技术领域
本发明涉及来自真核生物细胞器的电子传递链(electron transport chain,ETC)模块，以及该ETC模块在生物固氮中的应用。
发明背景
氮是农业中限制农作物生长及产量的主要营养物之一[1]。工业氮肥的使用可以解除这种限制，为农作物生长提供充足的氮源。但是工业氮肥的大量使用会导致环境问题，并且使用的氮肥经济成本也比较高，这些问题在发展中国家尤其显著[2-3]。这些因素使得研究人员将注意力重新放到了通过工程化手段在作物中重构生物固氮酶系统，以实现农作物自己固氮，以解决氮肥使用的问题。生物固氮(Biological Nitrogen Fixation，BNF)，是通过固氮菌中的固氮酶将气态氮转化成氨的过程，这一过程贡献了大气氮循环中60％以上的氮素[4]。固氮酶由两种可分离的组分(固氮酶还原酶(Fe蛋白)和固氮酶(XFe蛋白，其中X为Mo，V或Fe，取决于活性位点辅因子的金属原子组成))组成的金属酶家族(参见图1)[5-6]。所有三种固氮酶催化N2还原的过程可归纳为以下方程：N2+(6+2n)H++(6+2n)e-→2NH3+nH2(n≥1)[7-9]。在这个过程中，电子首先转移到Fe蛋白，其继而将电子传递给XFe蛋白，并伴随着每传递一个电子水解两分子的ATP[10-11]。虽然在所有固氮酶系统中Fe蛋白均是XFe蛋白的特有的电子供体，但是Fe蛋白的在固氮菌内的电子供体并不保守[9]。对Fe蛋白的直接电子供体是还原的黄素氧还蛋白(Flavodoxin)或铁氧化还原蛋白(Ferredoxin)，这主要取决于固氮生物宿主的生理性能[13-17]。
已有研究表明叶绿体，白体或线粒体可以作为在真核生物中导入固氮酶系统的理想场所[18-20]。这些负责能量转换的细胞器可以具有为固氮过程提供所需的还原能力和ATP的潜力。在这些细胞器中，不同的氧化还原反应过程依赖于不同的电子传递链(ETC)[21]。现有研究已将证实，植物细胞中往往包含着多个拷贝的铁氧还原蛋白(Ferredoxin)，包括在叶绿体或白体中表达的光合作用相关或非光合作用相关的Ferredoxin；以及位于线粒体中的与Ferredoxin类似的皮质铁氧还蛋白(mitochondria Ferredoxin-like adrenodoxins，MFD)[21-22]。叶绿体中表达的光合作用相关的Ferredoxin蛋白的主要功能是介导电子从光系统I(PSI)转移Ferredoxin-NADPH氧化还原酶(Leaf-type FNR，LFNR)以催化的NADPH的生成[23]。此外，光合作用相关的Ferredoxin蛋白还负责将来自于光合过程中的还原能力分配给参与氮和硫同化蛋白[24]。白体中的FNR(Root-type FNR,RFNR)与Ferredoxin之间的电子传递与叶绿体中电子传递方向相反，在氧化戊糖磷酸途径(OxPPP)中产生的NADPH通过RFNR将电子传递给Ferredoxin蛋白，以还原Ferredoxin蛋白[25]。在线粒体中，MFD介导电子由NADPH通过皮质铁氧还原蛋白氧化还原酶(NADPH-dependent adrenodoxin oxidoreductase MFDR)进而传递给半胱氨酸脱硫酶Nfs1，从而参与生物素的生物合成[26]。
前期研究中，我们已经在大肠杆菌中成功地构建了来自产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca，Ko)的重组MoFe[27]固氮酶系统以及来自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii，Av)的“最简化”FeFe[28]固氮酶系统(图1)。在本发明中，我们从合成生物学以及系统生物学的角度，将这两个固氮酶系统为三个功能性的模块：电子传递链(ETC)模块，金属原子簇合成模块和“核心”酶模块(图1)。继而，我们以大肠杆菌为“底盘”研究了来自与植物质体和线粒体的ETC模块能否为固氮酶“核心”酶模块(包括MoFe或FeFe固氮酶系统)提供氮素还原所需的还原力。研究结果显示来自叶绿体和白体的纯合ETC模块，或来自于质体或线粒体的杂合ETC模块，可以在功能上支持固氮酶活性。因此，我们的研究解决了在不同植物细胞器工程化重构固氮酶系统时所电子传递链模块选择的问题。
发明内容
