用于分离纯化的 RNA 的试剂和方法 本申请为 2006 年 12 月 1 日提交的申请号为 200580017853.5 标题为 “用于分离纯 化的 RNA 的试剂和方法” 的申请的分案申请
技术领域
本发明是关于改善从生物学样品中分离纯化的 RNA 的组合物和方法。背景技术 纯的完整 RNA 的分离为分子生物学、 临床和生物技术应用中分析基因表达的关键 步骤。为实现上述目标， 已经开发了多种 RNA 分离的方法。最经常使用的用于 RNA 分离的 方法基于酚提取、 从离液序列高的盐溶液中沉淀以及二氧化硅吸附 (Ausubel 等人， 2002)， 参阅申请人的专利 US4843155、 US 5346994 和 US 5945515。 在 US 4843155 中描述的方法通 常被称为单步 (single-step) 方法， 用 pH 为 4 的酚 - 胍溶液 (phenol-guanidinesolution)
提取 RNA。该方法的有效和简便使单步方法成为最常用的分离 RNA 的方法。
在申请人的 US 5346994 中描述的单步方法的改良方法允许通过 pH 为 4-6 的 酚 - 胍溶液的提取， 从同一样品中同时分离 RNA、 DNA 和蛋白质。均质处理生物学样品， 并且 所得匀浆用诸如氯仿或溴氯丙烷的疏水有机溶剂进行相分离。然后离心， 所得混合物分为 含有 RNA 的上层水相、 相的界面和含有 DNA 和蛋白质的下层有机相。收集所述水相， 用醇沉 淀并洗涤 RNA。
在 US 4843155 和 US 5346994 中描述的单步方法中， 小心收集分层的水相对分离 RNA 的质量很关键。 少量的相的界面和有机相容易和水相一起转移， 导致 DNA 和蛋白质污染 分离的 RNA。并且水相的收集要求手工处理， 成为实现单步方法自动化的障碍。
US 4843155 和 US 5346994 中描述的试剂和方法提供了基本纯的、 未降解的 RNA。 然而根据 US 4843155 和 US 5346994 分离的 RNA 含有残留量 (residual amount) 的基因组 DNA， 可以通过反转录聚合酶链式反应测定法 (reverse transcription-polymerase chain reaction assay， RT-PCR) 检测。因此根据 US 4843155 和 US 5346994 分离出的 RNA 还必 须进一步纯化使其不含 DNA(Guan 等人， 2003 ； Girotti 和 Zingg， 2003)。所述污染基因组 DNA 可以用作 DNA 聚合酶的母板 (matrix)， 产生另外的扩增产物并且扰乱 RNA- 依赖的反 转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)。RT-PCR 中的 DNA 污染只能通过使用一组含有基因组 DNA 中外显子 - 内含子序列的引物而部分减轻， 因为所述基因组 DNA 存在不含内显子的假基因 (pseudogene)， 使所述方法不可靠 (Mutimer， 1998)。
单步方法的改良已经改善了分离 RNA 的质量。在一种改良方法中， 通过加入氯化 锂的沉淀步骤移除 RT-PCR 抑制剂 (Puissant， 1990 ； Mathy， 1996)。在另一改良方法中， 在 盐存在下以醇沉淀 RNA 增加了分离 RNA 的纯度 (Chomczynski， 1995)。然而， 所述这些改良 不能有效去除 DNA 污染。
去除污染 DNA 的共同惯例是用脱氧核糖核酸酶 (deoxyribonuclease， DNase) 处理 含有 RNA 的样品。在 DNA 酶处理后， 所述含有 RNA 的样品随后用酚和氯仿萃取。在一种为了限制 DNA 污染的尝试中， 于单步方法中包括了附加的 DNA 沉淀步骤。通过添加三分之一 体积的 95％重量 / 重量乙醇， 从水相中沉淀出所述污染的 DNA(Siebert， 1993)。乙醇的终 浓度为约 24％重量 / 重量。该文作者指出， 在所述低的乙醇浓度下， DNA 沉淀而 RNA 仍然存 留在溶液中。RNA 通过添加更多的乙醇从溶液中沉淀出来。然而， 通过分析分离的 RNA 在 琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色的可见 DNA 带以及 RT-PCR 证明， 所述方法得到的 RNA 仍然受 DNA 污染。
在 另 一 种 为 了 减 少 DNA 污 染 并 改 善 单 步 方 法 中 RNA 的 质 量 的 尝 试 中， Monstein(1995) 在一种繁复的方法中， 将酚提取的 pH 值提高到 4.1-4.7， 并用蛋白酶 K 处 理样品， 然后再进行另一循环的酚提取、 沉淀和醇洗涤。这一方法不仅耗时， 而且仍然必需 用 DNA 酶处理以得到备用于 RT-PCR 中的不含 DNA 的 RNA。
