一种利用RNA干涉技术降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法 【技术领域】
本发明创造涉及一种有效降低曼地亚红豆杉(Taxus x media)细胞合成C-14位氧化紫杉烷的方法。它属于在植物细胞培养的基础上，上世纪80年代发展起来的基因工程的技术领域。植物细胞悬浮培养技术作为一种新技术，可以大规模生产出有用药物，前景可观。
背景技术
紫杉醇(taxol)是Wall等首次从短叶红豆杉(Taxus Brevifolia)树皮中分离得到的一种重要的次生代谢产物。临床可用于治疗卵巢癌、肺癌、膀胱癌、子宫癌及AIDS相关的Karposis肉瘤等，是目前应用最广泛的天然抗癌药物之一。然而，目前紫杉醇主要从红豆杉植物中提取，生产1kg的紫杉醇就需要2000-3000棵红豆杉的2000磅重的树皮。由于过度砍伐，导致红豆杉野生资源受到严重破坏。为解决这一问题，国内外学者在人工栽培、紫杉醇化学半合成与全合成、内生真菌、细胞培养等领域进行了探索。人工生产紫杉醇的方法中红豆杉细胞培养法被认为是最有发展前途的途径之一。同时，随着紫杉醇生物合成途径的逐步阐明及越来越多的关键酶和相关酶的基因的克隆和功能重组表达，利用基因工程方法对红豆杉细胞从基因水平上进行改造或对产紫杉醇的内生真菌菌种进行改造已经成为一种可能。已有以大肠杆菌为宿主菌组合紫杉烯合成酶等4种酶的基因产生紫杉烯的报道，且产率达到1.3mg/L，为天然产物生物合成基因的应用提供了借鉴。如果能将细胞培养与基因工程法结合，则有可能成为解决紫杉醇资源短缺的有效途径。红豆杉紫杉醇生物合成全过程约20步酶促反应，其中紫杉二烯合酶、紫杉二烯-5a-羟化酶、紫杉烷10β-羟化酶、紫杉烷-3a-羟化酶、紫杉二烯-5a-乙酰转移酶、紫杉烷-2a-苯甲酰转移酶、10-去乙酰巴卡亭III-10β-乙酰转移酶、3-氨基-3-苯基丙酰转移酶和3-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等主要的相关酶基因已成功克隆与表达。其中，紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)存在于包括紫杉醇在内的各种C-13氧取代的紫杉烷生物合成分支途径中，对该基因表达进行抑制，则有可能阻断中间产物流向C-14氧取代的紫杉烷，而改向生成包括紫杉醇在内的C-13氧取代的紫杉烷的途径，从而大幅度提高后者的产量。经文献检索：Kim等，Journal of Microbiology and Biotechnology，2000，10(1)：91-94，Ketchum等，Plant Cell Reports，2007，26(7)：1025-1033和国际专利：WO2007/081772，分别利用红豆杉的细胞悬浮培养系进行了转化试验。Kim的实验中研究了GFP蛋白在东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞中的表达，他们提供了GFP蛋白表达的蛋白质印迹的证据，但他们没有进行任何外源目的基因的转化实验。Ketchum等的研究中也进行了东北红豆杉的转化实验，但他们用的是野生型的根癌和发根农杆菌，同样也没有开展任何外源目的(功能)基因的转化工作。国际专利WO2007/081772尽管进行了曼地亚红豆杉外源目的(功能)基因的转化工作，但没有涉及到紫杉烷14β-羟基化酶基因的遗传操作。在抑制曼地亚红豆杉(Taxus x media)细胞紫杉烷14β-羟基化酶基因的表达，降低曼地亚红豆杉细胞合成C-14位氧化紫杉烷方面，国内外未见有报道。
【发明内容】
本发明提供一种利用RNA干涉技术降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
a)从红豆杉中克隆得到14β羟基化酶基因(简称14OH)片段；
b)构建RNA干涉载体，载体宿主菌为根癌农杆菌；
c)转化红豆杉愈伤组织，转化条件为将含有目的RNA干涉载体的根癌农杆菌活化稀释，转化对数生长期悬浮培养一天后的红豆杉愈伤组织，共培养2-3天后，清洗，转入含有抗生素的培养基中培养；
d)PCR和southern检测转基因细胞；
e)C-14氧取代的紫杉烷含量分析。
本发明所述方法，其中C-14位氧化紫杉烷为sinenxan A、sinenxan C和Yunnanxane。
构建RNA干涉载体所用的14OH基因的引物是：
5’-GCGGAATTCTAGAATGGATGTCTTTTATCCGTTAA-3’(正义链)
5’-GCTGGATCCATGAAGCAGCCCGGAAAAGTTGTC-3’(反义链)。
