半乳糖的测定方法与半乳糖诊断 / 测定试剂盒 【技术领域】
本发明涉及医学 / 食品检验测定技术领域， 更具体地， 本发明涉及半乳糖诊断 / 测 定方法及其试剂盒。 【背景技术】
牛奶在营养界素有″液体黄金″的美称， 我国早在 1992 年由七部位联合提出 ： ″ 一杯牛奶强壮一个民族″的口号。奶类除不含纤维素外， 几乎含有人体所需要的各种营养 素。牛奶中的乳糖进入人体后， 经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿 大脑发育的必需物质， 与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。
牛奶虽好但并不是所有的人都能享受， 有些人由于乳糖酶的缺乏， 人体不能很好 的消化吸收牛奶中的营养素， 还会造成钙、 磷、 钾、 铁等元素的吸收障碍， 影响婴幼儿的体格 和智力发育， 在老年人中， 乳糖酶缺乏是造成骨质疏松的重要原因。 中国成年人饮用牛乳后 乳糖吸收不良的发病率高达 86.7％， 不耐受指数为 0.9。
为了避免不适当饮奶对健康造成的损害， 因此最好在饮奶前检查自己是否耐受乳 糖， 在饮用牛奶后， 测试尿液中半乳糖的浓度， 这是目前国外最常用的一种方法， 更为简便、 经济、 可靠。 【发明内容】
[ 要解决的技术问题 ]
本发明的目的是提供一种半乳糖的测定方法。
本发明的另一个目的是提供一种半乳糖诊断 / 测定试剂盒。
[ 技术方案 ]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明的方法是一种采用酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Method) 与酶 ( 偶 ) 联法 (Couple Reaction) 的联用技术， 利用测定还原型烟酰胺辅酶 ( 还原型辅酶 ) 在 340nm 波长处的吸光度变化测定半乳糖的方法。
本发明半乳糖测定方法的的技术原理是根据下述三个酶的系列催化反应完成 ：
半乳糖 + 腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸 + 半乳糖 1- 磷酸
腺苷二磷酸 + 磷酰胺氨激酶腺苷三磷酸 + 氨
氨 + 乙醛酸 + 还原型辅酶甘氨酸脱氢酶甘氨酸 + 水 + 辅酶
本发明的方法利用半乳糖激酶 (galactokinase ； EC 2.7.1.6) 酶 ( 偶 ) 联氨激酶 (ammonia kinase ； EC 2.7.3.8)、 甘氨酸脱氢酶 (glycine dehydrogenase ； EC 1.4.1.10) 酶促反应终点法。半乳糖激酶酶解半乳糖反应产生腺苷二磷酸， 再通过 ( 偶 ) 联合氨激酶、 甘氨酸脱氢酶的作用， 最终将还原型辅酶 ( 在 340nm 处有吸收峰 ) 氧化成为辅酶 ( 在 340nm 处没有吸收峰 )， 从而得以测定还原型辅酶在 340nm 处吸光度下降的程度， 这样可以通过测 量 340n m 处吸光度下降的程度， 可以测算半乳糖的浓度大小。本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种半乳糖的测定方法。该半乳糖测定方法的步骤如下 ：
A、 样品准备 ：
A.1 标准样品的制备
将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中， 再将半乳糖浓度调整到 100 微摩尔 / 升， 得 到的溶液作为标准样品 ；
A.2 待测样品预处理
液体待测样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的固体待测样品像制备标准样品 一样溶于水或缓冲液中 ；
A.3 空白样品
所述的水或缓冲液作为空白样品， 其半乳糖浓度为 0 微摩尔 / 升 ；
B、 试剂溶液的制备 ：
分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 半乳糖激酶、 氨激酶、 甘氨酸脱 氢酶、 腺苷三磷酸、 磷酸胺与乙醛酸， 然后将它们混合均匀， 用水溶解得到所述的试剂溶 液， 它 们 的 浓 度 分 别 是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-0.35mmol/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1-100mmol/L、 1-100mmol/L 与 1-100mmol/L ； C、 待测样品与在步骤 B) 得到的试剂溶液按照体积比 1/10 至 1/500 进行混合， 在 温度 15-45℃下反应 5-60 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm( 如果受仪器限制可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ；
D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 ；
E、 在与步骤 C) 同样的条件下测定在步骤 A) 空白样品的吸光度随时间的变化 ；
F、 数据处理
由步骤 C-E) 所述测定的主波长 340nm 的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 半乳糖的含量 ：
式中 ：
ΔA( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ；
ΔA( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ；
ΔA( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。
根据本发明， 在所述的半乳糖测定方法中， 所述的缓冲液应该理解是能够使其测 定介质的 pH 基本保持稳定 ( 一般是 6.5-8.5) 的溶液。如果该 pH 高于 8.5 或 pH 低于 6.5， 则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果， 因此需要添加更多的介质与酶， 才 有可能达到预期的活性效果。
