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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710432805.7 (22)申请日 2017.06.09 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 李新蒋权卢应梅邓亚萍 蒋国军韩峰胡永洲 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 赵杭丽 (51)Int.Cl. C07K 5/103(2006.01) C07K 1/04(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C09K 11/06(2006.01) C12Q 1/5。
2、33(2006.01) (54)发明名称 一种检测脯氨酸异构酶活性的荧光探针及 制备和应用 (57)摘要 本发明提供一种检测脯氨酸异构酶活性的 荧光探针。 该探针在生理环境中荧光较弱， 可以 特异性地在脯氨酸异构酶的催化作用下发生构 型翻转， 生成荧光信号增强的产物， 因此该探针 可用于脯氨酸异构酶的活性评价。 可在检测细胞 或组织蛋白质提取液中脯氨酸异构酶活性中的 应用； 以及在检测活细胞中脯氨酸异构酶活性中 的应用。 本发明提供的荧光探针及检测方法具有 以下有益效果： (1)探针稳定性好， 能够长期保存 使用； (2)检测方法简便， 检测体系中加入探针孵 育10分钟测荧光强度， 即可给出结。
3、果， 无需其它 试剂辅助； (3)能实现活细胞中脯氨酸异构酶活 性的在体检测， 而其它报导方法仅能用于细胞匀 浆液。 所述探针的具结构如图。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 107312068 A 2017.11.03 CN 107312068 A 1.一种检测脯氨酸异构酶活性的荧光探针， 其特征在于， 具有式I所示的结构： 其中， R1为氢或者苯环； R2为荧光团， 选自萘甲酸、 荧光素、 罗丹明、 氟硼二吡咯。 2.权利要求1所述的一种检测脯氨酸异构酶活性的荧光探针的制备方法， 其特征在于， 通过以下步骤实现： (1)以氨基Fmoc保护的苯丙氨酸及对硝基苯胺为原料制备N-Fmo。
4、c-苯丙 氨酰对硝基苯胺； (2)固相合成法制备N端R2修饰的 “丙氨酸-甘氨酸或苯丙氨酸-脯氨酸” 三 肽链； (3)将上述步骤制备的 “N-Fmoc-苯丙氨酰对硝基苯胺” 脱除Fmoc保护基后与 “R2标记 的三肽链” 在干燥的二氯甲烷溶液中缩合， 得到式I所示荧光探针。 3.根据权利要求1所述的式I化合物在检测组织蛋白质提取液中脯氨酸异构酶活性中 的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 通过以下步骤实现： (1)组织样本提取： a)收集特定部位组织样本， 储存于-80； b)配制裂解液； c)根据样 本质量按10mg/50 l加入裂解液， 使用研磨棒进行研磨裂解； d)冰。
5、上裂解30min， 12000g离心 10min， 吸取上清至新的EP管中， 使用Bio-Rad公司的试剂盒对蛋白质提取液进行定量分析， 最后补充裂解液至蛋白质提取液终浓度为1 g/ l； (2)细胞样本提取： a)待细胞长至90密度时， 弃上清， 加入3ml的PBS溶液清洗3次， 最 后加入1.5ml PBS溶液， 使用干净的细胞刮铲将细胞收集， 吸取溶液至离心管中， 1200rpm离 心4min， 弃掉所有上清， 保留底部细胞， 冻存-80便于后续使用； b)配制裂解液； c)根据细 胞数量按6孔板/20 l加入裂解液； d)冰上裂解30min， 12000g离心10min， 吸取上清至新。
6、的EP 管中， 使用Bio-Rad公司的试剂盒对蛋白质提取液进行定量分析， 最后补充裂解液至蛋白质 提取液终浓度为1 g/ l； (3)组织/细胞样品中脯氨酸异构酶活性测试： a)配制浓度为100mM， pH8.0的4-羟乙 基哌嗪乙磺酸溶液； b)配制浓度为5mM的探针I， 溶解于70DMSO中； c)在96孔全黑色板中， 设置组别为4-羟乙基哌嗪乙磺酸+ddH2O+探针I， 4-羟乙基哌嗪乙磺酸+ddH2O+探针I+蛋白质 提取液， 依次加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液， ddH2O， 蛋白质提取液10 g， 探针I， 总体系为 100 L； d)使用M5多功能酶标仪， 设置检测前晃动5s， 。
