一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201810680236.2

申请日:

20180627

公开号:

CN108795788A

公开日:

20181113

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:

IPC分类号:

C12N1/19,C12Q1/18,C12R1/865

主分类号:

C12N1/19,C12Q1/18,C12R1/865

申请人:

江南大学

发明人:

曹春蕾,赵运英,曹正锋,余培斌,毛银

地址:

214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号

优先权:

CN201810680236A

专利代理机构:

苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙)

代理人:

杨慧林

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内容摘要

本发明公开了一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用,属于生物医药技术领域。本发明通过96孔板液体培养的方法,对文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进行筛选,并且在添加5μg/mL酮康唑的YPD固体培养基上进行进一步倍比稀释验证,确定和野生型相比,gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对5μg/mL酮康唑具有抗性,进而对它们抗氧化活性进行了测定。从本发明四个酿酒酵母缺失的基因作为研究基础出发,进行酮康唑的生产改良以及其他抗真菌新药物的研发,同时,也可找出其他致病真菌中和这四个基因同源的基因,得到单基因缺失株,用以验证酮康唑及其他新开发的抗真菌药物的临床效果。

权利要求书

1.一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母,其特征在于,所述酿酒酵母缺失了核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的GIP2基因、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的RNR1基因、核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的RML2基因或核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的MTF2基因中的一种或多种。 2.根据权利要求1所述的酿酒酵母,其特征在于,所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母BY4743。 3.权利要求1所述的酿酒酵母在酮康唑药物生产改良中的应用。 4.权利要求1所述的酿酒酵母在抗真菌药物生产中的应用。 5.一种酿酒酵母GIP2基因在酮康唑药物改良中的应用,其特征在于,所述GIP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。 6.一种酿酒酵母RNR1基因在酮康唑药物改良中的应用,其特征在于,所述RNR1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。 7.一种酿酒酵母RML2基因在酮康唑药物改良中的应用,其特征在于,所述RML2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。 8.一种酿酒酵母MTF2基因在酮康唑药物改良中的应用,其特征在于,所述MTF2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用,属于生物医药技术领域。

背景技术

目前,全球真菌感染率呈上升趋势,尤其是深部真菌感染日渐引起关注,真菌感染成为威胁人类生活质量和生命健康的重要病因之一。与之相反,临床上能够有效治疗真菌的药物种类相对有限,并且部分药物不良反应较大。

酮康唑(Ketoconazole,KCZ),化学名为顺-1-乙酞基-4-{4-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-咪唑基-1-甲基)-1,3-二氧戊环-4-甲氧基]苯基}哌嗪,是一种咪唑类的广谱抗真菌药物。酮康唑是1976年由比利时Gannsen制药公司研究开发,是临床上第一个可供口服的抗真菌药物,对许多浅表和深部真菌感染都有较好的抗菌作用。同时,酮康唑对肝药物酶具有较强的抑制作用,因此,在临床治疗中,酮康唑已被广泛应用于真菌的抗感染治疗中。由于在临床上出色的治疗效果,1980年酮康唑被载入《美国药典》的第21版,FDA评选酮康唑为A类广谱抗真菌药,2000年被中国药典收载为抗真菌药物的新增品种。酮康唑的抗真菌作用机制是通过抑制麦角固醇的合成通路中羊毛甾醇14a-去甲基化酶,导致羊毛甾醇堆积和真菌细胞膜麦角甾醇生物合成受阻,麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分,麦角甾醇生物合成受阻从而改变细胞膜的通透性,抑制真菌生长。

然而,有研究报道酮康唑具有肝损害作用,长期服用可能会导致内分泌功能失衡,酮康唑的肝脏毒性与其主要代谢物N-乙酰酮康唑有关。并且,近些年由于不规范使用抗菌药物,甚至滥用抗菌药物等因素,部分病原菌已经逐渐对现有的抗真菌药物产生了耐药性。现市面上出售的药物已难以满足临床抗真菌感染治疗的需求,尤其是那些多重耐药菌株引起的感染,经常因为无药可用而导致患者死亡。因此,对现有抗真菌药物不断改良,并且研发新的效果更好的抗真菌药物,是目前医药行业至关重要的一项课题。

此外,活性氧(reactive oxygen species,ROS)在调控细胞过程中有非常重要的作用,例如细胞凋亡、氧化应激等,目前也是分子医学和生命科学等最前沿的研究领域之一。研究发现,如果ROS在细胞中过量积累,会对细胞内的蛋白质、核酸等生物大分子造成氧化损伤,且研究发现由ROS引起的细胞内的氧化损伤和细胞程序性死亡与心脏病、肌萎缩侧索硬化症等疾病相关联,同时,ROS在细胞衰老的过程和在癌症的发展过程中起到至关重要的作用。

