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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810051970.2 (22)申请日 2018.01.19 (71)申请人 深圳中生健康管理有限公司 地址 518000 广东省深圳市南山区粤海街 道海德三道126号卓越后海中心14楼 (72)发明人 李杰 (74)专利代理机构 深圳市中联专利代理有限公 司 44274 代理人 李俊 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称 一种牙髓间充质干细胞的培养方法 (57)摘要 一种牙髓间充质干细胞的培养方法， 包括如 下步骤： 准备牙髓。
2、样本， 分离培养牙髓间充质干 细胞， 克隆化培养分离牙髓间充质干细胞， 牙髓 间充质干细胞检测， 牙髓间充质干细胞检测染 色。 本发明的有益效果在于： 1、 利用克隆分离培 养的细胞之间排列紧密， 中心部细胞界限不清。 呈圆形或不规则状及形成细胞结节样， 周边部细 胞呈多角形或短梭形， 胞浆较少， 核浆比例大， 核 仁明显， 部分细胞呈成纤维状； 2、 不会产生严重 的免疫排斥问题； 3、 取材方便安全和交叉感染风 险小， 可以用于修复缺损牙齿及牙齿再生； 4、 可 促进皮肤伤口愈合及再生， 延缓衰老或治愈失 明， 此外， 牙髓干细胞还可治疗心脏病、 类风湿性 关节炎、 烧伤、 中风或软骨受损。
3、等， 用途广泛。 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 CN 108277202 A 2018.07.13 CN 108277202 A 1.一种牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 包括如下步骤： S1、 准备牙髓样本： 将牙齿样本浸泡在缓冲溶液或将牙齿样本冷藏保存， 其保存时间在 40h47h， 其后劈开牙冠， 取出牙髓; S2、 分离培养牙髓间充质干细胞:用0.01M冻存液PBS冲洗后， 将取出的牙髓剪成约1mm3 1mm31mm3小块， 再用0.3%的I型胶原酶和0.4%的分解酶在37中消化1h， 轻轻吹打离散 单细胞团块， 将形成的单细胞悬液通过孔径为70 m的细胞筛网后800。
4、r/min离心5min； 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度5000/cm2的干细胞培养基接种 于培养瓶中培养， 每3d换液1次； S3、 克隆化培养分离牙髓间充质干细胞： 待细胞生长达8085%汇合度时， 用0.25%的 胰酶消化传代， 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度5000/cm2的干细胞 培养基接种于培养瓶中培养， 每3d换液1次， 其中等细胞生长达80汇合度时， 用0.25%的胰 酶消化收获； S4、 牙髓间充质干细胞检测： 将收获的子代牙髓间充质干细胞， 利用PBS重悬细胞， 调整 细胞密度为1106/ml， 取出1ml， 。
5、加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀， 在4下过夜并离心弃 乙醇后再流式细胞仪上进行细胞周期检测； S5、 牙髓间充质干细胞检测染色。 2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 所述牙齿样本为 1929岁健康成人阻生完整的第三磨牙， 且牙齿样本在浸泡和冷藏保存前需要对牙齿表面 进行灭菌处理。 3.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 牙冠劈开的深度 为0.6mm0.9mm， 并利用牙冠劈开的深度， 在无菌条件下， 暴露出牙髓组织， 之后取出牙髓。 4.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 取出牙髓的手术 工具为根管锉、 。
