成年食蟹猴骨髓间充质干细胞体外培养及病毒转染的方法 【技术领域】
本发明涉及骨髓间充质干细胞的体外培养以及对其病毒转染的方法，更具体地涉及感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞体外培养以及对其病毒转染的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，是具有自我复制、多向分化潜能的成体干细胞。在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力；同时，MSC还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化。这突破了MSC仅为中胚层干细胞的概念，揭示了MSC具有更为重要的理论研究意义和更为广阔的应用前景。骨髓MSC体外分离培养容易获取，细胞免疫原性低，易于被外源病毒转染且表达稳定，已成为组织工程、基因治疗和再生医学研究中理想的种子细胞。间充质干细胞的应用大多是通过细胞直接自体移植或细胞体外扩增并自体移植的方式进行。
无论是利用骨髓MSC作为移植细胞或者基因工程的载体细胞，其治疗或使用的方法以及效果和疗效都需要经过大量的实验进行验证。但以病患者为直接研究对象进行科学研究受到诸多因素的制约，尤其是伦理学方面的限制。因此，需要首先在实验动物的身上确定各种治疗方法的疗效。
在所有的实验动物中，普遍认为灵长类哺乳动物是与人类最接近的动物。食蟹猴作为一种近年来大规模饲养的猴科灵长类哺乳动物，在各种治疗方法和药物的临床前实验中，发挥着越来越重要的作用。但是在对某些疾病的治疗方法的研究中，又必须以成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴为对象，如老年痴呆等一些在成年人和老年人中才发生的疾病，只有以成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴为研究对象来进行病毒转染后的细胞移植，获得的实验数据才更有价值。
在以食蟹猴为对象研究骨髓间充质干细胞的应用中，我们发现成年食蟹猴的骨髓MSC在体外传代代数非常有限，细胞很快融合，在体外食蟹猴的骨髓MSC很难扩增到需要的数量。成年食蟹猴的骨髓MSC体外培养不过3代就出现大片的细胞融合。无法进行细胞数量的扩增以及体外的基因工程改造的实验。
【发明内容】
本发明的目的之一是通过对成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞的体外培养条件的改进，大幅地提高成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞在体外培养的扩增数量，以使细胞数量更易达到需要的量。
本发明的另一目的通过对转染条件的改进，从而提高慢病毒对成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞的转染效率。
本发明提供一种体外培养成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞的方法，包括：I)对来自成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞进行原代培养；II)当细胞生长到70％～80％的汇合度时，进行消化，传代及培养；III)每当所述传代培养的细胞生长到70％～80％汇合度时，再次进行消化，传代及培养；所述传代培养使用的是基础培养基，在所述基础培养基中添加有胎牛血清、青霉素和链霉素；其特征在于：所述传代培养的基础培养基中还添加有抗病毒药物。
在一种优选的实施方式中，所述抗病毒药物优选是抗逆转录病毒药物。
在一种优选的实施方式中，所述抗逆转录病毒药物优选是泰诺福韦。
在一种优选的实施方式中，向所述基础培养基中优选添加FGF-b或者FGF-b与EGF的混合物。
在一种优选的实施方式中，所述FGF-b或者所述EGF分别优选是重组人类FGF-b或者重组人类EGF。
在一种优选地实施方式中，优选所述基础培养基中还添加GlutaMAX-I二肽，所述基础培养基优选是αlpha改进型MEM培养基。
在一种优选的实施方式中，所述胎牛血清优选是骨髓间充质干细胞专用胎牛血清。