从 DNA 中分离 RNA 也可以通过不加胍盐 (guanidine salt) 的 pH 为 4 的酚提取实 现 (Kedzierski， 1991)。然而， 所述方法中不存在胍盐使得 RNA 对 RNA 酶 (ribonuclease， RNase) 敏感， 因此降解了所述 RNA。所述方法较近的改进使用了存在十二烷基硫酸钠的 pH 4.2 的酚提取缓冲液 (Chattopadhyay 等人， 1993)。RNA 分离方法中， 使用单步方法然后硅 柱 (silica column) 操作的结合也需要 DNA 酶处理 (Bonham， 1996)。所述双重纯化方法的 应用减少了 DNA 污染， 但是通过 RT-PCR 检测所得分离的 RNA 仍然存在基因组 DNA。用于分 离 RNA 的另一方法使用了含有 10％重量 / 重量至 60％重量 / 重量的酚的单相水性溶液 (US 专利申请 20030204077)。不含离液剂 (chaotrope) 时， 15％重量 / 重量至 55％重量 / 重量 的一元醇 (monoalcohol)、 二元醇或者多元醇用于使酚保持在水性溶液中。
因此， 通过 US 4843155 和 US 5346994 中描述的方法分离的 RNA 中存在 DNA 残留 量， 必需通过引入 DNA 酶处理而扩展所述操作。 这样做由于操作的时间较长且在 DNA 处理过 程以及附加的纯化步骤中可能造成 RNA 不必要地降解， 因此减少了所述方法的有用性。然 而从 RNA 制品中去除残留 DNA 为基于微阵列基因表达测定的 RT-PCR 所必需。
前述分离 RNA 的方法， 如 US 4843155 和 US 5346994 中所述， 基于在 pH 为 4 或者 更高条件下进行的酚提取。以前单步方法的改良没有尝试通过进行 pH 低于 4 的酚提取改 善 RNA 质量。相反， 首次用在 US 4843155 中的 pH 为 4， 在接下来的 US 5346994 中增加到 pH 范围 4-6。类似地， Monstein(1995) 所述的方法酚提取的 pH 值升高到 4.7。另一改善所 述单步方法的精心尝试提高了胍 - 酚提取的 pH 至 5.2(Suzuki， 2003)。
US 5973137 中 公 开 了 RNA 分 离 的 单 步 方 法 一 种 选 择， 使用非离液序列高的 (non-chaotropic) 酸性盐。然而， 所述单步酚提取法仍是用于 RNA 分离的最经常使用的 方法。描述单步方法的出版物 (Chomczynski， 1987) 为 American Chemical Society and Institute for Scientific Information 数据库中第四被引用最多的论文， 以及近二十年 中出版的被引用最多的论文 (CAS 2003， American Chemical Society)。
因此需要提高分离 RNA 的纯度的新方法。 发明内容 本发明公开了能从生物学样品中分离基本不含 DNA 的 RNA 的试剂和方法， 因此 易于用于反转录聚合酶链式反应 (reverse transcriptasepolymerase chain reaction， RT-PCR)。 所述 RNA 称为基本纯的 RNA， 为临床、 研究以及其他应用中的基因表达合适诊断所
必需。 一种实施方式为使用酸性酚的相分离 (phase separation) 方法， RNA 在水相中析 出。该方式基于预料不到的发现——基本纯的 RNA 可以通过酚提取在 pH 低于 4 下完成分 离。
另一种实施方式为 DNA 和蛋白质的酸性酚沉淀， RNA 存留在可溶性部分中。该方 式基于预料不到的发现——特定浓度的酸性酚选择性地沉淀 DNA、 蛋白质和其他细胞组分， 使 RNA 保持可溶性形式。使用酸性酚用于选择性沉淀 DNA 和蛋白质， 消除了对相分离的需 要， 还避免了有毒相分离有机溶剂的使用。该方法大大简化了 RNA 分离过程。
另一种实施方式为从含有酚、 离液剂和少量有机溶剂的溶液中选择性沉淀 RNA。 所 述实施方式可以用于选择性沉淀一直到大约 200 个核苷酸的 RNA 分子。较短的 RNA 分子 ( 低分子量 RNA) 和 / 或 DNA 还可以被回收。DNA 还可以通过升高有机溶剂的浓度至至少约 50％重量 / 重量而从样品中回收。
另一实施方式为通过调节溶液的 pH 值至最大值 3.3 从含有至少一种盐的溶液中 沉淀 RNA。
通过本发明的组合物和方法分离的 RNA 因其高纯度可以直接用于 RT-PCR， 也就是 说， 与原有的 RNA 分离方法相比， 本发明的方法的 RNA 受 DNA 和 / 或蛋白质污染少。所述原 有的方法例如在 US 4843155、 US5346994 和 US 5945515 中公开的方法。所述分离的 RNA 可 以为单链 (ssRNA) 或双链 (dsRNA)， 并且可以分离自各种生物来源， 包括动物、 植物、 酵母、 细菌以及病毒。本发明的方法和本发明组合物分离的 RNA 可以用于分子生物学、 生物技术 和临床科学。此外， 本发明的试剂可以单独使用， 或者与分离基本纯的 DNA( 基本不含 RNA 和蛋白质的 DNA) 和基本纯的蛋白质 ( 基本不含 RNA 和 DNA 的蛋白质 ) 的其他方法结合。
通过下列详细描述和实施例明确本发明上述和其它的优点。具体实施方式
公开了从生物学样品中制备纯 RNA 的方法和组合物。生物学样品为生物来源的任 何样品， 无论体内、 体外或者离体。 样品可以来源于人类、 动物、 植物、 细菌、 病毒、 真菌、 寄生 虫、 支原体等。纯化的 RNA 为通过反转录聚合酶链式反应测定的基本未降解并且不含 DNA 污染的 RNA。