在本发明中， 所述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲 液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘 氨酸 - 氢氧化钠缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或
“PBS” 缓冲液的缓冲液。
优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。
更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。
根据本发明， 在所述的半乳糖测定方法中， 所述的稳定剂应该理解是一种能保护 试剂中的介质 ( 底物 ) 与酶， 使其不会随着时间推移而改变其性质， 进而失去活性的物质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命， 通常长达数月， 甚至一、 二年。 如果没有所述的稳定剂， 则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时， 顶多数天， 就会逐渐失去活性而不再具备检测 性能。在本发明中， 所述的稳定剂使用量是 0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够， 则试剂活性的寿命就会缩短 ； 如果所述的稳定剂使用量过高， 则会增加成本。
在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自 - 氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或 双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。
优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自 - 氯化钠、 丙二醇、 甘油双乙酸钠或 叠氮钠的稳定剂。 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油 - 或双乙酸钠的稳定剂。
在本发明中， 所述的还原型辅酶是一种或多种选自 NADPH、 NADH 或 thio-NADH 的还 原型辅酶。
根据一种本发明的优选实施方式， 本发明使用全自动生化分析仪测定半乳糖时， 待测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下 ( 参数 ) 自动取样， 然 后在下述条件下进行测定 ： 测定方法为终点法， 温度 37℃， 反应时间 10 分钟， 测试主波长 340nm， 测试副波长 405nm， 被测半乳糖样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反应方向为 负反应， 延迟时间 0 分钟， 检测时间 5 分钟。
根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂试 剂：
由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 腺苷三磷酸、 磷酸胺与乙醛酸组成的试剂 1；
由所述的缓冲液、 稳定剂、 半乳糖激酶、 氨激酶与甘氨酸脱氢酶组成的试剂 2 ；
其中还原型辅酶、 半乳糖激酶、 氨激酶、 甘氨酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 磷酸 胺、 乙醛 酸在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的。
根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂 ：
由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 腺苷三磷酸、 磷酸胺与乙醛酸组成的试剂 1；
由所述的缓冲液、 稳定剂、 氨激酶与甘氨酸脱氢酶组成的试剂 2 ；
由所述的缓冲液、 稳定剂与半乳糖激酶组成的试剂 3 ；
其中还原型辅酶、 半乳糖激酶、 氨激酶、 甘氨酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 磷酸胺、 乙醛 酸在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。
在本发明半乳糖测定方法中使用的测定仪器可以是紫外 / 可见光分析仪， 例如 上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有限
公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司的 BTS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥林 帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以商 品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销售的全自动生化分析仪。
本发明还涉及半乳糖诊断 / 测定试剂盒。该半乳糖诊断 / 测定试剂盒由下述粉状 试剂组成， 在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂 ：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 0.001-7mol/L
还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L
半乳糖激酶 1000-80000U/L
氨激酶 1000-80000U/L
甘氨酸脱氢酶 1000-80000U/L
腺苷三磷酸 1-100mmol/L
磷酸胺 1-100mmol/L
乙醛酸 1-100mmol/L。
