转盐芥CBF1基因提高玉米、小麦抗旱耐盐性的应用 【技术领域】
本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过转盐芥CBF1基因改变玉米、小麦抗逆性的方案及用途。
背景技术
CBFs(CRT/DRE-binding factor)是与DNA顺式元件CCGAC结合的转录因子。转录因子是一类能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合的蛋白质分子，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达。当环境条件变化时，植物通过一系列信号传递，激发转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合后，激活RNA聚合酶II转录复合物，从而启动特定基因的转录，最后通过基因产物的作用对内外界信号做出调节反应。用于改良植物抗逆基因工程的转录因子见表1-1。
基因表达的转录调控
渗透胁迫应答基因的调控分为转录水平的调控和转录后的调控。转录水平的调控因子主要是与渗透胁迫相关的顺式作用元件和反式作用蛋白。一般认为转录水平上的调节在基因表达调节中占主导地位，转录因子在转录调节中起关键作用。许多胁迫应答基因编码转录因子，因而在基因表达的调控中起作用。迄今所分离的受盐胁迫和干旱诱导的转录因子基因主要有：MYB转录因子、含有碱性螺旋一环一螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC转录因子、含有碱性区域和亮氨酸拉链bZIP转录因子、锌指类转录因子以及具有AP2结构域的DRE结合蛋白如DREB1和DREB2等。
表1-1用于改良植物胁迫耐受性的转录因子(Taishi et al.，2006)
植物抗逆基因工程所采用的策略
植物长期进化过程中，其生长习性、形态结构和生理生化等方面形成了一套对各种逆境适应策略。其中较为普遍的是代谢的改变，即胁迫诱导的代谢调整。在逆境胁迫条件下，植物本身能够感知和传导逆境信号，启动相关基因的表达，进而激活相应的保护代谢途径。近年来植物抗逆境研究取得了很大进展，相继克隆了一些重要的耐盐、耐水分胁迫、耐冷的相关基因。随着植物耐盐耐早分子机制研究的逐步深入和生物技术研究的日臻完善，通过基因工程技术培育耐盐耐旱植物的研究正处在迅速发展之中。
转录因子也称反式作用因子，是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白质之间的相互作用，激活或抑制基因的转录。转录因子一般由DNA结合区、转录调控区(包括激活区或抑制区)、寡聚化位点和核定位信号4个功能区组成，转录因子通过这些功能区与启动子顺式元件作用或与其它转录因子的功能区相互作用来调控基因的转录。植物体内存在大量的转录因子，仅含27000个基因的拟南芥就有5.6％的基因是编码转录因子的(Riechmannand Ratcliffe，2000)。近年来，相继从高等植物中分离出一系列调控生长发育、代谢和对干旱、高盐、低温、激素、病原等因子发生反应的转录因子。这些转录因子根据与DNA结合区域的特点可以分为若干个家族，和植物逆境抗性相关的转录因子主要有4类：bZIP类、WRKY类、AP2/EREBP类和MYB类。
和植物逆境抗性相关的转录因子根据其表达特点可以划分为两类，一类是组成型转录因子，如大麦(Hordeum vulgare)HvCBF2(C-repeat/DRE binding factor2)(Xue，2003)，无论在逆境还是正常状况下基因都表达；一类是诱导型转录因子，只有在逆境诱导下基因才会表达，绝大部分的转录因子属于后一类。胁迫诱导的基因表达是受多重顺式作用元件顺序调控的。
虽然每种转录因子有各自的主要功能，但是同一胁迫应答可有多种转录因子的参与，同一个转录因子也可以参与多个胁迫应答。植物处于逆境时，遭受的胁迫通常由一种以上的因子共同造成，如低温或者高温下就不可避免地有水分丢失而造成的渗透胁迫，所以任何一个胁迫反应可能涉及多个转录因子的表达及调控。干旱诱导DREB类、ABRE类和MYB类转录因子同时表达，调控多种下游基因的表达及它们产物的协同作用。
在对植物逆境信号转导的研究中发现，转录因子在植物对逆境反应中起关键作用，在胁迫刺激下一些转录因子不断合成，通过启动或抑制靶基因的表达将信号传递和放大，从而引起植物生理生化的改变。在早期的研究中，通过筛选差异表达基因的途径，鉴定出一系列与干旱，盐及冷应答相关基因，如rd(responsive to dehydration)、erd(early responsive to dehydration)、cor(cold-regulated)、cin(cold-inducible)和lti(low-temperature induced)(Steponkus et al.，1998；Thomashow，1998；Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki，2000)等。对这些基因的启动子进行详细分析，从中确定了几个重要的顺式作用元件。目前对植物干旱胁迫地分子调控的认识，主要来自基于对这些顺式元件及其相应的转录因子的大量研究。
由于一些逆境相关的转录因子在逆境条件下能调节功能基因的表达和信号转导，它们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆相关基因的表达，提高一个转录因子的表达强度，就可以通过它促使多个功能基因发挥作用，从而使植株抗性性状获得综合改良(刘强，2000)。因此，利用转录因子基因提高作物抗逆性研究颇受重视。
转录因子CBF/DREB的发现及分析
Baker等(1994)通过对一个典型的受低温诱导的基因COR15的启动子分析，鉴定出一个重要的顺式作用元件命名为C-repeat(CRT)，其核心序列是CCGAC。Shinozaki等(1994)通过对干旱应答基因RD29启动子的分析，发现了一个控制干旱胁迫应答的顺式作用元件即DRE元件(dehydration-responsive element)。DRE含有保守的9bp的核心序列(TACCGACAT)，与CRT很相似，并且它们都参与干旱和低温诱导的基因表达。在ABA的缺陷型突变体(aba)和对ABA不敏感的突变体(abi)中，rd29A仍然能够受干旱和冷诱导而高强度表达，说明这一过程是不依赖于ABA的。进一步实验证明，DRE能够在不依赖于ABA的条件下使rd29A因干旱和冷诱导而上调表达。