生物固氮是一个复杂的、涉及诸多基因参与的系统，同时，也是一个需要大量的ATP以及还原能力的过程。因此，固氮酶系统的基因过多、特定的宿主环境中可被固氮酶系统利用的能量、以及还原能力是在农作物中重构固氮酶系统需要面临的主要瓶颈问题。近期研究中曾尝试减少MoFe固氮酶[29]以及FeFe固氮酶[28]所需的结构基因的数量来简化固氮酶系统，然而发现当结构基因的数目减少至9个时，MoFe固氮酶[29]活性急剧下降，当部分基因被回补到系统中时固氮酶活性又可以恢复到较高水平[30]，这些结果表明了简化固氮酶系统，同时不损失固氮酶效率的困难性。
在本发明中，我们首次引入和合成生物学和系统生物学模块化的理念，将固氮酶系统分为三个功能独立的模块：电子传递链(ETC)模块，金属原子簇合成模块和固氮酶“核心”酶模块。并进一步研究了来自于植物叶绿体、白体或线粒体的电子传递组件，包括铁氧还原蛋白(Ferredoxin)或Ferredoxin-NADPH氧化还原酶(FNR)能否分别替换ETC模块中的NifF或NifJ蛋白，为MoFe和FeFe固氮酶系统提供电子。在本研究中，我们利用模式生物大肠杆菌为“底盘”，研究了FeFe/MoFe固氮酶系统“核心”酶模块和来自于植物细胞器如叶绿体，白体和线粒体中ETC模块之间的相容性。
在本发明中，重组生成了NifJ或/和NifF蛋白被替换后的新的ETC模块，并利用乙炔还原法和15N2同化测定法测定了植物来源的ETC模块是否可以替代ETC模块中的NifJ或NifF蛋白为FeFe/MoFe固氮酶系统“核心”酶模块提供电子以支持固氮酶的活性。其中所述的“替代”方式包括：NifF蛋白被来源于植物细胞器的Ferredoxin蛋白替换，或NifJ蛋白被来源于植物细胞器的FNR蛋白替换，或者上述两种替换同时进行。其中当NifJ或NifF蛋白中的一种被替换时所形成的ETC模块称为杂合模块，当分别被植物细胞器的Ferredoxin蛋白和FNR蛋白同时替换时所形成的ETC模块称为纯合模块。更为具体地，其中所述的杂合ETC模块由来自于各种代表性植物的叶绿体、白体或线粒体的Ferredoxin替换NifJ-NifF模块中的NifF形成，或者由植物型FNR与鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120，As)FdxH或FdxB组成的杂合ETC模块构成。其中所述的纯合ETC模块是用编码Ferredoxin-NADPH氧化还原酶(FNR)及其来自靶植物细胞器的铁氧还原蛋白(Ferredoxin)分别替换了存在于固氮菌ETC模块中的NifJ和NifF蛋白所形成的植物来源ETC模块。
本发明的研究结果表明：所有植物来源的Ferredoxin(除了来自线粒体的Ferredoxin)均可以功能性地替代FeFe和MoFe固氮酶的NifF，这意味着这些Ferredoxin和NifH/AnfH之间的相互作用能够满足电子传递的需求；来自于各种植物的叶绿体和白体的纯合ETC模块(FNR-Ferredoxin)可以支持固氮酶的活性，这意味着植物质体中工程化重构固氮系统不需要额外携带ETC模块；由线粒体MFDR和鱼腥藻FdxH/FdxB形成的杂交模块可以支持固氮酶活性；并且经过对上述替代组件的来源进行分析，可以得出叶绿体来源的ETC模块能够在大肠杆菌中为固氮酶系统提供最合适的电子供给。
因此，基于上述可替代的ETC模块的技术方案，有利于未来我们将源于植物细胞器的内源性ETC用于生物固氮的过程中，由此避免在植物细胞中工程化重构生物固氮酶系统过程中由于固氮酶结构基因数量过多、还原能力以及能量需求高所带来的技术障碍。
更为具体地，本发明具体涉及以下方面的内容：
本发明的一方面涉及用于固氮系统的电子传递链(ETC)模块，其含有NifJ和NifF蛋白。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的固氮系统为MoFe固氮酶系统和FeFe固氮酶系统。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的NifJ和NifF蛋白由来自于真核生物细胞器的相应蛋白所分别取代或同时取代，并形成杂合的或纯和的ETC模块。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的真核生物为植物，所述细胞器为质体或线粒体。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的杂合ETC模块是将ETC模块中的NifF蛋白替换为来自于植物质体的铁氧化还原蛋白(Ferredoxin)形成。