用于细胞排列的微芯片和方法.pdf

本发明提供一种用于细胞排列的微芯片，通过结合光学钳和微流路的方法的优点，准确且快速地转移和排列细胞。一种用于排列细胞的微芯片，包括一基板，所述基板包括：至少一个细胞供应流路，包括一细胞注入口，与用于将细胞供应到所述细胞供应流路中的供应机构液体连通；至少一个细胞排出流路，包括与一排出机构液体连通的一细胞排出口，所述细胞排出流路用于将细胞引导到所述细胞排出口；至少一个储存部，用于临时储存在所述细胞供应流路和所述细胞排出流路之间流动的所述细胞；至少一个细胞排列部，用于接纳从所述储存部引入的细胞，所述细胞排列部包括由一隔壁分隔的多个间隔；及至少一个连接流路，从所述细胞排列部伸展到所述储存部；其中所述储存部宽于所述细胞供应流路、所述细胞排出流路及所述连接流路。

1、  一种用于排列细胞的微芯片，包括一基板，所述基板包括：
至少一个细胞供应流路，包括一细胞注入口，与用于将细胞供应到所述细胞供应流路中的供应机构液体连通；
至少一个细胞排出流路，包括与一排出机构液体连通的一细胞排出口，所述细胞排出流路用于将细胞引导到所述细胞排出口；
至少一个储存部，用于临时储存在所述细胞供应流路和所述细胞排出流路之间流动的所述细胞；
至少一个细胞排列部，用于接纳从所述储存部引入的细胞，所述细胞排列部包括由一隔壁分隔的多个间隔；及
至少一个连接流路，从所述细胞排列部伸展到所述储存部；
其中所述储存部宽于所述细胞供应流路、所述细胞排出流路及所述连接流路。

2、  根据权利要求1所述的微芯片，其中位于从所述细胞供应流路到所述连接流路的流通路径通过所述储存部的拐角的角度为直角或锐角。

3、  根据权利要求1或2所述的微芯片，其中所述细胞供应流路与经由所述储存部连接到所述细胞供应流路的所述细胞排出流路不在同一直线上。

4、  根据权利要求1～3任一所述的微芯片，其中包括多个所述储存部，所述储存部的每个连接于一分离的细胞供应流路、一分离的细胞排出流路及一分离的连接流路，其中所述分离的连接流路截止于所述细胞排列部。

5、  根据权利要求1～4任一所述的微芯片，其中包括六角形的所述间隔，使得其以蜂窝结构排列，其中每个间隔的底部包括小于所述六角形的一圆孔。

6、  一种用权利要求1～5任一所述的微芯片排列细胞的方法，包括：
顺序重复：第一步骤，将包含细胞的液体从供应机构经由细胞供应流路引入到至少一个储存部中；第二步骤，通过控制供应机构和排出机构或使用光学钳，将细胞从储存部经由连接流路转移到细胞排列部；第三步骤，使用光学钳将细胞放置于储存部中的期望选择的间隔中，直到在细胞排列部中完成期望的细胞排列。

7、  根据权利要求6所述的方法，其中还包括：
提供权利要求4或5中所述的微芯片；及
提供不同类型的细胞；
其中所述第一步骤包括，引入通过他们的类型进行分类的细胞，使得每个储存部接纳不同类型的细胞；所述第二步骤包括，通过控制所述供应机构和所述排出机构或通过所述光学钳，将期望的细胞从每个储存部经由分离的连接流路转移到细胞排列部。

用于细胞排列的微芯片和方法
技术领域
本发明涉及用于细胞排列的一种微芯片和方法，进一步地，涉及一种在进行排列操作时利用液体流动和光学钳一起转移细胞的方法，并涉及一种用于这种方法的细胞排列用微芯片。
背景技术
光学钳操作为一种通过采用激光束辐射压强来捕捉和扫描细胞的非接触方式的细胞转移方法已是公知的(例如，专利参考1)。
这种方法较佳地提供了准确且自由的细胞转移，但是，由于转移速度慢，当转移许多细胞或进行长距离转移时，导致了花费大量的时间，因此其效率不高。
另一种细胞转移的非接触式方法是发送液体到具有微型泵的微流路上(例如，专利参考2)。
