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1、10申请公布号CN101942499A43申请公布日20110112CN101942499ACN101942499A21申请号200910054687622申请日20090710C12Q1/68200601C12Q1/02200601G01N21/7820060171申请人复旦大学地址200433上海市邯郸路220号72发明人吴庆赖纯米李克勇常秀丽周志俊74专利代理机构上海正旦专利代理有限公司31200代理人包兆宜54发明名称一种检测生殖细胞支持细胞共培养细胞凋亡的方法57摘要本发明属生物技术领域，涉及生殖细胞支持细胞共培养的细胞凋亡检测方法。本发明采用在培养皿中对短期共培养生殖细胞和支持细胞。
2、进行直接TUNEL染色，染毒，检测共培养中整体细胞凋亡情况。本发明在培养皿中直接进行TUNEL染色，可保持生殖细胞支持细胞共培养形态，准确地反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征；同时不需要细胞爬片涂片等需要相应技术的过程，提高了实验的成功率。本发明可用于利用生殖细胞支持细胞共培养系观察化学物的急性生殖毒性和细胞凋亡。经实验验证，方法可信。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN101942504A1/1页21一种检测化学物诱导生殖细胞支持细胞共培养细胞凋亡的方法，其特征是通过原代分离大鼠雄性睾丸生殖细胞和支持细胞，在培养皿中对生殖细胞。
3、和支持细胞共培养，染毒，直接在培养皿中用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法观察共培养系的细胞凋亡情况；其包括下述步骤1实验动物生殖细胞、支持细胞原代分离，培养皿中培养；2细胞凋亡染色和观察。2按权利要求1所述方法，其特征是，所述的步骤1中，常规处理实验动物雄性大鼠后75乙醇消毒，无菌条件下快速取两侧睾丸，置于盛有HBSS的小皿中，HBSS清洗后移入15ML的离心管，加入含100G/MLDNAASE、01胶原酶和01透明质酸酶的DMEM液作用20MIN；离心去上清，再加入含100G/MLDNAASE、01胶原酶的DMEM液30MIN，离心去上清，加DMEM液放置冰浴15MIN后吸出上清。
4、，加胰酶吹打，至显微镜下观察生精小管成单个的细胞后加入2FBS终止消化，离心去上清，加新鲜培养液2ML制成单细胞悬液；接种细胞于明胶铺面的培养皿中，置于5CO2、95空气饱和湿度培养箱中培养。3按权利要求2所述方法，其特征是，所述的步骤1中，所述的新鲜培养液含DMEM丙酮酸钠非必需氨基酸乳酸钠抗生素转铁蛋白LIF。4按权利要求2所述方法，其特征是，所述的步骤1中，所述的细胞接种密度为7080。5按权利要求1所述方法，其特征是，所述的步骤2中，共培养系培养后，吸出培养液，用4多聚甲醛固定细胞1H；吸去固定液，加PBS洗2次；加3H2O室温孵育10MIN；用PBS洗2次；加入含TDT和DIGDUT。
5、P的标记缓冲液；将培养皿置于湿盒中，37标记2小时；TBS液洗2次后加封闭液，室温孵育30MIN；吸去封闭液，不洗加1100生物素化抗地高辛抗体稀释液50L于标记区域，将培养皿置于湿盒中，37反应30MIN；用TBS洗2次后加1100SABC抗体稀释液50L于标记区域，将培养皿置于湿盒中，37反应30MIN；用TBS洗4次；加DAB显色液至液体为棕色，蒸馏水洗，不吸，倒置显微镜下观察结果。权利要求书CN101942499ACN101942504A1/4页3一种检测生殖细胞支持细胞共培养细胞凋亡的方法技术领域0001本发明属生物技术领域，涉及检测细胞凋亡的方法，具体涉及一种生殖细胞支持细胞共培养。