相分离
本发明的一种实施方式提供了通过在 pH 小于 4 完成含有 RNA 样品的酚提取而提 高分离的 RNA 的纯度的方法和试剂。在一个实施方式中， pH 的范围从约 3.9 到约 3.6。pH 小于 4 的酚提取比 pH 为 4 或者更高的酚提取更有效地分离 RNA 和 DNA。
用于本发明相分离方法的所述 RNA 分离试剂包括酚的水性溶液以及保持 pH 范围 在约 3.6 至 4.0 以下的缓冲剂。在一个实施方式中， pH 范围在 3.7 至 3.9 之间。在 RNA 分 离试剂中酚的有效浓度范围为从约 10％重量 / 重量到约 60％重量 / 重量。在一个实施方 式中， 所述酚的浓度范围为从约 25％重量 / 重量到约 45％重量 / 重量。
所述组合物还可以包括其他组分例如 RNA 酶抑制剂、 盐、 螯合剂、 增溶剂、 去污剂、 离液剂以及酚的衍生物。
在一些实施方式中， 例如培养细胞的样品中具有低 RNA 酶活性的 RNA， 可以用 pH约 3.6 至 pH 小于 4 的酸性酚提取， 并且这样可以保护 RNA 不受降解。然而酚可能不足以防 止来自细胞 RNA 酶或者污染的实验室器皿的 RNA 降解。因此， 组合物中还可以包括至少一 种有效量的 RNA 酶抑制剂。所述 RNA 酶抑制剂可以存在于样品匀浆和 / 或酸性酚提取过程 中。RNA 酶抑制剂包括蛋白酶 K、 来自人胎盘的核糖核酸酶抑制剂、 氧矾核糖核苷复合物， 以 及离液序列高的盐 (chaotropic salt)。离液序列高的盐包括硫氰酸胍、 盐酸胍， 以及它们 的混合物。在一个实施方式中， 离液序列高的盐的有效浓度范围为从约 0.5M 到约 6M。在另 一实施方式中， 离液序列高的盐的有效浓度范围为从约 2M 到约 4M。
所述缓冲剂为醋酸盐、 柠檬酸盐、 磷酸盐、 邻苯二甲酸盐 (phthalate)、 酒石酸盐或 乳酸盐中的至少一种盐。缓冲剂的浓度应当足以维持组合物的 pH 在约 3.6 至小于 4.0。在 一个实施方式中， 所述 pH 的范围为约 3.75 至约 3.85。所述缓冲剂可以在样品匀浆前或匀 浆后， 单独或者与相分离试剂一起加入。一些具有高缓冲能力的例子例如血液以及植物组 织， 可以要求额外量的酸以将 pH 值调整到需要的范围内。
本发明组合物还可以包括有机和无机盐例如钠、 钾、 锂和铵的氯化物、 磷酸盐、 醋酸盐和硫氰酸盐。本发明组合物可以包括螯合剂例如柠檬酸盐和乙二胺四乙酸盐 (ethylenediamine tetraacetate salt)。本发明组合物可以包括去污剂例如聚氧乙烯山 梨聚糖 (polyoxyethylenesorbitan)、 十二烷基硫酸钠和肌氨酸。所述盐、 螯合剂和去污剂 促进组织增溶作用和基本纯 RNA 沉淀。为了帮助溶解酚， 所述水性组合物还可以包括增溶 剂或增溶剂的混合物。增溶剂包括多元醇例如浓度从约 1％重量 / 重量到约 10％重量 / 重 量的丙三醇， 选择上限为了不增加分离的 RNA 中的 DNA 污染。增溶剂也可以包括胍盐。 本发明组合物可以包括约 60 ％重量 / 重量范围内的酚， 最多约 5 ％重量 / 重量 的比酚自身毒性低的酚衍生物。所述衍生物包括苯基乙醇、 丙烯苯氧基醇 (propylene phenoxytol)、 百里酚或丁基酚 (butylphenol)。 在一个实施方式中， 所述衍生物存在量范围 为 1％重量 / 重量至约 5％重量 / 重量。所述组合物还可以包括不溶或部分水溶性的有机 化合物， 例如， 环己醇、 环己基溴化物和二氯苯甲酸。所述化合物增加了组合物的密度并取 代酚， 因此最小化所述组合物的毒性。
在相分离方法的一个实施方式中， 通常通过匀浆或溶胞 (lysis) 准备本发明组合 物中的样品。大量 DNA 和颗粒物质可以通过沉淀或过滤从匀浆或溶胞产物中除去。所述匀 浆或溶胞产物通过与疏水有机溶剂或有机溶剂的混合物混合分成水相和有机相， 所述有机 溶剂例如氯仿、 四氯化碳、 溴萘、 溴苯甲醚或溴氯丙烷。 所述混合物可以通过离心沉淀， 例如 在约 4℃到约 10℃的温度范围内离心。上层水相含有 RNA， 并且相的界面和有机相含有 DNA 和蛋白质。
从水相中用例如低级醇的水溶性有机溶剂沉淀 RNA。所沉淀的 RNA 通过沉降作用 (sedimentation) 或过滤洗涤并溶解在水、 甲酰胺或缓冲液中。 所述最终 RNA 制备物为基本 纯的， 即未降解并且通过 RT-PCR 测试基本不含 DNA 污染。
另外， 本发明相分离方法为适合用于 RNA、 DNA 和蛋白质的同时分离的方法。如 Chomczynski， 1993 或 TRI Reagent brochure， 2003 中所述， 分离到相的界面和有机相的所 述 DNA 和蛋白质可以回收。可选地， 通过加入 0.3 体积的乙醇 DNA 可以从有机相和相的界 面中沉淀出来， 然后通过用更高量的乙醇沉淀蛋白质。例如， DNA 可以用 pH 7.0 或者更高 的水性溶液从相的界面和有机相中在提取。在提取的 DNA 用乙醇从水性溶液中沉淀。可以
