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1、10申请公布号CN104178472A43申请公布日20141203CN104178472A21申请号201310204308322申请日20130528C12N9/42200601C12P19/1420060171申请人中国科学院青岛生物能源与过程研究所地址266101山东省青岛市崂山区松岭路189号申请人北京旭阳化工技术研究院有限公司72发明人英瑜张英伟李福利孙长江孟冬冬杨雪岗74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人周秀梅李颖54发明名称降解纤维素的酶及其构建和应用57摘要本发明涉及纤维素酶，具体的说是一种降解纤维素的酶及其构建和应用。降解纤维素的酶为序列表SEQIDN。
2、O1或序列表SEQIDNO2中氨基酸所示。本发明可以快速表达得到来源于热解纤维素菌的纤维素的生物转化的酶，且具有高的热稳定性、高的比酶活以及长的半衰期。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表6页附图1页10申请公布号CN104178472ACN104178472A1/1页21一种降解纤维素的酶，其特征在于降解纤维素的酶为序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中氨基酸所示。2按权利要求1所述的降解纤维素的酶，其特征在于所述降解纤维素的酶为内切纤维素酶和地衣聚糖酶；其中，内切纤维素酶和地衣聚糖酶。
3、的氨基酸序列为，序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中所示。3按权利要求1或2所述的降解纤维素的酶，其特征在于所述内切纤维素酶和地衣聚糖酶为与序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中所示氨基酸具有80以上同源性的片段。4一种权利要求1所述的降解纤维素的酶的构建方法，其特征在于将含有内切纤维素酶或地衣多糖酶基因的重组表达载体分别导入宿主细胞，表达得到序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中所示的内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列。5按权利要求4所述的降解纤维素的酶的构建方法，其特征在于所述作为重组表达载体的出发载体为PEASYE1、PET22B、PET28、PET32。
4、、PQE30、PGEX4T2、PBR322或PUC18。6一种按权利要求1所述的降解纤维素的酶的应用，其特征在于所述序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中氨基酸所示酶可作为用于纤维素的生物转化。7按权利要求6所述的降解纤维素的酶的应用，其特征在于所述内切纤维素酶可作为外切酶。权利要求书CN104178472A1/7页3降解纤维素的酶及其构建和应用技术领域0001本发明涉及纤维素酶，具体的说是一种降解纤维素的酶及其构建和应用。背景技术0002纤维素酶在造纸、食品、饲料、纺织和能源等工业领域都有着广泛的应用价值。纤维素酶可以将纤维素降解为寡糖或单糖。纤维素酶可以分为内切纤维素酶、外切纤维。
5、素酶、和葡萄糖苷酶。内切纤维素酶又称内切1,4葡聚糖酶（EC3214）,专一性切断纤维素的葡聚糖链中14糖苷连键，产生低聚合度的葡聚糖或纤维寡糖。地衣聚糖酶，又称1,31,4葡聚糖酶（EC32173），具有严格的底物专一性，它专一性切断1,31,4葡聚糖中与3O吡喃葡萄糖基团相连接的1,4糖苷键。00031,31,4葡聚糖是禾本科植物细胞壁的组成成分，尤其在谷类植物（如小麦、大麦、玉米、水稻等）胚乳细胞壁中大量存在。嗜热的地衣聚糖酶，在工业生产中拥有巨大优势，比如在酿造和动物饲料工业中。在啤酒发酵过程中，禾本科植物内源的地衣聚糖酶是热失活的；因此，添加外源地衣聚糖酶可以酶解混合连键的高分子量的。
