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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510458400.1 (22)申请日 2015.07.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105131083 A (43)申请公布日 2015.12.09 (73)专利权人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安南路199号 (72)发明人 张志琪葛先立刘瑞林苏娜 (74)专利代理机构 西安永生专利代理有限责任 公司 61201 代理人 高雪霞 (51)Int.Cl. C07K 7/06(2006.01) C12P 21/06(2006.01。
2、) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (56)对比文件 CN 102618608 A,2012.08.01, CN 101643767 A,2010.02.10, CN 103122022 A,2013.05.29, US 2003065040 A1,2003.04.03, WO 03053401 A3,2004.01.15, 史婷.扁杏仁蛋白的提取及其多肽对细胞活 性的影响研究. 中国优秀硕士学位论文全文数 据库 .2014,全文. Chunyan Wang et al.ACE inhibitory and an。
3、tihypertensive properties of apricot almond meal hydrolysate. European Food Research and Technology .2011,第232 卷(第3期),549-556. 审查员 李翠莹 (54)发明名称 具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁 肽及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了两种具有血管紧张素转化酶 抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法， 其中一种扁 杏仁肽的氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp， 另一种扁杏仁肽的氨基酸序列为Gln-His-Thr- Asp-Asp。 这两种扁杏仁肽是以扁杏仁为。
4、原料， 先 提取扁杏仁蛋白， 将扁杏仁蛋白酶解得到扁杏仁 总肽， 再经葡聚糖凝胶层析、 反相制备色谱分离 得到。 实验结果表明， 这两种扁杏仁肽具有较高 的血管紧张素转化酶抑制活性， 前者对血管紧张 素转化酶抑制活性的IC50值为67.520.05g/ mL， 后者对血管紧张素转化酶抑制活性的IC50值 为43.180.07g/mL， 且细胞毒性较低， 因而可 以作为降压药物。 该发明为扁杏仁的深加工和降 压肽的开发提供了新途径。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 CN 105131083 B 2018.07.10 CN 105131083 B 1.具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽。
5、， 其特征在于该扁杏仁肽的氨基酸序列 为： -His-Thr-Asp-Asp， 其中 代表Met或Gln。 2.一种权利要求1所述的具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽的制备方法， 其 特征在于它由下述步骤组成： (1)提取扁杏仁蛋白 将扁杏仁依次经热水脱皮、 粉碎、 脱脂、 溶剂提取、 乙醇和等电点沉降法复合沉淀、 冷冻 干燥， 得到扁杏仁蛋白； (2)蛋白酶解 将步骤(1)得到的扁杏仁蛋白与蒸馏水按质量体积比为40g:1L混合， 在温度为42水 浴中先用Protamex复合蛋白酶在pH值为6.5下水解100分钟， 加酶量为53140U/g蛋白， 水解 完后在沸水浴中灭酶20分钟， 然后在。
6、温度为53的环境中用Alcalase碱性蛋白酶在pH值为 7.6下酶解90分钟， 加酶量为1130U/g蛋白， 酶解完后在沸水浴中灭酶20分钟， 酶解过程用 0.5mol/L NaOH水溶液调节pH值； 10000转/分钟离心分离20分钟， 所得上清液在-40冷冻 干燥24小时， 得到扁杏仁总肽； (3)葡聚糖凝胶层析 将步骤(2)得到的扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为3050g:1L混合， 脱气、 超滤膜 过滤后加入Sephadex G-15填充柱中， 以超纯水为流动相， 采用自动液相色谱分离层析仪进 行分离， 进样量2mL， 流速3mL/分钟； 收集1940分钟所有流出成分， 冷冻干燥； 。