当干旱胁迫相关的顺式作用元件鉴定出来后，在确定能和这些元件结合的反式作用因子(转录因子)的研究中，酵母单杂交技术起了关键作用。Stockinger等(1997)率先通过酵母单杂交鉴定出一个DRE/CRT结合蛋白CBF1(CRT binding factor1；Jaglo-Ottosen et al.，1998)。在酵母中，CBF1能够作为转录因子上调依赖于DRE/CRT的转录过程，CBF1包含一个保守的DNA结合结构域(AP2 domain)，这一结构域也常在EREBP(乙烯-应答元件结合蛋白，ethylene-responsive element binding protein)家族的蛋白中出现。同时还发现CBF1有三个同源基因：CBF2、CBF3、CBF4。其中CBF1、CBF2和CBF3基因串联排列在拟南芥的四号染色体的一个8.7kb的区段(Medinaet al.，1999)。而CBF4单独存在于一号染色体上(Haake et al.，2002)。
在另一个独立的实验当中，Liu等(1998)利用酵母单杂交技术分离到5个独立的cDNA克隆，编码DRE/CRT结合蛋白，将这些蛋白命名为DREBs(DRE-binding proteins)。这5个蛋白又被分为两类，即DREB1和DREB2。其中，DREB1包括3个蛋白DREB1A、DREB1B、DREB1C。而且DREB1A与CBF3、DREB1B与CBF1、DREB1C与CBF2分别为同一个基因的产物。此外，DREB2包括DREB2A和DREB2B两个蛋白(Shinozaki et al.，2003)。
Gao等(2002)和Xue等(2002)对大麦、小麦、水稻、玉米、油菜、烟草和高粱(Sorghumvulgare Pers.)等的CBF类似物和拟南芥CBF进行了氨基酸序列同源性分析，发现它们除了均含保守的AP2结构域以外，还含有其他保守的氨基酸序列。Jaglo等(2001)也发现水稻、小麦、油菜和马铃薯(Solanum tuberosum L.)等的CBF相似物和拟南芥CBF氨基酸序列具有较高的同源性，而且在低温下作用途径也极为相似。现已清楚，DREB转录因子属于AP2/EREBP转录因子家族。AP2/EREBP转录因子特异存在于植物中，是与植物发育密切相关的一类转录因子的总称。该家族有APETALA2、RAV、DREB、ERF(EthyleneResponsive Element Binding Factors)以及4个功能未知的基因产物，其家族成员的蛋白质序列均含有保守的AP2结构域。
不论是DREB1还是DREB2都能特异性结合DRE/CRT元件，而且它们启动转录的功能在植物原生质体和酵母系统中都得到了证实。DREB1A/CBF3基因及另外两个同源基因都能被低温诱导但是不能被干旱诱导。而DREB2A和DREB2B则能够被干旱胁迫诱导。有趣的是，CBF4不能被冷胁迫诱导，却能被渗透胁迫诱导(Haake et al.，2002)，而在序列的同源性上，CBF4属于CBF/DREB1基因家族，它对渗透胁迫应答的特性，表明了CBF/DREB1与DREB2通路上存在交叉。CBF4基因在功能上的这一特性说明，CBF家族的基因尽管在序列上是同源的，但是它们在功能上却既有很多重叠但又不尽相同。而且最近还发现，在胁迫应答反应中，CBF2/DREB1C是作为CBF1/DREB1B和CBF3/DREB1A的一个负调控因子而起作用(Novillo et al.，2004)。
CBF/DREB1的诱导表达能够激活一些靶基因的表达，如COR(cold-regulated)类基因，后者参与植物获得性的抗逆能力的形成。过量表达CBF/DREB1的转基因植物提高了对冷、干旱和高盐的耐性。但是，Liu等(1998)报道过量表达DREB2不能提高拟南芥的抗逆性，这提示CBF/DREB1的功能不需要转录后的修饰、而DREB2则需要转录后修饰才能行使其功能。
CBF/DREB基因的克隆
DREB转录因子是目前研究较多的抗非生物胁迫的转录因子，克隆DREB基因和利用DREB基因进行转基因研究的已有许多工作。
拟南芥DREB基因是一个小的多基因家族，除DREB1和DREB2基因外，Sakuma等(2002)根据序列的同源性设计引物，用PCR方法从拟南芥DNA中扩增出3个与DREB1同源的DREB1D、DREB1E和DREB1F，以及6个与DREB2同源的DREB2C------DREB2H转录因子，其中DREB1D、DREB1F、DREB2C、DREB2D和DREB2F受高盐诱导，DREB2E受ABA诱导，可能它们分别参与了植物对不同逆境的应答。其它植物的DREB基因的克隆也有大量的报道。
从油菜(Brassica campestris L.)中分离出CBF/DREB转录因子基因的类似物，分别称作BNCBF5、BNCBF7、BNCBF16和BNCBF17，它们在低温下积累，诱导基因BN28、BN115表达。后二者的功能与拟南芥cor6.6/KIN和cor28的功能相似(Gao等，2002)。
从水稻中分离出了DREB的相似物，命名为OsDREB1As、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D和OsDREB2A。OsDREB1As和OsDREB1B受低温诱导，OsDREB2A受干旱和高盐诱导。OsDREB1A在转基因拟南芥中过表达可以引起拟南芥DREB1A下游靶基因的表达，导致植物对于干旱、低温和高盐的耐性增强，说明OsDREB1A和拟南芥DREB1A功能相似。但OsDREB1A更倾向结合GCCGAC序列，而拟南芥DREB1A的结合序列更倾向于ACCGAC，这可能是单子叶植物和双子叶植物之间的区别(Dubouzet等，2003)。
从大麦中克隆出了编码同拟南芥CBF/DREB1家族相似的基因分别命名为Hvcbf1、Hvcbf2和Hvcbf3，它们受低温的诱导(Xue，2002)。从小麦(Triticum aestivum L.cvNorstar)干旱诱导的cDNA中克隆出来TaDREB1，它表达的蛋白包含一个AP2/EREBP结构域，与拟南芥的DREB的DNA结合区无论是一级结构(氨基酸序列)还是二级结构都有很高的相似性，基因启动子序列有DRE元件TACCGACAT，TaDREB1可以被高盐、低温和干旱所诱导(Shen等，2003a，Jaglo等，2001)。