6、刮匙、 镊子及探针之其中任一种。 5.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 所述干细胞培养 基中含有15%的胎牛血清的 -MEM、 5%的DMEM培养基及5%无血清培养基。 6.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 在S4中， 还需要 用0.01M冻存液PBS冲洗两次， 并用0 .5的PI在4中染色30min。 7.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 在S5中， 取生长 良好的克隆化培养细胞做细胞爬片， 用LSAB法行抗 Vimemin、 CD44、 ON、 DSP免疫组化染色。 8.根据权利要求1所述的牙髓间充质。
7、干细胞的培养方法， 其特征在于， 在S2和S4中的离 心后还包括过滤除菌的步骤。 9.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 所述培养瓶为转 瓶、 生物反应器或T75培养瓶。 10.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法， 其特征在于， 所述FBS和牙髓 间充质干细胞的条件培养基的提及比为4： 5。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108277202 A 2 一种牙髓间充质干细胞的培养方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医学工程领域， 特别涉及一种牙髓间充质干细胞的培养方法。 背景技术 0002 1999年，Science 将人类胚胎干细胞研究成果评为当年。
8、世界十大科技进展之首， 2000年，Time 周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首， 并认为胚胎干细胞和人类 基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。 至此干细胞研究成为近年来生物学 以及医学领域中最引人注目的热点之一。 干细胞是在生物个体的生长和发育中起 “主干” 作 用的原始细胞， 是一种具有自我更新、 高度增殖和多向分化潜能的细胞群体， 它包括胚胎干 细胞和成体干细胞。 虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型， 但这种分化是 “非定位性” 的， 而且存在伦理道德等方面的问题。 成体干细胞则不存在着伦理、 法律、 免疫排斥反应等 问题， 同时具有取材方便、 来源广等优点， 因而，。
9、 成体干细胞在组织工程、 基因治疗及个体化 治疗的研究中具有较好的临床应用前景。 0003 其实， 干细胞的来源非常广泛。 包含乳牙、 骨髓、 脐带血、 脐带、 智齿等， 但不同组织 的干细胞使用时是有区别的。 目前市场上主要的产品为脐带血、 脐带衍伸的干细胞储存， 虽 然其中含有丰富的干细胞， 但局限于胎儿分娩出时的那一瞬间来实现收集， 保存。 而乳牙牙 髓干细胞的活性是骨髓干细胞3倍， 且可多向分化成结缔组织、 神经、 骨骼、 肌肉、 牙齿等组 织细胞， 应用前景非常广阔。 0004 牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内， 是牙体组织中唯一的软组织。 经研究， 科学家 发现了一种与骨髓间充质干细。
10、胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞， 细 胞中形态呈梭形， 可自我更新和多向分化， 有着较强的克隆能力。 这些由牙髓组织中分离出 的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞。 0005 “每颗牙齿都包含着丰富的干细胞 资源 ， 在健康时储存下来， 将来在有疾患需要 时培育分化干细胞， 甚至可以救命。 ” 0006 我国达到世界卫生组织牙齿健康标准的人口不足1， 17岁以下者， 缺失一颗或更 多牙齿的情况的人占7， 年龄大于50岁者， 平均缺牙数目为12颗， 一般成人曾接收口腔内 牙齿修复体约占85。 0007 保存健康种子， 从牙髓干细胞储存开始， 人的牙髓组织中存在的具有自我更新能 力、 。
