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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410772347.8 (22)申请日 2014.12.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104450585 A (43)申请公布日 2015.03.25 (83)生物保藏信息 CGMCCNo.10040 2014.11.21 (73)专利权人 四川省农业科学院农产品加工研 究所 地址 610066 四川省成都市锦江区外东狮 子山侧狮子山路4号 (72)发明人 曾晓丹朱永清贺红宇姚英政 李华佳王自鹏李治华刘培 (74)专利代理机构 成都立信专利事务所有限。
2、公 司 51100 代理人 冯忠亮 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 7/56(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (56)对比文件 CN 101724592 A,2010.06.09, CN 102334606 A,2012.02.01, CN 1926231 A,2007.03.07, 郭妍妍 等. “产乳酸芽孢杆菌RS-1菌株的分 离及鉴定” . 河北农业大学学报 .2010,第33卷 (第6期), 审查员 刘贺 (54)发明名称 一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯 草芽孢杆菌 (57)摘要 本发明为一种以玉米浆为唯一氮源高。
3、产L- 乳酸的枯草芽孢杆菌， 解决采用发酵法生产L-乳 酸生产成本较高的问题。 可利用作为碳源的葡萄 糖或乳糖或蔗糖和作为唯一氮源的玉米深加工 工业中废弃物玉米浆， 发酵生产L-乳酸。 属于枯 草芽孢杆菌 （Bacillussubtilis） ， 菌株保藏号： CGMCCNo.10040。 经42小时发酵实验， 最高产L- 乳酸量可达66g/L。 权利要求书1页 说明书4页 CN 104450585 B 2017.05.03 CN 104450585 B 1.一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草芽孢杆菌， 其特征在于该菌株分离于四 川家制泡菜中， 可利用作为碳源的葡萄糖或乳糖或蔗糖和作为唯。
4、一氮源的玉米深加工工业 中废弃物玉米浆， 发酵生产L-乳酸， 属于枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 菌株保藏号： CGMCC No.10040。 2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵生产乳酸的方法， 其特征在于将保藏编号 为CGMCC No.10040的枯草芽孢杆菌先接种至LB培养基35培养18小时后， 再接种至液体发 酵培养基中， 接种量按体积百分比为10%， 液体发酵培养基其碳源成分选择葡萄糖或蔗糖或 乳糖， 加入量为15% （W/V） ， 采用玉米深加工工业中废弃物玉米浆为唯一氮源， 其用量为3 10% （W/V） ， 其他成分为水， pH调节至6.5,发酵时。
5、间42小时。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104450585 B 2 一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草芽孢杆菌 0001 技术领域： 0002 本发明属于生物技术领域， 涉及泡菜中一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯 草芽孢杆菌。 0003 背景技术： 0004 乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸， 广泛存在于人体、 动物体、 植物和微生物 中。 乳酸按其旋光性可分为 D(-)乳酸， L(+)乳酸和 DL-乳酸三种， 人体只能代谢利用其中 的 L-乳酸。 因此， 世界卫生组织提倡使用 L-乳酸作为食品添加剂和内服药， 取代目前普遍 使用的 DL-乳酸。 此外， L-乳酸、 L-。
6、乳酸盐及其聚合物还广泛应用于医药、 农业和化学工业。 尤其近几年， 人们利用 L-乳酸聚合生成的聚 L-乳酸制造生物降解塑料， 绿色包装材料及 家用薄膜， 用以解决日益严重的环境污染问题， 引起了世界的广泛关注, 应用前景非常广 阔。 0005 当前， 全世界L乳酸市场处于供不应求状态， 世界市场总需求量约70万吨， 且每 年以10的速度递增， 而生产量只有30万吨， 缺口很大， 是迅速发展L乳酸生产的最佳时 期。 各国纷纷规划扩大L乳酸生产能力。 0006 国内目前主要采用发酵法和合成法生产乳酸， 其中使用发酵法生产的乳酸占80% 以上。 工业化发酵主要采用玉米和木薯淀粉为原料， 生产成本较。
