高亲和力抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 的轻链和重链可 变区 技术领域 本发明属于生物医学技术领域， 涉及一种单克隆抗体， 特别涉及抗 SEB 单克隆抗 体 FMU-SEB-No.2 的轻链和重链可变区， 包括其氨基酸序列和核苷酸序列。
背景技术 生物威胁及其防御是目前世界各国最重要的国家安全关切问题之一， 也是军事医 学研究的重要领域之一。生物威胁主要包括生物战争和生物恐怖活动， 是指利用生物剂 ( 包括战剂 ) 故意对特定目标人群以及与人类生产生活密切相关的其他生物体 ( 如动物、 植 物 ) 和设施等发动袭击的行为。因此， 生物威胁不仅可以大量杀伤人、 畜， 而且造成的民众 心理恐慌、 社会混乱以及经济损失等都是十分巨大的。 尽管联合国制定的 《禁止生物武器公 约》 ) 存在， 但并没有有效遏止生物武器研制和发展的势头， 一些军事大国不断提高其生物 战能力， 拥有生物武器的国家和地区进一步增多， 国际生物威胁的形势日趋恶化。 构成生物 威胁的主要元素是生物剂， 而生物剂中最主要的是烈性病原体及其毒性产物 ( 毒素 )。
B 型葡萄球菌肠毒素 (Staphylococal enterotoxin B， SEB) 毒性大、 极少量毒素 侵入人或动物机体便会中毒， 对人、 动物及环境构成极大威胁。 1.7μg 的 SEB 就可杀死一个 成年人， 是被列入联合国 《禁止生物武器公约》 核查清单的 11 种生物毒素之一。美军 10 年 来的毒素战剂防治研究规划始终将 SEB 作为重要的研究对象之一， 重点研究 SEB 损伤治疗 性抗体和小分子抑制剂等， 但是也仅有多克隆抗体 (PcAb) 制备的报道， 治疗性单克隆抗体 (mAb) 仍然处于起步研究阶段。
抗体单体分子是由两条相同的重链 (H 链 ) 和两条相同的轻链 (L 链 )， 通过链间二 硫键连接而成的四肽链结构。H 链和 L 链包括氨基 (N) 端和羧基 (C) 端， 靠近 N 端的可变区 (V 区 ) 由高变区 / 互补决定区 (HVR/CDR) 和骨架区 (FR) 组成 ； 靠近 C 端为恒定区 (C 区 )。 重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL) 形成的蛋白质折叠是抗原结合部位， 其中的 CDR/HVR 是抗体与抗原决定基互补结合的部位， C 区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据 FR/C 区 不同可分为人源、 鼠源等， 鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性， 易引起人体的免疫反 应， 这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服 鼠源性抗体的缺陷， 需要构建高亲和力的特异性嵌合抗体、 单链抗体或人源化抗体。
在改造过程中， 最为重要的是首先必须获得具有良好特异性、 亲和力和中和活性 的鼠源性亲本抗体， 克隆其轻链和重链可变区基因， 然后将这两条基因进行改造， 构建重组 抗体基因。因此， 筛选出高亲和力、 具有中和活性的鼠源性抗 SEB mAb， 从中克隆出轻、 重链 可变区基因， 对进一步研制具有完全自主知识产权的紧急救治 SEB 毒素中毒的中和性基因 工程抗体制剂， 作为战略储备以填补我国、 我军在该领域的空白， 对于提升我军未来反生物 战、 反生物恐怖应对能力， 不仅具有极其重大的军事意义， 而且在平时食物中毒救治方面也 具有十分重要的实际应用价值。
发明内容 本发明解决的问题在于提供一种高亲和力抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 的轻 链和重链可变区， 包括其氨基酸和核苷酸序列， 为构建高亲和力、 具有中和活性的抗 SEB 嵌 合或人源化基因工程抗体提供支持。
本发明是通过以下技术方案来实现 ：
一种抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 的轻链和重链可变区， 所述轻链可变区的 3 个互补决定区 (CDR) 序列分别为 ：
CDR1 ： Ser-Ser-Val-Ser-Tyr ；
CDR2 ： Asp-Thr-Ser ；
CDR3 ： Gln-Gln-Trp-Ser-Gly-Asn-Pro-Pro-Met-Tyr-Thr ；
所述重链可变区的 3 个互补决定区 (CDR) 序列分别为 ：
CDR1 ： Gly-Phe-Ala-Phe-Ser-Asn-Tyr-Asp ；
CDR2 ： Ile-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Tyr-Ala ；