11、高度增生能力、 多相分化潜能的成体干细胞， 即牙髓干细胞(Dental pulp stem cells, FPSCs)。 0008 牙髓干细胞属于间充质干细胞， 而且是活性最强的间充质干细胞， 活性的骨髓干 细胞的3倍。 少量牙髓干细胞就能分裂出千千万万细胞。 分化能力非常强， 在合适的体内或 体外环境下可以分化成为骨细胞、 脂肪细胞以及肝细胞等多种人体细胞， 为组织、 器官修复 和移植提供了新的细胞来源。 0009 牙髓干细胞， 既能保持自身未分化状态和增殖能力， 又可在适合的条件下分化成 多种功能细胞或组织器官， 例如牙周组织、 神经、 肌肉和脂肪细胞等， 为深受牙齿疾病困扰 说明书 1/。
12、7 页 3 CN 108277202 A 3 或为其感到担忧的人们带来新的希望， 并随着疾病研究范围扩大， 将来糖尿病， 脊髓损伤， 中风， 心脏瓣膜病， 牙周病等都有望利用牙髓干细胞得到治疗。 0010 目前， 普通的技术是通过酶消化法原代培养牙髓干细胞， 这样培养出的人牙髓干 细胞贴壁慢、 生长慢。 4h贴壁约70。 12h开始伸展。 48h基本展开。 细胞呈大多数为长梭形成 纤维状， 12个突起， 少数为多角形、 纺锤状或椭圆形， 体积较小.胞体丰满， 约10 12d达 到90。 发明内容 0011 为了克服上述所述的不足， 本发明的目的是提供一种取材方便安全、 免疫排斥和 交叉感染风险。
13、小、 用于修复缺损牙齿及牙齿再生、 促进皮肤伤口愈合及再生、 延缓衰老、 治 愈失明、 治疗心脏病、 类风湿性关节炎、 烧伤、 中风或软骨受损等疾病的牙髓间充质干细胞 的培养方法。 0012 本发明解决其技术问题的技术方案是： 一种牙髓间充质干细胞的培养方法， 包括 如下步骤： 0013 S1、 准备牙髓样本： 将牙齿样本浸泡在缓冲溶液或将牙齿样本冷藏保存， 其保存时 间在40h47h， 其后劈开牙冠， 取出牙髓； 0014 S2、 分离培养牙髓间充质干细胞:用0.01M冻存液PBS冲洗后， 将取出的牙髓剪成约 1mm31mm31mm3小块， 再用0.3的I型胶原酶和0.4的分解酶在37中消化。
14、1h， 轻轻吹 打离散单细胞团块， 将形成的单细胞悬液通过孔径为70 m的细胞筛网后800r/min离心 5min； 0015 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度 5000/cm2的干细胞培养 基接种于培养瓶中培养， 每3d换液1次； 0016 S3、 克隆化培养分离牙髓间充质干细胞： 待细胞生长达8085汇合度时， 用 0.25的胰酶消化传代， 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度5000/cm2 的干细胞培养基接种于培养瓶中培养， 每3d换液1次， 其中等细胞生长达80汇合度时， 用 0.25的胰酶消化收获； 0017 S4、 牙髓间充。
15、质干细胞检测： 将收获的子代牙髓间充质干细胞， 利用PBS重悬细胞， 调整细胞密度为1106/ml， 取出1ml， 加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀， 在4下过夜并离 心弃乙醇后再流式细胞仪上进行细胞周期检测； 0018 S5、 牙髓间充质干细胞检测染色。 0019 在本具体实施例中， 所述牙齿样本为1929岁健康成人阻生完整的第三磨牙， 且 牙齿样本在浸泡和冷藏保存前需要对牙齿表面进行灭菌处理。 0020 在本具体实施例中， 牙冠劈开的深度为0.6mm0.9mm， 并利用牙冠劈开的深度， 在 无菌条件下， 暴露出牙髓组织， 之后取出牙髓。 0021 在本具体实施例中， 取出牙髓的手术工具为根。