本发明所述方法，其中根癌农杆菌活化步骤如下：
f)在LB+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的培养基上筛选携带外源基因的农杆菌GV3101；
g)挑取该单菌落置于2ml LB液体培养基中，28℃，250rpm条件下培养两天；
h)取培养后的菌液250ul放入25ml LB液体培养基中，28℃，250rpm条件下培养过夜。
本发明所述方法，其中载体宿主菌为根癌农杆菌GV3101，曼地亚红豆杉细胞生长和转化所采用地培养基为6，7-V培养基，C-14氧取代的紫杉烷含量采用HPLC方法分析。
本发明的目的是提供一种有效降低曼地亚红豆杉(Taxus x media)细胞合成C-14位氧化紫杉烷的方法，是将针对红豆杉紫杉烷14β羟基化酶基因(简称14OH)片段构建的RNA干涉载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus x media)培养细胞中。通过转化方法的优化和一段时间的培养，快速、有效地抑制了曼地亚红豆杉细胞14OH基因的表达，明显地降低了曼地亚红豆杉细胞中sinenxan A(图1)、sinenxan C(图2)、Yunnanxane(图3)这三种C-14位氧化紫杉烷的总含量，显著地抑制了红豆杉细胞向C-14位氧化紫杉烷的流向，为代谢流向包括紫杉醇(taxol)和巴可亭III(baccatin III)在内的C-13位氧化紫杉烷(C-13 oxygenated taxoids)提供了条件。
附图说明：
图1：sinenxan A [α，5α，10β，14β-tetraacetoxytaxa-4(20)，11-diene]
图2：sinenxan C [10β-triacetoxy-14β-(2-methyl)butyryloxy-taxa-4(20)，11-diene]
图3：Yunnanxane [2α，5α，10β-triacetoxy-14β-(3-hydroxy-2-methyl)butyryloxytaxa4(20)，11-diene]
图4：RNA干扰载体T-DAN区
图5：GUS活性检测，左：转基因细胞；右：对照
图6：转基因细胞系的PCR检测，A：对照；B，C：转基因细胞
图7：转基因细胞系的PCR-Southern检测，A：对照；B，C：转基因细胞
图8：RT-PCR检测结果第一行是红豆杉转基因细胞系和非转基因细胞系中β-actin基因的RT-PCR分析结果，第二行是红豆杉转基因细胞系和非转基因细胞系中14OH基因的RT-PCR分析结果。A，B：转基因细胞；C：对照
图9三种C-14氧取代紫杉烷标准品的HPLC图谱1.Yunnanxane；2.sinenxan A；3.sinenxan C
【具体实施方式】
下面结合实施例进一步说明，但是本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的方案都在本发明保护范围之内。
实施例1：用本发明的有效降低曼地亚红豆杉(Taxus x media)细胞合成C-14位氧化紫杉烷的方法，将针对红豆杉紫杉烷14β羟基化酶基因(简称14OH)片段构建的RNA干涉载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus x media)培养细胞中。通过转化方法的优化和一段时间的培养，使曼地亚红豆杉细胞14OH基因的表达水平和曼地亚红豆杉细胞中sinenxan A、sinenxan C、Yunnanxane这三种C-14位氧化紫杉烷的总含量都得到降低。
实验材料：选用本实验室培养的生长状态较好的曼地亚红豆杉细胞系进行转化试验，采用6，7-V培养基(附加0.2mg/L 6-BA，1.5mg/L 2，4-D和2mg/L IAA)对红豆杉愈伤组织细胞进行培养。本试验采用根癌农杆菌GV3101，该菌株具有利福平(rifampicin)抗性，利用该抗性可对其进行筛选。载体pZh01由中科院遗传与发育生物学研究所朱立煌教授赠送。卡那霉素、乙酰丁香酮、利福平、头孢霉素、潮霉素，巯基乙醇，PVP购自sigma公司，RNA抽提试剂，逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂均购自鼎国生物技术有限公司，引物合成、DNA测序由鼎国生物技术有限公司完成。乙腈为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯试剂。PCR仪(Gene Amp PCR system 4700)；冷冻干燥机(北京博医康FD-1)；细胞超声破碎仪(宁波新芝JY92-II)；高效液相色谱仪(Waters 2487)；色谱柱(SunFireTM)；HPLC分析软件(Empower)。