这种方法的优点是可以快速地一次转移大量的细胞。然而，这种方法难以控制被转移的细胞数量和难以选择特定的细胞。进一步地，这种方法不适合于短的且准确的移动。
另一方面，已知一种微芯片，其具有许多微芯片细胞，用于培养基板上的细胞，这种微芯片作为用于对细胞进行规则排列的装置已是公知的(例如专利参考3)。
这种微芯片通过排列任意图案并培养至少两种细胞，能够用于使细胞芯片制作疑似组织，其可以用于毒性测试或再生医疗，以发现药品。在对细胞转移、附着、分化及生长等研究中，通过连续地培养不同的细胞来查找细胞的相互作用也是很有效的。
当将这种微芯片用于细胞排列时，从微芯片播种所述细胞之后，使用光学钳将细胞转移到微芯片细胞。
然而当细胞的播种是从微芯片执行时，多余的细胞留在微芯片细胞周围，用于细胞培养，这导致细胞芯片的不可再现性。而且，它要花许多时间使用光学钳来转移和对准许多细胞。在这种操作中，细胞有时在转移或排列之前会附着于微芯片上。进一步地，由于细胞转移很慢，虽然可以实现准确的分离，但要花很多时间用光学钳来分离和提取许多细胞，从而导致低效操作。
专利参考1：日本专利公开号2001-62792
专利参考2：日本专利公开号2003-274924
专利参考3：日本专利公开号2005-27598
发明内容
本发明要解决上述问题，将光学钳操作的有利方面与微流路方法的有利方面相结合。根据本发明所述方法和微芯片将提供准确且快速的细胞操作，如细胞转移和细胞排列等，从而有效地制造细胞切片。
根据权利要求1所述的本发明涉及一种用于排列细胞的微芯片，包括一基板，所述基板包括：至少一个细胞供应流路，包括一细胞注入口，与用于将细胞供应到所述细胞供应流路中的供应机构液体连通；至少一个细胞排出流路，包括与一排出机构液体连通的一细胞排出口，所述细胞排出流路用于将细胞引导到所述细胞排出口；至少一个储存部，用于临时储存在所述细胞供应流路和所述细胞排出流路之间流动的所述细胞；至少一个细胞排列部，用于接纳从所述储存部引入的细胞，所述细胞排列部包括由一隔壁分隔的多个间隔；及至少一个连接流路，从所述细胞排列部伸展到所述储存部；其中所述储存部宽于所述细胞供应流路、所述细胞排出流路及所述连接流路。
根据权利要求2所述的本发明涉及所述的微芯片，其中位于从所述细胞供应流路到所述连接流路的流通路径通过所述储存部的拐角的角度为直角或锐角。
根据权利要求3所述的本发明涉及根据权利要求1或2所述的微芯片，其中所述细胞供应流路与经由所述储存部连接到所述细胞供应流路的所述细胞排出流路不在同一直线上。
根据权利要求4所述的本发明涉及根据权利要求1～3任一所述的微芯片，其中包括多个所述储存部，所述储存部的每个连接于一分离的细胞供应流路、一分离的细胞排出流路及一分离的连接流路，其中所述分离的连接流路截止于所述细胞排列部。
根据权利要求5所述的本发明涉及根据权利要求1～4任一所述的微芯片，其中包括六角形的所述间隔，使得其以蜂窝结构排列，其中每个间隔的底部包括小于所述六角形的一圆孔。
根据权利要求6所述的本发明涉及一种用权利要求1～5任一所述的微芯片排列细胞的方法，包括：顺序重复：第一步骤，将包含细胞的液体从供应机构经由细胞供应流路引入到至少一个储存部中；第二步骤，通过控制供应机构和排出机构或使用光学钳，将细胞从储存部经由连接流路转移到细胞排列部；第三步骤，使用光学钳将细胞放置于储存部中的期望选择的间隔中，直到在细胞排列部中完成期望的细胞排列。
根据权利要求7所述的本发明涉及根据权利要求6所述的方法，其中还包括：提供权利要求4或5中所述的微芯片；及提供不同类型的细胞；其中所述第一步骤包括，引入通过他们的类型进行分类的细胞，使得每个储存部接纳不同类型的细胞；所述第二步骤包括，通过控制所述供应机构和所述排出机构或通过所述光学钳，将期望的细胞从每个储存部经由分离的连接流路转移到细胞排列部。