一种体外培养成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞和体外病毒转染的方法，包括：I)对来自成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞进行原代培养；II)当细胞生长到70％～80％的汇合度时，进行消化，传代及培养；III)每当所述传代培养的细胞生长到70％～80％汇合度时，再次进行消化，传代及培养；IV)当细胞生长到第3-5代时，对所述成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞进行病毒转染；所述传代培养使用的是基础培养基，在所述基础培养基中添加有胎牛血清、青霉素和链霉素、以及抗病毒药物；其特征在于：在进行步骤IV)的病毒转染前的第2-6天将添加有胎牛血清、青霉素和链霉素、以及抗病毒药物的所述基础培养基更换为不含抗病毒药物的添加有胎牛血清、青霉素和链霉素的基础培养基。
在一种优选的实施方式中，所述抗病毒药物优选是抗逆转录病毒药物。
在一种优选的实施方式中，所述抗逆转录病毒药物优选是泰诺福韦。
在一种优选的实施方式中，所述病毒优选是慢病毒。
应用本发明的方法，所述成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞经培养后，使得细胞能够传代的代数增多，并使得扩增能够得到的细胞数量明显增多。
应用本发明提供的体外培养成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞以及对其体外病毒转染的方法，可以明显提高病毒对成年灵长类哺乳动物，尤其是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞的转染效率。
【附图说明】
图1A和图1B分别为本发明的实施例1和对比例1中的细胞生长到第二代时的照片，图1A中显微镜的放大倍数为100倍，图1B中为200倍。
图2是本发明的实施例1和对比例1中的细胞在体外进行扩增后的细胞数量增长的折线图。
图3是本发明的实施例2、3和对比例2中的细胞在体外进行扩增后的细胞数量增长的柱状对照图。
图4是本发明的实施例4和对比例3、4、5中的细胞在体外进行扩增后的细胞数量增长的柱状对照图。
图5是本发明的实施例5和对比例6和7中的细胞在体外进行扩增后的细胞数量增长的柱状对照图。
图6是本发明的实施例6和对比例8中的细胞在体外进行扩增后的细胞数量增长的折线图，◆代表实施例6中的细胞在体外扩增的数量，▲代表对比例8中的细胞在体外扩增的数量。
图7示出了本发明的实施例7和对比例9中的细胞在以慢病毒为载体进行转染后，表达GFP蛋白的阳性细胞百分比。
图8示出了本发明的实施例7和对比例9中的细胞在以慢病毒为载体进行转染后，在荧光显微镜下所观察到的细胞，在图8B和8G中显微镜的放大倍数为200倍，在图8D和8I中放大倍数为100倍。
图9示出了本发明中使用的包装质粒CMVΔ8.91的基因构建图(9A)，包装质粒PMD.G的基因构建图(9B)，载体质粒Duet101的基因构建图(9C)。
【具体实施方式】
在本发明的实验中使用了6只8-10岁的成年食蟹猴，其猴泡沫病毒的感染率为100％。这些成年食蟹猴均来自广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司，该公司的动物实验设施已获得国际实验动物管理评估及认证协会(Association for Assessment and Accreditationof Laboratory Animal Care，AAALAC)的资质认证。在本发明中，成年骨髓间充质干细胞来自成年食蟹猴，这些成年骨髓间充质干细胞可以是如下步骤所述而取自活的成年食蟹猴，当然也可以是取自刚刚处死的动物体。取成年食蟹猴骨髓间充质干细胞的过程如下：
1)将骨穿刺针、纱布、手术铺巾消毒灭菌；
2)氯胺酮(15mg/kg)肌注，动物麻醉；
3)阿托品(0.04mg/kg)肌注，减少分泌物；
4)备皮、消毒、铺手术巾、确定髂后上棘、用利多卡因(2-3ml)局部麻醉；
5)调节骨穿刺针，骨穿刺针与骨面垂直穿刺，固定穿刺针在髂骨内；
6)拔出针芯，用含肝素化生理盐水的注射器抽取5-10ml骨髓，混匀；
7)拔出穿刺针，无菌纱布局部按压3-5min后，用纱布加压固定。术后使用头孢唑啉(25mg/kg)静脉滴注，预防感染；
8)根据取出骨髓的量，用体积为骨髓体积两倍的DPBS稀释，混匀；
9)在15ml离心管中加入3ml密度为1.073的Ficoll-PaqueTMPlus分离液(Stem Cell公司)；
10)用巴斯德管缓慢加入6ml稀释后的骨髓，轻轻叠加到Ficoll-PaqueTMPlus分离液上；