7、EX360， EM460， 每20s检测一次荧光 值， 共检测10min。 检测完成后， 导出数据， 统计荧光值变化趋势结果。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 步骤(1)所述裂解液为10mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA,pH7.5， 临用前加入PMSF 0.1mg/ml， Leupeptin 10 g/ml， Aprotitin 20 g/ ml。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 步骤(2)所述PBS溶液为： 8.00g NaCl, 0.20g KCl,3.63g Na2HPO412H2O,0.24g KH2PO4加水定容至1000ml； 配制。
8、的裂解液为10mM 权利要求书 1/2 页 2 CN 107312068 A 2 Tris,150mM NaCl,1mM EDTA,pH7.5， 临用前加入PMSF 0.1mg/ml， Leupeptin 10 g/ml， Aprotitin 20 g/ml。 7.根据权利要求1所述的式I化合物在检测活细胞中脯氨酸异构酶活性中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 通过以下步骤实现： 在DMEM高糖培养基中 加入式I化合物， 使其终浓度为5 M， 37下孵育30分钟， 观察记录细胞荧光强度； 式I化合物 的荧光强度与脯氨酸异构酶的活性之间存在正向相关， 从而实现对脯氨酸异构酶的。
9、特异性 检测和定量分析。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107312068 A 3 一种检测脯氨酸异构酶活性的荧光探针及制备和应用 技术领域 0001 本发明属生物检测领域， 涉及一类检测脯氨酸异构酶活性的荧光探针， 及其制备 方法和在检测生物样本中脯氨酸异构酶活性中的应用。 背景技术 0002 脯氨酸是一类特殊的氨基酸， 其结构中的氨基为双取代仲胺。 在蛋白质二级结构 中， 由于脯氨酸的存在， 正常的 螺旋骨架被瓦解， 在脯氨酸形成 转角。 而脯氨酸异构酶是 一类高度保守的亲免疫因子家族， 它由三个亚家族组成， 分别是FK506结合家族(FK-506- binding proteins，。
10、 FKBPs)， 亲环素类家族(cyclophilins)和parvulins家族， 在原核和真 核等多种微生物， 动植物中都有表达。 而在人体的多个组织部位， 其表达也很丰富， 可以调 节细胞的不同功能， 例如钙相关信号调节、 蛋白质折叠和基因表达。 脯氨酸异构酶催化原理 主要是通过脯氨酸异构酶活性结构域作用在底物蛋白质脯氨酸上， 使底物蛋白质的脯氨酸 发生异构， 从而引起蛋白质构象改变， 进而使蛋白质功能发生变化。 0003 细胞内钙信号的储存和释放可以引起激活多种信号通路， 涉及细胞的自噬， 凋亡 和坏死多种反应途径。 而内质网作为细胞内钙离子的储存器， 其受到兰尼碱(ryanodine。
11、)受 体和三磷酸肌醇(IP3)的调节。 同时， 相关研究报道表明FKBPs可以结合内质网膜上的相关 受体， 调节钙的释放， 从而引起细胞信号的激活。 0004 越来越多的证据表明， FKBPs参与了细胞众多反应过程， 例如细胞周期， 细胞存活 和凋亡通路， 特别是癌症。 因为在癌组织中， 发现FKBPs的表达都是异常的。 因此， 脯氨酸异 构酶在肿瘤新生， 放疗及化疗的反应都扮演了重要的角色， 在不同的组织中它可以抑制癌 基因或肿瘤。 众多临床数据也表明， 脯氨酸异构酶FKBPs可以作为癌症诊断、 治疗和预后的 生物标志物。 0005 目前， 市场上和临床上没有对脯氨酸异构酶活性和含量的检测试。