16、管锉、 刮匙、 镊子及探针之其中任一 种。 0022 在本具体实施例中， 所述干细胞培养基中含有15的胎牛血清的 -MEM、 5的 DMEM培养基及5无血清培养基。 0023 在本具体实施例中， 在S4中， 还需要用0.01M冻存液PBS冲洗两次， 并用0.5的PI 说明书 2/7 页 4 CN 108277202 A 4 在4中染色30min。 0024 在本具体实施例中， 在S5中， 取生长良好的克隆化培养细胞做细胞爬片， 用LSAB法 行抗Vimemin、 CD44、 ON、 DSP免疫组化染色。 0025 在本具体实施例中， 在S2和S4中的离心后还包括过滤除菌的步骤。 0026 在本。
17、具体实施例中， 所述培养瓶为转瓶、 生物反应器或T75培养瓶 0027 在本具体实施例中， 所述FBS和牙髓间充质干细胞的条件培养基的提及比为4： 5。 0028 本发明的有益效果在于： 0029 1、 利用克隆分离培养的细胞之间排列紧密， 中心部细胞界限不清。 呈圆形或不规 则状及形成细胞结节样， 周边部细胞呈多角形或短梭形， 胞浆较少， 核浆比例大， 核仁明显， 部分细胞呈成纤维状， 且培养3天长满； 0030 2、 牙髓间充质干细胞是由个人自己的组织所分离及培养出来的， 再使用在自体 上， 所以治疗上不会产生严重的免疫排斥问题； 0031 3、 取材方便安全和交叉感染风险小、 有别于脐带。
18、血干细胞， 所以医用价值极大， 可 以用于修复缺损牙齿及牙齿再生； 0032 4、 可促进皮肤伤口愈合及再生， 延缓衰老或治愈失明， 此外， 牙髓间充质干细胞还 可治疗心脏病、 类风湿性关节炎、 烧伤、 中风或软骨受损等， 用途广泛。 附图说明 0033 为了易于说明， 本发明由下述的较佳实施例及附图作以详细描述。 0034 图1为本发明的具体操作流程图； 0035 图2为本发明能够治疗疾病种类的示意图。 具体实施方式 0036 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并。
19、 不用于限定本发明。 0037 需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本发明中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。 0038 在本发明的描述中， 需要说明的是， 除非另有明确的规定和限定， 术语 “安装” 、“相 连” 、“连接” 应做广义理解， 例如， 可以是固定连接， 也可以是可拆卸连接， 或一体地连接； 可 以是机械连接， 也可以是电连接； 可以是直接相连， 也可以通过中间媒介间接相连， 可以是 两个元件内部的连通。 对于本领域的普通技术人员而言， 可以通过具体情况理解上述术语 在本发明中的具体含义。 0039 实施例一 0040 如图12所示， 本发明的一种牙髓间充质干细胞的培养方法。
20、， 包括如下步骤： 0041 S1、 准备牙髓样本： 将牙齿样本浸泡在缓冲溶液或将牙齿样本冷藏保存， 其保存时 间在40h47h， ， 劈开牙冠， 牙冠劈开的深度为0.6mm0.9mm， 并利用牙冠劈开的深度， 在无 菌条件下， 暴露出牙髓组织， 之后取出牙髓。 在本具体实施例中， 牙齿样本为1929岁健康 成人阻生完整的第三磨牙， 且牙齿样本在浸泡和冷藏保存前需要对牙齿表面进行灭菌处 说明书 3/7 页 5 CN 108277202 A 5 理。 另外， 牙髓干细胞最易成功的采集来源有健康的乳牙和智齿。 20颗乳牙都可用于提取牙 髓干细胞， 每一个换牙期的孩子都值得一存； 成年人如有拔除智齿。
21、的意愿的话， 也可进行牙 髓干细胞储存。 由于口腔细菌环境复杂， 提早保存牙髓干细胞， 或将提高其制备的成功率。 同时， 缓冲溶液可以是含有抗生素的缓冲溶液， 抗生素可以为青霉素或链霉素。 在本具体实 施例中， 取出牙髓的手术工具为根管锉、 刮匙、 镊子及探针之其中任一种。 0042 S2、 分离培养牙髓间充质干细胞:用0.01M冻存液PBS冲洗后， 将取出的牙髓剪成约 1mm31mm31mm3小块， 再用0.3的I型胶原酶和0.4的分解酶在37水浴进行消化作用 1h， 轻轻吹打离散单细胞团块， 将形成的单细胞悬液通过孔径为70 m的细胞筛网后， 并以 800r/min的离心速度， 离心5mi。
