一种检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒 【技术领域】
本发明涉及生物化学领域， 具体涉及核酸的检测试剂。背景技术 现代分子生物学研究表明， 雌性哺乳动物体细胞内仅有一条 X 染色体是有活性 的， 另一条 X 染色体大部分失活。对于一个细胞来说， 失活的染色体可能是父源的， 也可 能是母源的， 是随机的。对于一个个体来说， 父源 X 染色体和母源 X 染色体失活比例接 近 1 ∶ 1。 当 这 个 比 例 偏 离 1 ∶ 1 时， 称 为 X 染 色 体 失 活 偏 移 (shewed X-chromosome inactivation， SXCI)。由于 X 染色体失活的随机性， 使得女性体内的部分细胞群带有母源 的 X 染色体， 而另外部分细胞群带有父源的 X 染色体， 其表型取决于体内两种细胞群的比 例。高比例的优势细胞群将表现出表型优势。因此相同的基因型的 X 染色体连锁女性杂合 子出现表型的差异。 目前 X 染色体失活多用于 X 染色体连锁疾病的研究， 如血友病、 DMD( 进 行性肌营养不良 )、 X 染色体连锁智力低下等， X 染色体失活的具体类型是上述疾病病因诊 断的重要指标。
对 X 染色体失活的检测原理是基于女性体细胞组织的 X 染色体嵌合性和 X 染色体 基因多态性进行的。多态性表现为 X 染色体上的 STR(short tandem repeat， 短串联重复 ) 的重复次数不同。嵌合性表现为在一个女性体内部分细胞群母源 X 染色体有活性， 部分细 胞群父源 X 染色体有活性的。依据 X 染色体嵌合性的特点， X 染色体可以区分为失活的 X 染色体和有活性的染色体。其检测方法主要有表达方法和甲基化方法两种。表达方法是用 RT-PCR 的方法仅使表达的 XIST 基因反转录成 cDNA， 然后用 PCR 扩增反转录 DNA。表达方法 需进行反转录操作， 过程烦琐、 对技术人员要求较高。甲基化方法主要是利用失活的 X 染色 体为甲基化的， 而有活性的 X 染色体是非甲基化的 ； 用甲基化敏感性限制性内切酶对基因 组 DNA 进行消化后， 有活性的 X 染色体由于酶切位点处于非甲基化状态而被消化成短的片 段， PCR 扩增时没有产物 ； 而失活的 X 染色体由于酶切位点处于甲基化状态而不被切断， 可 扩增出 STR 片段， 然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切前后的 PCR 产物进行检测， 判断出两 条 X 染色体的失活比例。聚丙烯酰胺凝胶电泳法费时费力， 不适用于临床推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂 盒， 该试剂盒具有成本低和检测方法简便、 快速的优点。
本发明解决上述问题的技术方案具体是 ：
一种检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒， 该试剂盒由甲基化敏感性限 制性内切酶、 一对扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物、 一对扩增 MIC2 基因的引物和 DNA 聚合酶组成， 其特征在于 ：
所述的扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物的序列为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 或者 TGGGGAGAACCATCCTCACC ；所 述 的 扩 增 MIC2 基 因 的 引 物 的 序 列 为 ： AGA GGTGCGTCCGATTCTT 或 者 CGCCGCAGATGGACAATTT。
本发明所述的 AR 基因是指 human androgen receptor， 雄激素受体基因， 位于 X 染 色体 q11-12。
本发明所述的 MIC2 基因是指位于 X 和 Y 染色体短臂末端的 MIC2 基因。
本发明所述的两对引物可以由本领域常用的方法合成。 本发明所述的两对引物均 由上海英骏生物技术有限公司合成提供。
本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒中， 甲基化敏感性 限制性内切酶为本领域常用的甲基化敏感性限制性内切酶， 可以是美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒中， DNA 聚合酶为本 领域常用的 DNA 聚合酶， 可以是 Taq 酶。
本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒， 还可以包括甲基化 敏感性限制性内切酶消化反应液。 本发明所述的甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液是 本领域常用的消化反应液。 本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒， 还可以包括 PCR 扩 增反应液。本发明所述的 PCR 扩增反应可以是本领域常用的 PCR 扩增反应液。
本发明所述的试剂盒设计跨越甲基化敏感性酶切位点的 STR 扩增引物， 应用甲基 化敏感性限制性内切酶消化 DNA 标本后进行 PCR 扩增， 有活性的 X 染色体由于酶切位点处 于非甲基化状态而被切断， 无扩增产物 ； 而失活的 X 染色体由于酶切位点处于甲基化状态 而不被切断， 可扩增出 STR 片段， 然后通过 DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography， 变性高效液相色谱 ) 对酶切前后的 PCR 产物进行检测， 判断出两条 X 染色 体的失活比例。
本发明所述的两对引物所对应靶基因的具体情况如下所述 ：
1.STR 位点 ： 目的基因， 为 CAG 三碱基重复， 重复次数 8-31 次。选用的限制性内 切酶 HpaII， 识别序列及裂解位点为 5′ ...C/CGG...3′， 不能识别经甲基化修饰的基因序 列， 即失活的 X 染色体将扩增出 200-300bp 的产物， 而活性的 X 染色体被 HpaII 切断而无扩 增产物。所述 STR 位点基因如图 1 所示。
2.MIC2 基因位点 ： 作为内参基因用于报告酶切效果。在酶切的过程中， 若酶切不 完全， 则可能导致假阳性的结果。为了确保酶切效果， 予以加入 MIC2 基因作为内参基因。 MIC2 基因上的 HTF(HpaII tiny fragment) 岛包含了 3 个 HpaII 酶切位点， 并且无论其位 于失活与否的 X 染色体或 Y 染色体上， HTF 岛均始终保持非甲基化状态。因此当酶切不完 全时， 则将会出现 MIC2 基因 ( 位于 X 和 Y 染色体短臂的末端 ) 的扩增片段长度 375bp 的产 物。所述 MIC2 基因位点如图 2 所示。
本发明所述的试剂盒的使用方法为 ：