Qin等(2003)利用酵母单杂交的方法从玉米的cDNA文库中分离得到一个编码与DRE元件结合的蛋白基因，命名为maDREB1，它和拟南芥的DREB的功能相似。在玉米中发现了两个DRE的结合蛋白，命名为DBF1和DBF2，这两个转录因子属AP2/EREBP转录因子家族，和这个家族其他的转录因子不同的是，它们参与干旱应答的ABA依赖途径，而且更倾向于和ACCGAC序列结合(Dimosthenis和Montserrat，2002)。
从长春花(Catharanthus roseus)中克隆出两个AP2/EREBP成员基因：ORCA1(octadecanoid responsive-catharanthus-APETALA2-domain protein)和ORCA2基因，它们主要受茉莉酸等激发子的诱导(Menke et al.，1999)。Park等(2001)利用mRNA差异显示法从烟草中克隆得到了盐胁迫诱导基因Tsi1。Shen等(2003b)从高盐处理的耐盐植物山菠菜(Atriplex hortensis)cDNA文库中分离得到了一个编码EREBP/AP2类蛋白的基因AhDREB1，后者在烟草中的超表达显著提高了转基因植株的耐盐能力。Zhang等(2004)从西红柿(Lycopersicon esculentum)克隆出冷胁迫诱导基因LeDREB。高峰等(2005)使用RACE等方法获得了小盐芥(Thellungiella salsuginea)CBF1基因的全序列，将其命名为TsCBF1。Huang等(2007)从棉花中克隆到GhDREB1L，该基因不仅能被低温诱导表达，也可被干旱和高盐诱导表达。Chen等(2007)从大豆中克隆出一个AP2/EREBP家族新成员GmDREB2，它的表达受干旱，高盐，低温以及ABA诱导，在拟南芥中过表达GmDREB2显著提高了转基因植株的耐旱和耐盐性。
另外，分别从辣椒(Hong等，2005)得到Ca-DREBLP1；向日葵中(Díaz-Martín等，2005)得到HaDREB2；从西瓜(Mizuno et al.，2006)分离出CmDREB1；从高羊茅(Tang等，2005)中克隆出FaDREB1；从珍珠黍(Agarwal等，2007)中得到PgDREB2A。从白杨(Populus balsamifera)(Benedictl等，2006)、白桦树(Betula pendula)(Wellingl等，2006)、加宁桉(Eucalyptus gunni)(Kayall等，2006)、从蓝桉(E.Maria)(Gamboa等，2007)等树种中克隆出CBF家族基因。
CBF/DREB基因在植物基因工程中的应用及存在的问题
用耐受干旱、低温及高盐诱导的RD29A基因进行转化，能改善植物对干旱及低温的耐性，但不能全面提高植物的抗逆性(Yamaguchi-Shinozaki等，1994)。与植物的抗虫和抗病等性状相比，植物对非生物逆境的抗性要复杂的多，植物耐受干旱、高盐及低温耐性的能力不取决于单个因子，而是受许多因子制约。RD29A编码与LEA蛋白非常相似的亲水蛋白，RD17和ERDIO编码第二组LEA蛋白，KtNI和COR6.6IKIM编码的蛋白在结构上与富含丙氨酸的鱼类抗冻蛋白极为相似，COR15A编码的蛋白分布在叶绿体基质和原生质中，能增强叶绿体和原生质体的抗寒能力。从基因表达特性和基因产物的相似性分析，这些拟南芥基因编码的产物都与干旱、低温及高盐胁迫耐性相关。在RD29A、RD17、ERDIO、KI2V1、COR6.6/KIN2和COR15A等的启动子中都含有CRT/DRE元件，暗示着这些基因的表达受转录因子CBF/DREB的调控。
CBF/DREB转录因子能够识别CRT/DRE元件，调控多个与抗逆性状相关的基因表达。因此，可以通过导入CBF/DREB转录因子基因来提高植物的抗逆性。
Jaglo等(2001)把CBF1导入拟南芥，该基因的过量表达激活许多抗逆相关基因表达。Liu等(1998)用CaMV 35S启动子启动的DREB1A(CBF3)转化拟南芥，转基因植株DREB1A组成型过量表达，使植物的抗逆性得到综合提高。Gilmour等(2000)报道CBF3能诱导抗寒基因的表达，增加可溶性物质如蔗糖、棉子糖、果糖、葡萄糖以及脯氨酸的含量，从而提高抗寒性。同时发现其在转基因拟南芥植株中的过表达不仅使植株耐低温的能力提高，而且抗旱和抗盐性也得到改良。Hsieh等(2002)将CaMV35S启动子启动的拟南芥CBF1转入番茄，发现转基因植株有类同于拟南芥中出现的信号转导过程，在胁迫条件下细胞自由基减少，脯氨酸含量升高，气孔运动得到调节，植株的抗旱性和耐低温性都明显增强。Kang等(2002)发现CaMV35S-CBF3转基因植株在干旱胁迫下气孔迅速关闭，蒸腾减少，顺利渡过逆境，而在相同逆境条件下野生型植物只有16％能够成活。Shen等(2003b)将从山菠菜中克隆出的AhDREB1导入烟草，转基因植株的抗盐性明显提高。在拟南芥和玉米中过表达DREB类同源基因可提高转基因植株对逆境的抗性(Dubouzet等，2003，Qin等，2004)。Chen等(2007)将大豆GmDREB2基因在拟南芥中过表达，显著提高了转基因植株的耐旱和耐盐性。
把CBF/DREB转录因子基因导入植物，并不总能改善转基因植物的抗逆性。拟南芥DREB2A受干旱和高盐诱导，且调控下游CRT/DRE基因表达。Liu等(1998)DREB2A将与组成型强启动子CaMV35S连接并导入拟南芥，筛选出正常条件下过表达DREB2A的转基因株系。Northern杂交表明，尽管正常条件下DREB2A在转基因株系中过表达，但却不能够调控下游CRT/DRE基因表达，推测转基因DREB2A的产物与具备生理活性的DREB2A转录因子是有区别的。从mRNA转化为有活性的DREB2A转录因子，可能还需耍某种修饰(如磷酸化)。超表达DREB2A的转基因株系表型变化不大，抗逆性提高不明显。Dubouzet等(2003)利用CaMV35S驱动OsDREB24转化拟南芥，也得到了同样结论。
DREB转录因子的作用机理较为复杂，在转基因拟南芥植株中OsDREB1A和拟南芥DREB1A的功能是相同的，DREB转录因子能特异结合DRE(A/GC2CGAC)序列，激活靶基因的表达，但拟南芥DREB1A能结合DRE的核心序列即：ACCGAC和GCCGAC序列，而OsDREB1A只能特异结合GCCGAC序列，而不能结合ACCGAC序列(Dubouzet等，2003)。有的DREB转录因子，如DREB1A和DREB1D具有很高的序列相似性，DREB1A可被低温逆境诱导，而DREB1D却不能被低温诱导表达(Sakuma等，2002)。