6、的细胞凋亡检测方法。背景技术0002睾丸生殖细胞和支持细胞共培养系由于模拟了体内过程，并能提高生殖细胞的存活率和促进生殖细胞的增殖生长，常用于对生殖细胞发育分化过程的研究，和培养生殖细胞用于移植。目前，利用该培养系探讨化学物的生殖毒性研究尚处于开始阶段。0003在探讨化学物毒性时，化学物对细胞凋亡的影响是常用指标。现有技术检测化学物毒性的方法中，其中染色体荧光染色法尽管简便，但标本不宜保存；用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL，只要DNA双链断裂或链上出现缺口，即可在末端转移酶TDT的作用下被标记，其灵敏度高，不需大型仪器，是目前探测细胞凋亡的常用方法。0004现有技术对培。
7、养细胞用TUNEL法时，细胞处理不外乎分为两种情况，一是对贴壁细胞采取细胞爬片，二是对悬浮细胞采取收集细胞后涂片。但是，有研究报道，在观察大鼠睾丸生殖细胞支持细胞共培养系的细胞凋亡时，由于共培养体系中既有贴壁的支持细胞又有悬浮的生殖细胞，给一般的观察方法带来了困难。同时由于共培养系中生殖细胞和支持细胞互相共存，收集细胞和爬片涂片将不能观察其整体凋亡情况。目前尚没有发现用TUNEL法探测大鼠睾丸生殖细胞支持细胞共培养中的细胞凋亡的报道。为此，本发明拟探索短期培养，直接在培养皿中对共培养细胞系进行TUNEL染色的方法。发明内容0005本发明是的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测细胞凋亡的方法，。
8、具体涉及一种生殖细胞支持细胞共培养的细胞凋亡检测方法。0006本发明采用在培养皿中对短期共培养生殖细胞和支持细胞进行直接TUNEL染色，检测共培养中整体细胞凋亡情况。0007具体而言，本发明提供的生殖细胞支持细胞共培养的细胞凋亡检测方法，其特征是通过原代分离大鼠雄性睾丸生殖细胞和支持细胞，在培养皿中对生殖细胞和支持细胞共培养，染毒，直接在培养皿中用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL观察共培养系的细胞凋亡情况，其包括下述步骤00081大鼠雄性生殖细胞、支持细胞原代分离，培养皿中培养00092细胞凋亡染色和观察0010本发明中，所述步骤1，实验动物生殖细胞、支持细胞分离培养为0。
9、011取新生雄性大鼠，常规处理后消毒，无菌条件下快速取两侧睾丸，置于盛有HBSS的小皿中，HBSS清洗后移入离心管，加入含100G/MLDNAASE、01胶原酶和01透明质酸酶的DMEM液作用20MIN；离心去上清，再加入含100G/MLDNAASE、01胶原酶的DMEM说明书CN101942499ACN101942504A2/4页4液作用30MIN，离心去上清，加DMEM液放置冰浴后吸出上清，加胰酶吹打，显微镜下观察生精小管成单个的细胞后加入2FBS终止消化，离心去上清，加入新鲜培养液，制成单细胞悬液用于细胞培养；将细胞接种明胶铺面的培养皿中，置于5CO2、95空气饱和湿度培养箱中培养。00。
10、12本发明中，所述步骤2细胞凋亡染色和观察为0013细胞处理在培养皿中，无需取出，按所定时间培养后，吸出培养液，用4多聚甲醛固定细胞，固定1H；按照TUNEL试剂盒市购所示操作。0014实验结果显示00151在不同的培养温度和不同培养时间下TUNEL染色细胞凋亡和预期一致。0016比较33培养2H，41培养2H和41培养14H的细胞凋亡情况，结果表明，41培养2H组和14H组所得凋亡的发生率均明显高于33培养2H组，经2检验其差异有统计学意义。00172在不同浓度镉暴露条件下TUNEL染色细胞凋亡的表现和预期一致。0018在培养系培养24小时使生殖细胞完全贴壁后，加入不同浓度镉0，25，5，1。