技术效果
根据权利要求1所述的本发明，通过使用连接于注入口的供应机构，可以使许多细胞快速地从细胞供应流路流入到储存部中。而且，由于比连接流路更宽的储存部对细胞在储存部中的临时存储，有利于在细胞排列部的细胞间隔中提供对期望细胞的准确和期望的排列，此处，使用光学钳等传递期望的细胞被。
因此，本发明为细胞排列提供了快速且准确的操作。
另外，来自于供应机构的液体流防止细胞附着于微芯片的任何不希望的区域。
进一步地，不希望的细胞(例如，死细胞或不同大小的细胞等)通过连接于细胞排出口的排出机构，被从储存部释放到细胞排出流路。
根据权利要求2所述的本发明，在位于从细胞供应流路到连接流路的流通路径通过储存部的拐角的角度为直角或锐角。这防止许多细胞通过注入机构经由连接流路从储存部流入细胞排列部。因此，多余的细胞不会流入细胞排列部中。
根据权利要求3所述的本发明，细胞供应流路与由储存部连接的相应细胞排出流路不在同一直线上。这导致将细胞临时存储到储存部中，从而导致从储存部到细胞排列部的准确及简易的细胞转移操作。
根据权利要求4所述的本发明，提供了多个储存部和单个细胞排列部。每个储存部包括一不同的细胞供应流路、一不同的细胞排出流路和来自其他储存部的一连接流路。每个连接流路将每个储存部连接到单个细胞排列部。这种结构能够传递各种类型的细胞到细胞排列部，而不在流路中混合，从而即使处理具有相似形状或大小的不同细胞，也不用荧光标记等即可识别细胞。
根据权利要求5所述的本发明，所述细胞排列部包括六角形的间隔，从而其被排列为蜂窝结构，使其适用于要进行规则排列好的多个细胞。而且，每个间隔的底部包括小于所述六角形的一圆孔，使得这些细胞能够被稳固地固定于其中。
权利要求6所述的本发明提供了快速且准确的细胞转移和排列，通过如下三个步骤：第一步骤，将包含细胞的液体从供应机构经由细胞供应流路引入到至少一个储存部中；第二步骤，通过控制供应机构和排出机构或使用光学钳，将细胞从储存部经由连接流路转移到细胞排列部；及第三步骤，使用光学钳将细胞放置于储存部中的期望选择的间隔中，直到在细胞排列部中完成期望的细胞排列。
根据权利要求7所述，提供了多个细胞供应流路、储存部和连接流路。每个储存部通过相应的细胞供应流路接纳不同类型的细胞而不是其他储存部。从位于每个储存部的细胞中选择的期望的细胞被传递给细胞排列部，在流路中没有混合不同类型的细胞。因此，能够准确且快速地构建细胞芯片，其中不带荧光标记等地排列有不同类型的细胞。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1示出本发明用于排列细胞的微芯片，图1(a)为平面图；图1(b)为沿图1(a)中所示的A-A线的截面图；图1(c)为图1(b)中心的放大视图；
图2为图1(a)的中心周围的放大视图；
图3为沿图1(c)所示的B-B线的截面视图；
图4示出包括细胞间隔的微基板；图4(a)为平面图；图4(b)为立体图；图4(c)为一个间隔的放大视图；
图5示出细胞排列部的结构的另一实施例；
图6说明了从细胞供应流路到连接流路的流体路径的拐角的角度；图6(a)示出具有直角的一个实施例；图6(b)示出具有锐角的另一个实施例；
图7为用于本发明用于排列细胞的方法的装置的示意图；
图8示出本发明用于排列细胞的方法的第一步骤；
图9示出本发明用于排列细胞的方法的第二步骤；
图10示出本明用于排列细胞的方法的第三步骤；
图11示出在本发明用于排列细胞的方法中多余细胞的去除。
具体实施方式