DREB转录因子基因在转基因植物中过表达往往造成植株矮化，如转35S：DREB1A和转35S：OsDREB1A的拟南芥植株在正常生长条件下表现出形态多样化，转35S：DREB1Aa植株表现出严重的矮化、生长迟缓，推测是由于DREB转录因子引起靶基因过表达，导致相关蛋白的过量合成，使得转基因植物在正常生长条件下虽具有较高的逆境忍耐力，但引起使植株生长迟缓(Liu et al.，2003)。转基因植株矮化现象虽然可以通过使用逆境诱导性启动子来克服(Kasuga等，1999)，但经常出现未期望结果。例如，Hsieh(2002)即使用大麦的ABRC1和拟南芥COR15A逆境诱导的启动子来代替35S启动子，转基因番茄生长停滞现象仍未改变，只有喷施赤霉素后才能恢复正常生长。
玉米耐盐耐旱基因工程研究进展
玉米的基因工程目的在于通过导入有用的外源基因，获得转基因植物，用于其遗传改良。玉米基因工程主要在抗虫(向玉米中转入的抗虫基因主要是Bt毒蛋白基因)、抗除草剂、抗病(抗病毒病或抗真菌病害)和抗旱等方面取得了重大成就，转基因抗虫玉米和抗除草剂玉米在美洲已大面积推广，在欧洲也推广种植。抗非生物胁迫和品质改良的玉米基因工程也取得很大进展。下面概述玉米耐旱耐盐基因工程的进展。
刘岩等(1998)将大肠杆菌6-磷酸山梨醇脱氢酶基因gutD转入玉米，在转基因玉米中检测到山梨醇的合成和积累，耐盐性明显高于对照。何锶洁等(1999)将甜菜碱醛脱氢酶基因转入玉米，转基因植株获得了耐盐性。Jeanneau等(2002)在玉米中过表达C4-PEPC基因，提高了玉米抗旱能力。例如显著提高了玉米的耐盐性。Quan等(2004)将细菌的甜菜碱合成酶基因betA转入玉米，耐旱性实验和一些生理生化检测表明转基因玉米的耐旱性明显提高。Shou等(2004)将具有MAPKKK特性的NPK1蛋白激酶基因转入玉米，使玉米植株耐旱性得到提高。Yin等(2004)将来自拟南芥的液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因NXH1转入玉米，提高了植株的耐盐性。最近，Qin等(2007)报道，将玉米中克隆得到的ZmDREB2A基因在玉米中过表达，提高了植株的耐旱性及耐热性。
小麦耐盐耐旱基因工程研究进展
小麦抗旱耐盐育种主要采取以下几种途径：常规育种、远缘杂交、分子标记辅助育种和基因工程育种等。因缺乏高抗和容易利用的种质，以及漫长的育种周期，小麦抗旱(盐)常规育种进展缓慢，远不能满足生产的需求。伴随着植物基因工程的发展以及许多抗旱、耐盐相关基因的克隆，利用基因工程手段提高作物抗旱、耐盐性的研究越来越多。1991年，Vasil等用基因枪轰击小麦悬浮细胞获得了转化的愈伤组织，第一例小麦转化成功的报道就此诞生。1993年Vasil等又用基因枪法直接轰击幼胚，获得了可育的转基因小麦株系。同年，Weeks等也通过基因枪轰击小麦愈伤组织获得了可育的转bar基因小麦植株。在2002年前获得小麦转基因植株的报道中，基因枪法占90％左右，其他方法仅占10％(Wang et al.，2002)。基因枪转化体系的建立，推动了小麦遗传转化的发展，但是这一转化过程也受诸多因素影响，如重复性差、成本费用高、转化后嵌合体多、多基因拷贝整合、基因沉默机率甘、外源基因在后代中容易丢失等使其应用受到限制。1997年，Cheng等利用农杆菌介导法转化小麦成功，近年来，农杆菌介导法因其可重复性、转化频率较高、转基因低拷贝插入和转基因植株稳定较快等优点成为小麦遗传转化的主流技术。Sivamani等(2000a)将大麦HVA1基因(LEA蛋白基因家族3的一个成员)导入小麦，在土壤缺水的情况下提高了植株生长，转基因植株后代的大田试验得出，一些表达HVA1基因的转基因株系的生物量和产量比非转基因对照显著提高(Bahieldin et al.，2005)。Sawahel和Hasson(2002)将脯氨酸合成酶基因导入小麦获得了耐盐性显著提高的转基因植株。Abebe等(2003)将甘露醇合成酶基因导入小麦得到了合成甘露醇的耐盐和耐水分胁迫的小麦。这些转基因植株积累了不同水平的渗透保护物质，其耐盐性表现出不同程度的提高。Xue等(2004)通过农杆菌介导法转化愈伤组织，将拟南芥液泡膜Na+/H+Antiport基因转入小麦，发现在盐胁迫条件下，转基因植株比非转基因植株的叶片中积累了更高的K+和更低的Na+，盐碱地试验也得出转基因小麦株系的百粒重和产量比非转基因对照显著提高。
【发明内容】
针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种转TsCBF1基因改变玉米、小麦抗逆性的应用。
本发明所述的转TsCBF1基因改变玉米、小麦抗逆性的应用方法是，将从盐芥中克隆的TsCBF1基因以正义形式重组到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性鉴定，从中筛选出抗逆性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出在玉米、小麦育种中具有应用前景的新种质和新品种。
其中，所述TsCBF1基因来自盐生植物盐芥，有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列以正义形式构建成融合基因，并转入植物体内。
其中，所述用于构建融合基因的TsCBF1基因可为基因的全长序列，也可以为部分序列，也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸。
其中，所述应用方法是通过转TsCBF1基因或依据TsCBF1基因序列设计的多核苷酸序列获得的抗逆性提高的转基因植株。
其中，所述应用方法还可以是通过转TsCBF1基因获得对逆境抗性提高的转基因植株及后代。
本发明所说的TsCBF1基因克隆于不同生态型的盐生植物盐芥，彼此序列有高的相似性。该基因一般以cDNA形式或基因组基因形式克隆，以正向重组到植物表达载体中。在植物表达载体中，该基因转录可由原启动子启动，或由来自其它基因的植物特异的启动子启动，编码区后为植物基因的3′尾巴区。产生的融合基因应能在植物细胞中有效表达。
本发明所说的基因正向形式插入是指在植物的启动子序列后面正确连接上TsCBF1基因的完整编码框，即第一个密码子紧靠启动子，转录产物为正义mRNA。要求转录产物在细胞内基本稳定。不受制于是组成型启动子或诱导型启动子。
本发明所说的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或细胞水平上表现出的耐(抗)旱性、耐(抗)盐性、耐冷性、抗寒性、抗(耐)辐射性、抗病性、抗虫性、抗除草剂等特性及其组合。这种抗(耐)性在植株水平上可表现在某些发育阶段或全生育期，可通过多种指标衡量或评价。