11、0M培养12小时观察细胞凋亡。结果显示，除了生殖细胞和支持细胞凋亡图像外，尚有支持细胞吞噬凋亡细胞图像见图3。0019本发明利用生殖细胞支持细胞共培养系观察化学物的急性生殖毒性和细胞凋亡，能克服在常规方法中收集细胞所引起的细胞形态改变的缺陷，可保持生殖细胞支持细胞不同形态共培养时的状态进行TUNEL染色，从而准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征；同时不需要细胞爬片涂片等需要相应技术的过程，提高了实验的成功率。附图说明0020图1是共培养的支持细胞与生殖细胞生长情况0021其中显示，培养2H，支持细胞开始贴壁，生殖细胞呈悬浮状；培养14H，可见多数支持细胞贴壁，生殖细胞贴附于支持细胞。0。
12、022图2为不同的培养温度和不同培养时间下TUNEL染色所示细胞凋亡图。0023图3是培养24小时染毒镉12小时后的细胞凋亡图0024其中显示，除了生殖细胞和支持细胞凋亡图像外，尚有支持细胞吞噬凋亡细胞图像。具体实施方式0025实施例100261实验动物生殖细胞、支持细胞分离培养0027取生后新生雄性大鼠，常规处理后75乙醇消毒，无菌条件下快速取两侧睾丸，置于盛有HBSS的小皿中，解剖镜下仔细去除每个睾丸的脂肪组织、附睾、睾丸被膜及血管，HBSS清洗后移入15ML的离心管，加入相当于组织体积10倍的含100G/MLDNAASE、01胶原酶和01透明质酸酶的DMEM液作用20MIN。离心去上清，。
13、再加入含100G/MLDNAASE、01胶原酶的DMEM液作用30MIN，离心去上清，加DMEM液放置冰浴15MIN后吸出上清，加胰酶吹打，至显微镜下观察生精小管成单个的细胞后加入2FBS终止消化，离心去上清，说明书CN101942499ACN101942504A3/4页5加入2ML新鲜培养液DMEM丙酮酸钠非必需氨基酸乳酸钠抗生素转铁蛋白LIF制成单细胞悬液用于细胞培养。将细胞接种于已用明胶铺面的培养皿中，细胞接种密度为7080，置于5CO2、95空气饱和湿度培养箱中培养。00282细胞凋亡染色和观察0029细胞处理在培养皿中，无需取出，按所定时间培养后，吸出培养液，用4多聚甲醛固定细胞，固。
14、定1H。按照TUNEL试剂盒所示，吸去固定液，加PBS洗2次；加3H2O室温孵育10MIN；用PBS洗2次；加入含TDT和DIGDUTP的标记缓冲液试剂阴性对照加不含TDT酶的反应液，将培养皿置于湿盒中，于37标记2小时；TBS液洗2次后加封闭液，室温孵育30MIN；吸去封闭液，不洗加1100生物素化抗地高辛抗体稀释液50L于标记区域，将培养皿置于湿盒中，37反应30MIN；用TBS洗2次后加1100SABC抗体稀释液50L于标记区域，将培养皿置于湿盒中，37反应30MIN；用TBS洗4次；加DAB显色液显色至培养皿中的液体变为棕色约15MIN，蒸馏水洗，不吸，倒置显微镜下观察。0030实验结。
15、果显示00311，在不同的培养温度和不同培养时间下TUNEL染色细胞凋亡和预期一致。0032据文献报道支持细胞、精原细胞共培养在33培养2H细胞凋亡发生率不超过2，而在41培养将发生明显凋亡，因此本发明比较了33培养2H，41培养2H和41培养14H的细胞凋亡情况。结果表明，41培养2H组和14H组所得凋亡的发生率均明显高于33培养2H组，经2检验其差异有统计学意义。0033表1为单盲法在标记染色的区域内选3个视野每组均选择同一位置的视野并计数每个视野的凋亡细胞和总细胞数每个视野至少100个细胞所得细胞凋亡率。0034表1003500362，在不同浓度镉暴露条件下TUNEL染色细胞凋亡的表现和预期一致。0037在培养系培养24小时使生殖细胞完全贴壁后，加入不同浓度镉0，25，5，10M培养12小时观察细胞凋亡。结果显示，除了生殖细胞和支持细胞凋亡图像外，尚有支持细胞吞噬凋亡细胞图像见图3。0038表2是镉染毒后细胞凋亡增加，呈剂量依赖关系，经2检验其差异有统计学意义。0039表20040说明书CN101942499ACN101942504A4/4页60041为25M组与0M组比较0042为25M组与50M组比较0043为50M组与100M组比较说明书CN101942499ACN101942504A1/1页7图1图2图3说明书附图CN101942499A。