12、剂， 而针对脯氨 酸异构酶重组蛋白活性的检测一般使用双酶联酶切法检测， 该方法主要联合糜蛋白酶切割 和重组蛋白脯氨酸异构酶活性， 同时， 该方法只适用体外检测， 不能用于活细胞及在体检 测， 这限制了该方法的使用范围。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种检测脯氨酸异构酶活性的荧光探针， 是一种能快速在体 外和活细胞检测脯氨酸异构酶活性的荧光探针。 具有式I所示的结构： 说明书 1/4 页 4 CN 107312068 A 4 0007 0008 其中， R1为氢或者苯环； 0009 R2为荧光团如萘甲酸、 荧光素、 罗丹明、 氟硼二吡咯(BODIPY)等。 0010 本发明的又一个目的。
13、是提供式I所示化合物的合成方法， 通过以下步骤实现： (1) 以氨基Fmoc保护的苯丙氨酸及对硝基苯胺为原料制备N-Fmoc-苯丙氨酰对硝基苯胺； (2)固 相合成法制备N端R2修饰的 “丙氨酸-甘氨酸(或苯丙氨酸)-脯氨酸” 三肽链； (3)将上述步骤 制备的 “N-Fmoc-苯丙氨酰对硝基苯胺” 脱除Fmoc保护基后与 “R2标记的三肽链” 在干燥的二 氯甲烷溶液中缩合， 得到式I所示荧光探针。 0011 本发明的再一个目的是提供式I所示的化合物在检测细胞或组织蛋白质提取液中 脯氨酸异构酶活性中的应用， 通过以下步骤实现： 0012 1.组织样本提取： 1)收集特定部位组织样本， 储存于-。
14、80； 2)配制裂解液(10mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA,pH7.5， 临用前加入PMSF 0.1mg/ml， Leupeptin 10 g/ml， Aprotitin 20 g/ml)； 3)根据样本质量按10mg/50 l加入一定量裂解液， 使用研磨棒进行研 磨裂解； 4)冰上裂解30min， 12000g离心10min， 吸取上清至新的EP管中， 使用试剂盒(Bio- Rad公司， 货号5000111)对蛋白质提取液进行定量分析， 最后补充裂解液至蛋白质提取液终 浓度为1 g/ l。 0013 2.细胞样本提取： 1)待细胞长至90密度时， 弃上清， 加入3ml。
15、的PBS(8.00g NaCl, 0.20g KCl,3.63g Na2HPO412H2O,0.24g KH2PO4加水定容至1000ml)溶液清洗3次， 最后加 入1.5ml PBS溶液， 使用干净的细胞刮铲将细胞收集， 吸取溶液至离心管中， 1200rpm离心 4min， 弃掉所有上清， 保留底部细胞， 冻存-80便于后续使用； 2)配制裂解液(10mM Tris, 150mM NaCl,1mM EDTA,pH7.5。 临用前加入PMSF 0.1mg/ml， Leupeptin 10 g/ml， Aprotitin 20 g/ml)； 3)根据细胞数量按6孔板/20 l加入一定量裂解液； 。
16、4)冰上裂解30min， 12000g离 心10min， 吸取上清至新的EP管中， 使用试剂盒(Bio-Rad公司， 货号5000111)对蛋白质提取 液进行定量分析， 最后补充裂解液至蛋白质提取液终浓度为1 g/ l。 0014 3.组织/细胞样品中脯氨酸异构酶活性测试： 1)配制浓度为100mM， pH8.0的4-羟 乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液； 2)配制浓度为5mM的探针I， 溶解于70DMSO中； 3)在96孔全 黑色板中， 设置组别为HEPES+ddH2O+探针I， HEPES+ddH2O+探针I+蛋白质提取液， 依次加入 HEPES， ddH2O， 蛋白质提取液10g， 探针。
17、I， 总体系为100L； 4)使用M5多功能酶标仪 (SpectraMax)， 设置检测前晃动5s， EX360， EM460， 每20s检测一次荧光值， 共检测 10min。 检测完成后， 导出数据， 统计荧光值变化趋势结果。 0015 本发明的第四个目的是提供式I所示化合物在检测活细胞中脯氨酸异构酶活性中 的应用。 通过以下步骤实现： DMEM高糖培养基(品牌:Gibco， 货号:12800017)中加入式I所示 化合物， 使其终浓度为5 M， 37下孵育30分钟， 观察记录细胞荧光强度。 本发明提供的荧光 说明书 2/4 页 5 CN 107312068 A 5 探针的特征在于它本身在生。