6、葡聚糖，从而降低发酵液的黏度，提高过滤速度及提取产率，同时也会避免啤酒成熟过程中产生沉淀。在动物饲料工业，特别是肉鸡以及猪的饲料工业生产中，添加外源地衣聚糖酶可以促进动物消化，降低卫生清洁。0004木质纤维素主要由纤维素和半纤维素构成，是地球上最丰富的纤维素来源。在木质纤维素的生物转化及加工过程中，往往需要高温条件，耐高温纤维素酶可以直接用于高温条件下的生物质加工与转化。并且，由于这些耐高温的酶具有热稳定性好，半衰期长等优点，因此可以提高酶的使用效率，在生产上降低酶的用量，减少生产成本。所以，耐高温纤维素酶受到越来越广泛的重视。0005极端嗜热厌氧菌解糖热解纤维素菌属于木质纤维素降解菌，无纤维。
7、小体结构，具有游离作用的木质纤维素酶系，可作为耐热纤维素酶的产酶菌株。同时，产生耐高温纤维素酶的微生物在培养过程中具有不易受其他微生物污染、高温条件可以降低发酵液粘度而易于搅拌、底物和产物都有较高的可溶性并能降低冷却费用等优点。发明内容0006本发明目的在于提供一种降解纤维素的酶及其构建和应用。0007为实现上述目的，本发明采用的技术方案为0008一种降解纤维素的酶，降解纤维素的酶为序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中氨基酸所示。0009所述降解纤维素的酶为内切纤维素酶和地衣聚糖酶；其中，内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列为，序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中所示。。
8、0010所述内切纤维素酶和地衣聚糖酶为与序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中所示氨基酸具有80以上同源性的片段。说明书CN104178472A2/7页40011降解纤维素的酶的构建方法，将含有内切纤维素酶或地衣多糖酶基因的重组表达载体分别导入宿主细胞，表达得到序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中所示的内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列。0012所述作为重组表达载体的出发载体为PEASYE1、PET22B、PET28、PET32、PQE30、PGEX4T2、PBR322或PUC18。0013降解纤维素的酶的应用，所述序列表SEQIDNO1或序列表SEQIDNO2中氨基酸。
9、所示酶可作为用于纤维素的生物转化。所述内切纤维素酶可作为外切酶。0014本发明所具有的优点本发明可以快速表达得到来源于热解纤维素菌的纤维素的生物转化的酶，且具有高的热稳定性、高的比酶活以及长的半衰期。附图说明0015图1为本发明实施例提供的SDSPAGE检测纯化蛋白的分子量大小电泳图谱。具体实施方式0016实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。0017下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。0018实施例1、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的获得及其原核表达载体的构建0019该基因的克隆过程及其原核表达载体的构建。
10、过程包括以下步骤0020一、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的克隆0021经过全基因组测序，内切纤维素酶设计如下引物0022CFATGAAGAAAGAATGTCTTAGAGTTTTTGC0023CRTTACATCTTTCCTGTAAGTTCTAAAATTTTG0024根据地衣聚糖酶的基因，设计如下引物0025EFTCCAGTAACAGAGCCAAAATTCC0026ERTGTTGCTACACACCTCCCTT0027以提取的解糖热解纤维素菌，如解糖热解纤维素菌DSM8903（德国微生物菌种保藏中心，GERMANCOLLECTIONOFMICROORGANISMSANDCELLCULTURES,DS。
11、MZ），解糖热解纤维素菌CGMCC15183（中国普通微生物菌种保藏管理中心，CHINAGENERALMICROBIOLOGICALCULTURECOLLECTION，CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），总基因组DNA为模板，分别以CF与CR；EF与ER为引物对，通过PCR的方式扩增得到目的基因片段。0028扩增内切纤维素酶的PCR反应体系为50L，包括细菌基因组DNA1L；10PCRBUFFER5L；DNTPMIXTURE（各25MM）4L；引物CF（20M），1L；引物CR（20M），1L；LATAQPOLYMERASE（5U/L）05L；加DDH2O至总体系为50L。PC。