由于条件致病真菌白念珠菌和酿酒酵母的基因同源性较高,抗病机制相似,但白念珠菌没有单倍体,其遗传操作不如酿酒酵母容易。因此,很多白念珠菌的基因研究,都是先从酿酒酵母基因组出发,研究酿酒酵母基因的功能,从而再研究白念珠菌中同源基因的功能。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),隶属于半知菌亚门,芽孢菌纲,隐球酵母目,隐球酵母科,酵母属,也称啤酒酵母或芽殖酵母(budding yeast),因其具有单细胞、繁殖快、有单倍体和双倍体两种状态存在等优点,被当做真核模式生物。酿酒酵母全基因组的测序完成及对其基因组和蛋白组学的研究探索,为其他真核生物尤其是高等生物及人类的基因组结构和功能的研究和探索提供了基础,尤其是为人类疾病的研究提供了模型。然而,目前酿酒酵母中哪些基因改变对抗真菌药物酮康唑具有抗性并不明确,无法有针对性的利用酿酒酵母对酮康唑药物进行改良。

发明内容

为了克服上述问题,本发明利用添加5μg/mL酮康唑的YPD培养基,对酿酒酵母基因缺失株进行大规模筛选,得到了四种对5μg/mL酮康唑具有抗性的基因缺失菌株,说明缺失该基因之后,5μg/mL酮康唑对其没有抗菌效果。因此,从这四个基因出发,用以改良酮康唑及新的抗真菌药物的研发,可以解决临床上一部分真菌抗药性的问题。

本发明的第一个目的是提供一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母,所述酿酒酵母缺失了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GIP2基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RNR1基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RML2基因或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的MTF2基因中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中,所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母BY4743。

本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母在酮康唑药物生产改良中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述的酿酒酵母在抗真菌药物生产中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种酿酒酵母GIP2基因在酮康唑药物改良中的应用,所述GIP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第五个目的是提供一种酿酒酵母RNR1基因在酮康唑药物改良中的应用,所述RNR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第六个目的是提供一种酿酒酵母RML2基因在酮康唑药物改良中的应用,所述RML2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第七个目的是提供一种酿酒酵母MTF2基因在酮康唑药物改良中的应用,所述MTF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中,是以从美国Invitrogen Inc公司购买的酿酒酵母双倍体单基因缺失菌株文库出发,对该文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进行96孔板液体培养筛选:在添加2.5μg/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时进行抗性筛选。

本发明的有益效果在于:

本发明提供的四个基因缺失菌株对临床上使用的抗真菌药物酮康唑具有抗性,因此,可从这四个酿酒酵母基因作为研究基础出发,进行酮康唑的生产改良以及其他抗真菌新药物的研发,同时,也可找出其他致病真菌中和这四个基因同源的基因,得到单基因缺失株,用以验证酮康唑及其他新开发的抗真菌药物的临床效果。

附图说明

图1为gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌在5μg/mL酮康唑的YPD固体培养基中的表型;

图2为gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌抗氧化活性测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。

在本发明中,首先采用96孔板液体筛选的方法,对文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进行筛选,在添加2.5μg/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时,和野生型相比,发现gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对酮康唑具有抗性,然后在添加5μg/mL酮康唑的YPD固体培养基上进行进一步倍比稀释验证,确定和野生型相比,gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对5μg/mL酮康唑具有抗性,进而对它们抗氧化活性进行了测定。

YPD培养基的组成:每升YPD培养基含有20g蛋白胨,20g葡萄糖和10g酵母提取物,定容后1×105Pa灭菌30min。固体培养基每升加入20g的琼脂粉。

实施例1:96孔板液体培养基初筛

1.96孔板每个孔中加入200μL YPD液体培养基,每个孔中接种活化缺失株文库中不同菌株,过夜培养菌株至饱和。

2.预先配置YPD液体培养基和YPD+2.5μg/mL酮康唑的液体培养基,分别加至两个96孔板中,每个孔加培养基180μL。

3.两个96板上相同位置分别加入20μL相同浓度的已活化的同一种缺失株菌液,同时,在每块96孔板的固定位置加入一个野生型对照,30℃过夜培养。

4.过夜培养之后的96孔板用涡旋仪轻轻混匀,用酶标仪测定每个孔的OD600数值。

5.YPD培养基培养的菌株OD600数值减去相应YPD+2.5μg/mL酮康唑培养的同一菌株的OD600数值,和野生型差值比较,差值小于-0.3以上的,视为抗性菌株。

在添加2.5μg/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时,发现gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对酮康唑具有抗性。

实施例2:倍比稀释筛选验证

1.预先在YPD固体平板上活化初筛得到的抗性菌株及野生型菌株。

2.接种已活化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中,220r/min,30℃过夜培养至饱和。

3.用无菌水十倍梯度稀释培养饱和的菌液,使每个菌株分别稀释成5×106、5×105、5×104、5×103和5×102cells/mL 5个梯度浓度。

4.分别取2μL每个菌株不同梯度的稀释菌液在预先配制好的YPD和YPD+5μg/mL酮康唑的平板上点板,最后一行加上野生型对照,30℃培养48小时。

5.观察菌落生长情况,拍照,从初筛结果中验证出真正对于酮康唑抗性的菌株。

在添加5μg/mL酮康唑的YPD固体培养基上进行进一步验证,确定和野生型相比,gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对5μg/mL酮康唑均具有抗性。

