技术领域
本发明涉及一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用,属于生物医药技术领域。
背景技术
目前,全球真菌感染率呈上升趋势,尤其是深部真菌感染日渐引起关注,真菌感染成为威胁人类生活质量和生命健康的重要病因之一。与之相反,临床上能够有效治疗真菌的药物种类相对有限,并且部分药物不良反应较大。
酮康唑(Ketoconazole,KCZ),化学名为顺-1-乙酞基-4-{4-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-咪唑基-1-甲基)-1,3-二氧戊环-4-甲氧基]苯基}哌嗪,是一种咪唑类的广谱抗真菌药物。酮康唑是1976年由比利时Gannsen制药公司研究开发,是临床上第一个可供口服的抗真菌药物,对许多浅表和深部真菌感染都有较好的抗菌作用。同时,酮康唑对肝药物酶具有较强的抑制作用,因此,在临床治疗中,酮康唑已被广泛应用于真菌的抗感染治疗中。由于在临床上出色的治疗效果,1980年酮康唑被载入《美国药典》的第21版,FDA评选酮康唑为A类广谱抗真菌药,2000年被中国药典收载为抗真菌药物的新增品种。酮康唑的抗真菌作用机制是通过抑制麦角固醇的合成通路中羊毛甾醇14a-去甲基化酶,导致羊毛甾醇堆积和真菌细胞膜麦角甾醇生物合成受阻,麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分,麦角甾醇生物合成受阻从而改变细胞膜的通透性,抑制真菌生长。
然而,有研究报道酮康唑具有肝损害作用,长期服用可能会导致内分泌功能失衡,酮康唑的肝脏毒性与其主要代谢物N-乙酰酮康唑有关。并且,近些年由于不规范使用抗菌药物,甚至滥用抗菌药物等因素,部分病原菌已经逐渐对现有的抗真菌药物产生了耐药性。现市面上出售的药物已难以满足临床抗真菌感染治疗的需求,尤其是那些多重耐药菌株引起的感染,经常因为无药可用而导致患者死亡。因此,对现有抗真菌药物不断改良,并且研发新的效果更好的抗真菌药物,是目前医药行业至关重要的一项课题。
此外,活性氧(reactive oxygen species,ROS)在调控细胞过程中有非常重要的作用,例如细胞凋亡、氧化应激等,目前也是分子医学和生命科学等最前沿的研究领域之一。研究发现,如果ROS在细胞中过量积累,会对细胞内的蛋白质、核酸等生物大分子造成氧化损伤,且研究发现由ROS引起的细胞内的氧化损伤和细胞程序性死亡与心脏病、肌萎缩侧索硬化症等疾病相关联,同时,ROS在细胞衰老的过程和在癌症的发展过程中起到至关重要的作用。
由于条件致病真菌白念珠菌和酿酒酵母的基因同源性较高,抗病机制相似,但白念珠菌没有单倍体,其遗传操作不如酿酒酵母容易。因此,很多白念珠菌的基因研究,都是先从酿酒酵母基因组出发,研究酿酒酵母基因的功能,从而再研究白念珠菌中同源基因的功能。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),隶属于半知菌亚门,芽孢菌纲,隐球酵母目,隐球酵母科,酵母属,也称啤酒酵母或芽殖酵母(budding yeast),因其具有单细胞、繁殖快、有单倍体和双倍体两种状态存在等优点,被当做真核模式生物。酿酒酵母全基因组的测序完成及对其基因组和蛋白组学的研究探索,为其他真核生物尤其是高等生物及人类的基因组结构和功能的研究和探索提供了基础,尤其是为人类疾病的研究提供了模型。然而,目前酿酒酵母中哪些基因改变对抗真菌药物酮康唑具有抗性并不明确,无法有针对性的利用酿酒酵母对酮康唑药物进行改良。
发明内容
为了克服上述问题,本发明利用添加5μg/mL酮康唑的YPD培养基,对酿酒酵母基因缺失株进行大规模筛选,得到了四种对5μg/mL酮康唑具有抗性的基因缺失菌株,说明缺失该基因之后,5μg/mL酮康唑对其没有抗菌效果。因此,从这四个基因出发,用以改良酮康唑及新的抗真菌药物的研发,可以解决临床上一部分真菌抗药性的问题。
本发明的第一个目的是提供一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母,所述酿酒酵母缺失了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GIP2基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RNR1基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RML2基因或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的MTF2基因中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中,所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母BY4743。
本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母在酮康唑药物生产改良中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的酿酒酵母在抗真菌药物生产中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种酿酒酵母GIP2基因在酮康唑药物改良中的应用,所述GIP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第五个目的是提供一种酿酒酵母RNR1基因在酮康唑药物改良中的应用,所述RNR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第六个目的是提供一种酿酒酵母RML2基因在酮康唑药物改良中的应用,所述RML2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第七个目的是提供一种酿酒酵母MTF2基因在酮康唑药物改良中的应用,所述MTF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中,是以从美国Invitrogen Inc公司购买的酿酒酵母双倍体单基因缺失菌株文库出发,对该文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进行96孔板液体培养筛选:在添加2.5μg/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时进行抗性筛选。