根据一种本发明的优选实施方式， 本发明的半乳糖诊断 / 测定试剂盒有 ： 试剂 1 ： 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 还原型辅酶 0.25mmol/L 腺苷三磷酸 5mmol/L 磷酸胺 5mmol/L 乙醛酸 7mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 半乳糖激酶 8000U/L 氨激酶 8000U/L 甘氨酸脱氢酶 10000U/L。 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明的半乳糖诊断 / 测定试剂盒有 ： 试剂 1 ： 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 还原型辅酶 0.25mmol/L 腺苷三磷酸 5mmol/L 磷酸胺 5mmol/L 乙醛酸 7mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 100mmol/L稳定剂 500mmol/L
氨激酶 8000U/L
甘氨酸脱氢酶 10000U/L ；
组成如下的试剂 3 ：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
半乳糖激酶 800U/L。
根据另一种本发明的优选实施方式， 在本发明的半乳糖诊断 / 测定试剂盒中， 所 述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪 唑 - 盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲 液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液。
优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。
更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。
在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自 - 氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或 双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。
优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自 - 氯化钠、 丙二醇、 甘油双乙酸钠或 叠氮钠的稳定剂。
更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油 - 或双乙酸钠的稳定剂。
在本发明中， 无论是单剂试剂、 双剂试剂或三剂试剂， 在本发明测定半乳糖的方法 中， 所述的还原型辅酶可以是一种或多种选自 NADPH、 NADH 或 thio-NADH 的还原型辅酶。
使用本发明的半乳糖诊断 / 测定试剂盒时， 可以使用紫外 / 可见光分析仪， 例如 上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有限 公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司的 BTS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥林 帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以商 品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销售的全自动生化分析仪。
在采用本发明方法测定半乳糖时， 根据实验要求进行多次试验， 然后将得到的这 些试验结果按照下式计算出精密度 (CV) ：
式中 ： X- 试验结果平均值 ； Xi- 各次试验结果 ； n- 试验次数 .N ≥ 10 CV ＝ S/X*100％ 将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差 ：X——第一批各次试验结果平均值
Y——第二批各次试验结果平均值
Z——第三批各次试验结果平均值
U——为 X， Y， Z 中的最大值
V——为 X， Y， Z 中的最小值
每批试样数取 n ≥ 3
经过大量试验确定， 对于半乳糖含量为 0-500μmol/L 的样品， 其分析误差可以达 到≤ 6％。
本发明方法的灵敏度可以达到 1μmol/L。
通过大量试验确定， 本发明方法测定半乳糖含量范围是 0-500μmol/L， 本发明方 法适合于医学临床诊断。
【具体实施方式】
下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。 实施例 1 ： 血浆中半乳糖含量的测定 1) 标准样品的制备 将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中， 再将半乳糖浓度调整到 100 微摩尔 / 升 ； 2) 待测样品预处理 血浆样品作为待测样品， 无须预处理 ； 3) 空白样品 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其半乳糖浓度为 0 微摩尔 / 升 ； B、 试剂溶液的制备 ： 本实施例的半乳糖诊断 / 测定试剂为单剂试剂， 它含有 ： 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 甘油 1mol/L NADPH 0.25mmol/L 半乳糖激酶 6000U/L氨激酶 8000U/L
甘氨酸脱氢酶 10000U/L
腺苷三磷酸 5mmol/L
磷酸胺 3mmol/L
乙醛酸 7mmol/L。
按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。
C、 待测血浆样品， 与在步骤 B) 得到的试剂溶液按照体积比 1/20 进行混合， 在温度 37℃下反应 5 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变 化 ΔA( 样品 ) 为 0.0024 ；
D、 在 与 步 骤 C) 同 样 的 条 件 下 测 定 步 骤 A) 标 准 样 品 的 吸 光 度 随 时 间 的 变 化ΔA( 标准 ) 为 0.0155 ；