7、高。 另一方面作为玉米加工 废弃物的玉米浆， 产量大而价格低， 且富含多种氨基酸、 生物素、 维生素类、 微量元素等， 还 含有磷酸盐类， 因此是理想的低成本发酵材料。 0007 发明内容： 0008 本发明的目的是提供一种可以利用价格低廉的玉米浆为唯一氮源发酵生产高浓 度L-乳酸的枯草芽孢杆菌。 0009 一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草芽孢杆菌， 该菌株分离于四川家制泡 菜中， 可利用作为碳源的葡萄糖或乳糖或蔗糖和作为唯一氮源的玉米深加工工业中废弃物 玉米浆， 发酵生产L-乳酸， 属于枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 菌株保藏号： CGMCC No.1004。
8、0。 0010 枯草芽孢杆菌发酵生产乳酸的方法， 将枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） 先接种至 LB培养基35培养18小时后， 再接种至液体发酵培养基中， 接种量按体积百分比为10%(V/ V)， 液体发酵培养基其碳源成分选择葡萄糖或蔗糖或乳糖， 加入量为15% （W/V） ， 采用玉米深 加工工业中废弃物玉米浆为唯一氮源， 其用量为3-10% （W/V） ， 其他成分为水， pH调节至6.5, 发酵时间42小时。 0011 本发明枯草芽孢杆菌的获得： 取回实验室的四川家制自然发酵泡菜水用无菌生理 盐水稀释到合适梯度， 取1mL稀释液于无菌培养皿中， 倾倒至LB固体培养基混匀， 。
9、培养至出 现大量单菌落， 挑取菌落， 反复划线培养， 进行纯化。 0012 本发明提供的枯草芽孢杆菌自编号： RS-1， 保藏编号为CGMCC No.10040， 2014年11 月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏地址： 北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 说明书 1/4 页 3 CN 104450585 B 3 0013 本发明枯草芽孢杆菌具有产L乳酸的能力： 可利用作为碳源的葡萄糖或乳糖或 蔗糖和作为唯一氮源的玉米深加工工业中废弃物玉米浆， 发酵生产L-乳酸。 经42小时发酵， 最高产酸量可达66g/L。 0014 本发明生。
10、产L-乳酸的枯草芽孢杆菌具有良好稳定性， 连续15次培养， 性状稳定， 仍 具有高产L-乳酸能力。 0015 本发明的枯草芽孢杆菌RS-1分离自四川家制自然发酵泡菜水， 未经过人工诱变处 理， 属于公认安全 （Generally Recognized As Safe， GRAS） 菌种， 可用于食品及化工原料加 工。 0016 具体实施方式： 0017 实施例1： 0018 本发明一种可以利用价格低廉的氮源材料玉米浆为唯一氮源发酵生产高浓度L- 乳酸的枯草芽孢杆菌。 0019 本发明枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） 的分离方法， 采用梯度稀释混菌法从四川 家制自然发酵泡菜水中分离。
11、。 包括以下步骤： 将1mL泡菜水用9mL无菌生理盐水进行梯度稀 释， 稀释到泡菜水浓度为10-6-10-8mL/mL， 取1mL稀释液于无菌培养皿中， 倾倒至LB固体培养 基并混匀， 待培养基凝固后， 置于35培养箱培养24-48小时， 出现大量细菌菌落， 挑取具有 不同特征的单菌落， 在LB固体培养基上划线纯化， 并进一步培养， 得到纯菌株。 纯化后的菌 株先接种至LB培养基35培养18小时后， 再接种至液体发酵培养基中， 接种量按体积百分 比为10%， 35发酵培养42小时后， 用L乳酸测定试剂盒测试。 选取产酸量大于20g/L的菌 种进行保存。 纯化的菌株采用如下方式保藏， 用LB培养。
12、基在35培养24小时后， 在培养好的 LB培养基中添加甘油， 使甘油终浓度为20% （w/v） ， -20冻存， 每隔1年转接一次。 0020 本发明枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） 的形态学特征如下： 0021 本发明的枯草芽孢杆菌菌株接种在LB固体培养基上， 35培养24小时， 观察菌落 特征， 菌落呈乳白色半透明状， 表面光滑， 粘稠， 凸起， 边缘不整齐， 不产色素； 革兰氏染色反 应为阳性， 菌体呈短杆状， 染色均匀， 具运动性， 可形成内生孢子， 芽孢囊不明显膨大， 芽孢 椭圆形， 中生到次端生。 这一形态与产乳酸的枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.3242） 在菌落。
