一种红酵母细胞以及不对称转化生产光学活性醇的方法.pdf

本发明公开了一种红酵母细胞，以及使用该细胞生产光学活性醇的方法。以红酵母细胞为催化剂，能够在温和的反应条件下对多种前手性酮底物进行转化，得到相应的光学活性醇。底物的转化率高，产物光学纯度高(对映体过量值均在90％以上)，具有较高的实际应用价值和开发前景。

1.  一种红酵母细胞Rhodotorula sp.XY-J20，保藏号CGMCC No.2882。

2.  一种以红酵母细胞对潜手性酮进行不对称还原生产光学活性醇的工艺，包括：
(1)将能有效进行生物转化的红酵母细胞(Rhodotorula sp.XY-J20)进行常规培养、发酵，获得湿菌体直接作为生物催化剂或制备成固定化细胞后作为生物催化剂；
(2)以潜手性酮作为转化底物；
(3)将(1)获得的湿菌体或固定化细胞加入转化体系溶液后，再加入转化底物进行转化，生成相应的光学活性醇；
(4)将(3)的转化液，用乙酸乙酯萃取后旋转蒸发除去乙酸乙酯，加入甲醇后进行HPLC及GC检测，计算转化率及对映体过量值分析。

3.  根据权利要求2所述方法，特征在于步骤(1)中酵母发酵的培养基为YPD培养基，其中酵母提取物10％，蛋白胨20％，葡萄糖20％，含或不含琼脂2％，自然pH。

4.  根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤(1)中红酵母发酵步骤为：
(1)斜面培养：配置YPD培养基，110℃灭菌15分钟，冷却后制成斜面，接种红酵母菌株，30℃培养2-3天作为斜面活化种子，
(2)种子培养：配置YPD培养基，装液量100ml/250ml三角瓶，115℃灭菌20分钟，冷却后接入斜面活化种子，30℃，摇瓶转速180r/min，培养24小时，作为种子液，
(3)发酵培养：配置YPD培养基，装液量500ml/2000ml三角瓶，115℃灭菌20分钟，冷却后接入种子液，接种量5～10％，30℃，摇瓶转速180r/min，培养36小时，作为发酵培养液，发酵培养液经4000rpm离心收集细胞，磷酸盐缓冲液洗涤两遍后离心收集细胞，以细胞或以海藻酸钠等介质进行固定化处理后的细胞作为生物催化剂。

5.  根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤(3)中转化方法为摇床或搅拌罐转化，连续实施或分批进行：采用步骤(1)发酵所得湿菌体或以卡拉胶、海藻酸钠或聚乙烯醇为介质进行固定化的细胞为催化剂，转化体系为水相或有机/水双相体系，其中水相为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH＝5～9，有机相为甲烷、环己烷、正己烷、石油醚、正庚烷、辛烷中的一种，以辛烷为佳，用量为总体积的5～100％，可加入表面活性剂如吐温-80，用量为反应体系总体积的0.1～5％，湿菌体用量为200～250g/L，底物浓度1～6mg/ml，摇床转速180r/min，搅拌浆转速400rpm，转化温度30℃，转化时间2～36小时。

6.  根据权利要求2所述方法，其特征在于转化的潜手性底物为羰基化合物，包括对氨基苯乙酮、2-溴代苯乙酮、2-溴代对硝基苯乙酮、对氯苯丙酮和3，5-双三氟甲基苯乙酮，产物光学活性醇分别为对(S)-氨基苯乙醇、(S)-2-溴代苯乙醇、(S)-2-溴代对硝基苯乙醇、(S)-对氯苯丙醇和(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇。