实施例3:抗性菌株细胞中ROS测定

1.预先在YPD固体平板上活化得到的抗性菌株及野生型菌株。

2.接种已活化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中,220r/min,30℃过夜培养至饱和。

3.饱和菌液以十分之一的量转接两份,其中一份加入终浓度为2μg/mL的酮康唑,两份中都加入终浓度为2μg/mL的DHE,避光培养至对数生长期。

4.3步骤培养的分别取菌液1.5mL,室温下4 000r/min收集菌体。

5.用500μL PBS缓冲液洗2次,重悬到500μL的PBS中。

6.每个菌液取200μL分别加入黑色和透明的96孔板中。

7.黑色96孔板用荧光酶标仪进行测定荧光,激发波长490nm,发射波长610nm,PMT自动,透明的96孔板用来测定OD600值。

8.每个菌株的荧光值除以OD600值,得到了其细胞内ROS含量的多少和加入酮康唑之后细胞内ROS变化。

和野生型相比,gip2、rnr1、mtf2三株菌加入酮康唑之后,细胞内的氧化损伤更加严重,而rml2加入酮康唑之后,细胞内的氧化损伤反而降低了。因此,可以推测菌株rml2的抗酮康唑机制可能和细胞内氧化损伤降低有关。基因RML2可用以研究后续由氧化损伤引起的疾病。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1647

<212> DNA

<213> (Saccharomyces cerevisae)

<400> 1

atgtatataa aggcagaaca gaaaccccaa cagtttgaga ggaagaatga aaaactagac 60

agaaataaaa accagcagct accagatctt gaaacagatt tcaagggtta cagagtgaat 120

tcggacctat acaacaaaga acgagatgga agtacggaag agactttaaa ctctttgaag 180

tttttacata aacctcagag agtaactcaa atgagagcga acaggttccc agaggaagaa 240

gtgcaaagaa acactgattt aaacaaaaga attttctccg cagggaatga tgaaaacgtt 300

gataatgaga gcggctggtc aaaaattgcc gctgccaaga atcacacttc cgtagaatca 360

ttaaatggca gtacgagacc cccattcaaa atagagctgc ctcccctttc ccccaaatcc 420

accgtaccaa aatcttttca agcagaatat cccgaagcta agtcacctgg caatgatatg 480

aattttgaat atgatgaaga aattctaatt ccatttgcgc cacctgtata taaaaagtca 540

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agtgttcact ttgatcaggc ggcacctgta aaatattttg ctgaggatga aagccctata 720

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ttaatggtgg acccggaaga agagacaaaa atgctatcat ctggattaga aacgacatcc 840

atagatgatg acttgacgac agttgcgcca aaaggcttcg cacatcctgc taaaatttcg 900

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tacagcaaga acttccccat tttaagcaac aagaatccta aaagtttaaa gctgaacatt 1140

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aacgatccct tcgcggcggc agcatga 1647

<210> 2

<211> 2667

<212> DNA

<213> (Saccharomyces cerevisae)

<400> 2

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<210> 3

<211> 1182

<212> DNA

<213> (Saccharomyces cerevisae)

<400> 3

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<210> 4

<211> 1323

<212> DNA

<213> (Saccharomyces cerevisae)

<400> 4

atgatcagaa catcatctat attaaaaaac tgtaactata gatacataca ttgcatccat 60

agatgcttgc tgaatgaagc caatttgaaa gatagaaaaa ctcacaacgt agaaagagtt 120

tcaaatgaaa agacatttga acaagctctc gaagaggaac gtaaggtatt tggagaacta 180

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tacttgaggg aagctgttaa aagtgattac gatcttttaa gatacctaaa gcaatcacta 720

gacatttaca agaaaaggaa caaagaccta gagttaaaga tgaatgcaga atcttcaaac 780

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810680236.2 (22)申请日 2018.06.27 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人 曹春蕾赵运英曹正锋余培斌 毛银 (74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通合伙) 32257 代理人 杨慧林 (51)Int.Cl. C12N 1/19(2006.01) C12Q 1/18(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其。

2、应用 (57)摘要 本发明公开了一种具有酮康唑抗性的酿酒 酵母及其应用, 属于生物医药技术领域。 本发明 通过96孔板液体培养的方法, 对文库中以BY4743 为母菌株的4600多个单基因缺失株进行筛选, 并 且在添加5g/mL酮康唑的YPD固体培养基上进 行进一步倍比稀释验证, 确定和野生型相比, gip2、 rnr1、 rml2、 mtf2四株菌对5g/mL酮康唑 具有抗性, 进而对它们抗氧化活性进行了测定。 从本发明四个酿酒酵母缺失的基因作为研究基 础出发, 进行酮康唑的生产改良以及其他抗真菌 新药物的研发, 同时, 也可找出其他致病真菌中 和这四个基因同源的基因, 得到单基因缺失株, 。

3、用以验证酮康唑及其他新开发的抗真菌药物的 临床效果。 权利要求书1页 说明书4页 序列表4页 附图1页 CN 108795788 A 2018.11.13 CN 108795788 A 1.一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母, 其特征在于, 所述酿酒酵母缺失了核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示的GIP2基因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RNR1基因、 核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示的RML2基因或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的MTF2基因中的一种或多 种。 2.根据权利要求1所述的酿酒酵母, 其特征在于, 所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母 BY4743。 3.权利。