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的质体为叶绿体或白体，优选为叶绿体。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的杂合ETC模块是将NifJ和NifF组成的ETC模块中的NifJ蛋白替换为来自植物质体和线粒体的植物型的Ferredoxin-NADPH氧化还原酶(Ferredoxin-NADPH reductase，FNR)形成。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的质体为叶绿体或白体。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的杂合ETC模块是由来自于植物线粒体的NADPH依赖性的皮质铁氧还原蛋白氧化还原酶(NADPH-dependent adrenodoxin oxidoreductase，MFDR)与鱼腥藻FdxB构成。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的纯合ETC模块是由来自于靶植物细胞器的FNR与Ferredoxin蛋白组合构成。
上述方面所述的ETC模块，其中所述的靶植物细胞器为叶绿体或白体。前面任一项所述的ETC模块在生物固氮中的应用。
附图说明
图1：上半部分：为重组的MoFe和“最简化”FeFe固氮酶系统的模块化排列。图中的字母表示相应的nif或anfHDGK基因，例如，J代表nifJ基因。下半部分：固氮酶系统以固氮酶内部电子传递示意图，途中代表性蛋白有晶体结构图表示，其中缩写PFO(NifJ)代表丙酮酸-Ferredoxin(Flavodoxin)氧化还原酶；缩写FNR代表Ferredoxin-NADPH氧化还原酶；缩写NifF代表黄素氧还蛋白；缩写FdxN代表2[4Fe-4S]型铁氧还原蛋白；缩写FdxH代表[2Fe-2S]型铁氧还原蛋白；缩写Fe蛋白代表固氮酶还原酶；XFe蛋白中的X为Mo，V或Fe。Fe蛋白和XFe蛋白的辅因子显示为球-棒模型。Fe原子以铁锈色表示，S以黄色表示，C以灰色表示，O以红色表示，X原子(Mo、V或Fe原子)以紫色表示。此外该图中的基因排列不代表重组的MoFe和“最简化”FeFe固氮酶系统的真正基因排列。
图2：(A)表示鱼腥藻FdxH蛋白与来自于质体的Ferredoxin的序列比对；(B)表示鱼腥藻FdxH蛋白与来自于线粒体的Ferredoxin的序列比对。其中，(A)中绿色或(B)中深红色的序列是植物型Ferredoxin的前导肽；用于结合[2Fe-2S]的半胱氨酸残基用黄色突出显示；As代表鱼腥藻PCC7120；Cr代表莱茵衣藻；At代表拟南芥；Zm代表玉米；Os代表水稻；Ta代表小麦。
图3：本发明所使用的主要载体的质粒图谱。rrnB T1为大肠杆菌终止子(BBa_B0010)。TL是大肠杆菌thrL基因终止子；T0是噬菌体λt0终止子；Ta是由chen[1]等人报道的人工终止子L3S2P21。
图4：CrPETF或CrFNR可控表达的梯度诱导试验。(A)和(B)脱水四环素(aTc)梯度诱导由PLtetO-1启动子调控的CrPETF表达；(C)和(D)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)梯度诱导由Ptac启动子调控的CrFNR表达。在该实验中，首先用200ng/mL的aTc诱导CrPETF的表达，然后用梯度浓度的IPTG诱导CrFNR的表达。图中展示的乙炔还原活性是以携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统所得活性定义为100％活性条件下得到的相对活性。FeFe，代表“最简化”FeFe固氮酶系统；MoFe代表重组的MoFe固氮酶系统。误差柱表示三次以上独立实验得到的标准偏方差。
图5：乙炔还原发分析NifJ蛋白和质体Ferredoxin组成的杂合ETC模块的替代效应。(A)杂合ETC模块和“核心”酶模块之间的电子传递途径示意图。NifJ-NifF模块被包含NifJ与叶绿体Ferredoxin(B和C)、NifJ与白体Ferredoxin(D和E)、NifJ与线粒体Ferredoxin(F和G)的杂合ETC模块所替代。没有添加诱导剂的携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统的活性定义为100％。FeFe，代表“最简化”FeFe固氮酶系统；MoFe代表重组的MoFe固氮酶系统。As代表鱼腥藻PCC 7120；Cr代表莱茵衣藻；At代表拟南芥；Zm代表玉米；Os代表水稻；Ta代表小麦。误差柱表示三次以上独立实验得到的标准偏方差。