22、n； 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度 5000/cm2的干细胞培养基接种于培养瓶中培养， 培养基每三天换一次。 在本具体实施例中， 所述干细胞培养基中含有15的胎牛血清的 -MEM、 5的DMEM培养基及5无血清培养基。 FBS和牙髓间充质干细胞的条件培养基的提及比为4： 5。 0043 S3、 克隆化培养分离牙髓间充质干细胞： 待细胞生长达8085汇合度时， 用 0.25的胰酶消化传代， 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度5000/cm2 的干细胞培养基接种于T75 培养瓶中培养， 每3d换液1次， 其中等细胞生长达80汇合度 时，。
23、 用0.25的胰酶消化收获。 0044 S4、 牙髓间充质干细胞检测： 将收获的子代牙髓间充质干细胞， 利用PBS重悬细胞， 调整细胞密度为1106/ml， 取出1ml， 加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀， 在4下过夜并离 心弃乙醇后再流式细胞仪上进行细胞周期检测， 检测细胞的特异性， 包括间充质干细胞特 异性表面标志物Stro-1、 CD29、 CD44、 CD71、 CD90、 CD106、 CD120 等， 以及其它系细胞表面标 志物， 如CD14、 CD34、 CD45等。 在本具体实施例中， 还需要用0.01M冻存液PBS冲洗两次， 并用 0.5的PI在4中染色30min。 0045。
24、 S5、 牙髓间充质干细胞检测染色。 在S5中， 取生长良好的克隆化培养细胞做细胞爬 片， 用LSAB法行抗Vimemin、 CD44、 ON、 DSP 免疫组化染色。 0046 在本具体实施例中， 在S2和S4中的离心后还包括过滤除菌的步骤。 0047 利用克隆分离培养的细胞之间排列紧密， 中心部细胞界限不清。 呈圆形或不规则 状及形成细胞结节样， 周边部细胞呈多角形或短梭形， 胞浆较少， 核浆比例大， 核仁明显， 部 分细胞呈成纤维状， 且培养3天长满。 0048 实施例二 0049 本发明的一种牙髓间充质干细胞的培养方法， 包括如下步骤： 0050 S1、 准备牙髓样本： 将牙齿样本浸泡。
25、在缓冲溶液或将牙齿样本冷藏保存， 其保存时 间在40h47h， ， 劈开牙冠， 牙冠劈开的深度为 0.6mm0.9mm， 并利用牙冠劈开的深度， 在 无菌条件下， 暴露出牙髓组织， 之后取出牙髓。 在本具体实施例中， 牙齿样本为1929岁健 康成人阻生完整的第三磨牙， 且牙齿样本在浸泡和冷藏保存前需要对牙齿表面进行灭菌处 理。 另外， 牙髓干细胞最易成功的采集来源有健康的乳牙和智齿。 20颗乳牙都可用于提取牙 髓干细胞， 每一个换牙期的孩子都值得一存； 成年人如有拔除智齿的意愿的话， 也可进行牙 髓干细胞储存。 由于口腔细菌环境复杂， 提早保存牙髓干细胞， 或将提高其制备的成功率。 同时， 缓。
26、冲溶液可以是含有抗生素的缓冲溶液， 抗生素可以为青霉素或链霉素。 在本具体实 施例中， 取出牙髓的手术工具为根管锉、 刮匙、 镊子及探针之其中任一种。 说明书 4/7 页 6 CN 108277202 A 6 0051 S2、 分离培养牙髓间充质干细胞:用0.01M冻存液PBS冲洗后， 将取出的牙髓剪成约 1mm31mm31mm3小块， 再用0.3的I型胶原酶和0.4的分解酶在37水浴进行消化作用 1h， 轻轻吹打离散单细胞团块， 将形成的单细胞悬液通过孔径为70 m的细胞筛网后， 并以 800r/min的离心速度， 离心5min； 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密。