4、要求1所述的酿酒酵母在酮康唑药物生产改良中的应用。 4.权利要求1所述的酿酒酵母在抗真菌药物生产中的应用。 5.一种酿酒酵母GIP2基因在酮康唑药物改良中的应用, 其特征在于, 所述GIP2基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 6.一种酿酒酵母RNR1基因在酮康唑药物改良中的应用, 其特征在于, 所述RNR1基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 7.一种酿酒酵母RML2基因在酮康唑药物改良中的应用, 其特征在于, 所述RML2基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 8.一种酿酒酵母MTF2基因在酮康唑药物改良中的应用, 其特征在于, 所述MTF2基因的 核苷酸。

5、序列如SEQ ID NO.4所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108795788 A 2 一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用, 属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 目前, 全球真菌感染率呈上升趋势, 尤其是深部真菌感染日渐引起关注, 真菌感染 成为威胁人类生活质量和生命健康的重要病因之一。 与之相反, 临床上能够有效治疗真菌 的药物种类相对有限, 并且部分药物不良反应较大。 0003 酮康唑(Ketoconazole, KCZ), 化学名为顺-1-乙酞基-4-4-2-(2,4-二氯苯基)- 2-(1H-咪唑基。

6、-1-甲基)-1,3-二氧戊环-4-甲氧基苯基哌嗪, 是一种咪唑类的广谱抗真菌 药物。 酮康唑是1976年由比利时Gannsen制药公司研究开发, 是临床上第一个可供口服的抗 真菌药物, 对许多浅表和深部真菌感染都有较好的抗菌作用。 同时, 酮康唑对肝药物酶具有 较强的抑制作用, 因此, 在临床治疗中, 酮康唑已被广泛应用于真菌的抗感染治疗中。 由于 在临床上出色的治疗效果, 1980年酮康唑被载入 美国药典 的第21版, FDA评选酮康唑为A 类广谱抗真菌药, 2000年被中国药典收载为抗真菌药物的新增品种。 酮康唑的抗真菌作用 机制是通过抑制麦角固醇的合成通路中羊毛甾醇14a-去甲基化酶,。

7、 导致羊毛甾醇堆积和真 菌细胞膜麦角甾醇生物合成受阻, 麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分, 麦角甾醇生物 合成受阻从而改变细胞膜的通透性, 抑制真菌生长。 0004 然而, 有研究报道酮康唑具有肝损害作用, 长期服用可能会导致内分泌功能失衡, 酮康唑的肝脏毒性与其主要代谢物N-乙酰酮康唑有关。 并且, 近些年由于不规范使用抗菌 药物, 甚至滥用抗菌药物等因素, 部分病原菌已经逐渐对现有的抗真菌药物产生了耐药性。 现市面上出售的药物已难以满足临床抗真菌感染治疗的需求, 尤其是那些多重耐药菌株引 起的感染, 经常因为无药可用而导致患者死亡。 因此, 对现有抗真菌药物不断改良, 并且研 发新的效果。

8、更好的抗真菌药物, 是目前医药行业至关重要的一项课题。 0005 此外, 活性氧(reactive oxygen species,ROS)在调控细胞过程中有非常重要的 作用, 例如细胞凋亡、 氧化应激等, 目前也是分子医学和生命科学等最前沿的研究领域之 一。 研究发现, 如果ROS在细胞中过量积累, 会对细胞内的蛋白质、 核酸等生物大分子造成氧 化损伤, 且研究发现由ROS引起的细胞内的氧化损伤和细胞程序性死亡与心脏病、 肌萎缩侧 索硬化症等疾病相关联, 同时, ROS在细胞衰老的过程和在癌症的发展过程中起到至关重要 的作用。 0006 由于条件致病真菌白念珠菌和酿酒酵母的基因同源性较高, 抗。

9、病机制相似, 但白 念珠菌没有单倍体, 其遗传操作不如酿酒酵母容易。 因此, 很多白念珠菌的基因研究, 都是 先从酿酒酵母基因组出发, 研究酿酒酵母基因的功能, 从而再研究白念珠菌中同源基因的 功能。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), 隶属于半知菌亚门, 芽孢菌纲, 隐球酵母目, 隐球酵母科, 酵母属, 也称啤酒酵母或芽殖酵母(budding yeast), 因其具有单细胞、 繁殖 快、 有单倍体和双倍体两种状态存在等优点, 被当做真核模式生物。 酿酒酵母全基因组的测 序完成及对其基因组和蛋白组学的研究探索, 为其他真核生物尤其是高等生物及人类的基 说明书 1/4。