图6：乙炔还原法分析携带GroESL编码基因的高拷贝质粒与具有NifJ-AtMFD1或NifJ-AtMFD2杂合模块共转染后的MoFe或FeFe固氮酶活性。没有添加诱导剂的携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统的活性定义为100％。FeFe，代表“最简化”FeFe氮酶系统；MoFe代表重组的MoFe固氮酶系统。At代表拟南芥。误差柱表示三次以上独立实验得到的标准偏方差。
图7：乙炔还原法分析由KoNifF或AsFdxB与来自不同植物细胞器的FNR所组成的杂合ETC模块的替代效应。NifJ-NifF模块由植物型FNR与KoNifF(A和B)或AsFdxB(C和D)组成的杂合模块替代。没有添加诱导剂的携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统所获得的乙炔还原活性定义为100％。FeFe，代表“简化”FeFe氮酶系统；MoFe代表重组的MoFe固氮酶系统。Ko代表产酸克雷伯氏菌；As代表鱼腥藻PCC 7120；Cr代表莱茵衣藻；At代表拟南芥；Zm代表玉米。误差柱表示三次以上独立实验得到的标准偏方差。
图8：乙炔还原法分析由植物FNRs和AsFdxH形成的杂合模块的替代效应。(A)杂合ETC模块和“核心”酶模块之间的电子传递途径示意图。NifJ-NifF模块替换为由植物FNR和AsFdxH(B和C)组成的杂合模块。没有添加诱导剂的携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统获得的活性定义为100％。FeFe，代表“最简化”FeFe固氮酶系统；MoFe代表重组的MoFe固氮酶系统。As，鱼腥藻PCC 7120；Cr，莱茵衣藻；At，拟南芥；Zm，玉米。误差柱表示三次以上独立实验得到的标准偏方差。
图9：乙炔还原测定法和15N同化检测法分析叶绿体和白体的纯合ETC模块的替代效应。(A)示意图表示来自植物细胞器的纯合ETC模块和“核心”酶模块之间的电子传递途径。没有添加诱导剂的携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统获得的活性以100％表示。FeFe，代表“最小”FeFe固氮酶系统；MoFe代表重组的MoFe固氮酶系统。As，鱼腥藻PCC7120；Cr，莱茵衣藻；At，拟南芥；Zm，玉米。乙炔还原法的误差柱表示三次以上独立实验得到的标准偏方差。15N同化法的误差柱表示两次独立实验得到的标准偏方差。
图10：纯合ETC模块的单一组分不足以支持FeFe(A)或MoFe(B)固氮酶系统的活性。没有添加诱导剂的携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统获得的乙炔还原活性定义为100％。FeFe，代表“最简化”FeFe固氮酶系统；MoFe代表重组的MoFe固氮酶系统。As，鱼腥藻PCC 7120；Cr，莱茵衣藻；At，拟南芥；Zm，玉米。误差柱表示三次以上独立实验得到的标准偏方差。
实施例
材料和方法
实施例中使用的细菌菌株以及质粒参见表1
表1实施例中使用的细菌菌株以及质粒
细菌菌株的培养和生长培养基
用于大肠杆菌生长的Luria-Bertani(LB)培养基包含10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/L NaCl。本研究中使用的KPM限制性培养基包含10.4g/L Na2HPO4，3.4g/L KH2PO4，26mg/L CaCl2·2H2O，30mg/L MgSO4，0.3mg/L MnSO4，36mg/柠檬酸铁，10mg/L对氨基苯甲酸，5mg/L生物素，1mg/L维生素B1和0.8％(w/v)葡萄糖，20mM铵盐(KPM-HN)或10mM谷氨酸KPM-LN)作为氮源。终浓度为0.05％的酪蛋白水解氨基酸(购自于BD Biosciences，223050)加入到KPM基本培养基中以确保正常生长。抗生素使用浓度如下：氨苄青霉素为50μg/mL，氯霉素为25μg/mL。
重组质粒的构建