13、形态上 不同。 0022 本发明枯草芽孢杆菌 （RS-1） 的生理生化反应与本实验室鉴定并保存的典型枯草 芽孢杆菌 （B.sub） 生理生化反应结果如下表所示： 说明书 2/4 页 4 CN 104450585 B 4 0023 0024 本发明中枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） 与本实验室鉴定并保存的典型枯草芽 孢杆菌在V.P试验中反应不同； 与河北农业大学郭妍妍等发现的产乳酸枯草芽孢杆菌在硝 酸盐还原实验、 柠檬酸盐利用实验中反应不同； 与东北农业大学王晓翠等发现的产乳酸芽 孢杆菌在氧化酶实验中反应不同； 与发明专利CN 102334606中所述产乳酸枯草芽孢杆菌在 在氧化酶。
14、和厌氧生长实验中反应不同。 0025 本发明枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） 提取DNA后， 用细菌通用引物27f， 1492r扩 增出其16S rDNA后， 送上海生工公司进行测序， 将测序结果用BLAST程序在GenBank中进行 序列同源性比对分析。 结果显示RS-1的16S rDNA与多株枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 的16S rDNA序列相似性达99%以上， 结合形态学和生理生化特征， 鉴定菌株RS-1 为一株枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 。 0026 本发明与已有的枯草芽孢杆菌相比较主要是找到了一株只以玉米浆为唯一的氮 。
15、源， 能够发酵生产较高含量L乳酸的枯草芽孢杆菌。 0027 本发明中的LB培养基配方为： 胰蛋白胨1% （W/V） ， 酵母提取物0.5% （W/V） ， 氯化钠 1% （W/V） ， pH调节至7.0， 121灭菌15min。 0028 本发明中的LB固体培养基配方为： 胰蛋白胨1% （W/V） ， 酵母提取物0.5% （W/V） ， 氯化 钠 1% （W/V） ， 琼脂1.5% （W/V） ， pH调节至7.0， 121灭菌15min。 0029 本发明中的液体发酵培养基配方为： 氮源为玉米浆3% （W/V） ， 碳源为葡萄糖或乳糖 或蔗糖中的一种， 加入量15% （W/V） ， 其余为水。
16、， pH调节至6.5， 121灭菌15min。 0030 本发明中使用的玉米浆为四川省的鲁洲生物科技(四川)有限公司的商品玉米浆。 0031 本发明中使用的L乳酸测定试剂盒采购于南京建成生物工程研究所。 0032 实施例2： 0033 本发明中枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） ， 先接种至LB培养基35培养18小时 后， 再接种至液体发酵培养基中， 接种量按重量百分比为10%， 液体发酵培养基其碳源成分 选择葡萄糖， 加入量15% （W/V） ， 玉米浆3% （W/V） 、 其他成分为水， pH调节至6.5,发酵时间42小 时。 其产L乳酸为： 59.859 g/L。 说明书 3。
17、/4 页 5 CN 104450585 B 5 0034 其他与实施例1相同。 0035 实施例3： 0036 本发明中枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） ， 先接种至LB培养基35培养18小时 后， 再接种至液体发酵培养基中， 接种量按重量百分比为10%， 液体发酵培养基其碳源成分 选择乳糖， 加入量15% （W/V） ， 玉米浆添加量为3% （W/V） ， 其余为水， pH调节至6.5， 发酵时间42 小时。 其产L乳酸为： 47.575g/L。 0037 其他与实施例1相同。 0038 实施例4： 0039 本发明中枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） ， 先接种至。
18、LB培养基35培养18小时 后， 再接种至液体发酵培养基中， 接种量按重量百分比为10%， 液体发酵培养基其碳源成分 选择蔗糖， 加入量15% （W/V） ， 玉米浆添加量为3% （W/V） ， 其余为水， pH调节至6.5,发酵时间42 小时。 其产L乳酸为： 41.150g/L。 0040 其他与实施例1相同。 0041 实施例5： 0042 本发明中枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） ， 先接种至LB培养基35培养18小时 后， 再接种至液体发酵培养基中， 接种量按重量百分比为10%， 液体发酵培养基其碳源成分 选择葡萄糖， 加入量15% （W/V） ， 玉米浆添加量为5% 。
19、（W/V） ， 其余为水， pH调节至6.5,发酵时间 42小时。 其产L乳酸为： 66g/L。 0043 其他与实施例1相同。 0044 实施例6： 0045 本发明中枯草芽孢杆菌 （CGMCC No.10040） ， 先接种至LB培养基35培养18小时 后， 再接种至液体发酵培养基中， 接种量按重量百分比为10%， 液体发酵培养基其碳源成分 选择葡萄糖， 加入量15% （W/V） ， 玉米浆添加量为10% （W/V） ， 其余为水， pH调节至6.5， 发酵时 间42小时。 其产L乳酸为： 64.678g/L。 0046 其他与实施例1相同。 说明书 4/4 页 6 CN 104450585 B 6 。