10、 页 3 CN 108795788 A 3 因组结构和功能的研究和探索提供了基础, 尤其是为人类疾病的研究提供了模型。 然而, 目 前酿酒酵母中哪些基因改变对抗真菌药物酮康唑具有抗性并不明确, 无法有针对性的利用 酿酒酵母对酮康唑药物进行改良。 发明内容 0007 为了克服上述问题, 本发明利用添加5 g/mL酮康唑的YPD培养基, 对酿酒酵母基因 缺失株进行大规模筛选, 得到了四种对5 g/mL酮康唑具有抗性的基因缺失菌株, 说明缺失 该基因之后, 5 g/mL酮康唑对其没有抗菌效果。 因此, 从这四个基因出发, 用以改良酮康唑 及新的抗真菌药物的研发, 可以解决临床上一部分真菌抗药性的问题。

11、。 0008 本发明的第一个目的是提供一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母, 所述酿酒酵母缺失 了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GIP2基因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RNR1基 因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RML2基因或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的MTF2基 因中的一种或多种。 0009 在本发明的一种实施方式中, 所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母BY4743。 0010 本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母在酮康唑药物生产改良中的应用。 0011 本发明的第三个目的是提供所述的酿酒酵母在抗真菌药物生产中的应用。 0012 本发明的第四个目的是提。

12、供一种酿酒酵母GIP2基因在酮康唑药物改良中的应用, 所述GIP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0013 本发明的第五个目的是提供一种酿酒酵母RNR1基因在酮康唑药物改良中的应用, 所述RNR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0014 本发明的第六个目的是提供一种酿酒酵母RML2基因在酮康唑药物改良中的应用, 所述RML2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 0015 本发明的第七个目的是提供一种酿酒酵母MTF2基因在酮康唑药物改良中的应用, 所述MTF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 0016 在本发明的一种实施方式中, 是以从美国。

13、Invitrogen Inc公司购买的酿酒酵母双 倍体单基因缺失菌株文库出发, 对该文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进 行96孔板液体培养筛选: 在添加2.5 g/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小 时进行抗性筛选。 0017 本发明的有益效果在于: 0018 本发明提供的四个基因缺失菌株对临床上使用的抗真菌药物酮康唑具有抗性, 因 此, 可从这四个酿酒酵母基因作为研究基础出发, 进行酮康唑的生产改良以及其他抗真菌 新药物的研发, 同时, 也可找出其他致病真菌中和这四个基因同源的基因, 得到单基因缺失 株, 用以验证酮康唑及其他新开发的抗真菌药物的临床效果。

14、。 附图说明 0019 图1为gip2、 rnr1、 rml2、 mtf2四株菌在5 g/mL酮康唑的YPD固体培养基中的表型; 0020 图2为gip2、 rnr1、 rml2、 mtf2四株菌抗氧化活性测定结果。 具体实施方式 说明书 2/4 页 4 CN 108795788 A 4 0021 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明, 以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施, 但所举实施例不作为对本发明的限定。 0022 在本发明中, 首先采用96孔板液体筛选的方法, 对文库中以BY4743为母菌株的 4600多个单基因缺失株进行筛选, 在添加2.5 g/mL酮康唑的。

15、YPD液体培养基上对菌株进行 培养24小时, 和野生型相比, 发现gip2、 rnr1、 rml2、 mtf2四株菌对酮康唑具有抗性, 然后在 添加5 g/mL酮康唑的YPD固体培养基上进行进一步倍比稀释验证, 确定和野生型相比, gip2、 rnr1、 rml2、 mtf2四株菌对5 g/mL酮康唑具有抗性, 进而对它们抗氧化活性进行了测 定。 0023 YPD培养基的组成: 每升YPD培养基含有20g蛋白胨, 20g葡萄糖和10g酵母提取物, 定容后1105Pa灭菌30min。 固体培养基每升加入20g的琼脂粉。 0024 实施例1: 96孔板液体培养基初筛 0025 1.96孔板每个孔中。

16、加入200 L YPD液体培养基, 每个孔中接种活化缺失株文库中 不同菌株, 过夜培养菌株至饱和。 0026 2.预先配置YPD液体培养基和YPD+2.5 g/mL酮康唑的液体培养基, 分别加至两个 96孔板中, 每个孔加培养基180 L。 0027 3.两个96板上相同位置分别加入20 L相同浓度的已活化的同一种缺失株菌液, 同 时, 在每块96孔板的固定位置加入一个野生型对照, 30过夜培养。 0028 4.过夜培养之后的96孔板用涡旋仪轻轻混匀, 用酶标仪测定每个孔的OD600数值。 0029 5.YPD培养基培养的菌株OD600数值减去相应YPD+2.5 g/mL酮康唑培养的同一菌 株。

17、的OD600数值, 和野生型差值比较, 差值小于-0.3以上的, 视为抗性菌株。 0030 在添加2.5 g/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时, 发现gip2、 rnr1、 rml2、 mtf2四株菌对酮康唑具有抗性。 0031 实施例2: 倍比稀释筛选验证 0032 1.预先在YPD固体平板上活化初筛得到的抗性菌株及野生型菌株。 0033 2.接种已活化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中, 220r/min, 30过夜培养至饱和。 0034 3.用无菌水十倍梯度稀释培养饱和的菌液, 使每个菌株分别稀释成5106、 5 105、 5104、 510。