11)2500rpm离心30分钟，离心管内分成4层，从上到下分别是血清、单核细胞、Ficoll-PaqueTMPlus分离液和红细胞；
12)用巴斯德管吸取离心管中间的单核细胞层，转移至新的15ml离心管；
13)根据吸取的单核细胞悬液体积，按照1∶3～1∶5的体积比加入DPBS，混匀，1500rpm离心10min，弃去上层的液体，如此洗细胞两次；
14)将获得的单核细胞悬液接种，在含5％CO2，37℃孵箱中培养3天后更换培养基；
15)培养7-10天，当细胞长到70％～80％时，用0.25％Trypsin(胰酶)-EDTA消化，传代培养。
本发明人发现成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞在体外传代培养的过程中，不超过3代就会出现大片融合细胞的现象，这是因为成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞大多感染了猴泡沫病毒(SimianFoamy Virus，SFV)(通常幼年食蟹猴SFV的感染率明显低于成年食蟹猴)。因此，向本发明成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞的传代培养基中添加抗病毒药物，可以抑制细胞融合的现象发生，由于猴泡沫病毒是一种逆转录病毒，因此，添加抗逆转录病毒药物的效果更佳。在本发明的实施例中，通过向成年食蟹猴骨髓间充质干细胞的体外传代培养基中添加抗逆转录病毒的药物，如泰诺福韦，使上述现象消失。
本发明人还通过向传代培养基中添加FGF-b或者FGF-b与EGF的混合物，使细胞在体外扩增的数量增加。所述FGF-b或者所述EGF分别可以是重组人类FGF-b或者重组人类EGF。
本发明人还通过使用αlpha改进型MEM培养基(αMEM)作为成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞传代培养的基础培养基，并向αlpha改进型MEM培养基(αMEM)中添加GlutaMAX-I二肽，结果使得细胞在体外扩增的数量进一步增加。
本发明人还通过选用骨髓间充质干细胞专用胎牛血清代替普通的胎牛血清添加到成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞的传代培养基中，使得细胞在体外扩增的数量进一步增加。
实施例1和对比例1：在传代培养基中添加或未添加抗逆转录病毒药物泰诺福韦
将来自成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞进行传代培养，在实施例1中向以下的包含其它成分的基础培养基而成的传代培养基中添加泰诺福韦(LGM pharmaceuticals)，100ml的传代培养基中加入10μM；在比较例1中则不添加泰诺福韦。
100ml的传代培养基中包括的各成分：(1)88％(体积百分比)的DMEM(invitrogen)，此为基础培养基；(2)其它成分：10％的优等胎牛血清(GIBCO)、1％的L-谷氨酰胺液体(invitrogen)、1％的青霉素-链霉素液体(invitrogen)。
细胞第一次传代的接种数量为1×105，细胞接种的密度为1000/cm2。
结果：实施例1中的细胞没有很快出现大片融合的现象，可以传10代以上。而在对比例1中的细胞在第2代中就出现了细胞的大片融合现象，不能继续传代。可参见图1中的细胞照片，以及图2中的折线图。
在以上实验中还可以使用抗病毒药物恩曲他滨和施多宁，其他条件与实施例1相同，同样可以达到实施例1中的效果。
实施例2、3和对比例2：在传代培养基中添加不同的生长因子
将来自成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞进行传代培养，在实施例2和3以及对比例2中分别向传代培养基中添加不同的生长因子，在实施例2中添加FGF-b(Invitrogen)，浓度为20ng/ml；在实施例3中添加FGF-b(Invitrogen)与EGF(Invitrogen)的混合物，浓度各为10ng/ml，两种生长因子的总浓度为20ng/ml；在对比例2中添加EGF(Invitrogen)，浓度为20ng/ml。
100ml的传代培养基的各成分为：(1)88％(体积百分比)的αMEM(Invitrogen)，此为基础培养基；(2)其它成分：1％GlutaMAX-I(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素液体(Invitrogen)、10μM泰诺福韦(LGM pharmaceuticals)、10％骨髓间充质干细胞专用胎牛血清(GIBCO，AUS)。