与转入单个抗逆相关的功能基因相比，转入一个逆境诱导的转录因子可以调控多个与抗逆有关基因的表达。该发明从盐生植物盐芥中克隆出TsCBF1基因，采用农杆菌介导法或基因枪轰击法转入玉米、小麦，对其后代植株进行分子检测和抗旱耐盐性鉴定以及相关的生理指标测定，验证TsCBF1是否有着DREB转录因子家族成员的功能，和在转基因植株中的表达能否提高植株的耐旱性和耐盐性，以及过表达TsCBF1基因的转基因玉米植株是否在耐旱耐盐性比对照植株明显提高的同时生长发育正常，不出现矮化现象。
该发明筛选出了抗逆性好的转基因玉米、小麦株系，为转基因培育玉米、小麦抗逆新品种的工作奠定了一定基础。利用获得的转基因植株，我们还可研究植物对胁迫反应的信号转导网络及基因表达的变化，为揭示植物的抗旱耐盐机制可提供适宜的材料。
TsCBF1序列的基本特征
CBF1基因注册号为gi：41351816。通过NCBI中ORF finder在线分析发现在我们所测序的1040核苷酸中，1到201为该基因的5’非翻译区；202到852为蛋白质编码区，共编码216个氨基酸；853到1040为3’非翻译区和部分poly A+尾巴。该基因编码一含有216个氨基酸的蛋白质序列，通过Blast比对分析，其与拟南芥中的CBF1，CBF2，和CBF3分别有84％，81％和82％的相似性。从第49位到109位的60个氨基酸为一AP结构域。并通过Clustal W进行聚类分析，表明克隆的TsCBF1基因与拟南芥的CBF1，CBF2和CBF3基因有非常近的进化关系。
将TsCBF1基因的推测氨基酸序列和来自拟南芥的AtCBF1，AtCBF2，AtCBF3，AtDREB2A，AtDREB2B以及来自水稻的CBF1和DREB1B通过Clustal W进行聚类分析(分析结果经软件Treeview显示)，表明TsCBF1基因和拟南芥的AtCBF1的进化关系最近。
TsCBF1基因的重组
采用常规的分子克隆技术将TsCBF1的全长序列重组入植物双元表达载体pROK2或pCam系列等植物表达载体中获得正向插入的重组质粒。可根据受体植物和所需的TsCBF1基因的表达强度及可调控程度，融合基因可选用分别适合于单、双子叶植物和不同低等生物的组成性启动子，可选择植物器官或发育阶段特异性的启动子，或对特异信号(包括逆境信号、化学信号、物理信号等)发生反应的诱导型启动子等。融合基因可选择不同3′尾巴区，也可插入增强子序列，也可在编码区插入不同内含子。重组质粒可分别导入大肠杆菌或农杆菌中增殖或/和保存。
用含有TsCBF1基因的植物表达载体转化植物
根据转基因受体材料选用不同转基因方法获得转基因植物。
常用的转化方法有3类：1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、聚乙二醇诱导法、电融合法、硅碳纤维法等直接将质粒DNA导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。3)种系转化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系胚性愈伤组织为材料采用基因枪轰击法和以小麦无菌苗茎尖为材料采用农杆菌介导法进行遗传转化。
A.玉米自交系胚性愈伤组织遗传转化
玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-12天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.2mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。
采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl2、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。
在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将材料转入加有选择剂(如1-5ppm除草剂绿黄隆)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交结实。转基因植株采用PCR检测法筛选，Southern blotting验证。通过数代分子检测和自交结实产生纯系，在通过抗性鉴定和田间选择获得转基因优异材料。
B.小麦无菌苗茎尖遗传转化
小麦种子用70％乙醇浸泡1-3min，再用0.1％氯化汞溶液浸泡7-10min，然后用无菌水洗涤5遍。灭菌期间不断摇晃种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌种子放在盛有用无菌水浸润滤纸的罐头瓶内，封口后放在黑暗条件(24±2℃)下1-2天。待种子萌动长出胚根及胚芽后，将其放在M1培养基上于黑暗条件(24±2℃)下继续培养。待胚芽伸长至2-5cm时，用解剖刀剥去胚芽鞘及1-2片幼叶，暴露出芽尖，再用解剖刀从中部纵向切伤茎尖生长点。切伤茎尖生长点的无菌苗(萌发种子)用于农杆菌转化。
将带有目的质粒的根癌农杆菌LBA4404在附加抗生素的YEP培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为180rpm，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心5分钟，弃上清夜。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的MMS液体培养基重悬。然后将菌液倒在直径15cm的培养皿中，倾斜培养皿，使已被切伤的无菌苗茎端浸泡在菌液中，抽真空(0.05MPa)感染7～10min。
浸染后的茎尖用无菌滤纸吸干，将小苗初生根切短后插入小麦萌发培养基(M1培养基)上黑暗培养3天。培养温度为22-24℃。3天后将共培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层土壤的花盆中，并用松散湿润的蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃。隔天浇灌1/2MS培养基的无机盐溶液。移栽到蛭石中的转化植株长到三叶期时，均匀喷洒合适浓度的除草剂水溶液进行筛选。喷洒以植株叶片掉液滴为宜。喷洒后植株放在温室生长，白天温度15-20℃，夜间温度10℃左右，日光照12h左右，每3天浇水1次。移入田间时统计植株成活率。田间植株按照常规管理措施管理，在自然条件下越冬春化。返青期取叶片DNA进行PCR检测。
