技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种环肽类化合物抗肿瘤的应 用及其制备方法。
背景技术
癌症是人类健康的第一大杀手，2008年全球癌症发病人数和死亡人数分 别为1266万和756万，估计到2015年将有1500万新发病例，发病率和死 亡率呈逐年上升的趋势，并主要集中在发展中国家。
对于大多数的癌症患者而言，目前仍然缺少有效的治疗药物，现有的临 床上应用的抗肿瘤化疗药物，有些虽有一定的疗效，但大多为细胞毒性药物， 在抑制肿瘤细胞增值的同时，也能抑制机体正常细胞的增殖，如毛囊细胞和 骨髓细胞等，而产生一定的副作用，有些化疗药物的副作用相当大，甚至危 及生命，使患者非常痛苦，这一方面限制了化疗药物的临床应用，另一方面 也很难取得应有的治疗效果。尽管如此，目前临床上也仍然缺少有效的治疗 泌尿系统癌症的药物，如抗肾癌的药物等。另外，几十年来医疗技术的发展 只是提高了早期癌症的治疗效果，对于晚期癌症仍然是无能为力。
因此，研发高效低毒、成本低、靶向性高的抗肿瘤药物尤其是抗肾癌新 药是目前亟待解决的问题。经查阅资料目前还没有文献报道从链霉菌 （Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）中得到的环肽类化合物具有抗肿瘤 活性，尤其是抗肾癌的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环肽类化合物抗肿瘤的应用及其制备方法， 本方法成本低、产量高、简单易行、环境友好，制备得到的环肽类化合物抗 肿瘤活性高，从而有助于在癌症的防治过程中发挥作用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
环肽类化合物CP-1或CP-2在制备抗肿瘤药物和/或保健品中的应用，其 中，所述的环肽类化合物CP-1和CP-2的化学结构式如下：
环肽类化合物CP-1或CP-2在制备抗肾癌药物和/或保健品中的应用。
所述的抗肾癌药物和/或保健品为抑制肾癌细胞生长和增殖的药物和/或 保健品。
所述的抗肾癌药物和/或保健品为调控肾癌细胞周期的药物和/或保健 品。
所述的抗肾癌药物和/或保健品为使肾癌细胞停止在G1期的药物和/或 保健品。
所述的抗肾癌药物和/或保健品为抑制p-Erk、c-fos、cyclinD1、CDK4及 PCNA表达的药物和/或保健品。
一种环肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1）将链霉菌NRRL15010接种于灭菌后的初始发酵液中，在25～35℃， 200～400r/min下，发酵培养5～7天，得到发酵菌液；所述的初始发酵液，以 质量分数计，包括0.3～0.8%的D-葡萄糖，0.3～0.6%的酵母提取物，0.5～1.0% 的麦芽提取物，0.02～0.10%的碳酸钙，1～3%的D101大孔吸附树脂，余量 为水；
2）将发酵菌液过滤，得到滤液以及树脂和菌丝体的混合物，用乙酸乙酯 萃取滤液数次，合并乙酸乙酯部分，得到乙酸乙酯萃取液；
在室温下，用乙酸乙酯、甲醇分别冷浸提取树脂和菌丝体的混合物数次， 合并提取液，分别得到乙酸乙酯提取液和甲醇提取液；
3）将乙酸乙酯萃取液和乙酸乙酯提取液合并，减压浓缩至干，得到第一 浸膏；将甲醇提取液减压浓缩至干，得到第二浸膏；将第一浸膏和第二浸膏 合并，得到总浸膏；
4）将总浸膏经柱层析纯化，分离得到环肽类化合物CP-1和CP-2。
步骤2）所述的用乙酸乙酯萃取滤液的次数为2～4次，且每次萃取所用 乙酸乙酯与滤液的体积比为1～3:1；
所述的用乙酸乙酯、甲醇分别冷浸提取树脂和菌丝体的混合物的次数为 2～5次，每次冷浸提取的时间为1～24h，且每次冷浸提取所用乙酸乙酯、甲 醇的量均为树脂和菌丝体的混合物体积的1～5倍。
步骤4）所述的柱层析纯化包括三个阶段：