18、理环境中只有微弱的荧光， 但可在脯氨酸异构酶的催化作用 下， 构型改变， 生成强荧光的产物， 且荧光强度与脯氨酸异构酶的活性之间存在正向相关， 从而实现对脯氨酸异构酶的特异性检测和定量分析。 0016 本发明提供的荧光探针及检测方法具有以下有益效果： (1)探针稳定性好， 能够长 期保存使用； (2)检测方法简便， 检测体系中加入探针孵育10分钟测荧光强度， 即可给出结 果， 无需其它试剂辅助； (3)能实现活细胞中脯氨酸异构酶活性的在体检测， 而其它报导方 法仅能用于细胞匀浆液。 附图说明 0017 图1是HBVP细胞蛋白质提取液加入式Ia所示探针后， 体系荧光逐渐增强。 0018 图2是H。
19、BVP细胞蛋白质提取液加入式Ib所示探针后， 体系荧光逐渐增强。 0019 图3是EA.Hy926细胞培养基中加入式Ia所示探针后， 胞内荧光逐渐增强。 具体实施方式 0020 下面的实施例是对本发明的进一步说明， 而不是限制本发明的范围。 0021 实施例1： 探针分子Ia的合成 0022 0023 “N-Fmoc-苯丙氨酰对硝基苯胺” 脱除Fmoc保护基后溶解于干燥的二氯甲烷甲烷溶 液中， 加入等当量的 “N， N-二甲基萘甲酸标记的丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸三肽链， 以及等当 量的EDC， HOBt缩合， 产物经制备液相分离， 得到式Ia所示化合物。 MS： 798.3550. 0024 。
20、实施例2： 探针分子Ib的合成 0025 0026 “N-Fmoc-苯丙氨酰对硝基苯胺” 脱除Fmoc保护基后溶解于干燥的二氯甲烷甲烷溶 液中， 加入等当量的 “N， N-二甲基萘甲酸标记的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸三肽链， 以及等当量 的EDC， HOBt缩合， 产物经制备液相分离， 得到式Ia所示化合物。 MS： 722.3333。 说明书 3/4 页 6 CN 107312068 A 6 0027 实施例3： 探针分子Ia检测HBVP细胞蛋白提取液中的脯氨酸异构酶活性 0028 制备细胞蛋白质提取液： 配制细胞裂解液(10mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA, pH7.5)。
21、， 每一瓶细胞加入100 l裂解液， 同时加入对应的蛋白酶抑制剂Cocktail， 冰上裂解 30min， 12000g离心10min， 吸取上清至新的EP管中， 使用试剂盒(Bio-Rad公司， 货号 5000111)对蛋白质提取液进行定量分析， 最后补充裂解液至蛋白质提取液终浓度为1 g/ l。 0029 在磷酸缓冲盐溶液中加入Ia， 使其终浓度为10微摩尔， 加入蛋白提取液20微升， 置 荧光分光光度计记录363nm激发条件下， 460nm处的荧光发射强度随时间的变化规律。 实验 结果显示： 加入蛋白质提取液能提高脯氨酸异构酶荧光探针的荧光值， 证明蛋白质提取液 中含有脯氨酸异构酶， 而。
22、且脯氨酸异构酶荧光探针能够改变荧光值对其发生响应。 参见图 1。 0030 实施例4： 探针分子Ib检测HBVP细胞蛋白提取液中的脯氨酸异构酶活性 0031 在磷酸缓冲盐溶液中加入Ib， 使其终浓度为10微摩尔， 加入蛋白提取液20微升， 置 荧光分光光度计记录363nm激发条件下， 460nm处的荧光发射强度随时间的变化规律。 实验 结果显示： 加入蛋白质提取液能提高脯氨酸异构酶荧光探针的荧光值， 证明蛋白质提取液 中含有脯氨酸异构酶， 而且脯氨酸异构酶荧光探针能够改变荧光值对其发生响应。 参见图 2。 0032 实施例5： 探针分子Ia检测EA.Hy926活细胞中的脯氨酸异构酶 0033 待细胞长至90密度时， 按1:5传代至玻璃底皿中。 48小时后， 细胞培养基中加入 式I所示的化合物， 使其终浓度为5 M， 混匀； 使用荧光显微镜， 开启405nm激光器， 收集式I所 示化合物的荧光信号， 对细胞荧光进行实时记录。 结果见图3。 说明书 4/4 页 7 CN 107312068 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 8 CN 107312068 A 8 。