以bar为筛选标记基因的转化小苗用除草剂Finale(商品名)为筛选剂，其活性成分为广谱性除草剂glufosinate ammonium(草丁膦的铵盐)，浓度为5.78％(w/v)。使用浓度为每升自来水中加入3ml Finale，即0.3％Finale水溶液。喷洒后未转基因对照植株7天后开始死亡，14天后死亡率在90％以上；转基因植株表现出抗性，15天后移栽到田间。抗除草剂筛选的转化植株(T0)自交产生T1代种子，后者在花盆中萌发，小苗长到3-4叶期时喷洒除草剂水溶液，除草剂浓度和植株生长条件同T0代。存活植株长出3片新叶后取材进行分子检测。PCR检测阳性植株部分移栽入花盆，每株一盆；部分移栽到具有隔离设施的大田中。按照常规管理措施进行管理，植株自然越冬，返青后取叶片DNA进行分子检测。单株隔离自交授粉得T2代种子。部分T2代种子在大田播种，小苗自然越冬，返青后取新叶进行PCR检测、Southern杂交和半定量RT-PCR验证。转基因纯合株系的种子用于耐盐、耐旱生理指标测定和盐碱地种植试验。
转基因玉米植株的耐盐性旱性检测及利用
采用PCR方法检测出分别含正义和反义TsCBF1基因的玉米阳性植株，套袋自交或姊妹交结实。收获的种子播种在砂盆中，浇灌0.8％NaCl水溶液，并以未转基因自交系种子为对照。转基因植株的不同株系在盐水浇灌下表现出不同的耐盐性，多数转正义TsCBF1基因的株系表现出比对照明显提高的耐盐性。在转正义TsCBF1基因的株系中，半数以上株系的5叶期成活率在70％以上，而对照自交系植株出苗后很快死亡，5叶期的成活率不到20％，且植株严重受害。Northern杂交分析表明TsCBF1基因在这些转基因植株中过表达，在未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株中，TsCBF1基因的表达水平无明显差别。选出耐盐性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系，并用于耐盐玉米杂交种培育。
将转TsCBF1正义基因的玉米种子和未转基因的对照自交系的种子播在的花盆中，分别在苗期(3～7叶期)、雌雄穗发育期(9～13叶期)、开花授粉期进行干旱胁迫处理，检测干旱处理对玉米生长发育的影响、细胞膜受损程度、植株单株产量及其它经济性状和生理指标的差异等。同时，将转基因株系和对照的种子在加有18％PEG溶液中萌发，选择萌发率高的转基因株系。综合多方面的测试结果，转TsCBF1正义基因的玉米比对照植株表现出明显提高的耐旱性。选出耐旱性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。
转基因小麦植株的耐盐性旱性检测及利用
以野生型植株为对照，选择10-25个株系进行生理学测定。在种子萌发试验中，将种子晒干后播于大小一致的砂盆中(直径10cm，高15cm)，分别浇灌含不同浓度NaCl(0，100mM，200mM，300mM)的水溶液，各株系每浓度种300粒种子，每盆25粒。浇灌量各盆之间保持一致，每天观察种子出苗状况和小苗的整齐度，并避免雨淋。20天后统计种子最终出苗率。出芽标准为胚芽鞘露出覆盖的沙层。
根据种子出芽率的测定，选择200mM NaCl盐溶液作为盐胁迫处理期间的盐浓度。分别选取转基因株系和野生型植株进行耐盐性生理学测定。将各株系种子播种于大小一致的砂盆中(直径10cm，高15cm)，每盆种20粒，每个株系种8盆，每天浇灌Hoagland营养液，植株长到3叶期时定苗，各盆中留下大小长势一致的小苗15株。植株长到5叶期时，将沙盆按每个株系随机分成两组。其中一组用含有200mM NaCl的Hoagland营养液浇灌，连续浇灌10天，另一组继续用Hoagland营养液浇灌，作为未处理对照组。盐胁迫处理过程中，测定处理植株和未处理植株的GB含量及其它生理指标，包括光合作用指标、离子含量、RWC、叶绿素含量、细胞溶质势、可溶性糖和脯氨酸含量、细胞膜离子渗漏、丙二醛含量和生物量。苗期耐盐性测定试验在人工气候室中进行，白天温度和夜温分别为22-25℃和15-20℃，每天光照12小时，光强500μmol m-2s-1。根据试验结果选出耐盐性强的转基因株系。
无菌培养皿铺双层滤纸，再将滤纸分别用含20％(W/V)PEG-6000的无菌MS无机盐溶液(渗透势：-0.55MPa)浸润。取转基因株系和对照的种子各300粒表面灭菌，然后置于双层滤纸上于23℃黑暗中萌发。从第二天起每天统计种子的萌芽数，等到萌发率不再变化时测量芽长和最大根长。每株系每处理随机选取30粒萌发小苗进行测量和比较，并计算根、芽长度之比值。将转基因株系和野生型植株的种子播种于装有同样壤土的花盆中，进行干旱胁迫处理，测定处理植株和未处理植株的生理指标，包括光合作用指标、叶片相对含水量(RWC)、叶绿素含量、细胞溶质势、可溶性糖和脯氨酸含量、细胞膜离子渗漏、丙二醛含量、超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性等。另外，将所有株系的种子分别播在同样大小的沙盆中，3叶期定苗，每天浇灌Hoagland营养液。小苗5叶期时一次性浇足营养液后不再浇灌，直至所有植株的叶片发生永久性萎蔫，然后恢复浇水，观察各株系植株的表型变化。综合试验结果选出耐盐性强的转基因株系并用于小麦育种。
【具体实施方式】
实施例1：转TsCBF1基因创造玉米耐盐自交系及应用
1)受体系统的建立 以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、掖478、掖515等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有：
种子萌发培养基：KNO3 1900mg/l，NH4NO3 1650mg/l，CaCl2·2H2O 440mg/l，MgSO4·7H2O 370mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，FeSO4·7H2O 27.8mg/l，ZnSO4·7H2O10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，H3BO3 10mg/l，KI 0.83mg/l，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l，CuSO4·5H2O 0.025mg/l，CoCl2·6H2O 0.025mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8～6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。