第一阶段，将总浸膏上样至硅胶层析柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液， 按体积比（100:1）～（1:1）进行梯度洗脱，每1500ml收集一个流份，对流 出液进行TLC检测，将氯仿与甲醇按体积比为（50:1）～（20:1）洗脱的流份 合并，常压或减压蒸干溶剂，得到第一次过柱部分；
第二阶段：将第一次过柱部分，上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统 作为洗脱液，按体积比（1:100）～（100:1）进行梯度洗脱，每800ml收集一 个流份，对流出液进行TLC检测，将氯仿与甲醇按体积比为（70：30）～ （80：20）洗脱的流份合并，常压或减压蒸干溶剂，得到第二次过柱部分；
第三阶段，将第二次过柱部分，上样于高效液相色谱分离柱，分离得到 环肽类化合物CP-1和CP-2。
所述的高效液相色谱分离柱为岛津shimpac ODS20×250mm，高效液相 色谱分离是在298nm下，以甲醇-水系统或乙腈-水系统作为流动相，按 8ml/min进行等度洗脱，所述甲醇-水系统中甲醇与水体积比为73:27，乙腈- 水系统中乙腈与水的体积比为68:32。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
癌细胞的无限制、无止境增殖是导致机体细胞生长增殖机制严重失常的 原因，本发明公开了环肽类化合物CP-1、CP-2，能够抑制肾癌细胞生长、肾 癌细胞克隆形成及肾癌细胞周期，从而降低肾癌细胞增殖、扩散。
通过MTT实验证实环肽类化合物CP-1、CP-2能够显著降低肾癌细胞的 存活率；通过克隆形成率实验证实环肽类化合物CP-1、CP-2能够显著抑制 肾癌细胞增殖；通过流式细胞术分析细胞凋亡率实验证实环肽类化合物 CP-1、CP-2能够调控肾癌细胞周期，再通过蛋白免疫印迹实验证实环肽类化 合物CP-1、CP-2能够抑制肾癌细胞周期内相关蛋白的表达，找到了CP-1的 作用靶点，所以，环肽类化合物CP-1和CP-2能够应用于制备抗肿瘤药物和 /或保健品。
本发明制备环肽类化合物CP-1、CP-2的方法，以链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）为菌株，优化培养发酵条件，发酵后产物经处理后 经过硅胶柱及反相硅胶柱分离，最后经制备色谱柱，分离得到具有活性的环 肽类化合物CP-1和CP-2，本方法与现有技术相比，简单易行、环境友好、 成本低、产量高，是一种有效提高微生物活性次级代谢产物产量的方法。
附图说明
图1是本发明制备的环肽类化合物CP-1的ESI质谱图；
图2是本发明制备的环肽类化合物CP-2的ESI质谱图；
图3是本发明制备的环肽类化合物的HPLC色谱图；
图4是用MTT法检测本发明制备的环肽类化合物CP-1、CP-2对三种肾 癌细胞的活力测定结果；其中，（a）、（b）为CP-1、CP-2对786-O的活力测 定结果，（c）、（d）为CP-1、CP-2对769-P的活力测定结果，（e）、（f）为 CP-1、CP-2对ACHN的活力测定结果；
图5是用流式细胞仪检测本发明制备的环肽类化合物CP-1、CP-2对两 种肾癌细胞786-O和769-P的细胞周期调控结果；
图6是本发明制备的环肽类化合物CP-1、CP-2对三种肾癌细胞786-O、 769-P和ACHN克隆形成率的影响结果；
图7是本发明制备的环肽类化合物CP-1对786-O和769-P两种肾癌细胞 中与细胞周期相关的蛋白表达的影响结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例及附图对本发明做进一步的详细说明，所述是对 本发明的解释而不是限定。
1、环肽类化合物CP-1和CP-2的制备：
实施例1
1）将链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）接种于灭菌后的初 始发酵液中，在30℃，摇床速率为300转/min的条件下，发酵培养5～7天， 得到发酵菌液；