一种红酵母细胞以及不对称转化生产光学活性醇的方法
技术领域
本发明涉及生物转化领域，特别是涉及以微生物转化反应生产光学活性醇的工艺。
背景技术
光学活性醇是天然产物及手性药物合成中重要的手性砌块，种类繁多、作用多样、功能明显，是近年来开发较为活跃的对象之一，两种对映体均可被用于合成多种手性药物，产物广泛应用于医药、农药等行业，具有良好的发展空间和巨大的市场潜力。
目前制备光学活性醇的方法主要有物理法、化学法和生物法三种。物理法主要选择吸附拆分法和结晶法。化学法因使用的原理不同可分为三种：化学拆分、不对称合成和色谱分离。生物法是利用生物催化剂(酶或产酶细胞)进行外消旋体拆分或手性化合物的不对称合成和转化。与物理法和化学法相比，生物转化法具有更多突出优点：高效率、高立体选择性、反应条件温和、产物单纯、不污染环境以及经济和社会效益好等优点而最具吸引力，同时又克服了色谱法费用高、易产生副产物等缺陷。同时，进行对映体拆分的最大理论产率为50％，而生物转化不对称合成的最大理论产率则为100％，因而备受研究者的青睐。当前，生物转化已涉及羟基化、环氧化、脱氢等氧化还原反应、水解、水合、酯化、酯转移、脱水、脱羧、酰化、胺化、异构化和芳构化等各种化学反应。
利用氧化还原酶及相关的微生物为手性合成催化剂还原前手性的底物羰基化合物，可以直接得到具有光学活性的手性醇。酶作为生物催化剂，不对称还原制备光学活性化合物已成为普遍采用的方法。羰基还原酶催化还原许多在生理和药理上有活性的羰基化合物，能将前手性的底物转化为光学活性醇，许多手性醇可以通过羰基还原酶对潜手性酮的立体选择性还原得到。
酵母细胞是一种普遍使用的生物催化剂，细胞内含有丰富的氧化还原酶，可用于多种潜手性酮的不对称还原，但其产物的转化率和光学纯度都比较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以酵母细胞对于价格较为低廉的潜手性酮的不对称生物转化生成浓度高、光学纯度高的光学活性醇的方法，属于生物转化领域。
为达到本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：一种微生物转化制备光学活性醇的方法，所述方法是以前手性酮为底物，以本试验室保存并诱变得到的红酵母(Rhodotorulasp.XY-J20)为生物催化剂，进行不对称转化还原反应，反应结束后转化液经分离纯化从而得到一系列相应的光学活性醇。
所述红酵母细胞是以本实验室保存的红酵母(Rhodotorula sp.)为出发菌株，按照常规方法进行紫外线诱变得到的，紫外线照射为15W，距离25cm，时间1.5～2分钟。紫外诱变筛选出的较优菌株进行离子注入诱变，诱变剂量10¹³irons·cm^-2，经处理得到的菌株培养后进行转化实验，获得能够对多种潜手性酮进行不对称还原的高产菌株。该菌株在YPD培养基上形成圆形粘质状菌落，生长初期无色，成熟时为粉红色，命名为红酵母Rhodotorulasp.XY-J20。
此菌株已于2009年1月19日保存在北京市朝阳区大屯路中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保存号为CGMCC No.2882。
本发明生产光学活性醇的方法，包括：
(1)将菌株XY-J20进行常规培养，发酵，获得湿菌体或以海藻酸钠等介质进行固定化后作为生物催化剂；
(2)以前手性酮作为转化底物；
(3)将(1)获得的湿菌体或固定化细胞作为生物催化剂，于水相或水与有机溶剂组成的两相体系中，加入转化底物进行转化，生成光学活性醇；
(4)将(3)的转化液，用乙酸乙酯萃取后旋转蒸发除去乙酸乙酯，加入甲醇后用于转化率或对映体过量值分析。
转化用菌株的培养和发酵：
斜面培养：配置YPD培养基：酵母提取物10％，蛋白胨20％，葡萄糖20％，琼脂2％，自然pH，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/ml，下同。110℃灭菌15分钟，冷却后制成斜面，接种，30℃培养2-3天。