A培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5～9.0μmol/l和2，4-D 1.0～3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。
B培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。
成苗培养基：种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。
生根培养基：种子萌发培养基附加IBA 2.8～3.6μmol/l，用于无根小苗生根。
基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。
种子灭菌和萌发：玉米种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10--15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30---40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23---30℃)下1--2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。
茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化：萌发种子的胚芽伸长止3---5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下(24--27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6--10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为1.0μmoll，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2--3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5--6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。
2)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生
将带有双元载体(Mini--Ti质粒带有选择剂抗性基因和TsCBF1正义基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5--20倍用于转化。
取继代后培养13--20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7--12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。
将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22--28℃，夜温15--21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。
3)转基因植株的抗性检测和选择利用
取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。将转基因植株套袋自交结实。取种子播种在砂盆中，用0.7％NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和耐盐性检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐自交系。该自交系可用于配制玉米耐盐杂交种。
实施例2：转TsCBF1正义基因创造小麦优良抗逆育种材料
1.小麦无菌苗获得
小麦优良品种的种子，用70％乙醇浸泡1-3分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(20-25℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。
2.农杆菌培养及活化
将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因bar和TsCBF1基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。
3.小麦无菌苗转化
(1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大气压下处理3-6分钟。
(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在附加200mg/l谷氨酰胺的改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。
(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。
4.转化植株筛选与定植
转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂(Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9.6ml-10.8ml以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后5天后停止生长，15天左右死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到7-8叶时，将其定植到田间，并促进分蘖。
5.抗除草剂植株经春化处理后，在起身-拔节期取叶片提取DNA，采用PCR技术检测转化植株。PCR阳性植株进行Southern blotting检测。
采用PCR检测转基因植株时，每株系每代随机取30个左右个体进行检测，统计PCR阳性植株的比例。通过卡方(x2)检验推定外源基因在转基因植株中的遗传行为是否符合孟德尔分离规律。Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶及其缓冲液、ExScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司。Trizol试剂购自上海生工。引物合成和测序由北京博尚公司完成。