1. 对女性标本进行基因组 DNA 抽提后获得 DNA 样本。
2. 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 1 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
3. 采用本发明所述的双重 PCR 引物对酶切前后的 DNA 进行 PCR 扩增， 其中双重 PCR
扩增条件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
4. 在 50℃下， 使用 DHPLC 仪对 PCR 产物进行分析， 得到 DHPLC 图谱。
5. 对 DHPLC 图谱进行分析， 方法如下 ： 首先， 根据图谱上峰的迁移时间确定 DHPLC 图谱中每一个峰所对应的基因 ； 然后， 分析 DHPLC 图谱中 MIC2 基因酶切前后的 PCR 产物所 对应的峰 ； 最后， 判读 X 染色体失活情况和对自然流产进行家系分析 ；
其中， 对 X 染色体失活情况进行判读的方法由下列步骤组成 ：
通过分析 AR 位点酶切前后的扩增产物判断 X 染色体失活情况， 若 AR 位点为单峰， 说明该 STR 位点为纯合子， 无法判断 X 染色体失活是否正常， 当 AR 为双峰时， 根据公式 (d1/ u1)/(d1/u1+d2/u2) 计算失活比例 ； 所述公式中， d1 表示酶切后较高的峰的峰高， u1 表示与 之相对应的酶切前的峰的峰高， d2 表示酶切后较矮的峰的峰高， u2 表示与 d2 相对应的酶切 前的峰的峰高。
其中， 对自然流产进行家系分析的方法由下列步骤组成 ：
将家系中绕毛、 母亲、 父亲标本 PCR 产物检测所得 DHPLC 图谱排布在同一界面， 纵 向比较， 在同一位置所出峰片段长度相同。通过家系比对， 可以判断两个 X 染色体的来源 ( 父源或母源 )， 从遗传上追踪异常染色体的传递途径。
本发明所述的试剂盒的使用方法中女性标本是指经 G 带核型分析， 结果显示具有 两个 X、 没有 Y 染色体的标本。本发明所述的试剂盒的使用方法中， 女性标本是任何来源的 女性器官组织或体细胞， 可以是女性的外周血、 脐带血、 绒毛、 骨髓或上皮细胞等。
本发明所述的试剂盒的使用方法步骤 2 中， 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化的反应体系采用本领域常用的反应体系。 本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 2 中， 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化的反应体系可以如表 1 所示。
表 1HpaII 消化的反应体系
试剂 灭菌水 RE10×buffer Acetylated BSA(10μg/μl) DNA(100ng/μl) 用移液器混匀后 ： HpaII(8u/μl)
用量 3.4μl 1μl 0.2μl 5μl0.5μl本发明所述的试剂盒的使用方法步骤 3 中， PCR 扩增的反应体系采用本领域常用 的反应体系。 本发明所述的试剂盒的使用方法步骤 3 中， PCR 扩增的反应体系可以如表 2 所示。
表 2DNA 扩增的反应体系
其中 10×buffer(20mM Tris-HCl， 10mM(NH4)2SO4， 2mM MgCl2， 0.1 ％ X-100 和 10mM KCl， pH 8.8) 购买自北京鼎国生物技术公司的 ； dNTP(2.5mM) 购买自 TAKARA 公司。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 4 中， DHPLC 工作条件采用本领域常用的工 作条件。本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 4 中， DHPLC 工作条件可以如表 3 所示。
表 3DHPLCT 作条件 Gradient name Loading Start Gradient Stop Gradient Start Clean Stop Clean Start Equilibrate Stop Equilibrate Time(min) 0.0 0.5 20.5 20.6 20.7 20.8 20.9 ％A 55.9 50.9 32.0 0.0 0.0 55.9 55.9 ％B 44.1 49.1 68.0 100.0 100.0 44.1 44.1
其中缓冲液 A 为将三乙基铵醋酸盐 (TEAA) 溶于无菌超纯水得到的溶液， 浓度为 0.1M ； 缓冲液 B 为将三乙基铵醋酸盐 (TEAA) 溶解于乙腈无菌超纯水 ( 乙腈∶无菌超纯水＝ 1 ∶ 4v/v) 获得的溶液， 浓度为 0.1M。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 4 中， 用 DHPLC 分析仪 (WAVE DNA fragment analysis system， Transgenomic 公司 ) 在非变性条件下对 PCR 扩增产物进行分析。依据 NON-DHPLC 在柱温 50℃以下 DNA 双链保持完整状态的特性， 本试验柱温选择在 50℃， 进样量 为 10μl。由于长片段 DNA 的 P03- 与 TEAA 分子的 NH3+ 结合紧密， 故其洗脱时间延长， 因
此， 根据洗脱峰的位置先后及高度差异通过 DNA 色谱柱 (DNASep， Transgenomic 公司 ) 将不 同长度和拷贝数的 STR 区分。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 所得 PCR 产物的 DHPLC 图谱的分析方法中， 由于 本发明试剂盒中两对引物对应的 AR 基因和 MIC2 基因， 所得扩增片段大小不一样 (AR 位点 扩增片段约 200 ～ 300bp， MIC2 位点为 375bp)， 每对引物的 PCR 产物在进行 DHPLC 检测时 的迁移速度都不一样， 且片段大小和迁移速度成正相关， 在 DHPLC 图谱中表现为小片段的 峰出现较快 (AR 位点 )， 大片段的峰出现较慢 (MIC2 位点 )， 因此可从 PCR 产物的迁移时间 对其进行定性分析， 即确定 DHPLC 图谱中每一个峰所对应的基因。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 所得 PCR 产物的 DHPLC 图谱的分析方法中， MIC2 基因酶切前后的 PCR 产物所对应的峰位置不相同， 酶切前有峰， 酶切后无峰时为酶切完全， 以确保没有假阳性结果出现。