其中，所述的初始培养液，以质量分数计，其组成包括：0.5%D-葡萄糖， 0.5%酵母提取物，0.8%麦芽提取物，0.05%碳酸钙，1%D101大孔吸附树脂， 余量为水；本发明所用的链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）购 于ATCC。
2）将培养后的发酵菌液用5层纱布过滤，分别得到滤液、树脂和菌丝体 的混合物，用乙酸乙酯萃取滤液3次，所用乙酸乙酯和滤液的体积比为1:1； 在室温下，用乙酸乙酯、甲醇分别冷浸提取树脂和菌丝体的混合物3次，每 次12h，合并每次提取得到的乙酸乙酯提取液和甲醇提取液，所述冷浸提取 中乙酸乙酯、甲醇的用量分别为树脂和菌丝体的混合物体积的1～5倍；
3）将乙酸乙酯萃取液和乙酸乙酯的提取液合并，减压浓缩至干，得到第 一浸膏，将甲醇提取液减压浓缩至干，得到第二浸膏，将第一浸膏和第二浸 膏合并，得到总浸膏；
4）将总浸膏上样至硅胶层析柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液，按体积 比（100:1）～（1:1）进行梯度洗脱，在氯仿与甲醇体积比为50:1、20:1、5:1 和1:1的梯度下，每个梯度洗脱3～4个保留体积，每1500ml收集一个流份， 经TLC检测，合并成分基本相同的流份，共得到8个流份；其中，将将氯仿 与甲醇按体积比为（50:1）～（20:1）洗脱的流份合并，常压或减压蒸干溶剂， 得到第一次过柱部分；
将第一次过柱部分，上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统作为洗脱液， 按体积比（1:100）～（100:1）进行梯度洗脱，在氯仿与甲醇体积比为50:50、 60:40、70:30、80:20和90:10的梯度下，每个梯度洗脱3～4个保留体积，每 800ml收集一个流份，经TLC检测，合并成分基本相同的流份，共得到6个 流份；将氯仿与甲醇按体积比为（70：30）～（80：20）洗脱的流份合并， 常压或减压蒸干溶剂，得到第二次过柱部分；
5）将第二次过柱部分，上样于高效液相色谱分离柱，分离得到环肽类化 合物CP-1和CP-2。
分离条件为：岛津LC-6AD半制备液相色谱仪，示差折光检测器和紫外 检测器，色谱柱为岛津shimpac ODS20×250mm，流速为8ml/min，紫外检测 波长为298nm，以甲醇-水或乙腈-水系统作为流动相进行等度洗脱，所述甲 醇-水系统中甲醇与水体积比为73:27，乙腈-水系统中乙腈与水的体积比为 68:32。
参见图3，HPLC制备色谱图显示，在20分钟和16分钟左右，分别出 现了主面积峰，收集后分离得到的单体化合物分别为：CP-1和CP-2。
2、对分离得到的单体化合物进行结构表征
1）对CP-1进行结构表征，分析结果如下：
CP-1，淡黄色粉末，IR(KBr),cm-1:3310,1748,1668,1649,1523.UVλmax(nm):298.MS结果参见图1，显示分子量为718，分子式为C38H50N6O8，氢 谱提示为环肽类化合物，氢谱数据及归属如下：1H-NMR(400MHz,CDCl3): 甲基脯氨酸氢信号，4.46(1H,dd,α-H)，2.06(1H,m,β-H)，1.81(1H,m,β-H), 2.36(1H,m,γ-H),0.98(3H,d,γ-CH3),3.47(1H,dd,δ-H),3.08(1H,dd,δ-H); 甘氨酸信号，8.46(1H,brs,NH),4.88(1H,q,α-H),1.36(3H,d,α-CH3);N-甲基 甘氨酸信号，4.75(1H,m,α-H)，1.50(3H,d,α-CH3),2.82(3H,s,N-CH3);脯 氨酸信号，5.27(1H,dd,α-H)，2.35(1H,m,β-H)，1.97(1H,m,β-H),2.16(1H, m,γ-H),1.98(1H,m,γ-H),3.74(1H,m,δ-H),3.52(1H,m,δ-H);丝氨酸信号， 5.82(1H,brs,NH),4.49(1H,dd,α-H),4.84(1H,dd,β-H),3.54(1H,dd,β-H); 苯丙氨酸信号，6.69(1H,brs,NH),4.61(1H,dd,α-H),2.99(2H,m,β-H),7.15 (2H,m,2’-H,6’-H),7.28(2H,m,3’-H,5’-H),7.18(1H,m,4’-H);不饱和脂肪 酸上的信号，6.26,7.30,6.26,6.49,6.13,5.88,1.80.根据表征数据，确定CP-1 为环肽类化合物，由6个氨基酸组成，具有一个不饱和脂肪酸侧链，其结构 为：
