000×g离心5min，取上清液，用铁氰化钾方法测量其中的还原糖含量。
结果表明CBP58蛋白本身不具有几丁质酶活性。
实施例3扫描电子显微镜(SEM)观察CBP58蛋白结合粉状几丁质
1mL反应体系包括2mg/mLα型几丁质或β型几丁质，0.5mg/mL CBP58，室温下孵育24h，12,000×g离心10min，倒掉上清，沉淀于37℃下自然烘干固定样品，未加入CBP58的设为对照，扫描电镜下观察底物结合情况。
扫描电镜观察CBP58与粉状几丁质结合情况如图5所示。从图5A-B和图5E-F中可以看出经过经CBP58处理后的α几丁质和β几丁质边缘和表面粗糙不平、疏松多孔，更利于几丁质酶与底物的接触降解；从图5C-D和图5G-H中可以看出对照缓冲液处理后的平整光滑、纹理致密，不易于酶与底物的结合。结果说明CBP58为一种结合几丁质，使底物结构变松散的几丁质结合蛋白。
实施例4CBP58蛋白的结合能力
一、纳米须几丁质的制备
称取3mg/ml来自鱿鱼的β型几丁质于0.2M醋酸中，于超声波(400w)处理10s/2～3次，直至成胶状。最后用20mM Tris-HCl(pH8.0)过夜透析。
1M Tris-HCl(pH8.0):6.057g Tris,29.22g NaCl，定容到1L，HCL调到8.0，使用时稀释至所需浓度。
二、CBP58结合实验研究
1ml的反应体系中分别加入500μg/ml的CBP58，5mg/ml的来自虾壳粉的α型几丁质，5mg/ml来自鱿鱼的β型几丁质。胶体几丁质，纳米须几丁质和微晶纤维素，室温下缓慢旋转24h。孵化后于16000g离心5分钟，取10μl上清液用于后续SDS-PAGE分析。沉淀用Tris-HCl(pH8.0)洗2-3次除去多余未结合CBP58，而后加入50μl，SDS-PAGE样品缓冲液煮沸5min，取20μl用于SDS-PAGE分析，如图6。
实施例5CBP58抗真菌作用
将供试的黑曲霉(Aspergillus niger)和苹果树腐烂病(Cytospora mandshuricaMiura)两种真菌于28℃，在PDA平板或斜面上培养2-3d，将孢子洗下，通过0.45μm孔径滤膜除去菌丝，调整孢子浓度为1x10⁶孢子/mL。将100μL适量孢子溶液涂平板，然后将适量的CBP58蛋白加入PDA平板上的牛津杯中，阳性对照为噻霉酮，阴性对照为无菌水，置于28℃培养72h左右，观察菌丝生长情况。如图7和图8所示，结果表明CBP58具有较高的抵抗两种病原真菌活性，具有潜在的生物防治功能。






<110>  大连大学
<120>  几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用
<130>  2015
<160>  4   
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1596
<212>  DNA
<213>  Pseudoalteromonas sp.DL-6
<400>  1
atggcatcaa ttaaacttaa cacgattacg ctatctgcaa ttactagtgg tttactactc       60
agtacactag caccgcaagt gcaagcacat ggttatatgg atagccctaa agcgcgccaa      120
gcaatttgtc aagttgatgg cggatactgg tggcctgaag acggcacaaa tattcctaac      180
cttgcgtgtc gagccgcata tttagaatcg ggcacggtgc agtttgtaca agcgattgaa      240
ttttccgtta atactcctga ctatttaaat caaaccgcag ttgaggccag tgtaccaaac      300
ggcactttat gtgctggtgg cgatacagcc aaacggggta tggatttacc atcaccacat      360
tggcagcgcg gtgatgtaat gcctaactct aatggtgata tacaaatccg ttatttagct      420
gcaacaccac ataatcccag cttttggcag ttttatttaa ctaagccaac ttttaatacc      480
gctacagata tattgacctg gcaagactta gagctagttc aagagcatca aaatgttgaa      540
gtagtaaaag acaccgatgg tgaacgttat tatcaaatga gtgtggctat tccacaaggg      600
cgcaacggcg atgcaatttt gtatagccgc tggcaacgaa acgatgtcgt gggagaagga      660
ttttataact gtagtgacat taacattgta aacgacgctg caccaaccga tcctaatgcg      720
tgggcaagcc ttggttactt tgtacgccaa gggcaaaatg ccattgctgg tgacactgta      780
tgggctcgtt tatttgacga aacaggtcaa gaggtgatta atcaacagct taaaattaat      840
gctgacaatc aagcaaattg gcaacaagca ttggctgaac agcttaacct tgattacgcg      900
catttagtgc aaattggtgt gcaaaatcaa gagggagatg ttgtatttaa caacgcagat      960
gtactaacta accaagtata tggcaacaac ccaaattaca cctatacatt aagcgtgcag     1020
ggcgctccca gtaatacagc gcctattgtg agtaagccag aaaacctagt agttgatgaa     1080
aacaccatca cgtctgtgca tttacatgcg tttgatgatg agcgaagtgc gttaatttat     1140
acttggtcag taccggcacc actgagtttt accggtggcg atgccaatat caacttactc     1200
tcacctgaag tttcaacacc tacagattat accgtttcgg tctctgtttc tgatggccaa     1260
ttaacgaccc aaaccgaatt tattgtcacc gttaatgaca gcgttatcaa tgatcctgtt     1320
atcgctccat ggagctcaac agaggtttat caagcaacag ataaagcgag ctttcaaggc     1380
cgtatttact tagctaaatg gtggaatcaa ggtcagcagc cagatagttc aagtgcgtgg     1440
cagcctgttg acgagcctaa tacgccagca gcatggaata ttaataaagc ctatcaagcg     1500
ggcgcaaaaa taacctatca aggacagcgc tatagcgcca agtggtggac tcaaggcgat     1560
acgccaggac aagccgatgt atggaccaca ctgtaa                               1596
 