27、度 5000/cm2的干细胞培养基接种于培养瓶中培养， 培养基每三天换一次。 在本具体实施例中， 所述干细胞培养基中含有15的胎牛血清的 -MEM、 5的DMEM培养基及5无血清培养基。 FBS和牙髓间充质干细胞的条件培养基的提及比为4： 5。 0052 S3、 克隆化培养分离牙髓间充质干细胞： 待细胞生长达8085汇合度时， 用 0.25的胰酶消化传代， 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度5000/cm2 的干细胞培养基接种于生物反应器中培养， 每3d换液1次， 其中等细胞生长达80汇合度 时， 用0.25的胰酶消化收获。 生物反应器培养扩增可以是一级生物反应器培。
28、养， 也可以是 多级培养。 在一级生物反应器中细胞生长到一定程度时， 根据对细胞数量的要求可进行下 一级细胞放大培养， 即将微载体上的细胞完全消化之后作为种子细胞接种下一级生物反应 器或者直接添加新的微载体进行球转球放大培养。 0053 具体地， 生物反应器可选自搅拌式生物反应器、 固定床生物反应器、 波浪式(wave) 生物反应器等， 以及其他各种形式和基于各种原理的细胞体外大规模培养系统或装置。 搅 拌式生物反应器主要是通过搅拌器转动来搅动培养液以增加传质能力,确保细胞培养的氧 浓度和营养物质的均一性,达到大规模培养细胞的目的,同时使培养液对细胞施加一定的 剪应力。 目前在医学组织工程研究。
29、中最常用的是搅拌瓶反应器。 其主要特点是采用磁力转 子搅动培养液,把干细胞接种在磁力搅拌的培养液中,细胞在持续搅动的培养液中生长。 搅 拌式生物反应器的最大优点是， 能培养各种类型的动物细胞, 培养工艺容易放大， 产品质 量稳定， 非常适合于工厂化生产。 固定床生物反应器内部填充片状载体， 使细胞贴服生长， 通过连续灌注新鲜培养液使细胞达到较高密度， 培养过程中， 细胞营养充足， 代谢废物能及 时去除为细胞生长提供一个良好的环境。 使用的片状载体包括NBS公司的聚酯纤维等一切 可以利于细胞贴服生长的材料。 WAVE生物反应器是一次性使用的波浪袋生物反应器， 用以 替代传统的不锈钢发酵罐。 一次。
30、性反应器适用于各种类型的细胞培养。 温和的波浪式运动 可以起到良好的供氧和混合的目的， 同时， 这种运动方式所产生的剪切力也很小， 远远小于 传统罐体中用搅拌或者气升式方法所产生的剪切力； 能够支持高密度大规模细胞培养， 并 且不会形成泡沫和剪切力的破坏作用。 0054 S4、 牙髓间充质干细胞检测： 将收获的子代牙髓间充质干细胞， 利用PBS重悬细胞， 调整细胞密度为1106/ml， 取出1ml， 加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀， 在4下过夜并离 心弃乙醇后再流式细胞仪上进行细胞周期检测， 检测细胞的特异性， 包括间充质干细胞特 异性表面标志物Stro-1、 CD29、 CD44、 CD7。
31、1、 CD90、 CD106、 CD120 等， 以及其它系细胞表面标 志物， 如CD14、 CD34、 CD45等。 在本具体实施例中， 还需要用0.01M冻存液PBS冲洗两次， 并用 0.5的PI在4中染色30min。 0055 S5、 牙髓间充质干细胞检测染色。 在S5中， 取生长良好的克隆化培养细胞做细胞爬 片， 用LSAB法行抗Vimemin、 CD44、 ON、 DSP 免疫组化染色。 0056 在本具体实施例中， 在S2和S4中的离心后还包括过滤除菌的步骤。 0057 利用克隆分离培养的细胞之间排列紧密， 中心部细胞界限不清。 呈圆形或不规则 说明书 5/7 页 7 CN 108。
32、277202 A 7 状及形成细胞结节样， 周边部细胞呈多角形或短梭形， 胞浆较少， 核浆比例大， 核仁明显， 部 分细胞呈成纤维状， 且培养3天长满。 0058 实施例三 0059 本发明的另一种牙髓间充质干细胞的培养方法， 包括如下步骤： 0060 S1、 准备牙髓样本： 将牙齿样本浸泡在缓冲溶液或将牙齿样本冷藏保存， 其保存时 间在40h47h， ， 劈开牙冠， 牙冠劈开的深度为 0.6mm0.9mm， 并利用牙冠劈开的深度， 在 无菌条件下， 暴露出牙髓组织， 之后取出牙髓。 在本具体实施例中， 牙齿样本为1929岁健 康成人阻生完整的第三磨牙， 且牙齿样本在浸泡和冷藏保存前需要对牙齿。