2）对CP-2进行结构表征，分析结果如下：
CP-2：淡黄色粉末，IR(KBr),cm-1:3280,1728,1640,1599,798.UVλmax(nm):298.MS结果参见图2，显示分子量为704，分子式为C37H48N6O8，氢 谱提示为环肽类化合物，氢谱数据及归属如下：1H-NMR(400MHz,CDCl3): 脯氨酸氢信号，4.45(1H,dd,α-H)，2.16(1H,m,β-H)，1.98(1H,m,β-H),1.98 (1H,m,γ-H),1.88(1H,d,γ-CH3),3.61(1H,dd,δ-H),3.29(1H,dd,δ-H);甘氨 酸信号，8.56(1H,brs,NH),4.88(1H,q,α-H),1.37(3H,d,α-CH3);N-甲基甘氨 酸信号，4.79(1H,m,α-H)，1.51(3H,d,α-CH3),2.84(3H,s,N-CH3);脯氨酸 信号，5.17(1H,dd,α-H)，2.35(1H,m,β-H)，1.98(1H,m,β-H),2.16(1H,m, γ-H),1.98(1H,m,γ-H),3.74(1H,m,δ-H),3.59(1H,m,δ-H);丝氨酸信号，6.82 (1H,brs,NH),4.51(1H,dd,α-H),4.84(1H,dd,β-H),3.58(1H,dd,β-H);苯丙 氨酸信号，6.29(1H,brs,NH),4.65(1H,dd,α-H),2.96(2H,m,β-H),7.15(2H, m,2’-H,6’-H),7.29(2H,m,3’-H,5’-H),7.21(1H,m,4’-H);不饱和脂肪酸上 的信号，6.25,7.30,6.26,6.48,6.13,5.88,1.79.根据表征数据，确定CP-2为 环肽类化合物，由6个氨基酸组成，具有一个不饱和脂肪酸侧链，其结构为：
实施例2
1）将链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）接种于灭菌后的初 始发酵液中，在25℃，摇床速率为400转/min的条件下，发酵培养5天，得 到发酵菌液；
其中，所述的初始培养液，以质量分数计，其组成包括：0.3%D-葡萄糖， 0.3%酵母提取物，0.8%麦芽提取物，0.02%碳酸钙，1%的D101大孔吸附树 脂，余量为水；本发明所用的链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010） 购于ATCC。
2）将培养后的发酵菌液用5层纱布过滤，分别得到滤液、树脂和菌丝体 的混合物，用乙酸乙酯萃取滤液3次，所用乙酸乙酯和滤液的体积比为2:1； 在室温下，用乙酸乙酯、甲醇分别冷浸提取树脂和菌丝体的混合物4次，每 次16h，分别合并每次提取得到的乙酸乙酯提取液和甲醇提取液，所述冷浸 提取处理中每次提取所用乙酸乙酯、甲醇的量分别为树脂和菌丝体的混合物 体积的3倍；
3）将乙酸乙酯萃取液和乙酸乙酯的提取液合并，减压浓缩至干，得到第 一浸膏，将甲醇提取液减压浓缩至干，得到第二浸膏，将第一浸膏和第二浸 膏合并，得到总浸膏；
4）将总浸膏经柱层析纯化，纯化条件同实施例1，分离得到环肽类化合 物CP-1和CP-2。
实施例3
1）将链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）接种于灭菌后的初 始发酵液中，在35℃，摇床速率为200转/min的条件下，发酵培养7天，得 到发酵菌液；