本发明所述的试剂盒可以为临床提供 X 染色体失活异常的分子检测， 诊断率 达 82 ％。应用本试剂盒诊断， 同时进行家系分析时， 还可判断异常 X 染色体的来源。本 发明所述的试剂盒采用双重 PCR 引物进行扩增， 扩增条件稳定、 特异、 灵敏 ； 同时采用 DHPLC(denature high performance liquid chromatography， 变性高效液相色谱 ) 法对 PCR 产物进行分析， 该分析方法快速、 简便、 低成本、 高通量、 自动化， 且灵敏性高， 容易判读， 适用于临床。本试剂盒所对应的核心技术 --DHPLC 技术对检测样本的要求低 ( 仅需 100 ～ 150mg)， 灵敏度高于目前通用的聚丙烯酰胺凝胶电泳法， 可以将只差一个重复次数的 STR 片段区分开， 容易判读， 并依靠自动化操作的分析仪完成， 可进行完备的质控， 能极大地避 免人工操作所带来的人为出入。 同时， 本发明试剂盒的检测成本仅为 10.2 元 / 检测位点， 远 远低于现有的分析技术。 另外， 该技术还具有高通量的特点， 每天可完成 96 个次的检测。 本 发明试剂盒可用于分析 X 染色体失活相关疾病， 如自然流产、 血友病、 X 连锁智力低下、 G6PD 缺陷症、 Rett 综合征等的 SXCI 情况， 对 X 染色体连锁疾病的临床与研究提供简便可行的方 法， 并可协助确诊上述疾病或为上述疾病提供病因诊断。
以下是本发明所述的试剂盒在临床诊断率统计、 灵敏度实验、 成本计算及检测速 率分析。
1. 本试剂盒的临床诊断率统计
诊断率的高低取决于所选 STR 位点的杂合性。当所检测的 STR 位点为纯合峰时， 本发明试剂盒将无法判断其所在的一对 X 染色体各自的失活比例。
A. 试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 扩 增 AR 基 因 第 一 外 显 子 的 一 个 三 碱 基 STR 位 点 的 引 物 序 列 为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC。
III、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。
B. 本发明所述试剂盒的临床诊断率统计检测方法 ：
①本发明所选 STR 位点的理论杂合度的获得 ：
通过 www.gdb.org 数据库查找 STR 位点的理论杂合度。
②本发明所选 STR 的实际杂合度的统计 ：
a. 对 422 个女性 DNA 样本 ( 所有来源的女性器官组织或体细胞都适用， 本研究采用的是 271 例流产妇女外周血标本、 151 例流产绒毛标本 ) 提取基因组 DNA， 将浓度稀释至 100ng/μl 左右 ； 其中绒毛标本是孕 6-12 周的自然流产或人工流产的绒毛， 经绒毛核型分 析后取其中的女性， 且排除核型为 45， X 的标本。
b. 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 a 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
c. 扩增 AR 基因， 引物序列为 ：
GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC ；
反应体系见表 4， PCR 扩增条件为 ： 95 ℃预变性 5min， 94 ℃ 30s， 62 ℃ 45s， 72 ℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
表 4AR 基因扩增反应体系
试剂 灭菌水 DNA 样本 dNTP( 各 2.5mM) Taq 酶 10×buffer AR-F/AR-R(10pmol/μl)
用量 16.6μl 150ng 2μl 1.6U 2.5μl 0.8μld. 将 PCR 产物进行 50℃非变性 DHPLC 检测， 洗脱梯度见表 3 ；
e. 实际杂合度＝ STR 位点为杂合峰的个数 / 总样本个数。
(3) 结果分析
①该位点理论杂合度为 90％。
② 422 例 标 本 中， 在 STR 位 点 为 杂 合 子 的 标 本 346 例， 该位点实际杂合度＝ 346/422 ＝ 82.0％
2. 本试剂盒的灵敏度检测
A. 本发明试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 扩 增 AR 基 因 第 一 外 显 子 的 一 个 三 碱 基 STR 位 点 的 引 物 序 列 为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC。
III、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。
B、 本发明所述的试剂盒的灵敏度测试方法 ：
a、 对 2 例女性标本 ( 表型正常的女性门诊体检标本， 年龄为 30 岁， 染色体核型检
查为 46， XX) 和 1 例自然流产家系绒毛样本 ( 收集孕 8 周的自然流产正常核型女性绒毛标 本， 以及流产夫妇外周血标本 ) 进行 DNA 提取， 将浓度稀释至 100ng/μl 左右。
b. 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 a 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
c. 扩增 AR 基因， 引物序列为 ：
GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC ； 反应体系见表 4， PCR 扩增条 件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
表 4AR 基因扩增反应体系
试剂 灭菌水 DNA 样本 dNTP( 各 2.5mM) Taq 酶 10×buffer AR-F/AR-R(10pmol/μl)
用量 16.6μl 150ng 2μl 1.6U 2.5μl 0.8μld. 将 PCR 产物进行 50℃非变性 DHPLC 检测， 洗脱梯度见表 3 ；
e. 测序分析 ： 将 PCR 产物委托上海英骏生物技术有限公司进行。
f. 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ： 将 PCR 产物置于 8％非变性聚丙烯酰胺凝胶， 100V 恒压电泳 8 小时。
(3) 结果分析 ：
a. 用于测序的 2 个标本的 PCR 产物长度分别相差 6 个与 2 个 CAG 重复， 其对应的 DHPLC 图谱中， 该位点两峰出峰时间相差分别为 1min 与 0.3min。具体见图 3。由此可知， 当 出峰时间相差约 0.15min 时， 两片段长度差异即为 1 个 CAG 重复， 即 DHPLC 法可以将只差 1 个重复次数的两个 STR 片段区分开， 具备充足的灵敏度， 完全满足该位点的 X 染色体失活检 测要求。
b. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、 DHPLC 分析法均可用于家系研究。图 4 为一个家系的 结果， A 图为 DHPLC 结果， B 图为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。两图中父亲 DNA 标本酶 切后 PCR 扩增均无产物， 女儿 X 失活接近等比失活。母亲酶切前后的两条带在聚丙烯酰胺 凝胶电泳中区分不明显， 但在 DHPLC 中可清楚判读 ( 红色箭头处为母亲 STR 的杂合双峰 )。 由此可见， DHPLC 与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果一致， 但分辨率更高、 更容易判读， 即新
方法明显优于常规方法。
3. 本试剂盒成本计算
每个样本的检测成本约 10.2 元， 具体成本计算见表 5 ：
表 5 本发明所述试剂盒的成本计算
4. 本试验盒检测速率计算 ：
本试剂盒中的 DHPLC 检测时间为 15min/ 个样本， 每天可完成 96 个次的检测， 为完 全自动化的检测。
附图说明
图 1 为 STR 位点基因示意图， 其中扩增片段长度为 200 ～ 300bp。 图 2 为 MIC2 基因位点示意图， 其中扩增片段长度为 375bp。 图 3 为测序结果与 DHPLC 结果比较图， 其中 A 图为 DHPLC 结果， B 图为相应测序结果。 图 4 为聚丙烯酰胺凝胶电泳与 DHPLC 结果比较图， 其中 A 图为 DHPLC 结果， A 图为 丙烯酰胺凝胶电泳结果 ； B 图中 Marker 长度为 200bp ～ 300bp， R 表示女儿样本， F 表示母 亲样本， M 表示父亲样本， + 表示酶切后样本， - 表示酶切前样本。
图 5 为实施例 1 的 X 染色体失活偏移＞ 70％的 DHPLC 图谱。
图 6 为实施例 2 的自然流产 X 染色体失活家系分析的 DHPLC 图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明试剂盒的使用方法和技术效果， 下面将通过具体的病例分 析和临床统计来对本发明做进一步阐述。
实施例 1
X 染色体失活偏移 ( ＞ 70％ ) 的病例
1、 本发明试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 一对扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物， 其序列为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC ；
III、一 对 扩 增 MIC2 基 因 的 引 物，其 序 列 为 ： AGA GGTGCGTCCGATTCTT 和 CGCCGCAGATGGACAATTT。
IV、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。2、 本发明所述的试剂盒的使用方法 ：
(1) 对自然流产妇女外周血标本进行基因组 DNA 抽提后获得 DNA 样本， 将浓度稀释 至 100ng/μl。
(2) 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 1 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
(3) 采用本发明所述的双重 PCR 引物对酶切前后的 DNA 进行 PCR 扩增。引物如上 所述， 反应体系见表 2， PCR 扩增条件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
(4) 在 50℃下， 使用 DHPLC 仪对 PCR 产物进行分析， 得到 DHPLC 图谱， DHPLC 工作 条件可以如表 3 所示。
(5) 对 DHPLC 图谱进行分析， 对 X 染色体失活情况进行判读。
a.DHPLC 图谱中 ( 图 5)， 上方 ( 蓝色部分 ) 为酶切前标本的 PCR 产物的洗脱峰， 下 方 ( 红色部分 ) 为酶切后标本的 PCR 产物洗脱峰。在酶切前标本的产物峰中， 前面两个相 距较近的峰为 STR 位点的杂合峰， 后面相距较远的峰为 MIC2 位点内参峰。
b. 内参基因在酶切后无 PCR 产物， 说明酶切完全。 c.STR 呈双峰， 说明样本一对 X 染色体上的 STR 靶位点为杂合状态， 可用于区分 X 失活状态。
d. 酶切后出现的峰为失活峰， 其峰高代表失活量。根据公式 (d1/u1)/(d1/u1+d2/ u2) 计算失活比例＝ (0.702/0.879)/(0.702/0.879+0.208/0.803) ＝ 71.74％， 失活比例＞ 70％， 可诊断该标本为 X 失活偏移。
实施例 2
自然流产病例的家系分析
1、 本发明试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 一对扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物， 其序列为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC。
III、一 对 扩 增 MIC2 基 因 的 引 物，其 序 列 为 ： AGA GGTGCGTCCGATTCTT 和 CGCCGCAGATGGACAATTT。
IV、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。
2、 本发明所述试剂盒的使用方法 ：
(1) 家系的女儿标本为孕 7 周时 B 超提示胚胎停止发育 ( 无心管搏动、 不能见到胎 芽等 ) 后行清宫术收集的女性绒毛标本， 同时采集流产夫妇双方静脉血。对上述样本进行 基因组 DNA 抽提后获得 DNA 样本， 将浓度稀释至 100ng/μl。
(2) 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 1 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
(3) 采用本发明所述的双重 PCR 引物对酶切前后的 DNA 进行 PCR 扩增。引物如上 所述， 反应体系见表 2， PCR 扩增条件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
(4) 在 50℃下， 使用 DHPLC 仪对 PCR 产物进行分析， 得到 DHPLC 图谱， DHPLC 工作
条件可以如表 3 所示。
(5) 对 DHPLC 图谱进行分析， 对自然流产进行家系分析 ：
(a)DHPLC 图谱中 ( 图 6)， 上方的三道洗脱峰线 ( 青色、 绿色、 黑色 ) 分别为酶切前 的女儿、 母亲、 父亲标本， 下方的三道洗脱峰线为酶切后的女儿、 母亲、 父亲标本。
(b) 内参基因在酶切后无 PCR 产物， 说明酶切完全。
(c)STR 呈双峰， 说明样本一对 X 染色体上的 STR 靶位点为杂合状态， 可用于区分 X 失活状态。
(d) 通过酶切前的家系分析可以判断女儿一对 X 染色体的来源 ： 第一个峰与父亲 对应， 为父源峰， 第二个峰与母亲对应， 为母源峰。