种子培养和发酵：YPD培养基：酵母提取物10％，蛋白胨20％，葡萄糖20％，自然pH，装液量100ml/250ml三角瓶，110℃灭菌15分钟，冷却后接种，接种量5～10％，30℃，摇瓶转速180r/min，培养24～36小时，分别作为种子及及发酵培养液。其中发酵培养液经4000rpm离心收集细胞，磷酸盐缓冲液洗涤两遍后离心收集细胞，以细胞或以海藻酸钠等介质进行固定化处理后的细胞作为生物催化剂。
微生物转化反应：以培养的细胞为催化剂，于水相或水与有机溶剂组成的双相体系中进行转化，以前手性酮为底物，底物浓度1～6mg/ml，湿菌体用量为0.1～0.3g/ml，转化温度25～37℃，摇床转速180r/min，转化时间2～36小时。
或者，发酵收获的湿菌体制得固定化细胞，以此作为生物催化剂。固定化细胞可反复使用，进行多次生物转化反应。
其中所述的潜手性酮为羰基化合物，包括对氨基苯乙酮、2-溴代苯乙酮、2-溴代对硝基苯乙酮、对氯苯丙酮和3，5-双三氟甲基苯乙酮；
其中所述的水相是指pH5～9的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液；
其中所述的有机溶剂为正辛烷、正己烷、乙醇、二甲亚砜、四氢呋喃中的一种，以辛烷为佳，用量为总体积的5～100％；
可加入表面活性剂如吐温-80，用量为反应体系总体积的0.1～5％；
其中所述的固定化细胞是指发酵后湿菌体以卡拉胶、海藻酸钠或聚乙烯醇等介质包埋后的红酵母细胞，制备方法为：称取一定量湿菌体，分散到无菌水中，再与一定浓度的海藻酸钠溶液充分混合均匀，得到海藻酸钠和细胞的混合液。用注射器吸取上述混合液，滴入到预冷的1～4％CaCl₂溶液中，形成直径为1.8mm的固定化小球，钙化30min，于4℃冷藏备用；
或称取一定量湿菌体，分散到无菌水中，再与一定浓度的卡拉胶溶液充分混合均匀，得到4％卡拉胶和10％细胞的混合液。将混合液倒入平板使之固化，将其切成1.5cm×1cm×0.2cm的方块，倒入2％KCl溶液于4℃冷藏备用；
或称取一定量湿菌体，分散到无菌水中，再与一定浓度的聚乙烯醇溶液充分混合均匀，得到15％聚乙烯醇和10％细胞的混合液。将混合液铺于培养皿中，-20℃冷冻24h，取出后切割成3mm×3mm的立体小方块，生理盐水清洗后备用；
反应结束后，反应液用适量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩至干后加入1ml甲醇后，进行HPLC检测和GC检测，计算出底物转化率和产物的对映体过量值。
底物前手性酮和产物光学活性醇的HPLC测定：C18反相色谱柱，流动相乙腈∶水＝70∶30；进样量10ul；流速1ml/min；柱温25℃；紫外检测波长264nm。底物转化率定义为：X＝[C₀/(C₀+C)]×100％，式中C₀和C分别代表高效液相图谱中产物和底物峰的峰面积。
产物光学活性醇的对映体过量值测定方法和条件：手性气相毛细管柱AgilentCYCLODEX-B(60m×0.250mm×0.25μm)；进样口温度250℃，检测器温度250℃，柱温恒温130℃；载气为氮气，流速为1.4ml/min；分流比为10∶1；对照品和待测样品均用甲醇溶解，进样量为0.2μl。产物醇的对映体过量值ee(S)(％)＝([S]-[R]/[S]+[R])×100％，其中[S]和[R]分别代表(S)-和(R)型光学活性醇的浓度(μl/ml)。
本发明利用红酵母细胞不对称催化还原前手性酮的单相或双相体系，能够在温和的反应条件下对多种底物进行转化，底物的转化率高，产物光学纯度高(对映体过量值均在90％以上)，具有较高的实际应用价值和开发前景。
附图说明
图1是HPLC图谱，描述分离成功的底物3，5-双三氟甲基苯乙酮和产物(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇，其中4.039min的峰为产物(s)-3，5-双三氟甲基苯乙醇，4.633min的峰为底物3，5-双三氟甲基苯乙酮。