理解， 本发明组合物和方法可以用于从同一样品中分离基本纯的 RNA、 基本纯的 DNA( 即， 基 本不含 RNA 的 DNA) 和蛋白质。全部三种组分的分离允许用于具有 DNA 序列变化的基因表 达模式与生物学样品中的蛋白质含量的相关性， 还具有很多其他应用。
在一个实施方式中， 用作样品匀浆或溶胞的所述组合物可以不含一种或多种组 分， 在样品匀浆或溶胞后， 再单独或与相分离有机溶剂 ( 例如氯仿 ) 一起加入到匀浆或溶胞 产物中。在另一实施方式中， 样品匀浆或溶胞可以在高于 pH 4.0 下进行， 在此情况下然后 加入酸或者缓冲剂到匀浆或溶胞的样品中， 加入的量足以将匀浆或溶胞产物的 pH 控制在 约 3.6 至低于 4 的范围内。所述酸或缓冲剂的量可以直接加入匀浆或溶胞产物， 或者可以 溶解于相分离溶剂中。 当与相分离溶剂一起加入时， 所述酸可以为甲酸、 乙酸、 三氯乙酸、 氨 基己酸、 乳酸或氯苯乙酸。 为了提高酸的溶解性， 所述相分离试剂可以包括诸如乙二醇的增 溶剂。
在一个实施方式中， 样品的匀浆或溶胞在不含酚含有 RNA 酶抑制剂的溶液中进 行。在匀浆或溶胞后， 加入酚以达到终浓度范围为 10％重量 / 重量至 60％重量 / 重量， 并 在从约 3.6 到低于 4 的 pH 下进行提取。通过作为水性溶液一部分的缓冲剂、 或者加入酚中 的缓冲剂、 或者单独加入的缓冲剂， 维持所述提取过程中的 pH 范围。相分离后通过离心从 水相中用醇沉淀 RNA。洗涤沉淀的 RNA 并可以将其在水、 缓冲液或甲酰胺中溶解。 酸性酚沉淀 DNA 保留 RNA 在上清中
本发明的一个实施方式用不产生相分离的酸性酚溶液分离基本纯的 RNA。一定浓 度的酸性酚选择性沉淀 DNA( 单链 DNA(ss DNA) 和双链 DNA(ds DNA))、 蛋白质以及其它细胞 组分， 而 RNA 仍然保持溶解形式。利用这一预料不到的现象， 设计无需分离水相和有机相以 及相的界面的用于分离 RNA 的试剂和方法。
所述酸性酚沉淀方法简化了 RNA 分离步骤。它也排除了在相分离方法中使用的毒 性有机溶剂。所述组合物促使 DNA 和蛋白质在试管底部形成稳固的小球 (pellet)， 减少了 向含有 RNA 的上清部分中意外转移 DNA 和蛋白质分子的危险。 所述上清能安全地通过移液、 虹吸、 倾析或过滤收集， 其中每一种方式都可以在 RNA 分离的自动化操作中自动化应用。此 外所述全部的酸性酚沉淀方法可以在室温下进行， 消除了对相分离方法中应用的冷冻离心 机的需求。
用于酸性酚沉淀的组合物包括浓度范围为从约 3％重量 / 重量到低于 30％重量 / 重量的酚的水性溶液。 在一种实施方式中， 所述酚浓度范围为从约 3％重量 / 重量到约 25％ 重量 / 重量。在另一实施方式中， 所属酚浓度在约 8％重量 / 重量到约 20％重量 / 重量范 围内。所述酸沉淀实施方式中酚浓度低于 US 4843155 和 US 5346994 中所述的 30％重量 / 重量的酚到 60％重量 / 重量的酚浓度。
本发明组合物用缓冲剂或酸酸化， 用量足以维持 pH 在约 3.6 至约 5.5 范围内。在 一个实施方式中， 所述 pH 范围从约 3.9 至约 4.5。 所述缓冲剂可以选自有机或无机缓冲剂， 包括但不限于醋酸盐、 柠檬酸盐、 磷酸盐、 邻苯二甲酸盐、 酒石酸盐和 / 或乳酸盐。
为了提高 RNA 分离的效率， 酸性酚可以补充 RNA 酶、 盐、 螯合剂、 酚增溶剂和 / 或去 污剂。RNA 酶抑制剂包括氧矾核糖核苷复合物和蛋白酶 K， 或者所述抑制剂的组合。RNA 酶 抑制剂还包括促溶剂和离液剂例如浓度范围约 0.5M 到约 6M 的胍盐。 在另一实施方式中， 所 述离液剂的浓度为约 1.5M 至约 2.5M。离液序列高的盐能维持水性溶液中的酚用作为酚的
增溶剂。所述酸性酚组合物还可以包括有机和 / 或无机盐例如钠、 钾、 锂和铵的氯化物、 磷 酸盐、 醋酸盐和硫氰酸盐。所述组合物还包括螯合剂例如柠檬酸盐和乙二胺四乙酸盐。所 述组合物还含有去污剂包括例如聚氧乙烯山梨聚糖 (polyoxyethylenesorbitan)、 十二烷 基硫酸钠和肌氨酸。所述组合物还含有最多约 5％重量 / 重量的比酚毒性低的溶剂和试剂 例如百里酚、 苯基乙醇、 环己醇、 环己基溴化物和二氯苯甲酸。所述附加的组分促进组织增 溶作用和纯 RNA 沉淀。
所述酸性酚沉淀试剂可以含有附加的增溶剂或增溶剂的混合物以帮助份保持在 水溶液中。酚增溶剂包括乙二醇、 多元醇以及低级醇。所述增溶剂可以以从约 1％重量 / 重量到约 10％重量 / 重量的量加入到所述酸性酚沉淀试剂中， 选择上限为了不增加分离的 RNA 中的 DNA 污染。
在酸性酚沉淀方法的一个实施方式中， 生物学样品在沉淀试剂中匀浆或者溶胞。 离心或过滤所得匀浆或溶胞产物以去除沉淀的 DNA、 蛋白质以及其它细胞组分。RNA 保持可 溶形式， 随后用诸如低级醇的水溶性有机溶剂从上清中沉淀出来。 所述低级醇包括甲醇、 乙 醇、 丙醇、 异丙醇和丁醇。然后洗涤并可以在水、 缓冲剂或甲酰胺中溶解所述 RNA 小球。