本发明涉及生物化学领域， 具体涉及核酸的检测试剂。背景技术 现代分子生物学研究表明， 雌性哺乳动物体细胞内仅有一条 X 染色体是有活性 的， 另一条 X 染色体大部分失活。对于一个细胞来说， 失活的染色体可能是父源的， 也可 能是母源的， 是随机的。对于一个个体来说， 父源 X 染色体和母源 X 染色体失活比例接 近 1 ∶ 1。 当 这 个 比 例 偏 离 1 ∶ 1 时， 称 为 X 染 色 体 失 活 偏 移 (shewed X-chromosome inactivation， SXCI)。由于 X 染色体失活的随机性， 使得女性体内的部分细胞群带有母源 的 X 染色体， 而另外部分细胞群带有父源的 X 染色体， 其表型取决于体内两种细胞群的比 例。高比例的优势细胞群将表现出表型优势。因此相同的基因型的 X 染色体连锁女性杂合 子出现表型的差异。 目前 X 染色体失活多用于 X 染色体连锁疾病的研究， 如血友病、 DMD( 进 行性肌营养不良 )、 X 染色体连锁智力低下等， X 染色体失活的具体类型是上述疾病病因诊 断的重要指标。
对 X 染色体失活的检测原理是基于女性体细胞组织的 X 染色体嵌合性和 X 染色体 基因多态性进行的。多态性表现为 X 染色体上的 STR(short tandem repeat， 短串联重复 ) 的重复次数不同。嵌合性表现为在一个女性体内部分细胞群母源 X 染色体有活性， 部分细 胞群父源 X 染色体有活性的。依据 X 染色体嵌合性的特点， X 染色体可以区分为失活的 X 染色体和有活性的染色体。其检测方法主要有表达方法和甲基化方法两种。表达方法是用 RT-PCR 的方法仅使表达的 XIST 基因反转录成 cDNA， 然后用 PCR 扩增反转录 DNA。表达方法 需进行反转录操作， 过程烦琐、 对技术人员要求较高。甲基化方法主要是利用失活的 X 染色 体为甲基化的， 而有活性的 X 染色体是非甲基化的 ； 用甲基化敏感性限制性内切酶对基因 组 DNA 进行消化后， 有活性的 X 染色体由于酶切位点处于非甲基化状态而被消化成短的片 段， PCR 扩增时没有产物 ； 而失活的 X 染色体由于酶切位点处于甲基化状态而不被切断， 可 扩增出 STR 片段， 然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切前后的 PCR 产物进行检测， 判断出两 条 X 染色体的失活比例。聚丙烯酰胺凝胶电泳法费时费力， 不适用于临床推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂 盒， 该试剂盒具有成本低和检测方法简便、 快速的优点。
本发明解决上述问题的技术方案具体是 ：
一种检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒， 该试剂盒由甲基化敏感性限 制性内切酶、 一对扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物、 一对扩增 MIC2 基因的引物和 DNA 聚合酶组成， 其特征在于 ：
所述的扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物的序列为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 或者 TGGGGAGAACCATCCTCACC ；所 述 的 扩 增 MIC2 基 因 的 引 物 的 序 列 为 ： AGA GGTGCGTCCGATTCTT 或 者 CGCCGCAGATGGACAATTT。
本发明所述的 AR 基因是指 human androgen receptor， 雄激素受体基因， 位于 X 染 色体 q11-12。
本发明所述的 MIC2 基因是指位于 X 和 Y 染色体短臂末端的 MIC2 基因。
本发明所述的两对引物可以由本领域常用的方法合成。 本发明所述的两对引物均 由上海英骏生物技术有限公司合成提供。
本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒中， 甲基化敏感性 限制性内切酶为本领域常用的甲基化敏感性限制性内切酶， 可以是美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒中， DNA 聚合酶为本 领域常用的 DNA 聚合酶， 可以是 Taq 酶。
本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒， 还可以包括甲基化 敏感性限制性内切酶消化反应液。 本发明所述的甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液是 本领域常用的消化反应液。 本发明所述的检测 X 染色体失活的双重 PCR 分子诊断试剂盒， 还可以包括 PCR 扩 增反应液。本发明所述的 PCR 扩增反应可以是本领域常用的 PCR 扩增反应液。
本发明所述的试剂盒设计跨越甲基化敏感性酶切位点的 STR 扩增引物， 应用甲基 化敏感性限制性内切酶消化 DNA 标本后进行 PCR 扩增， 有活性的 X 染色体由于酶切位点处 于非甲基化状态而被切断， 无扩增产物 ； 而失活的 X 染色体由于酶切位点处于甲基化状态 而不被切断， 可扩增出 STR 片段， 然后通过 DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography， 变性高效液相色谱 ) 对酶切前后的 PCR 产物进行检测， 判断出两条 X 染色 体的失活比例。
本发明所述的两对引物所对应靶基因的具体情况如下所述 ：
1.STR 位点 ： 目的基因， 为 CAG 三碱基重复， 重复次数 8-31 次。选用的限制性内 切酶 HpaII， 识别序列及裂解位点为 5′ ...C/CGG...3′， 不能识别经甲基化修饰的基因序 列， 即失活的 X 染色体将扩增出 200-300bp 的产物， 而活性的 X 染色体被 HpaII 切断而无扩 增产物。所述 STR 位点基因如图 1 所示。
2.MIC2 基因位点 ： 作为内参基因用于报告酶切效果。在酶切的过程中， 若酶切不 完全， 则可能导致假阳性的结果。为了确保酶切效果， 予以加入 MIC2 基因作为内参基因。 MIC2 基因上的 HTF(HpaII tiny fragment) 岛包含了 3 个 HpaII 酶切位点， 并且无论其位 于失活与否的 X 染色体或 Y 染色体上， HTF 岛均始终保持非甲基化状态。因此当酶切不完 全时， 则将会出现 MIC2 基因 ( 位于 X 和 Y 染色体短臂的末端 ) 的扩增片段长度 375bp 的产 物。所述 MIC2 基因位点如图 2 所示。
本发明所述的试剂盒的使用方法为 ：
1. 对女性标本进行基因组 DNA 抽提后获得 DNA 样本。
2. 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 1 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