7、(4)反相制备色谱分离 将步骤(3)冷冻干燥后得到的产品与超纯水按质量体积比为4060g:1L混合， 用超滤 膜过滤， 超声脱气后， 注射入制备色谱系统， 进样量1mL， 采用Sinochrom ODS-BP色谱柱分 离， 洗脱相A为乙腈， 洗脱相B为含0.05三氟乙酸的超纯水， 梯度洗脱程序： 010分钟， 20乙腈； 1030分钟， 2040乙腈； 3040分钟， 4070乙腈； 流速12mL/分钟； 收 集8.529.14分钟和14.8715.26分钟流出的两种成分， 冷冻干燥， 得到氨基酸序列为 Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。。
8、 权利要求书 1/1 页 2 CN 105131083 B 2 具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于医用蛋白或肽/蛋白技术领域， 具体涉及两种具有显著的血管紧张素 转化酶(ACE)抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法。 背景技术 0002 目前， 天然生物活性肽研究的蛋白来源主要有： (1)植物性来源： 大豆/豆粕、 米糟、 花生、 杏仁等； (2)动物性来源： 蚕丝、 猪肉、 鸡肉、 动物皮/骨、 动物毒液等。 0003 生物活性肽的作用研究方向主要有： (1)抗高血压活性； (2)抗氧化活性； (3)抗血 栓活性； (4)抗菌作用； (5)免疫作用；。
9、 (6)拮抗与抗拮抗活性； (7)抗炎症作用等。 0004 以上成果大多停留在色谱分析水平， 没有制取到足够的纯净样品。 有的仅进行了 体外或细胞活性研究两者中的一项， 不能充分证明产物的安全和有效性。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于提供两种具有显著的血管紧张素转化酶抑制活 性的扁杏仁肽， 以及这两种扁杏仁肽的制备方法。 0006 解决上述技术问题所采用的技术方案是： 该扁杏仁肽的氨基酸序列为 -His-Thr- Asp-Asp， 其中 代表Met或Gln。 0007 本发明具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽的制备方法由下述步骤组成： 0008 1、 提取扁杏仁蛋白 00。
10、09 将扁杏仁依次经热水脱皮、 粉碎、 脱脂、 溶剂提取、 乙醇和等电点沉降法复合沉淀、 冷冻干燥， 得到扁杏仁蛋白。 0010 2、 蛋白酶解 0011 将步骤1得到的扁杏仁蛋白先用Protamex复合蛋白酶水解， 然后用Alcalase碱性 蛋白酶水解， 离心分离， 上清液冷冻干燥， 得到扁杏仁总肽。 0012 3、 葡聚糖凝胶层析 0013 将步骤2得到的扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为3050g:1L混合， 脱气、 超滤 膜过滤后加入Sephadex G-15填充柱中， 以超纯水为流动相， 采用自动液相色谱分离层析仪 进行分离， 进样量2mL， 流速3mL/分钟； 收集1940分钟所有。
11、流出成分， 冷冻干燥。 0014 4、 反相制备色谱分离 0015 将步骤3冷冻干燥后得到的产品与超纯水按质量体积比为4060g:1L混合， 用超 滤膜过滤， 超声脱气后， 注射入制备色谱系统， 进样量1mL， 采用SinochromODS-BP色谱柱分 离， 洗脱相A为乙腈， 洗脱相B为含0.05三氟乙酸的超纯水， 梯度洗脱程序： 010分钟， 20乙腈； 1030分钟， 2040乙腈； 3040分钟， 4070乙腈； 流速12mL/分钟； 收 集8.529.14分钟和14.8715.26分钟流出的两种成分， 冷冻干燥， 得到氨基酸序列为 Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-Hi。
12、s-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。 0016 本发明的扁杏仁蛋白可根据现有文献公开的任意一种提取方法提取。 说明书 1/6 页 3 CN 105131083 B 3 0017 本发明以扁杏仁为原料， 先提取扁杏仁蛋白， 再将扁杏仁蛋白酶解后得到的扁杏 仁总肽经葡聚糖凝胶层析、 反相制备色谱分离得到两种扁杏仁肽。 实验结果表明， 所制备的 两种扁杏仁肽具有较高的ACE抑制活性， 其中氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁 肽对ACE抑制活性的IC50值为67.520.05 g/mL， 氨基酸序列为Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁 杏仁肽对ACE抑制活性的IC50。