在酸性酚沉淀方法的另一实施方式中， 生物学样品在大约 3 倍 (3X) 至 5 倍 (5X) 浓缩的酸性酚沉淀试剂中匀浆。 应用浓缩的试剂允许使用同一种试剂处理实体组织 (solid tissue) 以及大体积 (high volume) 的液体样品。大体积的液体样品可以通过加入向浓缩 试剂少量水代偿。所述浓缩的试剂溶解生物学样品中的大多数组分， 并且从细胞结构中有 效释放 RNA。例如试样可以在两倍 (2X) 浓缩的试剂中匀浆。匀浆之后， 等体积水与所得匀 浆混合。水的加入使酚、 胍以及其它组分在期望的浓度内。如此创造了从含有 RNA 的样品 中有效沉淀并去除 DNA 和蛋白质的条件。
离心或过滤所述匀浆或溶胞产物后， RNA 保留在上清液或滤液中， 而 DNA、 蛋白质 以及其它细胞组分在试管底部形成了稳固的小球。如前面所述， RNA 用水溶性有机溶剂从 上清或滤液中沉淀出来。洗涤并可以在水、 缓冲剂或甲酰胺中溶解所述 RNA 沉淀。
在本发明的一种实施方式中， 在相分离方法或酸性酚沉淀方法中都可以使用单一 试剂 (single reagent)。 所述双重作用的试剂包括用在相分离方法中的试剂组分以及用在 酸性酚沉淀方法中的 2X 浓度试剂。如前所述， 用于相分离法的 pH 为约 3.6 至低于 4.0， 用 于酸性酚沉淀法的 pH 为 pH 为约 3.6 至低于 5.5。因此在双重作用实施方式中， 从一种方法 到另一种方法的转换前， 试剂 pH 的调节很必要。例如用于酸性酚沉淀方法的 2X 试剂 pH 为 4.2， 在使用相分离方法前必须进一步酸化到 pH 低于 4。
本发明相分离方法可以用于含有高量脂肪的样本例如脂肪组织和特定肿瘤或瘤 形成的组织。具有高水平污染物的样品， 例如植物以及含有脂肪的组织可以使用双重作用 步骤， 其中包括酸性酚沉淀方法和相分离方法。在一个实施方式中， 生物学样品在 2X 酸性 酚沉淀试剂中匀浆。然后用水稀释所得匀浆达到酸性酚沉淀试剂的浓度范围 ( 即约 3％重 量 / 重量的酚至约 30％重量 / 重量的酚 )。稀释之后， 沉淀的 DNA、 蛋白质和其它细胞组分 通过沉降作用或过滤除去。收集所得上清或滤液并与相分离溶剂混合。在一个实施方式 中， 每一体积上清加入 0.05 体积至 0.1 体积的相分离溶剂。所述相分离溶剂或溶剂的混合 物为至少一种疏水溶剂， 包括但不限于己内酯、 乙二醇二乙酸酯、 聚乙二醇二苯甲酸酯以及 用于相分离方法的溶剂。离心所得混合物以得到上层水相、 相的界面和有机相。收集含有RNA 的所述水相并与一体积低级醇混合以沉淀 RNA。洗涤并可以在水、 缓冲液或甲酰胺中溶 解所述沉淀的 RNA。
所述基于本发明酸性酚溶液的提供纯化的 RNA 的方法， 可用于使用 RT-PCR 的基于 微点阵测试基因表达， 应用于生物化学、 分子生物学和临床应用。 可以通过检测癌细胞以及 其它类型病理样本中特异基因表达模式说明。
使用小体积有机溶剂的选择性 RNA 沉淀作用
如前所述， RNA 可以从本发明相分离方法中的水相沉淀， 并且可以从酸性酚组合物 中沉淀。在每一种情况下， 通过添加约一体积有机溶剂以达到约 50％重量 / 重量的有机溶 剂终浓度， 沉淀 RNA。然而在一些样品制备中， 一体积有机溶剂共沉淀例如蛋白聚糖的多糖 和蛋白质以及 RNA。以前， 为了避免污染物的共沉淀， 一种改良所述单步 RNA 纯化方法的方 法， 通过在 0.9M 钠离子存在下使用 25％重量 / 重量的乙醇沉淀 RNA(Chomczynski， 1995)。 另一方法用 13％重量 / 重量至 23％重量 / 重量的有机溶剂处理不含酚的离液剂溶液， 使所 述溶液 pH 保持在 6 至 7.5 范围内沉淀 RNA。
在本发明方法中， 通过加入有机溶剂或溶剂的混合达到有机溶剂终浓度约 10％重 量 / 重量至约 40％重量 / 重量， 从酚 - 离液剂溶液中沉淀基本纯的 RNA。所述有机溶剂为 丙酮、 四甲烯砜 (tetramethylene sulfone)、 低级醇、 乙二醇、 多元醇、 丙酮、 乙二醇二乙酸 酯和 / 或二甲亚砜。当或者从相分离方法的水相中或者从酸性酚沉淀方法中不含 DNA 且不 含蛋白质上清中沉淀 RNA 时， 所述方法提供了基本纯的 RNA。 所述方法不要求向酚 - 离液剂 溶液加入盐。 出乎预料的是， 不采用较早建议的 (Chomczynski， 1995) 用盐补入溶液， 即可从约 10％重量 / 重量至约 40％重量 / 重量浓度的有机溶剂酚 - 离液剂溶液沉淀出基本纯的 RNA。 事实上， 与醇一起加入盐降低了所述分离的 RNA 的纯度。10％重量 / 重量至 40％重量 / 重 量的乙醇从酚 - 离液剂溶液中单独沉淀 RNA 的结果也与报道相反， 其中通过向酚 - 离液剂 溶液加入 0.3 体积乙醇 ( 终浓度 24 ％重量 / 重量 ) 使得 DNA 沉淀， 而 RNA 保持可溶形式 (Siebert， 1993)。
在一个实施方式中， 组合物中所述有机溶剂的终浓度为从约 20％重量 / 重量至约 25％重量 / 重量。在另一个实施方式中， 所述组合物中有机溶剂的终浓度为从约 10％重量 / 重量至约 40％重量 / 重量。所述酚 - 离液剂溶液的 pH 范围为从约 2.0 至约 9.0。在一个 实施方式中， 所述酚 - 离液剂溶液的 pH 范围为从约 3.5 至约 5.0。