图1显示了根据本发明用于排列细胞的微芯片(此后简称为：微芯片)；图1(a)为平面图；图1(b)为沿图1(a)中所示的A-A线的截面图；图1(c)为图1(b)中心的放大视图。图2为图1(a)的中心周围的放大视图。图3为沿图1(c)所示的B-B线的截面视图。
本发明的微芯片包括由例如光硬化性树脂的具有透光性的合成树脂形成的一大致的平面基板。所述基板包括至少一个细胞供应流路1、至少一个细胞排出流路2、至少一个储存部3、至少一个细胞排列部4和至少一个连接流路5。
所述细胞供应流路1用于将由来自于供应机构的液体传递而来的细胞转移到储存部3，所述细胞供应流路1为具有100μm的内径的中空流路，其埋设于所述基板内，使得其不出现在所述基板的外表面。
所述细胞供应流路1在其起始点处形成有细胞注入口6，其与如微泵或微量调节注射器等供应机构(图中未显示)液体连通。它还在其末端点处通过储存部3连接一细胞排出流路2。
所述细胞排出流路2用于通过排出机构的吸力从储存部3排出细胞，所述细胞排出流路2为内径约为100μm的中空流路，其埋设于所述基板内，使得它不出现在所述基板的外表面，这与细胞供应流路1相似。
所述细胞排出流路2在其末端点处形成有一细胞排出口7，其与例如微泵或微量调节注射器等排出机构(图中未显示)液体连通。它还在其起始点处通过储存部3连接于一细胞供应流路1。
所述储存部3位于所述细胞供应流路1和所述细胞排出流路2的公共中点处，以将他们连接至基板内。所述储存部3用于暂时存储从所述细胞供应流路1流向所述细胞排出流路2的细胞。
所述储存部3比细胞供应流路1和细胞排出流路2宽(如，宽于两倍)。因此，经过所述细胞供应流路1的包含细胞的液体流在储存部3被减速。这防止液体流到细胞排出流路2中。
所述细胞排列部4经由连接流路5连接于所述储存部3，使得细胞排列部4接纳从储存部3引入的细胞，以便在这里进行细胞排列操作。
所述细胞排列部4为一四边形的空间，其上部形成为朝下的锥台。所述细胞排列部的上边缘在所述基板的外表面限定了一开口。可选地，所述开口可以由一盖(图中未显示)覆盖，以提供开放条件用于通风及封闭条件用于防止在长时间的细胞培养过程中的溶液蒸发。对于短时间的细胞培养，所述细胞排列部4可以被埋设于所述基板内，这类似于所述细胞供应流路1、细胞排出流路2及储存部3。
所述细胞排列部4包括多个细胞间隔，用于通过隔壁分离存储所述细胞。
图4示出一微基板10，包括用于将细胞存储在细胞排列部4中的细胞间隔。如图1(c)所示，微基板10整体地装配于微芯片基板的底部。因此，微基板的上表面限定细胞排列部4的底表面。
有许多细胞间隔8形成于微基板10的上表面上。
六角形的多个细胞间隔8以蜂窝结构设置在微基板10上。这种蜂窝结构适合于多个细胞的任何规则的排列。
一圆孔9形成于细胞间隔8的底部。圆孔9小于六角形的外部形状，更具体地，小于六角形的内切圆。位于六角形细胞间隔8的底部的圆孔9有利于将细胞稳固地固定于间隔8的中心，而不会由于细胞特性而发生不同心的定位，所述细胞特性是当细胞置于六角形的间隔中时，细胞容易附着于间隔8的任意内隔壁的表面。
应当注意的是，根据本发明所述细胞排列部4的结构并不限于图4所示的以蜂窝图案设置的六角形的细胞间隔8。
也可以举出其他结构，例如，以网状图案设置的矩形的细胞间隔8(如图5(a)所示)，以及平行设置的直线的凹槽细胞间隔8(如图5(b)所示)。在图5中，(S)表示细胞。如图3(b)所示，不同的大小的细胞可以通过改变凹槽的宽度而被储存。较佳地，可以将其用于检测细胞之间的相互作用。
所述连接流路5连接于所述储存部3和所述细胞排列部4上。所述连接流路5比所述储存部3窄(较佳地，约为其1/2to1/3)。在从细胞供应流路1经由储存部3到连接流路5的流体路径的拐角的角度(θ)为直角或锐角。