质粒pKU7815和pKU7017是pACYC184衍生物质粒分别携带“最简化”FeFe[28]或重组MoFe[27]固氮酶系统。pKU7815和pKU7017的nifF和nifJ双缺失衍生质粒，在实施例中命名为pKU7830和pKU7831，其是通过使用每个操纵子两侧预留的特异性限制性位点(用于nifF的预留酶切位点为SwaI和用于nifJ的ScaI预留酶切位点为)直接去切除nifF和nifJ操纵子得到的。pKU7830和pKU7831的互补质粒是携带nifF和nifJ基因的pBR322M衍生质粒(pKU7832)。以pBR322M质粒作为骨架，通过使用Gibson Assemble试剂盒(NEB，E5520S)直接将tetR表达盒和PLtetO-1启动子区域直接重组到该质粒，从而得到pBR322M-PLtetO-1质粒。tetR表达盒包含一个组成型强启动子(BBa_J23100，https://parts.igem.org)，中等强度的核糖体结合位点(RBS，BBa_B0032，https://parts.igem.org)和自大肠杆菌的thrL基因的终止子。类似地，以pBR322M质粒作为骨架，通过直接将lacI表达盒和携带弱RBS的Ptac启动子重组到该质粒，从而得到pBR322M-Ptac质粒。一个对lac操纵子具有更高亲和力的LacI突变体LacIWF[31]被用于构建pBR322M-Ptac质粒，以降低植物型FNR的渗漏表达(leakage expression)。用来自质粒pBR322M-PLtetO-1的SwaI酶切片段[tetR-PLtetO-1]片段替换pKU7832中的nifF基因，得到质粒pKU7833。为了构建用于表达由NifJ和植物型Ferredoxin组成的杂交模块的质粒，通过使用NdeI/SpeI限制性位点将原始的Ferredoxin基因序列或化学合成Ferredoxin基因序列克隆到pKU7833质粒的PLtetO-1启动子的下游。为了便于检测不同铁氧还原蛋白的表达水平，编码组氨酸标签的序列添加到如图2中各个合成的铁氧还原蛋白序列，以灰色阴影表示。用来自质粒pBR322M-Ptac的ScaI酶切片段[lacI-Ptac]片段替换pKU7832中的nifJ基因，得到质粒pKU7846。为了构建表达由植物型FNR和NifF组成的杂交模块的质粒，用NdeI/SpeI限制性位点将原始FNR基因序列或化学合成的FNR基因序列克隆到pKU7846质粒的Ptac启动子的下游。用来自pKU7834的ScaI酶切片段[PLtetO-1-AsfdxH]片段来替换质粒pKU7847中的nifF基因，从而构建携带Ptac-AspetHori/PLtetO-1-AsfdxHori的pKU7853质粒。类似的方法还用于构建pKU7854～pKU7857和pKU7859～pKU7865。从大肠杆菌的基因组PCR扩增两侧携带XbaI/SpeI限制性位点的包含其原始启动子的groES PCR产物，并直接平端连接到pEASY-Blunt载体(TransGene，CB101)得到pKU7845质粒。质粒图参见图3。以上构建质粒在进一步实验前均通过测序以确定序列的正确性。
乙炔还原测定法
如文献[32]所述，使用C2H2还原法测定固氮酶活性。为了测定重组的大肠杆菌JM109菌株的固氮酶活性，细菌首先在KPM-HN培养基中生长过夜。然后将细胞稀释到20mL密封管中的2mL KPM-LN培养基中，最终OD 600为约0.3。为了得到最优的Ferredoxin和FNR回补效果，加入200ng/mL脱水四环素(aTc)或200μM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导Ferredoxin或FNR的表达，结果分别如图4所示。反复抽空管中的空气并用氩气冲洗3次。在30℃下静置培养6～8h后，加入2mL C2H2。约16h后，使用Shimadzu GC-2014气相色谱仪检测活性。所呈现的数据是均是基于至少三次重复的平均值。
15N2同化测定法
检测15N2同化活性，首先按照乙炔还原测定法中所描述的方法制备重组的大肠杆菌JM109菌株。反复抽空管中的空气并用氮气冲洗3次。最后从管中抽取3mL气体，同时注入2mL 15N2气体(99％+，上海稳定同位素工程研究中心)。在30℃下孵育48小时后，收集培养物，并冷冻干燥，研磨，称重并密封在锡胶囊中。同位素比率表示为δ15N，其值是同位素比率15N/ 14N的线性变换，表示样品中和大气N2中同位素比率之间的千分之一的差异[33]。所呈现的数据均是基于至少两个重复的平均值。
实施例1：由NifJ蛋白和质体Ferredoxin组成的杂合ETC模块可以在功能上支持固氮酶活性。