浓度 10％重量 / 重量至 40％重量 / 重量的有机溶剂沉淀被认为是较高分子量 RNA 的大于约 200 个碱基的 RNA 分子。低于 200 个碱基的 RNA 片段和多糖以及蛋白聚糖一起保 留在溶液中。较高分子量 RNA 沉淀后， 较小分子量 RNA 能通过沉淀从所述溶液中回收， 通过 使用额外量的有机溶剂达到约 50％重量 / 重量或者更高例如约 90％重量 / 重量的终浓度 进行沉淀。
本发明的方法凭借用约 10 ％重量 / 重量至约 40 ％重量 / 重量的有机溶剂沉淀 RNA， 还能够用于减少 RNA 制品中 DNA 污染的量。所述 RNA 的选择性沉淀仅在所述溶液中存 在小量污染的 DNA 时有效， 例如每 1 微克 RNA 中少于 10 纳克 DNA。用约 10％重量 / 重量至 约 40％重量 / 重量的有机溶剂沉淀 RNA 也提高了分离的 RNA 的质量， 这样得到高产率的基 本纯的并未降解的 RNA， 与申请人在先专利 US 4843155 和 US 5346994 中描述的方法一致。
从含盐溶液中进行酸性 RNA 沉淀
从含有盐的水性溶液中， 在 pH 低于约 3.3， 通过 pH 依赖沉淀 RNA 得到基本纯的 RNA 连同 DNA。从盐溶液中在酸性 pH 下沉淀 RNA 与 US5973137 的报道相反。US 5973137 公开 在 pH 低于 6 的溶液中， 非离液序列高的盐沉淀 DNA， 而 RNA 停留为可溶形式。
在本发明方法中， 向 RNA 溶液加入足以导致 pH 为 3.3 或者更低的量的缓冲酸。在 一个实施方式中， 所得 pH 在从约 3.0 到约 2.7 范围内。所述酸可以为有机酸或无机酸。所 述酸可以为盐酸、 磷酸、 乙酸和 / 或乳酸。在一个实施方式中， 组合物中的盐为胍盐。
所述实施方式可以并入本发明相的分离方法和 / 或本发明的酸性酚沉淀方法。为 了用在酸性酚沉淀方法中， 酸或缓冲剂可以溶解在水中或溶解在有机溶剂中。所述酸选择 性沉淀 RNA， 以可溶形式保留多糖和蛋白质。用于沉淀 RNA 的酸的量小， 允许 RNA 分离过程 中的低样品量。 在一个实施方式中， 所述酸的量的范围为 RNA 溶液的量的约 0.1％重量 / 重 量至 25％重量 / 重量。
如本发明所述， 用少量有机溶剂和酸性 pH 沉淀 RNA， 使用申请人的 US 4843155 和 US 5346994 中公开的方法还可以用于提高 RNA 的质量。
处理含有 RNA 的样品， 该样品得自用少量有机溶剂沉淀的 RNA 或从含盐的溶液 中酸性沉淀的 RNA， 沉淀出较高分子量的 RNA。较高分子量的 RNA 包括核糖体核糖核酸 (ribosomal RNA， rRNA， 例如 18S 和 28S 的 RNA) 以及信使核糖核酸 (messenger RNA， mRNA)。 所述保留的低分子量 RNA 少于约 200 个核苷酸， 包括转移核糖核酸 (transfer RNA， tRNA)、 5S 的 RNA 以及调控基因表达的小干扰 RNA(small interferingRNA， siRNA)。较低分子量 RNA 通过用附加量的有机溶剂处理， 从上述描述的溶液中回收。在一个实施方式中， 所述样 品用一体积例如甲醇、 乙醇、 丙醇等的低级醇处理沉淀低分子量 RNA。
本发明典型的溶液和方法在下列工作实施例中描述。
实施例 1 ： 从大鼠肝相分离分离 RNA
在一个实施方式中， 下列组合物用于相分离 RNA ： 4M 硫氰酸胍、 0.2M 硫氰酸铵、 5％ 重量 / 重量丙三醇、 40％重量 / 重量苯酚、 0.1％重量 / 重量肌氨酸、 10mM 柠檬酸钠以及 0.1M 乙酸钠的缓冲液， pH 为 3.8。
大鼠肝 (38 毫克 ) 在 1.5 毫升上述组合物中匀浆。然后， 向匀浆中加入 0.15 毫升 溴氯丙烷。振荡所得混合物， 并在 4℃下以 12000 重力加速度 (g) 沉降 15 分钟。沉降后， 形 成水相、 相的界面和下层的有机相。RNA 分布到水相中， 而 DNA 和蛋白质分布到相的界面和 有机相中。
通过加入 0.75 毫升异丙醇从水相中沉淀出 RNA。所述 RNA 沉淀在 10000 重力加速 度下离心 5 分钟。所得小球用 0.75 毫升的 75％重量 / 重量的乙醇洗涤并在 10000 重力加 速度下离心 5 分钟。最终 RNA 小球溶解在水中， 并且通过本领域技术人员公知的方法—— 用分光光度计测量在 260/280 纳米下吸光度 (A260/280) 检测所述 RNA 的浓度。
所述 RNA 的产量为 0.22 毫克。所述在 260/280 纳米下吸光度 (A260/280) 的比值为 1.76， 说明没有蛋白质的污染。 使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)、 肌动蛋白和 c-fos 基因的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR。用 Invitrogen(Carlsbad CA) 的 SuperScript 转录酶进行反转录， 用 Sigma(St. Louis MO) 的 Taq DNA 聚合酶进行 PCR。在 1％琼脂糖 - 溴化乙锭凝胶上分析 RT-PCR 产物。在没有反转录作用时， 分离的 RNA 中没有检测到 DNA。用 1％甲醛 - 琼脂糖凝胶并转移到尼 龙膜上对分离的 RNA 进行 Northern 印迹分析。溴化乙锭和亚甲蓝染色显示了未降解的核 糖体带 (ribosomal band)。 与生物素标记的探针杂交， 显示了未降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢 酶、 肌动蛋白和 c-fos 的 mRNA 带。