18、3和5102cells/mL 5个梯度浓度。 0035 4.分别取2 L每个菌株不同梯度的稀释菌液在预先配制好的YPD和YPD+5 g/mL酮 康唑的平板上点板, 最后一行加上野生型对照, 30培养48小时。 0036 5.观察菌落生长情况, 拍照, 从初筛结果中验证出真正对于酮康唑抗性的菌株。 0037 在添加5 g/mL酮康唑的YPD固体培养基上进行进一步验证, 确定和野生型相比, gip2、 rnr1、 rml2、 mtf2四株菌对5 g/mL酮康唑均具有抗性。 0038 实施例3: 抗性菌株细胞中ROS测定 0039 1.预先在YPD固体平板上活化得到的抗性菌株及野生型菌株。 0040。

19、 2.接种已活化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中, 220r/min, 30过夜培养至饱和。 0041 3.饱和菌液以十分之一的量转接两份, 其中一份加入终浓度为2 g/mL的酮康唑, 两份中都加入终浓度为2 g/mL的DHE, 避光培养至对数生长期。 说明书 3/4 页 5 CN 108795788 A 5 0042 4.3步骤培养的分别取菌液1.5mL, 室温下4 000r/min收集菌体。 0043 5.用500 L PBS缓冲液洗2次, 重悬到500 L的PBS中。 0044 6.每个菌液取200 L分别加入黑色和透明的96孔板中。 0045 7.黑色96孔。

20、板用荧光酶标仪进行测定荧光, 激发波长490nm, 发射波长610nm, PMT 自动, 透明的96孔板用来测定OD600值。 0046 8.每个菌株的荧光值除以OD600值, 得到了其细胞内ROS含量的多少和加入酮康唑 之后细胞内ROS变化。 0047 和野生型相比, gip2、 rnr1、 mtf2三株菌加入酮康唑之后, 细胞内的氧化损伤更加 严重, 而rml2加入酮康唑之后, 细胞内的氧化损伤反而降低了。 因此, 可以推测菌株rml2的 抗酮康唑机制可能和细胞内氧化损伤降低有关。 基因RML2可用以研究后续由氧化损伤引起 的疾病。 0048 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳。

21、的实施例, 本发明的保护范 围不限于此。 本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换, 均在本发明 的保护范围之内。 本发明的保护范围以权利要求书为准。 说明书 4/4 页 6 CN 108795788 A 6 序列表 江南大学 一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 1647 DNA (Saccharomyces cerevisae) 1 atgtatataa aggcagaaca gaaaccccaa cagtttgaga ggaagaatga aaaactagac 60 agaaataaaa accagcagct acca。

22、gatctt gaaacagatt tcaagggtta cagagtgaat 120 tcggacctat acaacaaaga acgagatgga agtacggaag agactttaaa ctctttgaag 180 tttttacata aacctcagag agtaactcaa atgagagcga acaggttccc agaggaagaa 240 gtgcaaagaa acactgattt aaacaaaaga attttctccg cagggaatga tgaaaacgtt 300 gataatgaga gcggctggtc aaaaattgcc gctgccaaga at。

23、cacacttc cgtagaatca 360 ttaaatggca gtacgagacc cccattcaaa atagagctgc ctcccctttc ccccaaatcc 420 accgtaccaa aatcttttca agcagaatat cccgaagcta agtcacctgg caatgatatg 480 aattttgaat atgatgaaga aattctaatt ccatttgcgc cacctgtata taaaaagtca 540 ggtgaactat tgaagagctc attgaagaga agatcaaaat cattacctac aaccccaggt 。

24、600 ataaggagcg ggaatggtgt ccaagcaaga gacggtagtc cgatgttgat taggagtaag 660 agtgttcact ttgatcaggc ggcacctgta aaatattttg ctgaggatga aagccctata 720 aacgttaata aaactgaaca acacgataat tgtctaagct ttaagcataa gccagtgaat 780 ttaatggtgg acccggaaga agagacaaaa atgctatcat ctggattaga aacgacatcc 840 atagatgatg acttg。

25、acgac agttgcgcca aaaggcttcg cacatcctgc taaaatttcg 900 aatccaaaca atggtaaagg caccaacaat acaaaattaa gaaaaagtaa aagatttcag 960 aacctcctaa agaacaggac cgacatgcca ccatcaaaat caaataaaaa attcgttaat 1020 ggtggcggtg ctcatgaaat ttcagatcgt aattcaaaaa attaccatgt tgttggatta 1080 tacagcaaga acttccccat tttaagcaac a。

26、agaatccta aaagtttaaa gctgaacatt 1140 tttatcaatt tatcacaaaa taagaaagtt tttctacaag aattgtcatt atacatccat 1200 agagacaaca attacttttc aaattcctcc tcattttata atattcccaa tagccacaat 1260 ggtaatgact gtaatggtgt ggccaagggt tataacgctg gctgtacaag attaattgct 1320 ggaaggatac tagtgaaaaa cattttctat gataaaagag tggtgg。