12、R扩增条件如下94C预变性5MIN，94C变性30SEC，54C退火45SEC，72C延伸150SEC，循环30次，72C延伸10MIN。0029扩增地衣聚糖酶的PCR反应体系为50L，包括细菌基因组DNA1L；10PCRBUFFER5L；DNTPMIXTURE（各25MM）4L；引物EF（20M），1L；引物ER（20M），1L；LATAQPOLYMERASE（5U/L）05L；加DDH2O至总体系为50L。PCR扩增条件如说明书CN104178472A3/7页5下94C预变性5MIN，94C变性30SEC，56C退火45SEC，72C延伸90SEC，循环30次，72C延伸10MIN。003。
13、0解糖热解纤维素菌来源的内切纤维素酶具有多个结构域，其催化结构域属于糖苷水解酶5家族，另外，还具有1个碳水化合物结合结构域和3个SLAYERHOMOLOGY结构域。0031解糖热解纤维素菌来源的地衣聚糖酶，属于糖苷水解酶5家族。0032二、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因表达载体的构建0033将步骤一经PCR获得的基因片段分别连接到表达载体PEASYE1中，将含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的连接产物分别转化大肠杆菌ECOLIBL21DE3，经PCR和测序鉴定后将含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的阳性克隆质粒分别命名为PEASYE1JX030399和PEASYE1KC958563，可用其进行内切纤。
14、维素酶和地衣聚糖酶的表达。0034实施例2、内切纤维素酶和地衣聚糖酶的表达、纯化0035将实施例1获得的含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的原核表达载体PEASYE1JX030399和PEASYE1KC958563分别转化大肠杆菌ECOLIBL21DE3，挑选阳性单克隆在37C下摇菌至OD600为05后，加入1MMIPTG诱导，10小时后离心收集菌体，含有目的蛋白的菌体按1G菌体加入4ML磷酸盐缓冲液50MMNAH2PO4,300MMNACL,PH80，同时加入蛋白酶抑制剂，溶菌酶（10MG/ML）,细胞充分悬浮后采用超声波法破碎细胞。所得细胞破碎液经4C、10000G离心20MIN，所得上清经。
15、022M滤膜过滤后即为粗酶液。0036进行蛋白纯化，具体方法为NINTASEFINOSE柱中的乙醇流出后，加入总体积为10ML的无菌水，每次加入2ML。加入总体积10ML的磷酸盐缓冲液50MMNAH2PO4,300MMNACL,PH80，每次加入2ML。加入粗酶液，并穿透3次。加入磷酸缓冲液50MMNAH2PO4,300MMNACL,PH80，直至流出液中无蛋白。然后依次加入咪唑浓度逐渐升高的洗脱缓冲液50MMNAH2PO4，300MMNACL，咪唑浓度分别为25MM、50MM、100MM、250MM，PH80各5ML，并收集蛋白组分，每次收集1ML。将经纯化所得的内切纤维素酶和地衣聚糖酶进行。
16、SDSPAGE电泳进行验证，纯化结果如图1所示，所获得的内切纤维素酶JX030399分子量为85KDA，地衣聚糖酶KC958563分子量为437KDA。0037SEQIDNO10038MKKECLRVFAVFMVFTFLLSLFPFVTFAQNTAYEKDKYPHLIGNSLVKKPSVAGRLQIIKQNGRRILADQNGEPIQLRGMSTHGLQWFPQIINNNAFAALANDWGCNVIRLAMYIGEGGYATNPQVKDKVIEGIKLAIQNDMYVIVDWHVLNPGDPNAEIYKGAKDFFKEIAQKFPNDFHIIYELCNEPNPTDPGVTNDEAGWKKVKA。