实施例 2 ： 从人血液中相分离的 RNA 分离
人血液 (0.5 毫升 ) 与 75 微升的冰乙酸 (glacial acetic acid) 和 5 毫升的如实 施例 1 所述的组合物混合。然后， 向所得混合物中加入 0.5 毫升溴氯丙烷。振荡所得混合 物， 并在 4℃下以 12000 重力加速度 (g) 沉降 15 分钟。沉降后， 所述混合物形成水相、 相的 界面和下层的有机相。RNA 分布到水相中， 而 DNA 和蛋白质分布到相的界面和有机相中。
通过加入 1.25 毫升异丙醇从水相中沉淀出 RNA。所述 RNA 沉淀在 12000 重力加速 度下离心 5 分钟。所得小球用 5 毫升的 75％重量 / 重量的乙醇洗涤并在 10000 重力加速度 下离心 5 分钟。最终 RNA 小球溶解在水中， 并且通过本领域技术人员公知的方法——用分 光光度计测量 A260/280 检测所述 RNA 的浓度。
所述 RNA 的产量为 18.9 微克。所述 A260/280 的比值为 1.70， 说明没有蛋白质的污 染。使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR。在没有反 转录作用时， 分离的 RNA 通过 PCR 没有检测到 DNA 污染。对分离的 RNA 进行 Northern 印迹 分析显示了未降解的核糖体 RNA 带以及未降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的 mRNA 带。 实施例 3 ： 通过相分离和酸化的溴氯丙烷分离 RNA
大鼠脾 (21 毫克 ) 在 1 毫升含有 3.5M 硫氰酸胍、 50mM 乙酸钾、 43 ％重量 / 重量 苯酚、 0.1％聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)pH 为 4.1 的水溶液中匀浆。所述匀浆以 12000 重力加速度 (g) 离心 10 分钟以去除大量 DNA 和微粒。所得澄清的匀浆与 0.1 毫升含 有 14％重量 / 重量乙酸的溴氯丙烷混合。所得混合物的 pH 为 3.7。振荡所得混合物， 并在 4℃下以 12000 重力加速度 (g) 沉降 15 分钟。沉降后， 所述混合物形成水相、 相的界面和下 层的有机相。RNA 分布到水相中， 而 DNA 和蛋白质分布到相的界面和有机相中。
通过加入 0.5 毫升乙醇从水相中选择性沉淀出 RNA。所得沉淀的 RNA 在 10000 重 力加速度下沉降 5 分钟， 然后用 75％重量 / 重量的乙醇洗涤并在 10000 重力加速度下沉降 5 分钟。 最终 RNA 小球溶解在水中， 并且通过本领域技术人员公知的方法——用分光光度计 测量在 260/280 纳米下吸光度 (A260/280) 检测所述 RNA 的浓度。
所述 RNA 的产量为 77 微升。所述 A260/280 的比值为 1.74， 说明没有蛋白质的污染。 使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR， 并且没有检测 到 DNA 污染。对分离的 RNA 进行 Northern 印迹分析显示了未降解的核糖体 RNA 带以及未 降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的 mRNA 带。
实施例 4 ： 通过相分离和在不含酚的离液剂溶液中匀浆分离 RNA
大鼠骨骼肌 (29 毫克 ) 在 0.5 毫升的 3M 硫酸氰胍和 5mM 乙酸盐的水性溶液中匀 浆。所得匀浆与 0.5 毫升苯酚和 0.1M 乙酸钠缓冲液混合， pH 为 3.7。所得混合物与 0.1 毫 升的溴氯丙烷振荡， 并在 4℃下以 12000 重力加速度 (g) 沉降 15 分钟。沉降后， 所述混合物 形成水相、 相的界面和下层的有机相。RNA 分布到水相中， 而 DNA 和蛋白质分布到相的界面 和有机相中。
通过加入 0.5 毫升含有 50％重量 / 重量乙醇的水性溶液从水相中选择性沉淀出
RNA。按实施例 1 中的描述洗涤、 处理并检测所述 RNA 沉淀。
所述 RNA 的产量为 16 微克。所述 A260/280 的比值为 1.70， 说明没有蛋白质的污染。 使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR， 并且没有检测 到 DNA 污染。对分离的 RNA 进行 Northern 印迹分析显示了未降解的核糖体 RNA 带以及未 降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的 mRNA 带。
实施例 5 ： 通过相分离和在 1％重量 / 重量的十二烷基硫酸钠中匀浆分离 RNA