细胞第一次传代的接种数量为1×105，细胞接种的密度为1000/cm2。GlutaMAX-I是一种L-谷氨酰胺的二肽衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸保护，该二肽衍生物非常稳定，在高温下裂解较少，肽酶可以将其裂解。
结果：实施例2和3中的细胞扩增数量和速度明显大于对比例2中的细胞扩增数量和速度。具体参见图3中的柱状图。
实施例4和对比例3、4、5：不同的基础培养基和/或不同的添加因子
将来自成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞进行传代培养，在实施例4中使用基础培养基αMEM(Invitrogen)(体积百分比为88％)和添加因子GlutaMAX-I(Invitrogen)(体积百分比为1％)；在对比例3中使用基础培养基αMEM(Invitrogen)(体积百分比为88％)和L-谷氨酰胺(Invitrogen)(体积百分比为1％)；在对比例4中使用基础培养基DMEM(体积百分比为88％)和GlutaMAX-I(Invitrogen)(体积百分比为1％)；在对比例5中使用基础培养基DMEM(体积百分比为88％)和L-谷氨酰胺(Invitrogen)(体积百分比为1％)。
100ml的传代培养基的其他成分为1％青霉素-链霉素液体(Invitrogen)、10μM泰诺福韦(LGM pharmaceuticals)、10％骨髓间充质干细胞专用胎牛血清(GIBCO，AUS)、浓度为20ng/ml的FGF-b(Invitrogen)。
细胞第一次传代的接种数量为1×105，细胞接种的密度为1000/cm2。
结果：实施例4中的细胞扩增数量和速度明显大于对比例3、4、5中的细胞扩增数量和速度。具体参见图4中的柱状图。
实施例5和对比例6和7：在传代培养基中不同的血清
将来自成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞进行传代培养，在实施例5中使用MSC专用胎牛血清(GIBCO，AUS)；在对比例6中使用USA产的优等胎牛血清(invitrogen，USA)；在对比例7中使用AUS产的优等胎牛血清(invitrogen，AUS)。
100ml的传代培养基的各成分为：(1)基础培养基：88％(体积百分比)的αMEM(Invitrogen)；(2)其他成分：1％GlutaMAX-I(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素液体(Invitrogen)、10μM泰诺福韦(LGM pharmaceuticals)、浓度为20ng/ml的FGF-b(Invitrogen)。
细胞第一次传代的接种数量为1×105，细胞接种的密度为1000/cm2。
结果：实施例5中的细胞扩增数量和速度明显大于对比例6和7中的细胞扩增数量和速度。具体参见图5中的柱状图。
实施例6和对比例8：在传代培养基中不同的基础培养基及其他成分
将来自成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞进行传代培养，在实施例6中使用的培养基成分为：88％(体积百分比)的αMEM(Invitrogen)(αMEM基础培养基)、MSC专用胎牛血清(GIBCO，AUS)、1％GlutaMAX-I(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素液体(Invitrogen)、10μM泰诺福韦(LGM pharmaceuticals)、浓度为20ng/ml的FGF-b(Invitrogen)；在对比例8中使用的培养基成分为：88％(体积百分比)的DMEM(invitrogen)(此为基础培养基)、1％的L-谷氨酰胺液体(invitrogen)、1％的青霉素-链霉素液体(invitrogen)、10μM泰诺福韦(LGM pharmaceuticals)。
细胞第一次传代的接种数量为1×105，细胞接种的密度为1000/cm2。
结果：实施例6中的细胞扩增数量明显大于对比例8中的细胞扩增数量。具体参见图6中的折线图。