其中，所述的初始培养液，以质量分数计，其组成包括：0.6%D-葡萄糖， 0.6%酵母提取物，0.5%麦芽提取物，0.02%碳酸钙，2%D101大孔吸附树脂， 余量为水；本发明所用的链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）购 于ATCC。
2）将培养后的发酵菌液用5层纱布过滤，分别得到滤液、树脂和菌丝体 的混合物，用乙酸乙酯萃取滤液2次，所用乙酸乙酯和滤液的体积比为3:1； 在室温下，用乙酸乙酯、甲醇分别冷浸提取树脂和菌丝体的混合物3次，每 次24h，合并每次提取得到的乙酸乙酯提取液和甲醇提取液，所述冷浸提取 处理中每次提取所用乙酸乙酯、甲醇的量分别为树脂和菌丝体的混合物体积 的2倍；
3）将乙酸乙酯萃取液和乙酸乙酯的提取液合并，减压浓缩至干，得到第 一浸膏，将甲醇提取液减压浓缩至干，得到第二浸膏，将第一浸膏和第二浸 膏合并，得到总浸膏；
4）将总浸膏经柱层析纯化，纯化条件同实施例1，分离得到环肽类化合 物CP-1和CP-2。
实施例4
1）将链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）接种于灭菌后的初 始发酵液中，在30℃，摇床速率为350转/min的条件下，发酵培养6天，得 到发酵菌液；
其中，所述的初始培养液（为本发明优化的培养液），以质量分数计，其 组成包括：0.8%D-葡萄糖，0.3%酵母提取物，1.0%麦芽提取物，0.10%碳酸 钙，3%的D101大孔吸附树脂，余量为水；本发明所用的链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）购于ATCC。
2）将培养后的发酵菌液用5层纱布过滤，分别得到滤液、树脂和菌丝体 的混合物，用乙酸乙酯萃取滤液4次，所用乙酸乙酯和滤液的体积比为1:1； 在室温下，用乙酸乙酯、甲醇分别冷浸提取树脂和菌丝体的混合物5次，每 次1h，合并每次提取得到的乙酸乙酯提取液和甲醇提取液，所述冷浸提取处 理中每次提取所用乙酸乙酯、甲醇的量分别为树脂和菌丝体的混合物体积的 1倍；
3）将乙酸乙酯萃取液和乙酸乙酯的提取液合并，减压浓缩至干，得到第 一浸膏，将甲醇提取液减压浓缩至干，得到第二浸膏，将第一浸膏和第二浸 膏合并，得到总浸膏；
4）将总浸膏经柱层析纯化，纯化条件同实施例1，分离得到环肽类化合 物CP-1和CP-2。
实施例5
1）将链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）接种于灭菌后的总 体积为20L初始发酵液中，在30℃，摇床速率为300转/min的条件下，发酵 培养5～6天，得到发酵液；
其中，所述的初始培养液（为本发明优化的培养液），以质量分数计，其 组成包括：0.8%D-葡萄糖，0.5%酵母提取物，0.6%麦芽提取物，0.02%碳酸 钙，1%的D101大孔吸附树脂，余量为水；本发明所用的链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）购于ATCC。
2）将培养后的发酵菌液用5层纱布过滤，分别得到滤液、树脂和菌丝体 的混合物，用乙酸乙酯萃取滤液2～4次，所用乙酸乙酯和滤液的体积比为1:1； 在室温下，用乙酸乙酯、甲醇分别冷浸提取树脂和菌丝体的混合物5次，每 次5h，分别合并每次提取得到的乙酸乙酯提取液和甲醇提取液，所述冷浸提 取中乙酸乙酯、甲醇的用量分别为树脂和菌丝体的混合物体积的5倍；
4）将总浸膏经柱层析纯化，纯化条件同实施例1，分离得到环肽类化合 物CP-1和CP-2。
3、环肽类化合物CP-1和CP-2的抗肿瘤活性实验
1）细胞培养及药物配制：
将人肾癌细胞系786-O，769-P和ACHN细胞接种于多孔板中（购于 American Type Culture Collection），用含10％胎牛血清（购于美国HyClone 公司）的RPMI-1640培养基（购于美国Gibco公司）在5%CO2培养箱内37℃ 培养不同时间，0.25%胰酶（购于美国Sigma公司）消化及传代。