3. 采用本发明所述的双重 PCR 引物对酶切前后的 DNA 进行 PCR 扩增， 其中双重 PCR
扩增条件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
4. 在 50℃下， 使用 DHPLC 仪对 PCR 产物进行分析， 得到 DHPLC 图谱。
5. 对 DHPLC 图谱进行分析， 方法如下 ： 首先， 根据图谱上峰的迁移时间确定 DHPLC 图谱中每一个峰所对应的基因 ； 然后， 分析 DHPLC 图谱中 MIC2 基因酶切前后的 PCR 产物所 对应的峰 ； 最后， 判读 X 染色体失活情况和对自然流产进行家系分析 ；
其中， 对 X 染色体失活情况进行判读的方法由下列步骤组成 ：
通过分析 AR 位点酶切前后的扩增产物判断 X 染色体失活情况， 若 AR 位点为单峰， 说明该 STR 位点为纯合子， 无法判断 X 染色体失活是否正常， 当 AR 为双峰时， 根据公式 (d1/ u1)/(d1/u1+d2/u2) 计算失活比例 ； 所述公式中， d1 表示酶切后较高的峰的峰高， u1 表示与 之相对应的酶切前的峰的峰高， d2 表示酶切后较矮的峰的峰高， u2 表示与 d2 相对应的酶切 前的峰的峰高。
其中， 对自然流产进行家系分析的方法由下列步骤组成 ：
将家系中绕毛、 母亲、 父亲标本 PCR 产物检测所得 DHPLC 图谱排布在同一界面， 纵 向比较， 在同一位置所出峰片段长度相同。通过家系比对， 可以判断两个 X 染色体的来源 ( 父源或母源 )， 从遗传上追踪异常染色体的传递途径。
本发明所述的试剂盒的使用方法中女性标本是指经 G 带核型分析， 结果显示具有 两个 X、 没有 Y 染色体的标本。本发明所述的试剂盒的使用方法中， 女性标本是任何来源的 女性器官组织或体细胞， 可以是女性的外周血、 脐带血、 绒毛、 骨髓或上皮细胞等。
本发明所述的试剂盒的使用方法步骤 2 中， 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化的反应体系采用本领域常用的反应体系。 本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 2 中， 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化的反应体系可以如表 1 所示。
表 1HpaII 消化的反应体系
试剂 灭菌水 RE10×buffer Acetylated BSA(10μg/μl) DNA(100ng/μl) 用移液器混匀后 ： HpaII(8u/μl)
用量 3.4μl 1μl 0.2μl 5μl0.5μl本发明所述的试剂盒的使用方法步骤 3 中， PCR 扩增的反应体系采用本领域常用 的反应体系。 本发明所述的试剂盒的使用方法步骤 3 中， PCR 扩增的反应体系可以如表 2 所示。
表 2DNA 扩增的反应体系
其中 10×buffer(20mM Tris-HCl， 10mM(NH4)2SO4， 2mM MgCl2， 0.1 ％ X-100 和 10mM KCl， pH 8.8) 购买自北京鼎国生物技术公司的 ； dNTP(2.5mM) 购买自 TAKARA 公司。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 4 中， DHPLC 工作条件采用本领域常用的工 作条件。本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 4 中， DHPLC 工作条件可以如表 3 所示。
表 3DHPLCT 作条件 Gradient name Loading Start Gradient Stop Gradient Start Clean Stop Clean Start Equilibrate Stop Equilibrate Time(min) 0.0 0.5 20.5 20.6 20.7 20.8 20.9 ％A 55.9 50.9 32.0 0.0 0.0 55.9 55.9 ％B 44.1 49.1 68.0 100.0 100.0 44.1 44.1
其中缓冲液 A 为将三乙基铵醋酸盐 (TEAA) 溶于无菌超纯水得到的溶液， 浓度为 0.1M ； 缓冲液 B 为将三乙基铵醋酸盐 (TEAA) 溶解于乙腈无菌超纯水 ( 乙腈∶无菌超纯水＝ 1 ∶ 4v/v) 获得的溶液， 浓度为 0.1M。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 步骤 4 中， 用 DHPLC 分析仪 (WAVE DNA fragment analysis system， Transgenomic 公司 ) 在非变性条件下对 PCR 扩增产物进行分析。依据 NON-DHPLC 在柱温 50℃以下 DNA 双链保持完整状态的特性， 本试验柱温选择在 50℃， 进样量 为 10μl。由于长片段 DNA 的 P03- 与 TEAA 分子的 NH3+ 结合紧密， 故其洗脱时间延长， 因
此， 根据洗脱峰的位置先后及高度差异通过 DNA 色谱柱 (DNASep， Transgenomic 公司 ) 将不 同长度和拷贝数的 STR 区分。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 所得 PCR 产物的 DHPLC 图谱的分析方法中， 由于 本发明试剂盒中两对引物对应的 AR 基因和 MIC2 基因， 所得扩增片段大小不一样 (AR 位点 扩增片段约 200 ～ 300bp， MIC2 位点为 375bp)， 每对引物的 PCR 产物在进行 DHPLC 检测时 的迁移速度都不一样， 且片段大小和迁移速度成正相关， 在 DHPLC 图谱中表现为小片段的 峰出现较快 (AR 位点 )， 大片段的峰出现较慢 (MIC2 位点 )， 因此可从 PCR 产物的迁移时间 对其进行定性分析， 即确定 DHPLC 图谱中每一个峰所对应的基因。
本发明所述的试剂盒的使用方法， 所得 PCR 产物的 DHPLC 图谱的分析方法中， MIC2 基因酶切前后的 PCR 产物所对应的峰位置不相同， 酶切前有峰， 酶切后无峰时为酶切完全， 以确保没有假阳性结果出现。
本发明所述的试剂盒可以为临床提供 X 染色体失活异常的分子检测， 诊断率 达 82 ％。应用本试剂盒诊断， 同时进行家系分析时， 还可判断异常 X 染色体的来源。本 发明所述的试剂盒采用双重 PCR 引物进行扩增， 扩增条件稳定、 特异、 灵敏 ； 同时采用 DHPLC(denature high performance liquid chromatography， 变性高效液相色谱 ) 法对 PCR 产物进行分析， 该分析方法快速、 简便、 低成本、 高通量、 自动化， 且灵敏性高， 容易判读， 适用于临床。本试剂盒所对应的核心技术 --DHPLC 技术对检测样本的要求低 ( 仅需 100 ～ 150mg)， 灵敏度高于目前通用的聚丙烯酰胺凝胶电泳法， 可以将只差一个重复次数的 STR 片段区分开， 容易判读， 并依靠自动化操作的分析仪完成， 可进行完备的质控， 能极大地避 免人工操作所带来的人为出入。 同时， 本发明试剂盒的检测成本仅为 10.2 元 / 检测位点， 远 远低于现有的分析技术。 另外， 该技术还具有高通量的特点， 每天可完成 96 个次的检测。 本 发明试剂盒可用于分析 X 染色体失活相关疾病， 如自然流产、 血友病、 X 连锁智力低下、 G6PD 缺陷症、 Rett 综合征等的 SXCI 情况， 对 X 染色体连锁疾病的临床与研究提供简便可行的方 法， 并可协助确诊上述疾病或为上述疾病提供病因诊断。