已知在大多数植物的不同细胞器具有多个拷贝的Ferredoxin蛋白[21]。通过初步的序列分析，我们发现来自植物叶绿体和白体的Ferredoxin蛋白与来自于鱼腥藻PCC 7120(As)的fdxH基因产物呈高度序列一致性，其中fdxH基因产物是蓝细菌中固氮酶的主要电子供体[34]。为了研究由NifJ蛋白和质体Ferredoxin形成的杂合ETC模块是否可以支持大肠杆菌中的固氮酶活性，分别选择来自衣藻(Chlamydomonas reinhardtii，Cr)，拟南芥(Arabidopsis thaliana，At)，玉米(Zea mays，Zm)，水稻(Oryza sativa，Os)和小麦(Triticum aestivum，Ta)的几种代表性质体Ferredoxin的编码序列用于进一步研究。所选取的代表性Ferredoxin编码基因根据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，优化后的基因序列参见序列表，并由诱导型PLteto-1启动子启动表达。将来自As的fdxH基因作为对照以验证诱导系统的有效性。
由来自于NifJ-NifF模块的NifF编码的黄素氧还蛋白被上述构建的杂合模块取代，并且通过乙炔还原的方法分析重组的MoFe或FeFe系统的活性[27-28]。结果表明，所有杂合的ETC模块均可以恢复MoFe和FeFe系统的固氮酶活性，并具有不同的恢复活性。当用来自As(FdxH)，Cr(PETF)或Os(FD1)的铁氧还原蛋白分别替代NifF时，观察到FeFe固氮酶系统的值大于100％(参见图5和表2)。该结果表明，杂合的“最简化”FeFe固氮酶[28]中AvAnfH蛋白可能更倾向于Ferredoxin而不是Flavodoxin作为电子供体。除了NifJ-AtFD2杂合模块，所有叶绿体Ferredoxin衍生的杂交模块均可以恢复FeFe固氮酶系统的约100％的活性，NifJ-AtFD2杂交模块展现出约76％的活性(图5B)。NifJ-CrPETF和NifJ-TaFD杂合模块可以恢复MoFe固氮酶系统90％以上的活性。NifJ-AtFD2，NifJ-ZmFDI和NifJ-OsFD1杂合模块展现出低于70％活性(图5C)。当与来自相同生物体的叶绿体Ferredoxin衍生的杂合ETC模块相比时，所有白体Ferredoxin衍生的杂合模块显示较低的固氮酶活性(图5B-5E)。
表2.用来自不同植物质体的Ferredoxin分别替代NifF后FeFe或MoFe固氮酶系统的活性
a携带NifJ-NifF模块的FeFe或MoFe固氮酶系统的活性以100％表示。所呈现的数据是均基于至少三次独立实验的平均值。
线粒体是植物固氮酶的另一个潜在位置，因此我们在大肠杆菌中进一步研究了线粒体Ferredoxin支持固氮的能力。按照本节前面部分所述的相同策略克隆线粒体Ferredoxin编码基因。当线粒体Ferredoxin衍生的杂合ETC模块(NifJ-AtMFD1或NifJ-AtMFD2)被导入到大肠杆菌时，没有观察到固氮酶活性的恢复(图5F和5G)。进一步地，为了排除GroESL蛋白质对线粒体Ferredoxin在大肠杆菌中正确和有效折叠的影响，如Picciocchi等人所述[26]，将携带GroESL编码基因的高拷贝质粒与具有NifJ-AtMFD1或NifJ-AtMFD2杂合模块的MoFe或FeFe核酸酶系统共转化，最后仍获得了类似的阴性结果(图6)。同时，系统发育分析也表明线粒体Ferredoxin没有与固氮酶的任何电子供体存在相近的进化关系。总体而言，这些结果表明线粒体Ferredoxin不能与NifJ蛋白配对以形成能够为固氮酶系统的提供电子的功能性ETC模块。
实施例2：植物型FNR分别与KoNifF，AsFdxH和AsFdxB组成的杂合ETC模块对固氮酶系统的电子供应研究
在植物中已经鉴定出了三种位于不同细胞器的FNR蛋白。所有这些FNR均起到介导Ferredoxin和NADPH之间的电子转移的作用[23,25,26]。为了研究由植物型FNR和固氮酶的电子供体(KoNifF，AsFdxH和AsFdxB)所组成的杂合ETC模块是否可以介导电子传递给固氮酶，选择了来自Cr，Zm的叶绿体或白体的FNR编码序列、或来自At线粒体的MFDR来进行试验。将这些杂合模块转化到大肠杆菌中，并用乙炔还原法测定它们的活性。结果表明：由植物FNR和NifF组成的杂合ETC模块均不能恢复MoFe或FeFe固氮酶系统的乙炔还原活性；AsFdxB与仅能与来自线粒体的MFDR偶联时可以形成功能性ETC模块以支持MoFe和FeFe固氮酶活性(图7)；植物FNR和AsFdxH形成的杂合模块均可以恢复MoFe和FeFe固氮酶系统的固氮酶活性(图8)。