13、值为43.180.07 g/mL， 且细胞毒性较低， 因而可以作为降压 药物。 具体实施方式 0018 下面结合实施例对本发明进一步详细说明， 但本发明的保护范围不仅限于这些实 施例。 0019 实施例1 0020 1、 提取扁杏仁蛋白 0021 根据公布号为CN 102845585A、 发明名称为 “聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的 方法” 中实施例1公开的方法提取扁杏仁蛋白。 0022 2、 蛋白酶解 0023 将扁杏仁蛋白与蒸馏水按质量体积比为40g:1L混合， 在温度为42水浴中先用 Protamex复合蛋白酶在pH值为6.5下水解100分钟， 加酶量为53140U/g蛋白， 水解完后。
14、在沸 水浴中灭酶20分钟， 然后在温度为53的环境中用Alcalase碱性蛋白酶在pH值为7.6下酶 解90分钟， 加酶量为1130U/g蛋白， 酶解完后在沸水浴中灭酶20分钟， 酶解过程用0.5mol/L NaOH水溶液调节pH值； 10000转/分钟离心分离20分钟， 所得上清液在-40冷冻干燥24小 时， 得到扁杏仁总肽。 0024 3、 葡聚糖凝胶层析 0025 将2.06g扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为40g:1L混合， 脱气、 超滤膜过滤后加 入Sephadex G-15填充柱中， 以超纯水为流动相， 采用自动液相色谱分离层析仪(上海沪西 分析仪器厂提供)在检测波长为280nm、。
15、 进样量为2mL、 流速为3mL/分钟下进行分离， 收集19 40分钟所有流出成分， 如此反复试验， 合并流出组分， 在-40冷冻干燥24小时， 得到产品 共0.76g。 0026 4、 反相制备色谱分离 0027 将步骤3葡聚糖凝胶层析中得到的0.76g产品与超纯水按质量体积比为50g:1L混 合， 用超滤膜过滤， 超声脱气20分钟后， 注射入岛津LC-10A制备色谱系统， 色谱柱为大连伊 利特Sinochrom ODS-BP， 检测波长220nm， 进样量1mL， 流速12mL/min， 洗脱相A为乙腈， 洗脱 相B为超纯水(含0.05wt.三氟乙酸)， 梯度洗脱程序： 010分钟， 20。
16、(体积浓度)乙腈； 10 30分钟， 2040(体积浓度)乙腈； 3040分钟， 4070(体积浓度)乙腈； 收集 8.529.14分钟和14.8715.26分钟流出的两种成分， 在-40冷冻干燥24小时， 得到 114mg肽A和12mg肽B， 经HPLC检测证明两种肽均为纯品， 经PPSQ-31A蛋白质自动检测仪检 测， 肽A的氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp， 肽B的氨基酸序列为Gln-His-Thr-Asp-Asp。 0028 发明人对实施例1得到的肽A和肽B分别进行体外和细胞实验， 具体实验情况如下： 0029 1、 体外ACE抑制活性 0030 在37下， ACE可。
17、以与马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)相互作用， 将其降解为马尿酸 说明书 2/6 页 4 CN 105131083 B 4 (HA)， 即同等条件下， 一个物质如果使得ACE-HHL体系中转化出的HA越少， 其ACE抑制性越 强， 即HA峰面积越小， 物质的ACE抑制性越强。 0031 将肽A和肽B分别用pH值为8.3的硼酸缓冲液配制成5 g/mL、 10 g/mL、 50 g/mL、 100 g/mL、 150 g/mL 5个浓度， 作为样品溶液。 向2mL离心管中加入120 L5mmol/L HHL和40 L样 品溶液， 于37水浴恒温6min， 加入100 L0.1U/mL的ACE溶液(。
18、用pH值为8.3的硼酸缓冲液配 制)， 于恒温磁力搅拌器中37恒温4000r/min搅拌反应60min， 加入160 L 1.0mol/L HCl水 溶液反应10min， 终止反应后用超滤膜过滤， 滤液用Waters1525高效液相色谱仪测定HA， 色 谱条件： Waters PDA 2996二极管阵列检测器； 美国安捷伦Agilent 300Stable-bond C18大 孔色谱柱； 进样量20 L； 流速1mL/min； 检测波长228nm； 流动相A为乙腈， 流动相B为超纯水， 两者均含0.05TFA； 梯度洗脱程序： 040min， 1045乙腈。 同时pH值为8.3的硼酸缓 冲液做。
