一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用.pdf

本发明公开了一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有：a)RNA抽提液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物和TaqMan探针、f)标准阳性DNA模板、g)PCR荧光定量反应液，其特征是：引物序列分别为正义引物：5′-TAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGA-3′，反义引物：5′-TTCAAATGTCCCTTTCCCGAAGAA-3′，扩增子大小为125bp，荧光探针序列为：5′-FAM-CAACGGTTATTGCTGCATGTGCTCCTCA-TAMRA-3′，探针的5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性DNA模板由已插入狂犬病毒N蛋白区391bp片段的pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。高效方便地对血清制品中的狂犬病毒的污染进行实时监控，还能为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

1、  一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)RNA抽提液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物和TaqMan探针、f)标准阳性DNA模板、g)荧光定量PCR反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：5′-TAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGA-3′，反义引物：5′-TTCAAATGTCCCTTTCCCGAAGAA-3′，扩增子大小为125bp，荧光探针序列为：5′-FAM-CAACGGTTATTGCTGCATGTGCTCCTCA-3′，探针的5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性DNA模板由已插入狂犬病毒N蛋白区391bp片段的pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。

2、  根据权利要求1所述的一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征是：所述的逆转录反应液是由5×buffer，10μmol/L的反义引物、逆转录酶、RNA酶抑制剂、10mM dNTPs和无RNA酶的灭菌双蒸水组成。

3、  根据权利要求1所述的一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的荧光定量PCR反应液是由2×Premix、10μmol/L的正义引物和反义引物、10μmol/L荧光探针和无菌双蒸水组成。

4、  根据权利要求1所述的一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征是：所述的标准阳性模板DNA核苷酸序列为：
TAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGATCCCTAAATGCAACGGTTATTGCT
GCATGTGCTCCTCATGAAATGTCTGTTCTAGGGGGCTATCTGGGAGAGGA
ATTCTTCGGGAAAGGGACATTTGAA。