实施例3：来自叶绿体和白体的纯合ETC模块支持固氮酶活性
在验证了述杂合模块作为固氮酶系统的电子供应功能之后，进一步研究由来自植物细胞器的FNR和对应的Ferredoxin所组成的纯合ETC模块是否能够支持固氮酶活性。通过组合Ptac控制的FNR和PLtetO-1控制的Ferredoxin(技术细节在“材料和方法”部分提供)，我们构建两个纯合的叶绿体ETC模块(CrFNR-PETF，ZmLFNR-FDI)，一个纯合的白体ETC模块(ZmRFNR-FDIII)，以及一个纯合的线粒体ETC模块(AtMFDR-MFD)。由于已知AsPetH-FdxH模块可以支持其原始宿主中的固氮作用，因此该模块被用作对照。
当这些纯合的ETC模块分别用于代替MoFe或“最简化”FeFe固氮酶系统中的NifJ-NifF模块时，分别用乙炔还原和15N同化方法测定其支持固氮酶活性的能力。结果表明，除了来自线粒体的AtMFDR-MFD模块，所有其他ETC模块均可以支持MoFe和FeFe固氮酶的乙炔还原活性和15N同化活性(图9)；当来自每个模块的两个组分中的任一个被单独表达时，没有观察到活性的恢复(图10)，这表明对于植物纯合ETC模块的功能而言两个组分是必须同时存在的。
对于FeFe固氮酶系统，叶绿体模块CrFNR-PETF和ZmLFNR-FDI与AsPetH/FdxH一样能偶恢复约45％乙炔还原活性和恢复高于30％15N同化活性(图5B和D)。MoFe固氮酶系统获得了相似的结果，叶绿体模块CrFNR-PETF和ZmLFNR-FDI与AsPetH/FdxH模块都各自恢复了约46％15N同化活性(图9E)。来自白体的ZmRFNR-FDIII模块相比于来自相同生物体的叶绿体模块而言，仅能恢复较低的MoFe和FeFe固氮酶的活性(图9B，C，D和E)。与MoFe酶系统中的NifJ-NifF缺陷型的阴性对照(6％15N同化活性)相比，携带AtMFDR-MFD模块的MoFe固氮酶系统能够观察到微弱增加的活性(11％15N同化活性)(图9E)。但是这种表型没有在FeFe固氮酶系统中观察到(图9D)。由于大肠杆菌中存在多拷贝的Ferredoxin，我们认为携带AtMFDR-MFD模块的MoFe固氮酶系统的活性增强可能归由于AtMFDR和来自大肠杆菌的Ferredoxin形成的杂和ETC模块。对于FeFe 固氮酶系统，由于其高背景活性，这种效应可能被掩盖在高背景活性所掩盖(图9D)。
总之，上述结果表明，来自质体(包括叶绿体和白体)、而非线粒体的纯合ETC模块，能够为固氮酶系统提供还原氮气所需的电子和还原力。
参考文献
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SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
王忆平
<120> 来自真核生物细胞器的电子传递链模块及其应用
<130> C16P9855
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<170> PatentIn version 3.5
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tctagctgtg taggcaaagt tgttgaaggt gaagttgacc aatctgatca aatcttctta 240
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tgcacaatta agacccacca agaaccgtac cttgcttaat ttaaatacta gt 352
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ttgatcaacg aagctgaagg aacaaagcat gaaattgaag ttcctgatga tgagtatatt 120
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcgctaccta caaagtcaaa 60