用DMSO将环肽类化合物CP-1和CP-2配成20mM的储备液，于-20℃ 避光保存，待用。MTT实验时，用含10%（体积浓度）胎牛血清的RPMI-1640 培养基将其进一步稀释成1、10、20、50、100μM的工作浓度加入相应的实 验孔。
2）MTT法检测环肽类化合物CP-1、CP-2对肾癌细胞生长的抑制作用
实验方法：实验分为样品组和对照组；
样品组：分别加入1、10、20、50、100μM的CP-1或CP-2；
对照组：与1μM CP-1或CP-2稀释液中含有相同浓度DMSO的10%胎 牛血清的RPMI-1640培养液。
取对数生长期786-O，769-P和ACHN细胞，分别以200μL、4×103个 细胞/孔接种于96孔板，各设5个复孔。于加药后48、72h后弃去原培养液， 每孔加无血清培养液与20μL的5mg/ml MTT（购于Sigma公司）混合溶液 200μL，培养4h，弃上清，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，使结晶物 充分溶解。
用酶标仪检测各孔490nm的吸光度，并计算细胞存活率：
细胞存活率（%）=（实验组A490平均值/空白对照组A490平均值）×100%。 以药物浓度为横坐标，细胞存活率（%）值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
抑制率（%）＝（1-处理组OD值／空白对照组OD值）×100%）
实验结果分析：
参见图4，从MTT结果分析显示，CP-1和CP-2均对786-O，769-P和 ACHN细胞具有明显的体外生长抑制作用。不同浓度的CP-1和CP-2作用于 786-O，769-P和ACHN细胞后，药物CP-1和CP-2浓度小于10μM时，CP-1 和CP-2对786-O，769-P和ACHN细胞生长抑制不明显，药物CP-1和CP-2 浓度大于20μM后，随着药物浓度的升高和作用时间的延长，786-O，769-P 和ACHN细胞存活率显著下降。
随着浓度的增加，CP-1和CP-2对三种肾癌细胞786-O，769-P和ACHN 的抑制率也增加；随着作用时间的增加，除了对769-P细胞外，CP-1和CP-2 对另外两种肾癌细胞786-O和ACHN的抑制率也增加。CP-1对三种肾癌细 胞作用48小时的IC50值分别为：30,25和50μＭ，作用72小时的IC50值分 别为：20,30和22μＭ；CP-2对三种肾癌细胞作用48小时的IC50值分别为： 70,65和73μＭ，作用72小时的IC50值分别为：40,65和70μＭ。由此可见， CP-1的抑制作用较强。
3）环肽类化合物CP-1、CP-2对肾癌细胞克隆形成的影响
细胞克隆是指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，其形成能力与肿 瘤细胞的群体依赖性和增殖能力密切相关。克隆形成能力的大小可反映肿瘤 细胞的成瘤能力和恶性程度，也是评价单细胞存活和增殖的良好指标。
实验方法：分别把786-O，769-P和ACHN用胰酶消化并吹打成单个细 胞，悬浮于完全培养基中，将细胞悬液进行梯度稀释，接种于24孔板中，接 种密度分别为150μL/孔，各设3个平行孔，每孔加CP-1或CP-2，终浓度为 50μM，将细胞于CO2培养箱中培养5天后弃培养液，用PBS洗2次，4%多 聚甲醛固定后用1%结晶紫染色，流水缓慢洗去染色液，空气干燥，扫描细 胞培养板。
实验结果分析：
参见图6，可以看出，利用环肽类化合物CP-1、CP-2作用5天后的肾癌 细胞克隆形成率为零，而对照组克隆形成率为100%，故CP-1和CP-2可有 效抑制786-O，769-P和ACHN细胞克隆形成的能力，进一步证实环肽类化 合物CP-1和CP-2对肾癌细胞增殖的抑制作用。
4）流式细胞仪检测环肽类化合物CP-1、CP-2对肾癌细胞周期的影响