以下是本发明所述的试剂盒在临床诊断率统计、 灵敏度实验、 成本计算及检测速 率分析。
1. 本试剂盒的临床诊断率统计
诊断率的高低取决于所选 STR 位点的杂合性。当所检测的 STR 位点为纯合峰时， 本发明试剂盒将无法判断其所在的一对 X 染色体各自的失活比例。
A. 试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 扩 增 AR 基 因 第 一 外 显 子 的 一 个 三 碱 基 STR 位 点 的 引 物 序 列 为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC。
III、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。
B. 本发明所述试剂盒的临床诊断率统计检测方法 ：
①本发明所选 STR 位点的理论杂合度的获得 ：
通过 www.gdb.org 数据库查找 STR 位点的理论杂合度。
②本发明所选 STR 的实际杂合度的统计 ：
a. 对 422 个女性 DNA 样本 ( 所有来源的女性器官组织或体细胞都适用， 本研究采用的是 271 例流产妇女外周血标本、 151 例流产绒毛标本 ) 提取基因组 DNA， 将浓度稀释至 100ng/μl 左右 ； 其中绒毛标本是孕 6-12 周的自然流产或人工流产的绒毛， 经绒毛核型分 析后取其中的女性， 且排除核型为 45， X 的标本。
b. 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 a 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
c. 扩增 AR 基因， 引物序列为 ：
GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC ；
反应体系见表 4， PCR 扩增条件为 ： 95 ℃预变性 5min， 94 ℃ 30s， 62 ℃ 45s， 72 ℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
表 4AR 基因扩增反应体系
试剂 灭菌水 DNA 样本 dNTP( 各 2.5mM) Taq 酶 10×buffer AR-F/AR-R(10pmol/μl)
用量 16.6μl 150ng 2μl 1.6U 2.5μl 0.8μld. 将 PCR 产物进行 50℃非变性 DHPLC 检测， 洗脱梯度见表 3 ；
e. 实际杂合度＝ STR 位点为杂合峰的个数 / 总样本个数。
(3) 结果分析
①该位点理论杂合度为 90％。
② 422 例 标 本 中， 在 STR 位 点 为 杂 合 子 的 标 本 346 例， 该位点实际杂合度＝ 346/422 ＝ 82.0％
2. 本试剂盒的灵敏度检测
A. 本发明试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 扩 增 AR 基 因 第 一 外 显 子 的 一 个 三 碱 基 STR 位 点 的 引 物 序 列 为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC。
III、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。
B、 本发明所述的试剂盒的灵敏度测试方法 ：
a、 对 2 例女性标本 ( 表型正常的女性门诊体检标本， 年龄为 30 岁， 染色体核型检
查为 46， XX) 和 1 例自然流产家系绒毛样本 ( 收集孕 8 周的自然流产正常核型女性绒毛标 本， 以及流产夫妇外周血标本 ) 进行 DNA 提取， 将浓度稀释至 100ng/μl 左右。
b. 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 a 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
c. 扩增 AR 基因， 引物序列为 ：
GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC ； 反应体系见表 4， PCR 扩增条 件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
表 4AR 基因扩增反应体系
试剂 灭菌水 DNA 样本 dNTP( 各 2.5mM) Taq 酶 10×buffer AR-F/AR-R(10pmol/μl)
用量 16.6μl 150ng 2μl 1.6U 2.5μl 0.8μld. 将 PCR 产物进行 50℃非变性 DHPLC 检测， 洗脱梯度见表 3 ；
e. 测序分析 ： 将 PCR 产物委托上海英骏生物技术有限公司进行。
f. 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ： 将 PCR 产物置于 8％非变性聚丙烯酰胺凝胶， 100V 恒压电泳 8 小时。
(3) 结果分析 ：
a. 用于测序的 2 个标本的 PCR 产物长度分别相差 6 个与 2 个 CAG 重复， 其对应的 DHPLC 图谱中， 该位点两峰出峰时间相差分别为 1min 与 0.3min。具体见图 3。由此可知， 当 出峰时间相差约 0.15min 时， 两片段长度差异即为 1 个 CAG 重复， 即 DHPLC 法可以将只差 1 个重复次数的两个 STR 片段区分开， 具备充足的灵敏度， 完全满足该位点的 X 染色体失活检 测要求。
b. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、 DHPLC 分析法均可用于家系研究。图 4 为一个家系的 结果， A 图为 DHPLC 结果， B 图为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。两图中父亲 DNA 标本酶 切后 PCR 扩增均无产物， 女儿 X 失活接近等比失活。母亲酶切前后的两条带在聚丙烯酰胺 凝胶电泳中区分不明显， 但在 DHPLC 中可清楚判读 ( 红色箭头处为母亲 STR 的杂合双峰 )。 由此可见， DHPLC 与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果一致， 但分辨率更高、 更容易判读， 即新