CDR3 ： Thr-Ser-His-Asp-Tyr-Gly-Ser-Thr-Tyr-Arg-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val。
所述的抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 的轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ. ID.NO.1， 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ.ID.NO.2 所示。
所述的编码 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 轻链可变区的基因序列如 SEQ.ID.NO.3 所示， 编码重链可变区的基因序列如 SEQ.ID.NO.4 所示。
所述的抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 的轻链和重链可变区应用于构建针对 SEB 的基因工程抗体或诊断试剂的制备。
与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ：
1、 本发明提供的抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 与 SEB 的亲和力高， 能够特异性 识别 SEB 并进行免疫反应， 动物体内外实验证实对 SEB 具有较强的中和能力 ；
2、 本发明克隆抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 的轻链、 重链可变区基因和氨基酸 序列， 序列分析证实了该抗体序列的惟一性。
3、 分析获得轻链、 重链可变区的 CDR 区， 在此基础上为构建高亲和力、 具有中和活 性的抗 SEB 嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
附图说明
图 1 是间接 ELISA 检测 FMU-SEB-No.2mAb 与 SEA、 SEB 和 SEC1 的交叉反应结果图 ； 图 2 是 FMU-SEB-No.2mAb 抑制 SEB 引起的小鼠脾细胞体外增殖实验结果图 ； 图 3 是 FMU-SEB-No.2mAb 体内中和 SEB 中毒的小鼠存活实验结果图 ； 图 4 是 FMU-SEB-No.2mAb 轻链可变区基因同源性序列检测结果 ； 图 5 是 FMU-SEB-No.2mAb 重链可变区基因同源性序列检测结果 ； 图 6 是 FMU-SEB-No.2mAb 轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果 ； 图 7 是 FMU-SEB-No.2mAb 重链可变区氨基酸同源性序列检测结果。具体实施方式
本发明用天然 SEB 免疫 Balb/c 小鼠， 制备了一组小鼠抗 SEB 的单克隆抗体， 从中筛选出能稳定分泌高亲和力抗 SEB 的 FMU-SEB-No.2mAb 杂交瘤细胞株， 制备腹水获得高亲 和力抗 SEB mAb ； 并确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其 CDR 序列 ； 为抗 SEB 嵌合 或人源化基因工程抗体提供支持。 下面结合具体单克隆抗体的制备方法、 抗体活性检测， 以 及序列的检测和唯一性的确定对本发明做详细说明， 所述是对本发明的解释而不是限定。 本发明具体按以下步骤实施 ：
1、 小鼠抗 SEB 高亲和力抗体 FMU-SEB-No.2mAb 的制备
1.1 单克隆抗体的制备、 纯化
按单克隆抗体制备方法 ( 细胞和分子免疫学实验技术第一版， P9-P17)， 用天然 SEB 免疫 Balb/c 小鼠 ( 购白第四军医大学实验动物中心 )， 初次免疫， 使用福氏完全佐剂， 后续免疫使用福氏不完全佐剂， 每次间隔 3 周， 均为皮下多点注射， 共免疫 4 次。末次免疫 7 ～ 10 天后采血测其效价， 检测免疫效果。间隔 2 ～ 3 周后， 经腹腔注射抗原再加强免疫， 3 天后处死动物取脾进行细胞融合。