采用Southern杂交分析法确定转基因植株时，以PCR方法检测出含TsCBF1基因的阳性植株为材料采用CTAB法提取高质量DNA，然后用EcoRI限制性内切酶彻底消化。酶切反应体系为：50μl 10×酶切缓冲液，3U内切酶/μg DNA，40-45μg小麦基因组DNA，补足无菌ddH2O至500μl，37℃酶切过夜，65℃加热10min终止酶切反应。将酶切完全的基因组DNA经无水乙醇沉淀、浓缩后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，每泳道加样20-30μg DNA，缓冲液为1×TBE[0.089mol/L Tris-硼酸、0.002mol/L EDTA(pH8.0)]，电泳电压小于1V/cm，按照需要待指示剂溴酚蓝迁移至合适位置时停止电泳。电泳完毕，将凝胶经变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)处理20min，重复一次，再用去离子水漂洗两次，将凝胶浸泡于中和液(0.5M Tris·Cl，pH 7.4；1.5M NaCl)中20min，并重复一次。以20×SSC(0.3M Citrate Sodium；3M NaCl，pH 7.0)作转移缓冲液，真空印迹90min将DNA转移至尼龙膜上，具体操作见真空印迹仪(Hybaid，UK)说明书。印迹结束后，6×SSC漂洗尼龙膜5min，室温晾干30min，置于80℃烘干2h将DNA固定在尼龙膜上，备用。同时回收目的基因的PCR扩增片段，按照如下方法对DNA片段进行放射性标记：DNA模板15-50ng，6-random primer 1μL(125ng/μL)，用灭菌双蒸水将体积补足至30μL，沸水浴10min，冰浴5min。然后在上述体系中加入：5×Buffer10μL，dNTP(dATP、dTTP、dGTP each 3.3nmol/μL)1.5μL，dCTP-32P 3μL(10nCi/μL)，Klenow fragment 1μL(约4U)，用灭菌双蒸水将体积补足至50μL，于37℃温育2h，然后于95℃变性10min以终止标记反应。将印迹DNA的尼龙膜放入盛有适量预杂交液(0.5M Na2HPO4，用H3PO4调pH至7.2；1mM EDTA，pH 8.0；7％SDS；1％BSA；100μg/mL变性鲑鱼精DNA)的杂交盒中，65℃预杂交3h，然后加入放射性标记探针，充分混匀，65℃杂交16-20h。杂交结束后，将膜置于洗膜液I(2×SSC，0.1％SDS)中，室温振荡漂洗10min，然后依次置于洗膜液II(1×SSC，0.1％SDS)中，室温振荡漂洗10min，洗膜液III(0.5×SSC，0.1％SDS)中，65℃水浴振荡漂洗10min，最后将杂交膜用滤纸吸干，保鲜膜包裹后进行常规的压片和X光片冲洗。
对于转基因小麦植株，采用定量RT-PCR检测检测目的基因的表达。取约0.1克幼嫩的小麦叶片，液氮研磨成粉，转移到盛有1ml Trizol试剂的1.5ml离心管中，充分混匀。加入200μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈振荡30秒。离心、取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀0.5-1小时。12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗2次，室温干燥至透明状。DNA酶消化(12.5μl体系)半小时，在37℃水浴锅中进行。反应体系：RNA 15μl，DNaseI Buffer 2.5μl，RNase inhibitor 0.5μl；DEPC水6μl。反应完后，补加DEPC水至100μl，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提10分钟。12000rpm离心10分钟，吸取上清，加入1/10体积的NaAc(3M，pH5.2)及2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜。离心回收沉淀，75％乙醇洗2次，10μl DEPC水溶解。凝胶电泳检测样品质量，合格的RNA提取物在260nm和280nm测定光吸收值并计算RNA量。使用随机六引物进行反转录，反应体系及步骤为：RNA 500ng，Random hexaprimer 0.5μL，灭菌ddH2O补足至7μL，95℃5min，冰浴3min，然后加入AMV reversetranscriptase Buffer 2μL、AMV reverse transcriptase 0.25μL、RNase inhibitor0.25μL、dNTP 0.5μL，总体积10μL。42℃反转录2h，95℃3min。将反转录所得cDNA稀释10倍为模板进行PCR扩增。半定量RT-PCR的反应体系及引物序列如下所示。在25μl反应体系中含有10mM Tris-Cl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μMdNTP each、0.8μM引物、0.625U Taq DNA polymerase、1μl模板，无菌去离子水补足25μl。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸30s，循环40次；72℃延伸7min。扩增产物电泳分析。RT-PCR所采用的内标为小麦内源基因Actin。同时以不含目的基因的空载体转化产生的植株和未转基因植株为对照材料。未转目标基因植株不产生特异扩增带。
6.转基因植株子代分析
通过春化阶段(低温处理条件因品种而异)的植株在长日照下起身、拔节、开花结实。转基因植株产生的种子，在浸水萌动后放冰箱(0-2℃)中进行春化处理30-65天。部分春化处理后的种子用10.8ml水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；另一部分春化处理后的种子播种在大田和砂盆，分别进行干旱胁迫处理和高盐胁迫处理，筛选耐旱和/或耐盐转基因植株。提取抗逆植株的叶片DNA，采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例，获得纯系后用于小麦育种或直接进入安全性实验和区域实验。