27、tacg atatacgtgg 1380 gatagttgga gaacaacaca tgaagtggaa tgcgtttaca tcagtgatgg cgatggaata 1440 ttgccgggca ctaacatgga cattttccac ttcattatcg atgatgtcag caaagtggat 1500 cctcgcggca agttagaatt ttgcattcat tattctacac gtaacgacta tgagcgcgaa 1560 gagtactggg acaacaacaa cgggaataat tataaggtgg atgttgtaat ggatggcttt 。

28、1620 aacgatccct tcgcggcggc agcatga 1647 序列表 1/4 页 7 CN 108795788 A 7 2 2667 DNA (Saccharomyces cerevisae) 2 atgtacgttt ataaaagaga cggtcgtaaa gaacctgtcc aattcgataa gattaccgct 60 cgtatatcac gcttatgcta tggtttagat ccaaaacata tcgacgccgt taaggtcacc 120 caacgtatca tttctggtgt ctatgaaggt gtcacaacaa tcgaactag。

29、a caacttagcc 180 gctgaaacat gcgcttatat gactactgtt catccagatt acgccaccct agcggccaga 240 attgccattt ctaatttaca taaacaaacc acaaaacaat tttctaaggt tgtcgaagat 300 ctttatagat acgtcaatgc tgctactggt aagcccgctc ccatgatctc tgatgatgtc 360 tacaatattg tcatggaaaa caaggataaa ttgaactccg caattgtcta tgacagagat 420 ttt。

30、cagtaca gttattttgg ttttaaaact ttggaacgtt cttatttact aagaatcaac 480 ggtcaagtgg ccgaacgtcc acaacattta attatgagag tcgcactagg catccacggt 540 agagatatcg aggctgcttt agaaacgtat aacttgatgt ctctaaaata ttttactcac 600 gcctctccaa cgttgttcaa tgccggtact ccaaaacctc aaatgtcctc ttgtttcttg 660 gttgccatga aggaggactc t。

31、atcgagggg atttacgaca ccttgaagga atgtgctttg 720 atttccaaaa ctgctggtgg tattggtcta catatccata acattcgttc aactggttct 780 tacattgctg gtacaaacgg tacttctaac ggtttaattc ctatgattcg tgttttcaat 840 aacactgccc gttatgttga ccagggtggt aataaaagac ctggtgcgtt tgccctttac 900 ctggaaccat ggcatgctga tatatttgat tttattgata。

32、 ttaggaagaa ccacggtaaa 960 gaggaaattc gtgcaagaga tttgttccct gctctatgga ttcctgatct tttcatgaag 1020 cgtgtcgaag aaaatgggac ctggacatta ttctctccaa catcagctcc tggtttaagc 1080 gattgttacg gtgacgagtt tgaggctcta tatacccgct acgagaaaga aggtcgtggt 1140 aagactatca aagcccaaaa attatggtat tccattttgg aagctcaaac tgaaa。

33、ctggt 1200 acacctttcg ttgtttacaa ggatgcttgt aacagaaaat ctaatcaaaa aaacttaggt 1260 gtcatcaagt catcaaactt atgctgtgaa attgttgaat actcagctcc agatgaaact 1320 gctgtttgta acttggcttc cgttgcctta ccagcattca ttgaaacttc tgaggatggt 1380 aagacttcca catacaactt caaaaaatta catgaaattg ctaaagttgt tactcgtaat 1440 ttaaa。

34、cagag tcattgatcg taattactac cctgttgaag aagcgagaaa atccaatatg 1500 agacatagac caattgcttt gggtgttcaa ggtctcgctg acactttcat gctgttacgt 1560 ttgccatttg attctgagga agcccgtttg ctaaatatcc aaatctttga aactatttat 1620 catgcctcca tggaagcttc ttgtgaacta gctcagaagg acggtccata cgaaactttc 1680 caaggatctc ctgcttctca。

35、 aggtatacta cagtttgata tgtgggacca aaaaccctac 1740 ggcatgtggg attgggacac cttaagaaaa gatatcatga agcatggtgt tagaaattcc 1800 ttgaccatgg caccaatgcc tactgcatcc acatcccaaa tattgggtta taatgaatgt 1860 ttcgaaccag tcacttccaa tatgtactcc cgtcgtgtct tatccggtga attccaggtt 1920 gtgaaccctt acttactgcg tgacttggtt gatt。

36、taggta tttgggatga gggtatgaaa 1980 cagtatctga ttacacaaaa tggctccatt caaggcttac caaacgttcc acaagaattg 2040 序列表 2/4 页 8 CN 108795788 A 8 aaggacttat acaagactgt ttgggaaatt tcacaaaaga ctatcattaa catggcagcc 2100 gatcgttctg tctatattga tcaatctcat tctttgaatt tgttcttacg tgccccaact 2160 atgggtaaac taacaagtat gc。

37、atttttac ggatggaaga agggattgaa gaccggtatg 2220 tactatttga gaacccaagc tgcatctgct gcaattcaat ttactattga tcagaagatt 2280 gcggatcaag ctacagaaaa cgttgctgat atttccaact tgaagcgtcc atcatatatg 2340 ccttccagtg caagctacgc tgccagcgat ttcgtgcccg cagctgtgac tgcaaacgca 2400 actattccat ctctagatag ctcctcggaa gcttcaa。