33、表面进行灭菌处 理。 另外， 牙髓干细胞最易成功的采集来源有健康的乳牙和智齿。 20颗乳牙都可用于提取牙 髓干细胞， 每一个换牙期的孩子都值得一存； 成年人如有拔除智齿的意愿的话， 也可进行牙 髓干细胞储存。 由于口腔细菌环境复杂， 提早保存牙髓干细胞， 或将提高其制备的成功率。 同时， 缓冲溶液可以是含有抗生素的缓冲溶液， 抗生素可以为青霉素或链霉素。 在本具体实 施例中， 取出牙髓的手术工具为根管锉、 刮匙、 镊子及探针之其中任一种。 0061 S2、 分离培养牙髓间充质干细胞:用0.01M冻存液PBS冲洗后， 将取出的牙髓剪成约 1mm31mm31mm3小块， 再用0.3的I型胶原酶和0。
34、.4的分解酶在37水浴进行消化作用 1h， 轻轻吹打离散单细胞团块， 将形成的单细胞悬液通过孔径为70 m的细胞筛网后， 并以 800r/min的离心速度， 离心5min； 再用0.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度 5000/cm2的干细胞培养基接种于培养瓶中培养， 培养基每三天换一次。 在本具体实施例中， 所述干细胞培养基中含有15的胎牛血清的 -MEM、 5的DMEM培养基及5无血清培养基。 FBS和牙髓间充质干细胞的条件培养基的提及比为4： 5。 0062 S3、 克隆化培养分离牙髓间充质干细胞： 待细胞生长达8085汇合度时， 用 0.25的胰酶消化传代， 再用0。
35、.01M冻存液PBS冲洗一次， 将细胞沉淀， 同时将密度5000/cm2 的干细胞培养基接种于转瓶中培养， 每3d换液1次， 其中等细胞生长达80汇合度时， 用 0.25的胰酶消化收获。 0063 在本实施例中， 使用的是含有微载体的转瓶培养细胞， 转瓶工作体积为125ml， 微 载体为Cytodex-3。 0064 在本实施例中， S3具体步骤如下： 0065 A、 转瓶预处理： 125ml转瓶清洗干净， 烘干至完全干燥， 并进行灭菌处理， 加入硅化 液15ml18ml于转瓶中， 缓慢旋转转瓶使硅化液浸润瓶壁， 吸去硅化液后， 将转瓶置于通风 处风干15h， 蒸馏水冲洗备用； 0066 B、。
36、 微载体预处理： 本实施例中微载体密度定为2g/L， 称取 0.05gCytodex-3加入转 瓶中， 加入0.01M冻存液PBS浸泡3h， 吸去后加入20ml新的PBS， 130高压蒸汽灭菌， 吸去 PBS， 并加入 20ml含17胎牛血清的 -MEM培养液， 37浸泡过夜。 0067 C、 每天换液1次， 其中等细胞生长达80汇合度时， 用0.25的胰酶消化收获。 0068 S4、 牙髓间充质干细胞检测： 将收获的子代牙髓间充质干细胞， 利用PBS重悬细胞， 调整细胞密度为1106/ml， 取出1ml， 加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀， 在4下过夜并离 心弃乙醇后再流式细胞仪上进行细胞周。
37、期检测， 检测细胞的特异性， 包括间充质干细胞特 异性表面标志物Stro-1、 CD29、 CD44、 CD71、 CD90、 CD106、 CD120 等， 以及其它系细胞表面标 志物， 如CD14、 CD34、 CD45等。 在本具体实施例中， 还需要用0.01M冻存液PBS冲洗两次， 并用 说明书 6/7 页 8 CN 108277202 A 8 0.5的PI在4中染色30min。 0069 S5、 牙髓间充质干细胞检测染色。 在S5中， 取生长良好的克隆化培养细胞做细胞爬 片， 用LSAB法行抗Vimemin、 CD44、 ON、 DSP 免疫组化染色。 0070 在本具体实施例中， 在S2和S4中的离心后还包括过滤除菌的步骤。 0071 利用克隆分离培养的细胞之间排列紧密， 中心部细胞界限不清。 呈圆形或不规则 状及形成细胞结节样， 周边部细胞呈多角形或短梭形， 胞浆较少， 核浆比例大， 核仁明显， 部 分细胞呈成纤维状， 且培养3天长满。 0072 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 7/7 页 9 CN 108277202 A 9 图1 图2 说明书附图 1/1 页 10 CN 108277202 A 10 。