5、  权利要求1所述的一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染狂犬病毒检测中应用。

一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，适用于对血清制品中的狂犬病毒污染进行实时监控，同时为相关基础研究提供技术支持。
背景技术
狂犬病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridae)，狂犬病毒属(Lyssavirus)，其核酸为不分节段的单股负链RNA分子，狂犬病是由狂犬病毒引起的一种急性传染病，人兽都可以感染，又称恐水病、疯狗病等。狂犬病毒主要在动物间传播，该病主要是通过动物噬咬时牙齿上带的唾液中的狂犬病病毒侵入人或动物体而受到感染。狂犬病一旦发病，其进展速度很快，多数在3-5天，很少有超过10天的，病死率为100％。奶牛和肉牛群中，急性发作时，死亡率甚高，给畜牧业、国际贸易出口和食品安全等带来严重的问题。由于Rabies的组织培养宿主范围相当广，常导致培养细胞污染来自血清的Rabies，且常常不易引起注意，给细胞培养以及相关基础研究带来一定的问题。狂犬病毒的快速检测是控制和消灭该病的前提，但其常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：
1.血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光染色、双抗体夹心ELISA和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍承认且广泛应用的有：补体结合实验、间接血凝试验、琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。
2.生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，周期长，浪费生物资源和人力物力。
3.分子生物学诊断技术包括核酸杂交实验、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、负染电镜检测等。核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳等检测方法更适合于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高，不适宜同时进行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。样品可以是器官、组织、细胞中的Rabies，并可与不同的Rabies株与轮状病毒、边界病毒相区别，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA或RNA拷贝数。因此，如何快速、准确测定狂犬病毒是面临的主要难题之一。
近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determinedby LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，163：29-38)、病原体的定性(Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detection andClassification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，83：1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang，Jun Wang，Donald V.Lightner.Quantitation of Taurasyndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay[J].J.Virol.Methods，115(2004)109-114.；Birgit Liss.Improved quantitative real-time RT-PCR forexpression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res.，2002，Vol.30 No.17e89.；Franck Housseau a，limberly R.Lindsey a，et al.Quantitative real-time RT-PCRas a method for monitoring T lymphocyte reactivity to full-length tyrosinase proteinin vaccinated melanoma patients[J].J.Immunol.Methods 266(2002)87-103.；DesireN，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency VirusType 1 Proviral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，39：1303-1310；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-ThroughputReal-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37：327-332；Kang B，Oh J，Lee C，Park BK，Park Y，Hong K，Lee K，Cho B，Song D.Evaluation of a rapid mmunodiagnostic test kit for rabiesvirus[J].J.Virol.Methods，2007，145(1)：30-36；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95：111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量主要方法，国内目前也已有关于丙肝、乙肝、支原体、爱滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广、稳定性好。
本发明的另一个目的是在于提供了一种荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染狂犬病毒检测中的应用，可高效方便地对血清制品中的狂犬病毒污染进行实时监控，同时为相关基础研究提供技术支持。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒：它包括a)RNA抽提液、b)逆转录反应液、c)RNA酶抑制剂、d)逆转录酶、e)引物和荧光探针(TaqMan)、f)标准阳性DNA模板、g)荧光定量PCR反应液，其特征在于：采用传统的两步法扩增(Two-Step RT-PCR)，即第一步进行逆转录反应，将RNA样品逆转录成cDNA，第二步进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性DNA样品定量检测未知样品。用DNA作为标准品，使得定量反应结果更加稳定可靠，并大大增加了实验的重复性，减少误差。逆转录反应液含有逆转录酶反应液，RNA酶抑制剂，荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物序列分别为正义引物：(FP)5′-TAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGA-3′(SEQ ID NO：1)，反义引物(RT)：5′-TTCAAATGTCCCTTTCCCGAAGAA-3′(SEQ ID NO：2)，扩增子大小125bp。荧光探针序列为5′-FAM-CAACGGTTATTGCTGCATGTGCTCCTCA-TAMRA-3′(SEQ ID NO：3)，探针的5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端标以荧光淬灭基团TAMRA。标准阳性DNA模板由已插入狂犬病毒是N蛋白区391bp片段的pGEM-T载体(购自Promega公司)转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司)，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。所述的逆转录反应液是由5×buffer，10μmol/L的反义引物，逆转录酶，RNA酶抑制剂，10mM dNTPs和无RNA酶的灭菌双蒸水组成；荧光定量PCR反应液是由2×Premix，10μmol/L的正义引物和反义引物，10μmol/L荧光探针和无菌双蒸水组成。所述的标准阳性模板DNA核苷酸序列为：
TAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGATCCCTAAATGCAACGGTTATTGCTGCATGTGCTCCTCATGAAATGTCTGTTCTAGGGGGCTATCTGGGAGAGGAATTCTTCGGGAAAGGGACATTTGAA
在本发明的一个优选方案中，采用传统的两步法扩增(Two-Step RT-PCR)，即第一步进行逆转录反应，将RNA样品逆转录成cDNA，第二步进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性DNA样品定量检测未知样品。用DNA作为标准品，使得定量反应结果更加稳定可靠，并大大增加了实验的重复性，减少误差。在本发明的一个具体方案中，逆转录反应液由反义引物(RT)，逆转录酶，RNA酶抑制剂，5×buffer溶液，10mM dNTPs和无RNA酶的灭菌双蒸组成；荧光定量PCR反应液由正义引物(FP)，反义引物(RT)，荧光探针(TaqMan)，2×buffer溶液和灭菌双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，逆转录反应液由5×buffer溶液5μl，10μmol/L的反义(RT)引物2.5μl，10mM dNTPs1.5μl，逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μl，无RNA酶的灭菌双蒸水9μl组成；荧光定量反应液由2×buffer溶液12.5μl，10μmol/L正义(FP)、反义(RT)引物各3μl，10μmol/L荧光探针0.75μl，灭菌双蒸水0.75μl组成。其中荧光探针为(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。