具体步骤如下：(1)双元载体的构建，用引物F：5’-GCGGAATTCTAGAATGGATGTCTTTTATCCGTTAA-3’(P1)，R：5’-GCTGCATCCATGAAGCAGCCCGGAAAAGTTGTC-3’(P2)从中国红豆杉中克隆出14OH基因片断，将该目的片段正反向插入pZh01载体的T-DNA区域GUS片断两侧构建其RNA干涉载体(图4)，最后用电击法将含有上述外源基因片段的载体导入农杆菌GV3101中，获得有关工程农杆菌菌株。
(2)农杆菌的活化：首先，在LB+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的培养基上筛选携带外源基因的农杆菌GV3101。然后，挑取该单菌落置于2ml LB液体培养基中(含50mg/L卡那霉素)，28℃，250rpm条件下培养两天。取培养后的菌液250ul放入25ml LB液体培养基中(含50mg/L卡那霉素，50uM乙酰丁香酮)，28℃，250rpm条件下培养过夜，至OD值为1.0-1.2。
(3)细胞的培养：红豆杉细胞生长大周期呈S型，可将其划分为：延迟期(0-15d左右)，对数生长期(15-30d)，静止期(30-35d)。选取处于不同生长期的的红豆杉细胞4g左右，放入12ml6，7-V液体培养基中，24℃，125rpm条件下于悬浮培养液中分别进行1天，3天，9天，14天的振荡培养。
(4)转化：将2.5ml活化好的农杆菌3000g离心15min，去除上清液，在沉淀中加入一定体积6，7-V液体培养基进行稀释。分别加入2.5ml 6，7-V液体培养基、稀释1倍(加入5ml 6，7-V液体培养基)、稀释2倍(加入10ml 6，7-V液体培养基)，比较它们的转化效果。取稀释好的菌液500ul放入悬浮培养的细胞体系中，超声30s后，24℃，125rpm条件下共培养。在共培养1-3天后，用含300mg/L头孢霉素的新鲜6，7-V液体培养基清洗细胞3-4遍。每次加入培养基后，于24℃，125rpm条件下摇15min，然后用5ml移液枪吸净液体，再重复上述操作。之后，将细胞转移至含300mg/L头孢霉素的6，7-V固体培养基上。室温条件下生长两周后再将细胞转移至含300mg/L头孢霉素和2.5mg/L潮霉素的培养基上。
(5)PCR-Southern检测：取新鲜的愈伤细胞50mg，参照松科植物基因组总DNA的提取方法，用CTAB(2％)法(加6％PVP)提取基因组DNA。因为红豆杉富含多糖多酚类物质，需采用改进的CTAB法进行基因组总DNA的提取。DNA的提取步骤如下：(1)65℃水浴预热2％的CTAB提取液(含2％β-巯基乙醇，6％PVP)；(2)在液氮中研磨样品，转入离心管，加入预热好的CTAB提取液(每克样品加入3～5ml的提取液)，65℃保温1h，每隔10～20min轻轻摇动混匀；(3)于18℃，12000rpm条件下离心5min，取上清；(4)加入等体积酚：氯仿，充分混匀，于18℃，10000rpm条件下离心10min，取上清；(5)加入等体积氯仿，充分混匀，于18℃，10000rpm条件下离心10min，取上清；(6)加入0.6倍体积的异丙醇混匀，室温放置，沉淀15min；(7)于18℃，12000rpm条件下离心6min，弃上清；(8)将沉淀用75％的乙醇洗20min，室温条件下12000rpm离心2min，弃上清后重复上述操作；(9)将沉淀吹干，溶于150ulRNase水，37℃放置30min，除去RNA。(10)将提取产物用琼脂糖凝胶电泳检测，置于冰箱(-20℃)保存待用。以提取的10ug基因组总DNA为模板，用扩增目的基因的序列作为引物进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性3min，94℃50s，56℃50s，72℃1.5min，35个循环，72℃延伸10min。对PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，80V电泳2～4h，电泳缓冲液为1×TAE。琼脂糖凝胶上的DNA片段经碱变性后，转移到硝酸纤维素薄膜上，80℃烘烤2h使DNA与薄膜交联。然后于42℃预杂交4h，接着加入地高辛标记的外源目的基因片段作为探针进行杂交，预杂交液成分为：5×SSPE，5×denhardt试剂。