19、空白对照试验。 每个实验平行测定3次取平均值。 用SPSS Statistics进行统计， 分别 拟合肽A和肽B抑制曲线， 计算IC50值， 试验结果见表1。 0032 表1肽A和肽B的ACE抑制活性结果 0033 0034 由表1可见， 肽A的IC5067.520.05 g/mL， 肽B的IC5043.180.07 g/mL， 说明 肽A和肽B具有较好的ACE抑制活性。 0035 2、 人脐静脉内皮细胞活性试验 0036 取对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)， 用PBS缓冲液冲洗， 弃去PBS缓冲液， 用胰酶溶液消化细胞， 制成1104/mL或1105/mL的细胞悬液。 平行分为11。
20、组， 具体分组如 下： 0037 (1)空白对照组； 0038 (2)肽A低剂量组： 加入肽A浓度为150 g/mL； 0039 (3)肽A中剂量组： 加入肽A终浓度为300 g/mL； 0040 (4)肽A高剂量组： 加入肽A肽终浓度为600 g/mL； 0041 (5)肽B低剂量组： 加入肽B终浓度为150 g/mL； 0042 (6)肽B中剂量组： 加入肽B终浓度为300 g/mL； 0043 (7)肽B高剂量组： 加入肽B终浓度为600 g/mL； 0044 (8)卡托普利(Cap)组： Cap浓度为10-5mol/L； 0045 (9)去甲肾上腺素(NE)组： 加入NE终浓度为100。
21、 g/L； 0046 (10)肽A+NE： 加入肽A与NE， 肽A浓度为300 g/mL、 NE浓度为100 g/mL； 0047 (11)肽B+NE： 加入肽B与NE， 肽A浓度为300 g/mL、 NE浓度为100 g/mL。 0048 MTT实验 0049 将1104/mL细胞悬液， 每孔100 L接种于96孔板， 于37、 5CO2培养箱中静置培 养。 待细胞贴壁后， 空白对照组加入100 L高糖DMEM培养液； 试验组(2)-(11)按分组要求分 说明书 3/6 页 5 CN 105131083 B 5 别加入同体积的不同干预因素。 每组设6个复孔， 放入37、 5CO2条件下分别培。
22、养24、 48和 72h。 培养结束后， 每孔加入10 L的MTT溶液， 继续孵育4h， 终止培养， 吸弃培养液。 每孔加入 100 L的DMSO， 震荡10min， 使结晶物质充分溶解。 用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其 吸光度(A)值， 并计算细胞增值率， 结果见表2。 0050 表2MTT比色法试验结果 0051 0052 注： 表中数据为细胞增殖率， 根据公式细胞增殖率试验组ODA490值/对照组ODA490 100计算得到； *表示与空白对照组比较P0.05， *表示与空白对照组比较p0.01。 0053 由表2可见， 较之空白对照组， NE对HUVEC增殖有明显的促进作用，。
23、 而Cap及不同剂 量的肽A、 肽B对HUVEC均有抑制生长作用， 其中Cap和高剂量肽A和肽B对HUVEC增殖有极显著 的抑制作用(p0.01)， 同时肽A和肽B对NE均具有一定拮抗作用。 0054 (2)HUVEC培养液中一氧化氮(NO)和内皮素(ET)含量测定 0055 将1105/mL细胞悬液， 每孔100 L接种于96孔板， 于37、 5CO2培养箱中静置培 养， 待细胞贴壁后， 按分组要求分别加入不同干预因素， 分别继续培养10、 24和48h， 收集培 养上清液， 按试剂盒说明书测定NO、 ET含量， 结果见表3和表4。 0056表3细胞培养液中NO含量( M)测定结果(n6) 。
24、说明书 4/6 页 6 CN 105131083 B 6 0057 0058 注： *表示与空白对照组比较P0.05， *表示与空白对照组比较p0.01。 0059表4细胞培养液中ET含量(pg/mL)测定结果(n6) 0060 0061 注： *表示与空白对照组比较P0.05， *表示与空白对照组比较p0.01。 0062 由表3、 表4可见， 与空白对照组比较， 卡托普利及不同剂量的肽A、 肽B均可升高 HUVEC培养液中NO含量， 而且随着培养时间的延长， NO量显著增加。 而卡托普利及不同剂量 说明书 5/6 页 7 CN 105131083 B 7 的肽A、 肽B对HUVEC培养液中。
25、ET的含量， 均有显著的降低作用。 0063 实验结果还显示， 去甲肾上腺素(NE组)可显著地降低HUVEC培养液中NO含量， 促进 ET分泌； 中剂量肽A、 肽B和去甲肾上腺素合用， 可使培养液中NO含量和ET值接近空白对照 组， 说明肽A、 肽B对去甲肾上腺素具有显著的拮抗作用。 0064 综合上述实验结果可见， 本发明所提供的氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp和 Gln-His-Thr-Asp-Asp的两种扁杏仁肽均具有较高的ACE抑制活性和对人脐静脉内皮细胞 功能的保护作用， 因而具有降压作用， 可以作为降压药物开发使用。 说明书 6/6 页 8 CN 105131083 B 8 0001 序列表 1/1 页 9 CN 105131083 B 9 。