通过向感染成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞的传代培养基中添加抗逆转录病毒药物如泰诺福韦、FGF-b或者FGF-b与EGF的混合物等，并且通过用本发明中的使细胞扩增数量和速度增加的培养基成分，使得第一代1×105个细胞可以扩增到6～8×107。使成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞扩增可以满足试验对细胞数量的需要，对于各种疗法或药物的临床前实验的发展具有重要的意义。
实施例7和对比例9：慢病毒转染实验
在该实验中，在实施例7中我们采用以实施例6中的条件传代培养的成年食蟹猴的骨髓间充质干细胞，即88％(体积百分比)的αMEM(Invitrogen)、MSC专用胎牛血清(GIBCO，AUS)、1％GlutaMAX-I(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素液体(Invitrogen)、10μM泰诺福韦(LGM pharmaceuticals)、浓度为20ng/ml的FGF-b(Invitrogen)；当细胞生长到第四代时，将培养基换成不包含泰诺福韦的培养基，其余成分与上述培养基相同。当在不包含泰诺福韦的培养基中生长6天后进行以慢病毒为载体的病毒转染，20小时后检测细胞被病毒转染的效率。在对比例9中，使用与实施例7中相同的条件，只是在细胞培养和病毒转染的过程中一直都使用泰诺福韦。以下是慢病毒制备以及转染的过程：
第一步：慢病毒的制备(即在293T细胞中进行病毒的扩增)
1)传代培养293T细胞，保持细胞在较高的密度，按1∶4～1∶5分传；
2)在转染病毒前一天，用100μg/ml的多聚-右旋-赖氨酸溶液包被100mm培养皿(使细胞贴壁更牢)，室温作用60min，使用前用无菌PBS洗两次；
3)使293T细胞在转染前可以达到70～80％汇片；
4)取400μl OPTI-MEM培养基(Invitrogen)置于5ml聚苯乙烯管中，将载体质粒DNA按照DUET101∶CMV8.91∶PMD.G＝3∶4∶1比例溶于其中，这三种载体质粒DNA来自霍普金斯大学程临钊实验室(http://www.addgene.org/pgvecl？f＝c & identifier＝17629 & cmd＝findpl& attag＝c)。三个质粒DNA总量为16μg，混匀，室温放置5min；
5)同样取Lipofectamine2000脂质体(GIBCO)32μl加入另一盛有400μl OPTI-MEM(Invitrogen)的聚苯乙烯管中，轻柔混匀，室温放置5min；
6)再将步骤4)和5)得到的两种液体混合，室温放置20min；
7)将质粒DNA与Lipofectamine2000脂质体的混合液加入含有8ml新鲜培养基的293T细胞培养皿中，混匀，37℃，5％CO2培养箱中培养；
8)转染后12h，弃去转染液，加入8ml ITS培养液收集病毒上清；
9)继续培养24hr、48hr后收集病毒上清，500rpm离心去除细胞碎片，用0.45μm滤器过滤到无菌离心管中，在浓缩前在4℃下进行保存。
第二步：慢病毒的浓缩
1)取4ml无菌DPBS加到Ultra-Plus 20滤膜(Millipore)上，2500rpm离心5分钟，湿润滤膜。弃去管底DPBS溶液。
2)将经过0.45μm滤器过滤的病毒上清加入滤膜套管内，4℃，4000g离心20min。
3)吸取滤膜插件上的上清，分装于1.5ml EP管中，滴度鉴定后储存于-80℃冰箱中，备用。
第三步：慢病毒滴度的鉴定
1)用100μg/ml的多聚-右旋-赖氨酸溶液包被六孔板，以每孔2×105个细胞的密度将293T细胞接种于六孔板。
2)将病毒上清加入293T细胞培养液中，以8μg/ml的浓度加入聚凝胺。
3)荧光显微镜下计算绿色荧光蛋白阳性细胞数，以下面公式计算病毒上清滴度。病毒滴度＝绿色荧光蛋白阳性细胞百分比×293细胞总数/加入病毒上清的体积。
第四步：慢病毒转染细胞
1)根据绿色荧光蛋白(GFP)病毒滴度和细胞数量，按照MOI值等于10加入病毒上清(MOI＝病毒数/细胞数，即相当于10个病毒一个细胞)，以10μg/ml的浓度加入聚凝胺。孵育20小时后弃去转染液，加入新鲜培养基；
2)培养1周后，荧光显微镜下观察，同时在不同时间点计算转染效率。
结果：在实施例7中慢病毒转染效率可以达到55％，而对比例9中的慢病毒转染效率只有10％左右。可见利用本发明的方法可以大大地提高成年食蟹猴MSC细胞的转染效率。可以参见图7和图8。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。