取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 计数， 同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤 细胞与脾细胞按 1 ∶ 10 比例混合进行细胞融合。 融合后细胞悬液加入含有饲养细胞 ( 正常 Balb/c 小鼠腹腔巨噬细胞 ) 的 96 孔板， 37℃、 5％ CO2 孵箱培养。待克隆出现后， 间接 ELISA 检测， 挑选阳性克隆。 对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化， 直至获得能够 稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系 ( 体外连续培养超过 6 个月 )， 并对其分泌的抗体进行 Ig 亚 类测定 ( 结果为 IgG1 亚类， κ 型轻链 )。
在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后， 按小鼠腹水制备方法制备包含单 克隆抗体的腹水 ( 细胞和分子免疫学实验技术第一版， P9-P17)。腹水经 45 ％饱和硫酸 铵沉淀后， 采用 QFF 阴离子交换层析法纯化。用 SDS-PAGE 鉴定纯化抗体的纯度， 纯化的 FMU-SEB-No.2mAb 纯度达到 95％。
1.2 抗 SEB 单克隆抗体 FMU-SEB-No.2 的效价测定
用间接 ELISA 方法测定纯化前腹水以及纯化后 mAb 的相对亲和力。其中包被抗原 为天然 SEB， 待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后 mAb， 检测抗体为羊抗鼠 -HRP 酶标记抗 体， 底物使用 ABTS。所筛选出的高亲和力 FMU-SEB-No.2mAb， 腹水效价为 1×10-7， 纯化后效 -5 价为 0.6ng/ml， 而一般采用间接 ELISA 检测腹水效价达 1×10 以上的抗体即可使用。
1.3 间接 ELISA 检测 FMU-SEB-No.2mAb 与其他型别葡萄球菌肠毒素的交叉反应
分 别 用 2μg/ml SEA(A 型 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 )、 SEB、 SEC1(C1 型 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 ) 包 被 96 孔 ELISA 板， 100μl/ 孔， 4 ℃ 过 夜。0.05 ％ Tween20-PBS(PBST) 洗 涤 后， 将 FMU-SEB-No.2mAb 用含 0.1 ％ BSA 的抗体稀释液稀释至 0.5μg/ml 加入到 ELISA 板孔中， 100μl/ 孔， 37℃孵育 1h。 PBST 洗涤后， 加入工作浓度羊抗鼠 -HRP 酶标记抗体， 100μl/ 孔， 37℃孵育 45min， 行间接 ELISA。结果如图 1 所示， 其中， 纵坐标为 405nm 波长处的吸光度值 (A405)， 表示 FMU-SEB-No.2mAb 与不同抗原反应的程度， 可以看出 FMU-SEB-No.2mAb 仅特异 性地与 SEB 反应， 而与 SEA 和 SEC1 均无交叉反应。
1.4FMU-SEB-No.2mAb 体内外中和活性测定
通过抗 SEB 的 FMU-SEB-No.2mAb 抑制 SEB 引起的小鼠脾细胞体外增殖情况来确定 抗体的体外中和活性。取 8 周龄 Balb/c 小鼠的脾细胞悬液， 按 1×106/ 孔的浓度加入到培 养板当中， 加入 RPMI 1640 作为阴性对照组 ( 既不加 SEB、 也不加阻断抗体 )， 其余的培养孔分别设加入浓度为 200ng/ml 的 SEB 组、 SEB+FMU-SEB-No.2mAb 组 ( 浓度为 200μg/ml)、 SEB+PcAb( 针对 SEB 的多克隆抗体， 小鼠免疫血清 ) 组、 SEB+ 抗卵类粘蛋白 No.9( 无关抗体 对照 ) 组， 均与小鼠脾细胞共培养 5 天 (37℃， 5％ CO2)， 在倒置显微镜下观察对照孔细胞有 明显的增殖时 ； 用 MTT 法检测细胞增殖情况。检测结果如图 2 所示， 纵坐标为 490nm 波长处 的吸光度值 (A490)， 表示细胞增殖程度， RPMI 1640 组为阴性对照组， 相当于正常的脾细胞 增殖 ； 可以看出加入 SEB 后， 脾细胞在受到 SEB 的刺激之后， 与正常相比显示出明显的增殖 促进作用 ； 加入作为阻断抗体的 FMU-SEB-No.2mAb 与针对 SEB 的多克隆抗体对 SEB 的刺激 进行阻断， 细胞增殖效果与正常培养相当， 说明加入的阻断抗体能够完全阻断 SEB 对小鼠 脾细胞的刺激作用 ； 而作为对照抗体的抗卵类粘蛋白 No.9 则几乎无阻断作用， 细胞增殖效 果与 SEB 刺激组相当。