ttcattacgc cggaaggtga actggaagtg gaatgcgatg acgatgtgta tgttctggat 120
gcagctgaag aagcgggcat cgatctgccg tacagctgtc gcgcgggttc ttgcagctct 180
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcgcgaacag cggtggcgcg 60
accatgagcg cggtgtacaa ggttaaactg ctgggtccgg acggccagga agatgagttc 120
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcgcgaccta taacgtgaaa 60
ctgattaccc cggagggtga agtggagctg caagtgccgg acgatgtgta catcctggac 120
caagcggaag aggacggtat tgatctgccg tacagctgcc gtgcgggtag ctgtagcagc 180
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcgcgaccta caacgttaag 60
ctgatcaccc cggaaggtga ggttgaactg caagtgccgg acgatgttta tatcctggat 120
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcgcggtgta taaggttaaa 60
ctggtgggtc cggagggcga agagcacgag ttcgatgcgc cggacgatgc gtacatcctg 120
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcgccaccta caatgtcaaa 60
ctgatcacgc cggatggcga agttgaactg caagtgccgg acgatgtgta tattctggat 120
caagcagaag aagaaggcat cgatctgccg tatagttgcc gtgcaggcag ctgtagcagc 180
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcgcgaccgc ggtgcacaag 60
gttaaactga tcggtccgga cggcgtggaa cacgagttcg aagcgccgga ggatacctac 120
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ctggtgaccc cggagggcga agtggagctg gaagttccgg acgatgtgta catcctggat 120
caggcggaag aggaaggtat tgacctgccg tacagctgcc gtgctggtag ctgtagcagc 180
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcatgatcgg tcaccgtatt 60
agccgtctgg gcagcaccat cgtgaaacag ctggcgcgtg agggttacct ggcgacctat 120
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catatgggca gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcatggtgtt ccaccgtctg 60
agccgtctgg gtagccgtat cgttaaggag ctgccgcgtg aacgtcacct gagcatgtgc 120
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tgggaactgc tgaagaaaga caacacctac gtgtatatgt gcggtctgaa aggcatggag 840
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<212> DNA
<213> 人工序列
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