图2是GC图，描述成功分离(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇及(R)-3，5-双三氟甲基苯乙醇，其中23.2min出峰的是(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇，24.2min出峰的是(R)-3，5-双三氟甲基苯乙醇。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
实施例l
YPD培养基：酵母提取物10％，蛋白胨20％，葡萄糖20％，自然pH，装液量100ml/250ml三角瓶，110℃灭菌15分钟。
取4℃保存的红酵母XY-J20斜面菌种，挑取一环接种至装有100ml培养基的250ml摇瓶中，30℃，180rpm培养24hr，按照接种量5％接种量转接至盛有500ml培养基的2000ml摇瓶中，30℃，180rpm，培养30hr，发酵培养液经4000rpm离心并用磷酸盐缓冲液洗涤两遍后离心收集细胞，得湿菌体约30g。
实施例2
取发酵并洗涤后的红酵母XY-J20湿菌体1g，加入至10ml含有0.5％吐温80及20％辛烷的PBS(pH 7.0)中，加入底物对氨基苯乙酮6.6mg(4.88mM)，转化21h，于30℃，180rpm条件下进行转化，转化时间为24h。反应结束后，反应液用适量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩至干后加入lml甲醇后，进行HPLC检测和GC检测，底物对氨基苯乙酮的转化率和对映体过量值分别为44.0％和92.3％。
实施例3
取发酵并洗涤后的红酵母XY-J20湿菌体1g，加入至10ml含有0.5％吐温80及20％辛烷的PBS(pH 7.0)中，加入底物对2-溴代苯乙酮6.7mg，于30℃，180rpm条件下进行转化，转化时间为21h。反应结束后，反应液用适量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩至干后加入1ml甲醇后，进行HPLC检测和GC检测，底物对氨基苯乙酮的转化率和对映体过量值分别为100％和90.6％。
实施例4
取发酵并洗涤后的红酵母XY-J20湿菌体1g，加入至10ml含有0.5％吐温80及20％辛烷的PBS(pH 7.0)中，加入底物对2-溴代对硝基苯乙酮10.8mg，于30℃，180rpm条件下进行转化，转化时间为21h。反应结束后，反应液用适量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩至干后加入1ml甲醇后，进行HPLC检测和GC检测，底物对氨基苯乙酮的转化率和对映体过量值分别为86.6％和95.2％。
实施例5
取发酵并洗涤后的红酵母XY-J20湿菌体1g，加入至10ml含有0.5％吐温80及20％辛烷的PBS(pH 7.0)中，加入底物对对氯苯丙酮7.5mg，于30℃，180rpm条件下进行转化，转化时间为21h。反应结束后，反应液用适量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩至干后加入1ml甲醇后，进行HPLC检测和GC检测，底物对氨基苯乙酮的转化率和对映体过量值分别为50％和96.2％。
实施例6
以1.5％海藻酸钠，12.5％的细胞包埋浓度，2％CaCl₂对红酵母细胞进行固定化作为催化剂。以1000ml烧杯作为生物反应器，30℃，搅拌桨转速400r/min，将112克固定化小球(相当于20g湿菌体)分散在200ml含有5％辛烷的0.1M pH8.0Tris-HCl中，加入400ul底物3，5-双三氟甲基苯乙酮，在30°转化，转化4hr。反应结束后，反应液用适量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩至干后加入1ml甲醇后，进行HPLC检测和GC检测，底物对氨基苯乙酮的转化率和对映体过量值分别为93.6％和95.2％。