图6(a)示出了直角的实施例，图6(b)示出了锐角的实施例。
所述连接流路5的宽度和角度的这种尺度可以防止多个细胞从所述储存部3经由所述连接流路5流进所述细胞排列部4。因此，多余的细胞不会流进所述细胞排列部4。
所述细胞供应流路1经由储存部3与细胞排出流路2连接，但彼此不在一条直线上。
这种结构当细胞通过所述供应流路1达到所述储存部3时，的确为所述储存部3中的细胞提供了一种暂时的存储。因此，可以很容易地实现从所述储存部到所述细胞排列部4的细胞转移。
根据本发明所述的微芯片，多个储存部3经由分离的连接流路5连接于一个细胞排列部4上。在图中，两个储存部3相对于所述细胞排列部4对称设置，但是，也可以提供超过三个的储存部。
每个储存部3分别连接于不同的细胞供应流路1及细胞排出流路2上。也就是说，提供许多流路用于连接所述细胞供应流路1、储存部3和细胞排出流路2，并且这些许多流路相对于所述细胞排列部4对称设置。
所述结构可以将细胞转移到所述细胞排列部4，并且不会混合不同类型的细胞，从而不再需要任何荧光标记等。
以下解释本发明的细胞排列方法。
图7为一示意图，示出了用于本发明细胞排列方法的装置的一个实施例。所述装置包括一倒置的显微镜，与激光源等结合。以下解释本装置的结构。
所述显微镜包括：能够沿着X-Y轴运动并支撑微芯片11的一电子镜台12，直接地放置于电子镜台12的下面的一物镜13，其用于聚焦来自于激光源(稍后描述)的光并将所述光引导到所述微芯片11，一激光源灯14，其具有垂直放置于所述物镜13上面的卤素灯，用于将光发送微芯片11，放置于所述激光源灯14和所述微芯片11之间的一电快门15，用于控制从所述激光源灯14到所述微芯片11的光量，及如CCD摄影机或CMOS摄影机的一成像器件16，用于捕捉从所述激光源灯14通过所述微芯片11的可见光的传输图像。
所述电子镜台12的移动及所述电快门15的打开/闭合操作通过来自于计算机27控制软件的控制信号进行控制。
包括一分色镜171和一吸收式滤波器172的一反射镜单元17垂直地放置于所述物镜13的下面。
所述分色镜171将光路从所述激光源改变到所述物镜13。所述分色镜171还使来自于所述激光源灯14的光通过并将其引导到所述成像器件16。
所述吸收式滤波器172仅仅使由激光源灯14照射出的通过分色镜171的具有各种波长的光成分中选择出的可见光成分通过。
所述激光源包括发出红外激光的第一激光源18和发出紫外激光的第二激光源19。
来自于所述第一激光源18的所述红外激光用作一捕捉激光，以捕获和控制细胞，即光学钳。例如，YAG激光器(波长为1060nm)，Nd:YLF激光器(波长为1047nm)，DPSS激光器(波长为1064nm)等可以被用作红外激光器，但是不限于这些激光器，只要其被控制对细胞不产生任何损害。
来自于所述第二激光源19的所述紫外线激光用作一细胞熔合激光。但是，所述第二激光源19对于本发明的方法不总是必要的。
电快门20、21，分色镜22、23、25、26和电反射镜单元24被沿着光学传导路径放置，从而将激光从所述第一激光源18和所述第二激光源19引导到上述反射镜单元17的分色镜171。
电快门20、21分别被放置于所述第一激光源18和所述第二激光源19的出口前面。
他们能通过来自所述计算机27的控制信号被独立地打开和关闭。因此，来自所述第一激光源18和所述第二激光源19的激光能经由所述电反射镜单元24等被选择性地引导到反射镜单元17。
所述分色镜23被放置于所述电快门20之前，所述分色镜22被放置于所述电快门21之前。