38、gag aggcatctcc agctccaaca 2460 ggtagccact cattaactaa aggaatggca gaattaaacg ttcaagagtc taaggtagaa 2520 gttcctgaag tacctgcccc aactaagaat gaagaaaaag ctgcccccat cgttgatgat 2580 gaggaaaccg agttcgacat ttacaactct aaggttatag catgtgctat tgataaccca 2640 gaagcttgtg aaatgtgttc gggttaa 2667 3 1182 DNA (Saccharom。

39、yces cerevisae) 3 atgttggtgc tagggtctct tagatcggcg ctgtcgtgca gttccacagc atcgcttatt 60 agtaagagaa acccttgtta tccatacggt atactctgtc gaactctatc tcagagtgtt 120 aaattgtggc aagagaatac ttcaaaagat gactccagtt tgaacattac tccacgatta 180 ctaaagatta tacctaacga tactgatatc gtgactcttg agaagcagga tgaattgatt 240 aaa。

40、agacgtc gtaaactttc gaaagaagtg acccagatga agaggctaaa acccgtctca 300 cctggtttga gatggtaccg ttcccccatt tatccatatt tgtacaaagg tcgtccggtt 360 agagccctaa ctgttgttcg aaagaagcac ggtggtagaa ataattcagg aaaaatcact 420 gtccgtcacc aaggtggtgg ccatagaaat agaacgaggc tgatagactt taacagatgg 480 gaaggtggtg cacaaacggt g。

41、caaaggatt gagtacgatc cgggtagatc ctctcatatc 540 gccctattga agcataatac taccggcgaa ttgtcttata ttattgcttg tgatgggtta 600 cgcccaggcg atgtggtcga atccttcaga agaggtattc ctcaaacttt actgaatgaa 660 atgggcggga aagtagaccc tgctatcttg agtgttaaga ctacccaaag aggcaactgt 720 ctacctattt ccatgatccc cataggtact attattcaca。

42、 acgttggcat aacacccgtt 780 ggacctggaa aattttgtcg ctctgctggt acatatgcca gagtccttgc gaaattacct 840 gaaaaaaaga aagctattgt tagattacaa agcggtgaac atcgttatgt gtctttagag 900 gctgtcgcta ccattggcgt ggtctccaat attgaccatc aaaacagatc tcttggtaaa 960 gccggcagat caagatggtt agggataaga cccactgtta gaggtgttgc catgaata。

43、aa 1020 tgtgaccatc ctcacggtgg tggccgtggt aaatccaagt ctaataaatt atcaatgtct 1080 ccatggggac aactggcaaa ggggtacaag actagaaggg gtaaaaatca aaatagaatg 1140 aaagtaaaag acagaccaag aggcaaagat gcaagattat aa 1182 4 1323 DNA 序列表 3/4 页 9 CN 108795788 A 9 (Saccharomyces cerevisae) 4 atgatcagaa catcatctat attaaaaa。

44、ac tgtaactata gatacataca ttgcatccat 60 agatgcttgc tgaatgaagc caatttgaaa gatagaaaaa ctcacaacgt agaaagagtt 120 tcaaatgaaa agacatttga acaagctctc gaagaggaac gtaaggtatt tggagaacta 180 ttcgaagctg gagcaagggt tgaaaacatg aggcacacta atgctagcaa aataattgac 240 aagtattaca atgggctaca ggacaactcc gagggaacta gtgtaaa。

45、aaa agaaaaaatt 300 gtttttaacc acagtcaaag agctcaaagg aagcttccaa ataaggacca tgaattcctg 360 aaggaaacag caggcaatga ctatgtctac gaacgggcag aaccttctgc tattagcact 420 aaaacgataa gtgagcagac aagaactttg ctggaaaaga tatttgacga agataatagc 480 attaataaaa gcaacagaga attgctgaat cttaatctgc gcaagggctc gggaatggaa 540 g。

46、ctttgaggc agccagttgc acattccaac gtcaaattta gcgaggaagt gatgcaagaa 600 attggtaata agattcggta ccaaaccaca ctggatcagg ttttagaacc tcacattgac 660 tacttgaggg aagctgttaa aagtgattac gatcttttaa gatacctaaa gcaatcacta 720 gacatttaca agaaaaggaa caaagaccta gagttaaaga tgaatgcaga atcttcaaac 780 attttcgaag acattagaag。

47、 tgcgtgtata aataaaccgg cagaactacc gaaaccgctt 840 gcaatgactt taccatatat tatagtcaaa tcgcttagat taggtgactt tgatttcccg 900 gcagacagaa agtacacatt gatctcctat gtttataatg aatgtaaaaa caacatggac 960 gcttcactgt acctaacaat ttgtaatgtt gatttctaca atttgctggt tcagctattg 1020 tgggaaaact tccaggagat tcgctacttg agacgtgtgg ttaccgagat gagcgttaat 1080 ggtgtcatcg gaaatattga aaccgtggat atattggata agattgtcaa agaaatgaga 1140 agtttaaatg aggatgtctt tcttgaa。

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