17、YAEPIIKMLRQMGNENIIIVGSPNWSQRPDFAIKDPIADDKVMYSVHFYTGTHKVDGYVFENMKMAIEAGVPVFVTEWGTSEASGDGGPYLDEADKWLEYLNANNISWVNWSLTNKNETSGAFVPYISGVSQATDLDPGSDQKWDISELSISGEYVRSRIKGIPYQPIERTLKISQDQVACAPIGQPILPSDFEDGTRQGWDWDGPSGVKGALTIEEANGSNALSWEVEYPEKKLQDGWASAPRLILRNINTTRGDCKYLCFDFYLKPKQATKGELAIFLAFAPPSLNYWAQAEDSFNID。
18、LSNLSTLKKTPDDLYSFKISFDLDKIKEGKIIGPDTHLRDIIIVVADVNSDFKGRMYLDNVRFTNMLFEDVTPQTTGYEAISKLYSKKIVNGISTNLFGPEKAVTRAEVAAMAVRLLDLQEESYNGEFTDVSKNSWYANEVSTAYKAGIILGDGKYIKPEKAVTREEMAVFAMRIYRILTDEKAEATEEIAISDKNSISSWARQDVNAAISLGLMDVFTDGSFGPKAKVARAEATQIIYKILELTGKM0039（A）序列特征0040长度756说明书CN104178472A4/7页60041类型氨基酸序列0。
19、042链型单链0043拓扑结构线性0044（B）分子类型蛋白质0045（C）假设否0046（D）反义否0047（E）最初来源解糖热解纤维素菌0048结构特点69325为糖苷水解酶5家族结构域，352572为碳水化合物结合结构域，576618、636677、701742为3个SLAYERHOMOLOGY结构域。0049SEQIDNO20050SSNRAKIPEIKIASRKIPNNAALKFVKDMKIGWNLGNTFDAAFENPSFDDELLYETAWCGVKTTKQMIDTVKKAGFNTIRIPVSWHNHVTGSNFTISKRWLDRVQQVVDYAMKNKMYVIINIHHDIMPG。
20、YYYPNSQHLQTSIKYVKSIWTQVATRFKNYNDHLIFEAVNEPRLTGSRFEWWLDMNNPECRDAVEAINKLNQVFVDTVRSTGGNNVSRYLMVPGYAAAPEYVLIDEFKIPKDSSKYKNRIIISVHAYRPYNFALQAPNESGSVSEWSVNSEESRRDIDYFMDKLYDKFVSKGIPVVIGEFGARDKNGNLQSRVEFAAYYVRAARARGITCCWWDNNAFYGNGENFGLLDRKTLKWVYPEIVSAMMKYAR0051（A）序列特征0052长度3780053类型氨基酸序列0054链型单链0055拓扑结构线性00。
21、56（B）分子类型蛋白质0057（C）假设否0058（D）反义否0059（E）最初来源解糖热解纤维素菌0060结构特点54347为糖苷水解酶5家族结构域0061实施例3、酶学特性检测0062按实施例2的方法纯化后分别得到内切纤维素酶和地衣聚糖酶，然后分别使用10KDA超滤管置换缓冲液（200MM乙酸乙酸钠盐缓冲液，PH56），以去除酶液中的咪唑，分别获得内切纤维素酶和地衣聚糖酶酶液。0063利用上面获得内切纤维素酶和地衣聚糖酶，分别进行下述反应进行酶学特性鉴定0064以滤纸、羧甲基纤维素钠、木聚糖、微晶纤维素、地衣多糖和大麦葡聚糖为底物测定蛋白酶活时使用35二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖的。
22、生成量。检测滤纸酶活时，150L反应体系中加入5MGWHATMANNO1滤纸作为底物，其他底物的总添加量为1（W/V）。0065浓度为32G/ML的内切纤维素酶溶液和2G/ML的地衣聚糖酶溶液各取50L，加入到乙酸乙酸钠缓冲液（200MM乙酸乙酸钠盐缓冲液，PH56）中，75C反应30分钟后加入200LDNS溶液，煮沸5分钟，冷却后加入650L水并混匀，取200L加入到酶标说明书CN104178472A5/7页7板中，测其在540NM的吸收值。以0、01、02、03、04、05、06、07、08、09、1MG/ML的葡萄糖或木糖为标准样品，以DNS法测得的吸光度值与糖浓度绘制标准曲线，根据标准。
23、曲线计算所得样品还原糖的量。0066葡萄糖标准曲线Y9783X00009R2099780067木糖标准曲线Y11406X00049R2099870068其中，X为葡萄糖或木糖浓度，MG/ML；Y为对应糖浓度下的540NM的吸收值。0069一个酶活单位定义为每分钟水解底物产生1MOL还原糖所需的酶量。比酶活力定义为酶活与对应蛋白量的比值。酶活反应体系如表1所示。0070表1酶活反应体系0071组分空白实验对照组样品组样品对照组缓冲液150L50L100L底物100L100L酶液50L50L0072再分别以1MM的对硝基苯D吡喃半乳糖苷（PNPG）、对硝基苯D纤维二糖苷PNPC和对硝基苯D吡喃木糖。