在 25 平方厘米的塑料瓶中长满的人类成纤维细胞 (Clonetics， SanDiego CA) 的 原代培养， 用 1.5 毫升含有 1％重量 / 重量的十二烷基硫酸钠以及 10mM 柠檬酸钠、 pH 为 7.0 的溶液覆盖， 补充 50 微克 / 毫升的蛋白酶 K。所得细胞溶液在室温 ( 约 20℃ ) 下孵育一小 时， 转移到离心管中， 与 1.5 毫升的含有 12％重量 / 重量水的酸性酚以及 100mM 乙酸钠混 合， pH 为 3.7。在 4℃下离心 15 分钟后， 所述混合物形成水相、 相的界面以及有机相。相分 离后， RNA 分布到水相中， 而 DNA 和蛋白质分别分布到相的界面和有机相中。
通过加入 0.75 毫升乙醇从水相中沉淀出 RNA， 并在 10000 重力加速度下沉降 5 分 钟。所得 RNA 小球用 75％的乙醇洗涤， 在 10000 重力加速度下离心 5 分钟， 并溶解在水中。
所述 RNA 的产量为 18 微克。所述 A260/280 的比值为 1.71， 说明没有蛋白质的污染。 使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR， 并且没有检测 到 DNA 污染。对分离的 RNA 进行 Northern 印迹分析显示了未降解的核糖体 RNA 带以及未 降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的 mRNA 带。
实施例 6 ： 通过酸性酚沉淀分离 RNA
在一个实施方式中， 下列组合物用于酸性酚沉淀 RNA ： 20％重量 / 重量苯酚、 2M 硫 氰酸胍、 15mM 柠檬酸钠、 0.1M 氯化锂、 0.05％重量 / 重量肌氨酸、 1.5％重量 / 重量丙三醇以 及醋酸钠缓冲液， pH 为 4.2。大鼠肝 (52 毫克 ) 在 1 毫升上述组合物中匀浆。所述匀浆于 室温 ( 约 20℃ ) 下在 10000 重力加速度下离心 5 分钟以去除沉淀的 DNA、 蛋白质和细胞组 分。
所得上清液转移至以干净试管中， 与 1 毫升乙醇混合以沉淀 RNA。沉淀的 RNA 在 10000 重力加速度下离心 5 分钟， 用 75％重量 / 重量的乙醇洗涤并溶解在水中。
所述 RNA 的产量为 187 微克。 所述 A260/280 的比值为 1.74， 说明没有蛋白质的污染。 使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR， 并且没有检测 到 DNA 污染。对分离的 RNA 进行 Northern 印迹分析显示了未降解的核糖体 RNA 带以及未 降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的 mRNA 带。
实施例 7 ： 使用两倍浓度的试剂通过酸性酚沉淀分离 RNA
大鼠肝 (47 毫克 ) 在 1 毫升浓度为实施例 6 所指出浓度 2 倍的实施例 6 所述试剂 中匀浆。所述浓缩的试剂包括添加的 1％重量 / 重量苯基乙醇。所得匀浆与 1 毫升水混合 形成沉淀试剂。
所述沉淀的 DNA、 蛋白质和其它细胞组分通过在于室温 ( 约 20℃ ) 下在 10000 重 力加速度下离心 5 分钟沉降。所得上清转移至洁净试管， 与 1 毫升乙醇混合沉淀 RNA。沉淀 的 RNA 在 10000 重力加速度下沉降 5 分钟， 用 75％重量 / 重量的乙醇洗涤， 并溶解在水中。
所述 RNA 的产量为 178 微克。 所述 A260/280 的比值为 1.77， 说明没有蛋白质的污染。 使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR， 并且没有检测到 DNA 污染。对分离的 RNA 进行 Northern 印迹分析显示了未降解的核糖体 RNA 带以及未 降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的 mRNA 带。
实施例 8 ： 通过本发明的两步程序分离 RNA
大鼠脑 (61 毫克 ) 在 1 毫升实施例 7 中所述的 2 倍浓缩试剂中匀浆。所得匀浆与 1 毫升水和混合， 并将所得混合物于室温 ( 约 20℃ ) 下在 10000 重力加速度下离心 5 分钟 去除沉淀的 DNA、 蛋白质和细胞组分。 所得上清转移到清洁试管， 并与 0.05 毫升溴氯丙烷混 合。离心所述混合物， 分成上层水相、 相的界面和有机相。
所述含有 RNA 的水相转移到新的试管， 用异丙醇中的 5M 乳酸酸化到 pH 为 2.9。所 述 RNA 沉淀在 10000 重力加速度下沉降 5 分钟， 用 75％重量 / 重量的乙醇洗涤， 并溶解在水 中。
所述 RNA 的产量为 33 微克。所述 A260/280 的比值为 1.77， 说明没有蛋白质的污染。 使用 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的引物， 成功地将所述分离的 RNA 应用于 RT-PCR， 并且没有检测 到 DNA 污染。对分离的 RNA 进行 Northern 印迹分析显示了未降解的核糖体 RNA 带以及未 降解的 3- 磷酸甘油醛脱氢酶的 mRNA 带。
根据上述说明书和实施例， 本发明的其它变化或实施方式对本领域普通技术人员 而言也是很明显的。因此， 上述实施方式不能被理解为是对本发明范围的限制。14