实验方法：用50μM CP-1和CP-2处理786-O，769-P和ACHN细胞， 48h后，收集细胞，用PBS洗涤2次，加入体积分数为70%乙醇液，将其置 -20℃内固定，过夜。取出离心洗涤后，PBS洗涤2次，加入150μL RNA酶 （RNase），置37℃温育30min后，再加入10mg/mL150μL PI染液混匀， 置室温，避光30min后，用流式细胞仪检测细胞周期的分布。
实验结果分析：
参见图5，为环肽类化合物CP-1、CP-2对两种肾癌细胞786-O和769-P 的细胞周期分析结果，CP-1和CP-2处理后的G0/G1期细胞的比例均显著升 高，同时S期和G2/M期细胞的比例均降低，未见明显凋亡峰(Sub G0)出现。 CP-1和CP-2在相同浓度作用下，CP-1处理786-O细胞后G0/G1期细胞比例 可达到85.03%，CP-2处理786-O细胞后G0/G1期细胞比例达到64.80%。CP-1 处理769-P细胞后G0/G1期细胞比例达到80.67%，CP-2处理769-P细胞后 G0/G1期细胞比例有61.84%。
CP-1和CP-2处理后，两种肾癌细胞786-O和769-P的细胞主要停止在 G1期，尤以CP-1的作用更强，如在786-O细胞中，与对照组处于G1期51.4% 的细胞百分数相比，经CP-1处理后的停止在G1期的细胞百分数为80.1%； 在769-P细胞中，对照组和CP-1处理组处于G1期的细胞百分数分别为54.4% 和80.0%，可见，这两个化合物主要是通过抑制细胞周期在G1期而起作用。
5）蛋白免疫印迹实验，CP-1对肾癌细胞周期相关蛋白表达的影响
实验方法：分别收集用50μM CP-1处理48h后的786-O，769-P和ACHN 细胞，用RIPA细胞裂解液裂解细胞获得总蛋白，Bradford比色法定量。制 备12%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），按每孔30μg蛋白上样，120V电压 下分离蛋白后，再采用25V电压作用12h将凝胶上的蛋白湿转至硝酸纤维素 膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1h后，分别加入T-Erk（博奥森1:200）、p-Erk （博奥森1:200）、c-fos（Santa Cruz1:400）、CyclinD1（Santa Cruz1:200）、 CDK4（Santa Cruz1:400）、PCNA（SCT1:2000）和GAPDH（上海康成 1:10000），4℃冰箱孵育过夜，TBST充分漂洗5次后，加荧光二抗IgG（LI-COR 公司）室温避光孵育1h，TBST漂洗5次，用Odyssey双色红外激光成像系 统（LI-COR公司）扫描。实验中采用GAPDH作为内参照，扫描所得图像 采用QuantityOne软件做灰度值分析，并与GAPDH相比量化蛋白表达的相 对水平。
实验结果分析：
参见图7，从表达条带可以看出，786-O、769-P细胞经CP-1处理的药物 组与空白对照组、DMSO组比较，CP-1可以显著下调cyclinD1、CDK4蛋白 表达。同时检测DNA合成相关蛋白PCNA的表达，786-O、769-P细胞经CP-1 处理后，PCNA与对照组相比较均表达下调。细胞周期蛋白cyclinD1的表达 在细胞从G0期到S期的进程中发挥重要作用，检测周期蛋白cyclinD1上游 调控蛋白的表达，发现p-Erk和c-fos蛋白表达水平均显著下降。
综上所述，利用链霉菌（Streptomyces hawaiiensis NRRL15010）作为菌 株，对培养条件进行优化，经分离得到的环肽类化合物单体CP-1和CP-2， 通过MTT实验证实环肽类化合物能够显著降低肾癌细胞的存活率；通过克 隆形成率实验证实环肽类化合物能够显著抑制肾癌细胞增殖；通过流式细胞 术分析细胞凋亡率实验证实环肽类化合物能够调控肾癌细胞周期，再通过蛋 白免疫印迹实验证实环肽类化合物能够抑制肾癌细胞周期内相关蛋白的表 达，找到了CP-1的作用靶点，所以，环肽类化合物CP-1和CP-2能够应用 于制备抗肿瘤药物和/或保健品。