 
<210>  2
<211>  38
<212>  DNA
<213>  人工合成
<400>  2
ggaattccat atgcatggtt atatggatag ccctaaag                             38
 
 
 
<210>  3
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工合成
<400>  3
ccgctcgagc agtgtggtcc atacatcggc ttg                                  33
 
 
 
<210> 4
<211>  531
<212>  PRT
<213>  Pseudoalteromonas sp.DL-6
<400>  4
Met Ala Ser Ile Lys Leu Asn Thr Ile Thr Leu Ser Ala Ile Thr Ser
1               5                   10                  15     
Gly Leu Leu Leu Ser Thr Leu Ala Pro Gln Val Gln Ala His Gly Tyr
            20                  25                  30         
Met Asp Ser Pro Lys Ala Arg Gln Ala Ile Cys Gln Val Asp Gly Gly
        35                  40                  45             
Tyr Trp Trp Pro Glu Asp Gly Thr Asn Ile Pro Asn Leu Ala Cys Arg
    50                  55                  60                 
Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Gly Thr Val Gln Phe Val Gln Ala Ile Glu
65                  70                  75                  80 
Phe Ser Val Asn Thr Pro Asp Tyr Leu Asn Gln Thr Ala Val Glu Ala
                85                  90                  95     
Ser Val Pro Asn Gly Thr Leu Cys Ala Gly Gly Asp Thr Ala Lys Arg
            100                 105                 110        
Gly Met Asp Leu Pro Ser Pro His Trp Gln Arg Gly Asp Val Met Pro
        115                 120                 125            
Asn Ser Asn Gly Asp Ile Gln Ile Arg Tyr Leu Ala Ala Thr Pro His
    130                 135                 140                
Asn Pro Ser Phe Trp Gln Phe Tyr Leu Thr Lys Pro Thr Phe Asn Thr
145                 150                 155                 160
Ala Thr Asp Ile Leu Thr Trp Gln Asp Leu Glu Leu Val Gln Glu His
                165                 170                 175    
Gln Asn Val Glu Val Val Lys Asp Thr Asp Gly Glu Arg Tyr Tyr Gln
            180                 185                 190        
Met Ser Val Ala Ile Pro Gln Gly Arg Asn Gly Asp Ala Ile Leu Tyr
        195                 200                 205            
Ser Arg Trp Gln Arg Asn Asp Val Val Gly Glu Gly Phe Tyr Asn Cys
    210                 215                 220                
Ser Asp Ile Asn Ile Val Asn Asp Ala Ala Pro Thr Asp Pro Asn Ala
225                 230                 235                 240
Trp Ala Ser Leu Gly Tyr Phe Val Arg Gln Gly Gln Asn Ala Ile Ala
                245                 250                 255    
Gly Asp Thr Val Trp Ala Arg Leu Phe Asp Glu Thr Gly Gln Glu Val
            260                 265                 270        
Ile Asn Gln Gln Leu Lys Ile Asn Ala Asp Asn Gln Ala Asn Trp Gln
        275                 280                 285            
Gln Ala Leu Ala Glu Gln Leu Asn Leu Asp Tyr Ala His Leu Val Gln
    290                 295                 300                
Ile Gly Val Gln Asn Gln Glu Gly Asp Val Val Phe Asn Asn Ala Asp
305                 310                 315                 320
Val Leu Thr Asn Gln Val Tyr Gly Asn Asn Pro Asn Tyr Thr Tyr Thr
                325                 330                 335    
Leu Ser Val Gln Gly Ala Pro Ser Asn Thr Ala Pro Ile Val Ser Lys
            340                 345                 350        
Pro Glu Asn Leu Val Val Asp Glu Asn Thr Ile Thr Ser Val His Leu
        355                 360                 365             
His Ala Phe Asp Asp Glu Arg Ser Ala Leu Ile Tyr Thr Trp Ser Val
    370                 375                 380                
Pro Ala Pro Leu Ser Phe Thr Gly Gly Asp Ala Asn Ile Asn Leu Leu
385                 390                 395                 400
Ser Pro Glu Val Ser Thr Pro Thr Asp Tyr Thr Val Ser Val Ser Val
                405                 410                 415    
Ser Asp Gly Gln Leu Thr Thr Gln Thr Glu Phe Ile Val Thr Val Asn
            420                 425                 430        
Asp Ser Val Ile Asn Asp Pro Val Ile Ala Pro Trp Ser Ser Thr Glu
        435                 440                 445            
Val Tyr Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ser Phe Gln Gly Arg Ile Tyr Leu
    450                 455                 460                 
Ala Lys Trp Trp Asn Gln Gly Gln Gln Pro Asp Ser Ser Ser Ala Trp
465                 470                 475                 480
Gln Pro Val Asp Glu Pro Asn Thr Pro Ala Ala Trp Asn Ile Asn Lys
                485                 490                 495    
Ala Tyr Gln Ala Gly Ala Lys Ile Thr Tyr Gln Gly Gln Arg Tyr Ser
            500                 505                 510        
Ala Lys Trp Trp Thr Gln Gly Asp Thr Pro Gly Gln Ala Asp Val Trp
        515                 520                 525            
Thr Thr Leu
    530