E、 在与步骤 C) 同样的条件下测定在步骤 A) 使用的水作为空白溶液的吸光度随时 间的变化 ΔA( 空白 ) 为 0.0005 ；
F、 数据处理
由步骤 C-E) 所述测定的主波长 340nm 的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 半乳糖的含量 ：
式中 ：
ΔA( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ；
ΔA( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ；
ΔA( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。
通 过 上 式 计 算 得 到 该 血 浆 样 品 的 半 乳 糖 含 量 为 13μmol/L， 其误差是 ±0.4μmol/L。
实施例 2 ： 血浆中半乳糖含量的测定
1) 标准样品的制备
将一定量的半乳糖溶于水中， 再将半乳糖浓度调整到 100 微摩尔 / 升， 作为标准样 品；
2) 待测样品的制备
血浆样品作为待测样品， 无须预处理 ；
3) 空白样品
所述的水作为空白样品， 其半乳糖浓度为 0 微摩尔 / 升 ；
B、 试剂溶液的制备 ：
半乳糖诊断 / 测定试剂为双剂试剂， 它含有 ：
组成如下的试剂 1 ：
磷酸盐缓冲液 100mmol/L
NADH 0.25mmol/L
腺苷三磷酸 5mmol/L
磷酸胺 5mmol/L
乙醛酸 7mmol/L ；
组成如下的试剂 2 ：
磷酸盐缓冲液 100mmol/L
乙二醇 5mol/L
半乳糖激酶 9000U/L
氨激酶 32000U/L
甘氨酸脱氢酶 40000U/L。
按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。
C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 计量方法 ： 终点法 测试计量时间点 ： 21， 31 主波长 ： 340 副波长 ： 405 反应温度 ： 37 样品体积 ： 20 试剂 1(R1) 体积 ： 200 试剂 2(R3) 体积 ： 50 反应方向 ： 负 标准样品 1 ： 0 标准样品 2 ： 100 定标结果显示 K 值为 -7011， 换算成灵敏度为 0.000142ΔA/μmol/L。 测试结果显示该血浆中含有半乳糖为 15μmol/L。其误差是 ±1μmol/L。 实施例 3 ： 血浆样品中半乳糖含量的测定 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是本实施例 ： B、 试剂溶液的制备 ： 半乳糖诊断 / 测定试剂为三剂试剂， 它含有 ： 组成如下的试剂 1 ： 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L NADH 0.25mmol/L 腺苷三磷酸 6mmol/L 磷酸胺 5mmol/L 乙醛酸 7mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 甘油 1mol/L 氨激酶 48000U/L 甘氨酸脱氢酶 60000U/L 组成如下的试剂 3 ： 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 甘油 1mol/L 半乳糖激酶 24000U/L。 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 计量方法 ： 终点法 测试计量时间点 ： 21， 31主波长 ： 340
副波长 ： 405
反应温度 ： 37
样品体积 ： 20
试剂 1(R1) 体积 ： 20
试剂 2(R2) 体积 ： 180
试剂 3(R3) 体积 ： 50
反应方向 ： 负
标准样品 1 ： 0
标准样品 2 ： 100
定标结果显示 K 值为 -6705， 换算成灵敏度为 0.00015ΔA/μmol/L。
测试结果显示该血浆中含有半乳糖为 68μmol/L。其误差是 ±2μmol/L。
实施例 4 ： 稳定性试验
该实施例的操作方式与实施例 1 相同， 只是在实施例 1 实施后， 实施例 1 使用的试 剂在密闭试剂瓶中在 2-8℃下存放了半年与一年。
使用同样的标准样品， 使用与实施例 2 同样的新试剂与上述存放半年与一年的试 剂分别进行了测定， 其它条件都与实施例 2 相同， 其测定结果如下 ：
表1
新试剂 存放半年的试剂 存放一年的试剂
半乳糖含量 79μmol/L 79μmol/L 80μmol/L分析误差 ±2μmol/L ±2μmol/L ±2μmol/L表 1 结果表明， 使用本发明的试剂盒， 采用本发明的测定方法可以保证获得稳定 的结果， 其稳定性至少一年以上。
实施例 5 ： 线性试验
该 实 施 例 的 操 作 方 式 与 实 施 例 2 相 同， 只是配制新的标准样品浓度达到 500μmol/L， 将 800μmol/L 的半乳糖依倍比稀释， 然后进行测试， 其测定结果如下 ：
表2
半乳糖预期值 半乳糖测试值 0 0 20 21 50 49 100 98 150 150 200 201 300 299 400 399 500 503 表 2 结果表明， 使用本发明的试剂盒， 采用本发明的测定方法可以保证线性可以达到 500μmol/L。
申请人经过实验验证， 采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的， 鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同， 不另一一例举。
总之， 实验证明 ： 采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化 (ΔA) ≤ 0.0005 ； 吸光度时间反应曲线应呈下降曲 线； 试剂可测有效 (R ≥ 0.99) 线形范围可达 500μmol/L ； 试剂测试的不准确度， 其相对偏 差不超过 ±5％ ； 试剂测试的精密度 ( 重复性 ) 的变异系数 (CV) ≤ 5％ ； 试剂的灵敏度可 达 0.00015±0.00005A/μmol/L ； 试剂在 2-8℃下保存， 活性可以稳定一年 ； ——本发明灵 敏度高、 精确度好， 线形范围宽广， 稳定期长， 足以便于推广应用。14