体重 14 ～ 17g 的 8 周龄 Balb/c 小鼠， 两只为一组， 以生理盐水作为阴性对照， anti-PTA1mAb 作 为 无 关 抗 体 对 照， 将 不 同 剂 量 FMU-SEB-No.2mAb(2μg、 20μg、 200μg、 2mg) 分别与 SEB(2μg) 预先混合 (PBS 稀释至 0.5ml)， 室温放置 1 小时， 小鼠腹腔注射 (0.5ml/ 只 ) ； 4 小时后腹腔注射 LPS(PBS 稀释至 75μg/0.5ml/ 只 )， 观察小鼠存活情况 4 天 (96 小时 )。具体结果如图 3 所示， 横坐标为观察的时间， 纵坐标为小鼠存活的个数， 可 以看出， 生理盐水对照和 anti-PTA1 对照抗体均不能保护小鼠， 24h 之后无小鼠存活 ； 注射 剂量为 2μg、 20μg、 200μg 的 mAb 组也不能保护小鼠， 显示相同的结果 ； 而注射剂量为 2mg mAb 组的两只小鼠一直存活， 说明注射剂量达到 2mg 之后， FMU-SEB-No.2mAb 可以有效保护 注射 SEB(2μg 相当于 8LD50) 小鼠的存活， 在体内表现出对 SEB 的中和活性。
2、 抗 SEB 的 FMU-SEB-No.2mAb 轻链和重链可变区基因的克隆
2.1FMU-SEB-No.2mAb 杂交瘤细胞的培养
按常规方法复苏 ( 细胞培养， 第一版， P88) 分泌 FMU-SEB-No.2mAb 的杂交瘤细胞， 用含 10％小牛血清的 RPMI 1640 培养基于 37℃， 5％ CO2 孵箱中培养至对数生长期。
2.2 总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成
采用 TRIZOL Reagent( 购自美国 GIBCO 公司 ) 提取总 RNA， 具体操作步骤按说明书 进行 ； cDNA 第一链合成试剂盒购自美国 GIBCO 公司， 在得到总 RNA 后按说明书进行反转录 合成 cDNA 第一链。
2.3RT-PCR 法扩增 FMU-SEB-No.2mAb 的 VL 和 VH 基因
一 步 法 RT-PCR 扩 增 试 剂 盒 购 自 TakaRa 公 司，按 试 剂 盒 说 明 书 扩 增 FMU-SEB-No.2mAb 的 VL 和 VH 基因 ；
利用 VL F( 上游引物 ) 和 VL B( 下游引物 ) 以及 VH F 和 VH B 两对引物， 以总 RNA 为模板进行 RT-PCR ；
反应体积 50μl， 反应条件为 ： 94℃ 5min ； 95℃ 30s， 58℃ 1min， 72℃ 1min， 循环 35 次； 72℃ 7min ； 引物序列为 ：
VL F ： gttagatctc cagcttggtc cc 22bp ；
VL B ： gacattcagc tgacccagtc tcca 24bp ；
VH F ： tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34bp ；
VH B ： aggtsmarct gcagsagtcw gg 22bp ；
(IUB 标准兼并碱基代码 ： s： c/g ； m： a/c ； r： a/g ； w： a/t)2.4PCR 扩增产物的克隆和筛选
PCR 产物经 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 用小量胶回收试剂盒 ( 购自上海华舜生物工程 有限会司 ) 回收 PCR 扩增片段， 用 DNA 连接试剂盒 ( 购自 TakaRa 公司 ) 将该片段按说明书， 利用加 A 尾插入 pMD-T18 载体 ( 购自 TakaRa 公司 ) 中， 连接物转化 E.coli( 购自中国普通 微生物菌种保藏中心， CGMCC， 北京 )， 接种在 Amp 抗性 LB 琼脂培养平皿中 37℃培养过夜。
挑取 LB 琼脂培养平皿中克隆， 在 Amp 抗性 LB 培养基中 37℃摇菌过夜， 以 1μl 菌 液为模板， 通过上述针对轻链、 重链可变区设计的引物， 用 PCR 法筛选重组阳性 E.coli 克 隆；
将所获得重组阳性 E.coli 克隆摇菌， 菌液送交上海生物工程技术服务有限公司 完成基因序列测定， 轻链可变区的基因序列如 SEQ ID NO.3 所示， 重链可变区的基因序列如 SEQ ID NO.4 所示。
3FMU-SEB-No.2mAb 轻链和重链可变区的核苷酸序列及同源性分析
3.1 确定测序无误后， 在 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 数据库中， 进行核苷酸序列同源 性分析 (Blastn)。
FMU-SEB-No.2mAb 轻链可变区基因与编号为 GeneID ： 100047316 的小鼠 Ig 轻链可 变区基因同源性最高， 达 254/272(93％ )， 如图 4 所示。 FMU-SEB-No.2mAb 重链可变区基因与编号为 GeneID ： 100043989 的小鼠 Ig 重链可 变区基因同源性最高， 为 268/280(95％ )， 如图 5 所示。