方法明显优于常规方法。
3. 本试剂盒成本计算
每个样本的检测成本约 10.2 元， 具体成本计算见表 5 ：
表 5 本发明所述试剂盒的成本计算
4. 本试验盒检测速率计算 ：
本试剂盒中的 DHPLC 检测时间为 15min/ 个样本， 每天可完成 96 个次的检测， 为完 全自动化的检测。
【附图说明】
图 1 为 STR 位点基因示意图， 其中扩增片段长度为 200 ～ 300bp。 图 2 为 MIC2 基因位点示意图， 其中扩增片段长度为 375bp。 图 3 为测序结果与 DHPLC 结果比较图， 其中 A 图为 DHPLC 结果， B 图为相应测序结果。 图 4 为聚丙烯酰胺凝胶电泳与 DHPLC 结果比较图， 其中 A 图为 DHPLC 结果， A 图为 丙烯酰胺凝胶电泳结果 ； B 图中 Marker 长度为 200bp ～ 300bp， R 表示女儿样本， F 表示母 亲样本， M 表示父亲样本， + 表示酶切后样本， - 表示酶切前样本。
图 5 为实施例 1 的 X 染色体失活偏移＞ 70％的 DHPLC 图谱。
图 6 为实施例 2 的自然流产 X 染色体失活家系分析的 DHPLC 图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明试剂盒的使用方法和技术效果， 下面将通过具体的病例分 析和临床统计来对本发明做进一步阐述。
实施例 1
X 染色体失活偏移 ( ＞ 70％ ) 的病例
1、 本发明试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 一对扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物， 其序列为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC ；
III、一 对 扩 增 MIC2 基 因 的 引 物，其 序 列 为 ： AGA GGTGCGTCCGATTCTT 和 CGCCGCAGATGGACAATTT。
IV、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。2、 本发明所述的试剂盒的使用方法 ：
(1) 对自然流产妇女外周血标本进行基因组 DNA 抽提后获得 DNA 样本， 将浓度稀释 至 100ng/μl。
(2) 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 1 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
(3) 采用本发明所述的双重 PCR 引物对酶切前后的 DNA 进行 PCR 扩增。引物如上 所述， 反应体系见表 2， PCR 扩增条件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
(4) 在 50℃下， 使用 DHPLC 仪对 PCR 产物进行分析， 得到 DHPLC 图谱， DHPLC 工作 条件可以如表 3 所示。
(5) 对 DHPLC 图谱进行分析， 对 X 染色体失活情况进行判读。
a.DHPLC 图谱中 ( 图 5)， 上方 ( 蓝色部分 ) 为酶切前标本的 PCR 产物的洗脱峰， 下 方 ( 红色部分 ) 为酶切后标本的 PCR 产物洗脱峰。在酶切前标本的产物峰中， 前面两个相 距较近的峰为 STR 位点的杂合峰， 后面相距较远的峰为 MIC2 位点内参峰。
b. 内参基因在酶切后无 PCR 产物， 说明酶切完全。 c.STR 呈双峰， 说明样本一对 X 染色体上的 STR 靶位点为杂合状态， 可用于区分 X 失活状态。
d. 酶切后出现的峰为失活峰， 其峰高代表失活量。根据公式 (d1/u1)/(d1/u1+d2/ u2) 计算失活比例＝ (0.702/0.879)/(0.702/0.879+0.208/0.803) ＝ 71.74％， 失活比例＞ 70％， 可诊断该标本为 X 失活偏移。
实施例 2
自然流产病例的家系分析
1、 本发明试剂盒， 其组成如下 ：
I、 甲基化敏感性限制性内切酶， 购自美国 Promega 公司的 HpaII 限制性内切酶。
II、 一对扩增 AR 基因第一外显子的一个 CAG 三碱基 STR 位点的引物， 其序列为 ： GCCGCCGTCCAAGACCTACC 和 TGGGGAGAACCATCCTCACC。
III、一 对 扩 增 MIC2 基 因 的 引 物，其 序 列 为 ： AGA GGTGCGTCCGATTCTT 和 CGCCGCAGATGGACAATTT。
IV、 DNA 聚合酶 ： Taq 酶， 选用的是北京鼎国生物技术公司的 Taq 酶。
2、 本发明所述试剂盒的使用方法 ：
(1) 家系的女儿标本为孕 7 周时 B 超提示胚胎停止发育 ( 无心管搏动、 不能见到胎 芽等 ) 后行清宫术收集的女性绒毛标本， 同时采集流产夫妇双方静脉血。对上述样本进行 基因组 DNA 抽提后获得 DNA 样本， 将浓度稀释至 100ng/μl。
(2) 使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII 消化步骤 1 获得的 DNA 样本， 反应条件 为 37℃过夜消化。
(3) 采用本发明所述的双重 PCR 引物对酶切前后的 DNA 进行 PCR 扩增。引物如上 所述， 反应体系见表 2， PCR 扩增条件为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 62℃ 45s， 72℃ 45s， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 7min， 4℃保存。
(4) 在 50℃下， 使用 DHPLC 仪对 PCR 产物进行分析， 得到 DHPLC 图谱， DHPLC 工作
条件可以如表 3 所示。
(5) 对 DHPLC 图谱进行分析， 对自然流产进行家系分析 ：
(a)DHPLC 图谱中 ( 图 6)， 上方的三道洗脱峰线 ( 青色、 绿色、 黑色 ) 分别为酶切前 的女儿、 母亲、 父亲标本， 下方的三道洗脱峰线为酶切后的女儿、 母亲、 父亲标本。
(b) 内参基因在酶切后无 PCR 产物， 说明酶切完全。
(c)STR 呈双峰， 说明样本一对 X 染色体上的 STR 靶位点为杂合状态， 可用于区分 X 失活状态。
(d) 通过酶切前的家系分析可以判断女儿一对 X 染色体的来源 ： 第一个峰与父亲 对应， 为父源峰， 第二个峰与母亲对应， 为母源峰。
(e) 通过酶切前后的比较， 女儿的失活峰完全为父源峰， 母源 X 保持活性 ； 母亲的 X 染色体 1 ∶ 1 失活， 失活正常。12101962680 A CN 101962681
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