所述分色镜22将激光路径从所述第二激光源19改变到所述分色镜23。
所述分色镜23使从所述第一激光源18到所述电反射镜单元24的激光通过。它还将来自于所述第二激光源19经所述分色镜22而到来的激光进行反射，将其引导到所述电反射镜单元24。
因此，来自所述第一激光源18和所述第二激光源19的激光通过上述分色镜22、23沿相同的路径被引导到所述电反射镜单元24。
所述电反射镜单元24具有两个电控反射镜，其可以由来自所述计算机27的控制信号独立地控制。当对所述电子镜台12上的所述微芯片11进行扫描时，一个反射镜沿X轴方向扫描，另一个沿Y轴方向扫描。
电流计反射镜、压电驱动的反射镜、传动驱动的反射镜等可以用于电控反射镜。
所述分色镜25在所述电反射镜单元24之后将激光路径改变到所述分色镜26。
所述分色镜26将该激光路径改变到所述反射镜单元17的所述分色镜171。
根据本发明所述排列细胞的方法是通过使用前述装置用如下方法实现的。
预备，本发明所述微芯片固定于倒置显微镜的电子镜台12上。还准备例如微型泵或微注射器等的供应机构和排出机构。然后，将所述供应机构连接于所述微芯片11的细胞注入口6，所述排出机构经由软管连接于细胞排出口7。
第一步骤，所述供应机构将包含细胞(S)的液体经由细胞供应口1发送到储存部3中(图8)。来自所述供应机构的液体供应导致快速地将细胞供应到所述储存部3中。
第二步骤，发送到所述储存部3中的期望的细胞(S1)通过控制所述供应机构和所述排出机构或通过使用光学钳(图9)被转移到细胞排列部4。
所述供应机构和所述排出机构的运行过程中，对它们的控制将排出机构吸收的流速设置在比通过供应机构抽吸的流速低的水平(排出机构能停止其吸收操作)。
当这些流速基本相等时，从所述细胞注入口6到细胞供应流路的液体流体变成所述储存部3中的层流，然后通过细胞排出流路2。上述控制防止经由细胞注入口6引入到细胞供应流路1的液体平滑地流通到细胞排出流路2，这导致所述储存部3中的液体扩散，使得液体经由连接流路5流入所述细胞排列部4。
该控制更能够仅将期望的细胞(S1)通过向所述细胞供应流路1引入更少的细胞，经由所述连接流路5转移到所述细胞排列部4。
在光学钳的情况中，从第一激光源8输出的红外激光被引导到储存部3，来捕获液体中的细胞，然后，通过驱动电反射镜单元24移动激光将期望的细胞(S1)经由所述连接流路5转移到所述细胞排列部4。
最后，第三步骤，被转移到所述细胞排列部4中的期望的细胞(S1)通过使用前述的光学钳的细胞转移操作，被放置于期望的细胞间隔8(图10)的圆孔9中。
所述供应机构和所述排出机构是受控的，使得由所述排出机构吸收的流速高于所述供应机构抽吸的流速(所述供应机构能停止其抽吸操作)，以引导包含在从细胞供应流路1传递到储存部3中的液体中的多余细胞朝向细胞排出流路2，然后，多余的细胞从细胞排出口7(图11)排出。
可以通过根据需要重复第一到第三步骤，在所述细胞排列部4中排列细胞。
可以处理各种类型的细胞。在上述第一步骤中每个细胞供应流路1接纳一不同类型的细胞，然后被引导到分离的储存部3中的每个中。
在上述第二步骤中，从分离的储存部3中的每个选择的每种期望的细胞经由分离的连接流路5中的每个，通过控制上述供应机构和排出机构或通过光学钳，被转移到所述细胞排列部4中。
在第三步骤中，所述细胞排列部4中的细胞通过光学钳被放置到期望的细胞间隔中。
从第一步骤到第三步骤的重复导致在具有各种类型细胞的细胞排列部4中的期望的排列。
本发明较佳地用于制造细胞切片，以形成疑似组织，用于在制药生产或再生医疗中的有毒性测试，或可适用的于研究细胞操作，如细胞转移、细胞熔合、细胞分离或细胞生长。