本发明的有益效果在于:
本发明提供的四个基因缺失菌株对临床上使用的抗真菌药物酮康唑具有抗性,因此,可从这四个酿酒酵母基因作为研究基础出发,进行酮康唑的生产改良以及其他抗真菌新药物的研发,同时,也可找出其他致病真菌中和这四个基因同源的基因,得到单基因缺失株,用以验证酮康唑及其他新开发的抗真菌药物的临床效果。
附图说明
图1为gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌在5μg/mL酮康唑的YPD固体培养基中的表型;
图2为gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌抗氧化活性测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
在本发明中,首先采用96孔板液体筛选的方法,对文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进行筛选,在添加2.5μg/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时,和野生型相比,发现gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对酮康唑具有抗性,然后在添加5μg/mL酮康唑的YPD固体培养基上进行进一步倍比稀释验证,确定和野生型相比,gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对5μg/mL酮康唑具有抗性,进而对它们抗氧化活性进行了测定。
YPD培养基的组成:每升YPD培养基含有20g蛋白胨,20g葡萄糖和10g酵母提取物,定容后1×105Pa灭菌30min。固体培养基每升加入20g的琼脂粉。
实施例1:96孔板液体培养基初筛
1.96孔板每个孔中加入200μL YPD液体培养基,每个孔中接种活化缺失株文库中不同菌株,过夜培养菌株至饱和。
2.预先配置YPD液体培养基和YPD+2.5μg/mL酮康唑的液体培养基,分别加至两个96孔板中,每个孔加培养基180μL。
3.两个96板上相同位置分别加入20μL相同浓度的已活化的同一种缺失株菌液,同时,在每块96孔板的固定位置加入一个野生型对照,30℃过夜培养。
4.过夜培养之后的96孔板用涡旋仪轻轻混匀,用酶标仪测定每个孔的OD600数值。
5.YPD培养基培养的菌株OD600数值减去相应YPD+2.5μg/mL酮康唑培养的同一菌株的OD600数值,和野生型差值比较,差值小于-0.3以上的,视为抗性菌株。
在添加2.5μg/mL酮康唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时,发现gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对酮康唑具有抗性。
实施例2:倍比稀释筛选验证
1.预先在YPD固体平板上活化初筛得到的抗性菌株及野生型菌株。
2.接种已活化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中,220r/min,30℃过夜培养至饱和。
3.用无菌水十倍梯度稀释培养饱和的菌液,使每个菌株分别稀释成5×106、5×105、5×104、5×103和5×102cells/mL 5个梯度浓度。
4.分别取2μL每个菌株不同梯度的稀释菌液在预先配制好的YPD和YPD+5μg/mL酮康唑的平板上点板,最后一行加上野生型对照,30℃培养48小时。
5.观察菌落生长情况,拍照,从初筛结果中验证出真正对于酮康唑抗性的菌株。
在添加5μg/mL酮康唑的YPD固体培养基上进行进一步验证,确定和野生型相比,gip2、rnr1、rml2、mtf2四株菌对5μg/mL酮康唑均具有抗性。
实施例3:抗性菌株细胞中ROS测定
1.预先在YPD固体平板上活化得到的抗性菌株及野生型菌株。
2.接种已活化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中,220r/min,30℃过夜培养至饱和。
3.饱和菌液以十分之一的量转接两份,其中一份加入终浓度为2μg/mL的酮康唑,两份中都加入终浓度为2μg/mL的DHE,避光培养至对数生长期。
4.3步骤培养的分别取菌液1.5mL,室温下4 000r/min收集菌体。
5.用500μL PBS缓冲液洗2次,重悬到500μL的PBS中。
6.每个菌液取200μL分别加入黑色和透明的96孔板中。
7.黑色96孔板用荧光酶标仪进行测定荧光,激发波长490nm,发射波长610nm,PMT自动,透明的96孔板用来测定OD600值。
8.每个菌株的荧光值除以OD600值,得到了其细胞内ROS含量的多少和加入酮康唑之后细胞内ROS变化。
和野生型相比,gip2、rnr1、mtf2三株菌加入酮康唑之后,细胞内的氧化损伤更加严重,而rml2加入酮康唑之后,细胞内的氧化损伤反而降低了。因此,可以推测菌株rml2的抗酮康唑机制可能和细胞内氧化损伤降低有关。基因RML2可用以研究后续由氧化损伤引起的疾病。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种具有酮康唑抗性的酿酒酵母及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1647
<212> DNA
<213> (Saccharomyces cerevisae)
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