24、苷PNPX溶液为底物测定酶活。0073取经适当稀释的酶溶液加入乙酸乙酸钠缓冲液中，75C反应30分钟后加入450L饱和硼酸钠溶液并混匀，取200L加入到酶标板中，测其在405NM的吸收值。以TRISHCL（50MM，PH90）溶液稀释1MG/ML的对硝基苯酚标准样品，使其终浓度为020G/L，取200L加入到酶标板中，测其在405NM的吸收值以绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶解反应所得对硝基苯酚的量。0074对硝基苯酚标准曲线Y0086X00803R209990075其中，X为对硝基苯酚的浓度UG/ML；Y为对应对硝基苯酚浓度下的405NM的吸收值。0076一个酶活单位定义为每分钟水解底物产生。
25、1MOL对硝基苯酚所需的酶量。比酶活力定义为酶活与对应蛋白量的比值。酶活反应体系如表1所示。0077试验一、内切纤维素酶和地衣聚糖酶的最适反应PH值、最适反应温度及在最适反应条件下半衰期的确定0078在75C测定蛋白在不同PH范围（PH46、5、56为200MM的乙酸乙酸钠缓冲液；PH6、66、7、76、8为PC缓冲液（50MM磷酸，12MM柠檬酸）的酶活，确定其最适反应PH值；在其最适反应PH值条件下测其在不同温度范围（55、60、65、70、75、80C）的酶活，确定其最适反应温度。最适反应条件下半衰期的测定方法为将酶置于其最适反应条件下，每隔一段时间测定残余酶活，残余酶活为50时的取样时。
26、间即为此条件下的半衰期。0079表2JX030399蛋白和KC958563蛋白的酶学性质检测0080说明书CN104178472A6/7页80081试验二、内切纤维素酶和地衣聚糖酶的底物特异性测定0082JX030399蛋白在最适条件下（75C，PH56）分别以DNS法和PNP法测定其底物特异性，反应体系如表1。实验结果如表3所示。JX030399蛋白以羧甲基纤维素钠为底物时，测得其酶活为1711U/MG，其分别以微晶纤维素AVICELPH101和对硝基苯纤维二糖苷PNPC为底物时的酶活为1011U/MG和1043U/MG。结果表明JX030399蛋白为具有较高外切纤维素酶活性的持续性内切纤维。
27、素酶。0083表3JX030399蛋白的底物特异性分析00840085KC958563蛋白在最适条件下（80C，PH56）分别以DNS法和PNP法测定其底物特异性，反应体系如表1。实验结果如表3所示。KC958563蛋白以大麦葡聚糖和地衣多糖为底物时酶活较高，分别为1284IU/MG和627IU/MG，其它酶活较低。0086表4KC958563蛋白的底物特异性分析0087底物比酶活IU/MG大麦葡聚糖12840311484地衣多糖627837木聚糖649026磷酸溶胀纤维素179001对硝基苯D纤维二糖苷036002羧甲基纤维素钠019003微晶纤维素PH101018011说明书CN10417。
28、8472A7/7页90088实施例40089利用上述实施例2纯化得到内切纤维素酶，对微晶纤维素或未经预处理的小麦秸秆进行降解处理0090具体是，以未经预处理的小麦秸秆或微晶纤维素作为底物，用上述实施例2纯化得到内切纤维素酶分别进行酶解处理；0091取10GJX030399蛋白溶于PH56的醋酸盐缓冲液体系中，加入50MG固体底物，总反应体系为1ML，酶解温度为75C，酶解时间分别为1、3、6、12、24、36小时。测定不同酶解时间时上清中的葡萄糖和纤维二糖含量。0092酶解微晶纤维素AVICELPH101得到葡萄糖的量为33MOL/NMOL酶，产生纤维二糖的量为91MOL/NMOL酶。酶解未经预处理小麦秸秆产生葡萄糖的量为35MOL/NMOL酶，产生纤维二糖的量为093MOL/NMOL酶。说明书CN104178472A1/6页1000010002序列表CN104178472A102/6页110003序列表CN104178472A113/6页120004序列表CN104178472A124/6页130005序列表CN104178472A135/6页140006序列表CN104178472A146/6页150007序列表CN104178472A151/1页16图1说明书附图CN104178472A16。