(6)14OH基因mRNA表达水平的检测：利用RT-PCR技术半定量的检测基因表达水平的变化。按Trizol说明书提取总RNA，逆转录及PCR反应按照试剂盒说明书操作。参照14OH基因的DNA序列设计引物F：5’GTGCTGTTGCTGGCATTGTT3’R：5’TCCTCATCGCTGCATGGATT 3’，预计扩增出800bp左右的目的基因片段；同时针对看家基因β-actin设计引物F：5’GTCCTCAGTGCTGTTGCTGG 3’和R：R5’GCTGCATGGATTTCCTCTGT 3’，预计扩增出800bp左右的β-actin基因片段。PCR参数：94℃预变性2min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物于3％琼脂糖电泳，电压80V，50min。
(7)C-14氧取代的紫杉烷含量分析：(1)紫杉烷类成分的提取。细胞于冷冻干燥机中(-50℃)干燥至恒重，称取0.2g，研磨，2ml甲醇浸提过夜后辅助超声提取30min，细胞超声破碎仪破碎细胞(50W，10s，10次，间隔15s)，1700g离心10min，取上清液。重复上述过程，合并两次上清液，25℃干燥。再溶于2ml二氯甲烷，加等量水混匀，1700g离心10min，取二氯甲烷层，重复上述过程，合并两次二氯甲烷层25℃干燥，0.5ml甲醇溶解待测。(2)紫杉烷类测定。将待测样品用0.45u的滤膜过滤后进行HPLC(Waters 2487)分析。色谱柱为SunFireTM(150×4.6mm，5um particle size，C18)，柱恒温40℃，流动相为A：水B：100％乙睛，梯度洗脱，流速1ml/min。进样量10ul，紫外检测器，检测波长210nm。以保留时间定性，峰面积法定量样品浓度为：
C样品＝S样品×C标品/S标品
梯度洗脱程序如下：
结果与分析
曼地亚红豆杉细胞转化方法的优化：(1)细胞培养周期中不同时间转化对转化效率的影响.选用不同生长时期的细胞进行转化，其转化效率大不相同。如果在对数生长期的稳定期(21天左右)进行转化，细胞转化率可高达100％；而在对数生长期的初期(15天左右)转化，则很有可能转化失败；若在对数生长期末期(30天左右)、延迟期或静止期转化，细胞转化率仅在30％-40％左右。(2)共转化时间对转化的影响。红豆杉细胞与农杆菌共培养时间在2-3天为宜，如果超过3天，细胞很容易褐化死亡。(3)细胞悬浮天数对转化的影响。我们采用悬浮培养14天，9天，3天，1天的细胞分别进行转化，发现悬浮培养14天，9天的细胞极易褐化死亡而直接导致转化失败；悬浮3天的细胞转化后生长状态明显差于悬浮培养1天的细胞。(4)农杆菌的浓度对转化的影响。农杆菌的浓度对转化也有一定的影响。如果农杆菌在共培养的培养液中浓度过低(稀释倍数2倍)，则红豆杉的细胞转化效率会大大下降；若农杆菌浓度过高(加入2.5ml液体培养基)，则会抑制细胞的生长，甚至导致细胞死亡，在本实验中农杆菌稀释倍数为1倍时实验效果最佳。在对报告基因的检测中，经过抗性筛选的转化细胞GUS染色结果呈现蓝色(图5)
转化细胞的鉴定：PCR检测结果(图6)显示实验组(转基因细胞系)在900bp附近扩增出很亮的特异条带，在进一步的PCR-southern检测中实验组出现了强杂交信号，而对照组则缺乏亮的杂交条带，这证实转基因试验取得成功(图7)。
RT-PCR检测结果：取PCR鉴定为阳性的细胞系进行RT-PCR分析。结果显示：内参基因β-actin在转基因和非转基因细胞中表达水平基本一致，而14OH基因在转基因细胞系中的表达水平相对非转基因细胞系显著下降(图8)。
转基因细胞系中紫杉烷类含量HPLC分析结果：以三种C-14位氧化紫杉烷类化合物sinenxan A、sinenxan C、Yunnanxane作为标准品(图9)，每个样品测定三次，应用Empower软件对得到的HPLC结果分析显示，转基因的红豆杉细胞与对照相比三种紫杉烷的含量发生了较大的改变，其中红豆杉细胞中主要的C-14氧取代紫杉烷Sinenxan A下降37％左右，yunnanxane下降26％左右，sinenxan C下降11％左右(表1)。
表1转基因的红豆杉细胞系与非转基因细胞系中三种C-14位氧化紫杉烷类化合物的含量的比较
本发明创造有如下优点：1.可以有效地抑制曼地亚红豆杉细胞14OH基因的表达。2.显著地降低了曼地亚红豆杉细胞中sinenxan A、sinenxan C、Yunnanxane这三种C-14位氧化紫杉烷的总含量，最高可降低到原来的这三种C-14位氧化紫杉烷总含量的75.7％。3.明显地抑制了曼地亚红豆杉细胞向C-14位氧化紫杉烷的流向，有望使代谢流向包括抗癌药物紫杉醇(taxol)和及其前体巴可亭III(baccatin III)在内的C-13位氧化紫杉烷(C-13oxygenated taxoids)，从而为提高红豆杉悬浮培养细胞紫杉醇的生物合成产量提供一条新方法。