同源性分析表明， 编码 FMU-SEB-No.2mAb 的轻、 重链可变区的核苷酸序列， 尽管与 其它基因序列有一定同源性， 但未发现与本发明完全相同的基因序列， 表明本发明在基因 序列上具有惟一性。
3.2 将可变区基因翻译成氨基酸序列， 进行氨基酸序列分析
FMU-SEB-No.2mAb 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1， 重链可变区的氨基酸 序列如 SEQ ID NO.2 所示。
在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白质 数据库中， 进行氨基酸序列同源性分析 (Blastp)。
分析结果表明， FMU-SEB-No.2mAb 轻链氨基酸序列与编号为 qb|AAB00850.1 的小 鼠 BCR 同源性最高， 达 95/107(88％ )， 如图 6 所示。
FMU-SEB-No.2mAb 重链氨基酸序列与编号为 qb|AAO19048.1 的小鼠 Ig 重链可变区 蛋白的同源性最高， 为 103/122(84％ )， 如图 7 所示。
同源性分析表明， FMU-SEB-No.2mAb 轻、 重链可变区的氨基酸序列， 尽管与其它蛋 白氨基酸序列有一定同源性， 但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列， 表明本发明在氨 基酸序列上也具有惟一性。
3.3 利用 IMGT/V-QUEST 分析可变区结构， 确定 CDR 区。
将 测 序 所 得 FMU-SEB-No.2mAb 轻 链 和 重 链 可 变 区 序 列， 在 IMGT/V-QUEST 网 站 (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest) 进行分析， 得出其 CDR 区。
轻链可变区的 3 个互补决定区 (CDR) 序列， 如 SEQ ID NO.1 划线部分所示， 具体 为：
CDR1 ： Ser-Ser-Val-Ser-Tyr ；
CDR2 ： Asp-Thr-Ser ； CDR3 ： Gln-Gln-Trp-Ser-Gly-Asn-Pro-Pro-Met-Tyr-Thr ； 所述重链可变区的 3 个互补决定区 (CDR) 序列， 如 SEQ ID NO.2 划线部分所示， 具 CDR1 ： Gly-Phe-Ala-Phe-Ser-Asn-Tyr-Asp ； CDR2 ： Ile-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Tyr-Ala ； CDR3 ： Thr-Ser-His-Asp-Tyr-Gly-Ser-Thr-Tyr-Arg-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val。 4. 基因工程抗体设计 基于抗 SEB mAb FMU-SEB-No.2 的表达、 纯化以及序列分析， 设计构建以下生物制体为 ：
品 1) 单链抗体的构建 ： 可将本发明的 FMU-SEB-No.2mAb 轻、 重链可变区基因通过 linker 连接， 插入原核或真核表达载体， 转化宿主菌或转染真核细胞， 用于制备可对 SEB 中 毒有治疗作用的单链抗体。
2) 人 - 鼠抗 SEB 嵌合抗体的构建 ： 可将本发明的 FMU-SEB-No.2mAb 轻、 重链可变 区基因插入通用型嵌合抗体表达载体中， 获得含嵌合基因的载体转染真核细胞， 用于制备 可对 SEB 中毒有治疗作用的嵌合抗体。
3) 人源化抗体的构建 ： 可将本发明的 FMU-SEB-No.2mAb 轻、 重链可变区基因的 CDR 区移植到人源抗体可变区的骨架区 (FR) 中， 形成互补决定区 (CDR) 移植抗体 (CDR-grafted antibody)， 也称重构抗体 (reshaping antibody) 或人源化抗体 (humanized antibody)。
利用 CDR 移植技术改造抗体， 可以获得既保持鼠源性亲本 mAb 特异性， 又更加接近 人抗体的新型抗体， 用于制备可对 SEB 中毒有治疗作用的人源化抗体。
4) 可根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列， 制备针对 SEB 功能表位的其 它生物制品。
5) 可应用本发明的高亲和力 FMU-SEB-No.2mAb 制备测定环境中 SEB 含量的 ELISA 试剂盒， 可望在反恐、 食品检验中有广泛的应用价值。