在本发明的一个优选方案中，标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(购自Promega公司)载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。实验所用的标准品制备过程为：PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体(购自Promega公司)4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR鉴定阳性后送博亚生物工程有限公司测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨卞的LB培养基过夜培养，用SDS碱裂解法制备质粒DNA，经Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化后于紫外分光光度计测A₂₆₀定量，并稀释至梯度10⁹-10²拷贝/10μl，-70℃保存。
在本发明提供检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有一条一端标记有荧光报告基团另一端标记有荧光淬灭基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光探测器检测，模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对狂犬病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对狂犬病毒的基因组的靶片段中核苷酸排列的特殊性，将反应体系(引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、扩增程序等)的优化，并将Q-PCR技术和定量检测系统(包括LigthCycler系统，Roche，ABI Prism系统，PEApplied Biosystems)相结合，将其用于各种来源的狂犬病毒样品的定量检测。通过优化方案，反复实验，以及与传统检测方法进行比较，建立了定量检测狂犬病毒的方法，并研制出狂犬病毒的定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100个以下的病毒基因拷贝数，检测范围可以达到八个数量级。
在本发明的另外一个方面，本发明还提供了一种荧光定量PCR试剂盒对狂犬病毒进行检测的方法，该方法包括下列步骤：
A)用f)标准阳性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(购自promega公司)载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并用紫外分光光度计定量；
B)用a)RNA抽提液从待测标本中提取RNA，然后加b)逆转录反应液，c)RNA酶抑制剂，d)逆转录酶，e)反义引物进行逆转录；
C)荧光定量PCR由e)引物和荧光探针(TaqMan)，g)PCR荧光定量反应液，f)标准阳性DNA模板或逆转录反应产物组成，已加入了标准品及待测样品的荧光定量反应液PCR反应体系上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；
D)通过比较待测样品和标准品的循环域值根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。
在本发明中提供的检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒可对各种来源的狂犬病毒样品进行准确定量检测，并可对牛血液制品和牛血清进行定量检测和质量监控，同时为相关基础研究提供技术支持。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1.与传统定量方法相比，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始RNA拷贝数，做到了真正意义上核酸定量。
2.与一步法相比，本实验采用的两步法扩增(Two-Step RT-PCR)，用已知浓度的DNA标准品使得定量反应结果更加稳定可靠，并大大增加了实验的重复性，减少误差。
3.检测范围广，在10⁹-10² copies/reaction浓度范围内有极好的线性关系(R＝0.999)，检测范围可以达到八个数量级，已达到国际先进水平，其灵敏度可检测100copies以下，是其它任何方法无法比拟的。
4.适用于各种型号的荧光定量扩增仪，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(CV)小于2％，说明其极高的重复性和稳定性。
5.该实时荧光定量PCR利用外标准曲线，是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；F.M.奥斯伯等主编，科学出版社，2005，精编分子生物学实验指南，或按照制造厂商建议的条件。
实施例1狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒组成及其反应条件
A).试剂盒组成：
a)试剂盒组成如下：(10次反应)
RNA提取液A(4ml/管)        RNA提取液B(800μl/管)
逆转录反应液(90μl/管)    逆转录酶(10μl/管)
RNA酶抑制剂(400U/管)
强阳性标准品(100倍稀释定值准品20μl/管，共四管)
PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)    DEPC H₂O(2ml/管)
阴性标准品(50μl/管)        临界阳性标准品(50μl/管)
荧光定量PCR反应液(125μl/管)
(RNA提取液A为Invitrogen公司产品。b)逆转录反应液，d)逆转录酶购自Promega公司，g)荧光定量PCR反应液和RNA酶抑制剂(40U/μl)购自TAKARA公司。)
B).逆转录反应液(反应总体积是25μl)：由5×buffer溶液5μl，10μmol/L的反义引物RT(SEQ ID NO：2)2.5μl，10mM dNTPs1.5μl，逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μl，无RNA酶的灭菌双蒸水9μl和待测样品5μl组成；荧光定量反应液由2×buffer溶液12.5μl，10μmol/L正义引物FP(SEQ ID NO：1)、反义引物RT各3μl，10μmol/L荧光探针0.75μl，灭菌双蒸水0.75μl，待测样品的cDNA或标准品组成。其中荧光探针为(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。
C).反应条件如下：(采用两步法)
cDNA synthesis：70℃          10min
                0℃           2min
                0℃           pause
                42℃          50min
                70℃          10min
PCR：           95℃，        2min
                94℃，        30s
                60℃，        90s
                40cycles
在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对Rabies的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。
D).荧光定量PCR试剂盒检测狂犬病毒的灵敏度、检测范围及稳定性
取转录的标准品RNA10⁹-10²c/r浓度范围，每个浓度三个重复，加RNA裂解液400μl充分混匀，室温(20-25℃，以下相同)静置10分钟，加80μl氯仿，室温静置3分钟，于4℃12000g/min离心10分钟，上清液转移到另一个离心管，加200μl异丙醇，室温沉淀10分钟，4℃12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75％(体积比)乙醇充分吹散，于4℃7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然干燥，加无RNA酶水25μl 60℃10min溶解。
E).取D)步所提RNA 5μl，然后加逆转录反应液5×buffer 5μl，反义引物RT(SEQ ID NO：2)2.5μl(10μmol/L)，10mM dNTPs 1.5μl，RNA酶抑制剂(40U/μl)，逆转录酶1μl，分别加入对应编号的PCR反应管，在PCR仪上进行逆转录实验。反应条件为：70℃10min，0℃2min，42℃50min，70℃10min。荧光定量PCR反应液12.5μl，10μmol/L正义引物FP(SEQ ID NO：1)、反义引物RT(SEQ IDNO：2)各3μl，荧光探针0.75μl(10μmol/L)，待测样品cDNA或标准品DNA 5μl，分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性2min；94℃30s，60℃90s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为518nm。
循环结束后，运用仪器自带分析软件(Eppendorf荧光定量PCR仪，型号：Mastercyler ep realplex，软件：realplex)，读取待检样品拷贝数。结果为：