基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获 ELISA 法 技术领域 本发明涉及动物医学领域, 特别涉及基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原 捕获 ELISA 法。
背景技术 鸭瘟 (Duck plague, DP), 又称鸭病毒性肠炎 (Duck viral enteritis, DVE), 是鸭、 鹅、 天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病, 其致病特征是血管损伤、 组织出血、 消化 道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡, 对野生水禽也有不同的致 死率。DP 的病原为 DPV(Duck plague virus, DPV), DPV 是一种泛嗜性全身性感染的病毒, 目前大多数学者把其暂时列为 α 疱疹病毒亚科, 但尚未分属。目前, 已报道的 DPV 检测方 法有病毒分离鉴定、 聚合酶链式反应 (PCR)、 荧光实时定量 PCR、 间接免疫酶组化法、 间接免 疫荧光法、 电镜观察、 原位杂交、 间接原位 PCR 法、 血清中和试验 (SNT)、 琼脂凝胶扩散试验、 酶联免疫吸附试验 (ELISA)、 反向被动血凝试验、 微量固相放射免疫测定法、 生物素标记寡 核苷酸探针原位检测、 地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等, 这些方法各有特点。 但是, 传统的病毒分离鉴定方法大约需 4 ~ 5d, 且方法繁琐, 费时费力。一些免疫学方法以 及 PCR 方法也往往需要特殊的仪器、 设备以及熟练的技术人员。此外, 许多血清学检测方法 都是基于纯化的 DPV 全病毒产生的抗体来检测 DPV, 由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病 毒中会掺杂有许多宿主细胞成分, 而导致许多假阳性结果出现。
ELISA 方法是免疫学检验中最重要、 也是最常用的方法, 目前, 应用抗原捕获 ELISA(AC-ELISA) 方法对病毒进行检测的研究已有许多报道。 在检测 DPV 方法中, 贾仁勇在 《鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和 UL24 基因的发现、 原核表达及应用研究》 中公开了已有 基于 UL24 重组蛋白抗体的 AC-ELISA 的报道, 该方法用兔抗 UL24 重组蛋白多克隆抗体包被 酶标板, 以鸭抗重组 UL24 蛋白多克隆抗体作为抗原捕获抗体, 建立了敏感性、 特异性、 重复 性好的 DPV 抗原捕获 ELISA 检测方法。UL51 蛋白为鸭瘟病毒的一种皮层蛋白, 具有良好的 免疫原性和反应原性, 用抗重组 UL51 蛋白多克隆抗体建立检测 DPV 的 AC-ELISA 方法至今 无报道。
发明内容 有鉴于此, 本发明的目的在于提供一种基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗 原检测方法, 该方法特异性和敏感性高的鸭瘟病毒抗原检测方法, 其能捕获 16ng/mL 鸭瘟 病毒抗原。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为 :
基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获 ELISA 法, 具体步骤为 :
a 固相抗体的制备 : 将浓度大于或等于 12.5μg/mL 的 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 与固相载体连结, 用封闭液封闭, 洗涤去除未结合的抗体及杂质, 得固相抗体 ;
b 加待测样品 : 将待测样品与步骤 a 所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质, 得抗
原 -A 抗复合物 ;
c 与 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 反应 : 将浓度大于或等于 25μg/mL 的 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 与步骤 b 所得抗原 -A 抗复合物保温反应并洗涤去杂质, 得抗原 -A 抗 -B 抗复合物 ;
d 与酶标抗体反应 : 将酶标抗体作体积小于或等于 2000 倍的稀释, 得酶标抗体稀 释液, 将酶标抗体稀释液与步骤 c 所得抗原 -A 抗 -B 抗复合物保温反应, 得抗原 -A 抗 -B 抗 复合物 - 酶标抗体复合物 ;
e 显色 : 在步骤 d 所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后, 加入终止液终 止反应得显色样品液 ;
f 检测及结果判定 : 将步骤 e 所得显色样品液用酶标仪测定 OD450nm 值, 当 OD450nm 值 > 0.265 时判为阳性, 当 OD450nm ≤ 0.265 时判为阴性。
步骤 a 所述的 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 中 A 为免疫学研究中常规实验动物中 除鸭外的任一种动物, 步骤 c 所述的 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 中 B 为免疫学研究中常规 实验动物中除 A 外的任一种动物, 步骤 d 中所述酶标抗体为 HRP 标记的免疫学研究中常规 实验动物中除 A 和 B 外的动物抗 B IgG。
进一步, 所述的基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获 ELISA 法, 具体步 骤为 :
a 固相抗体的制备 : 将浓度等于 12.5μg/mL 的 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 与固 相载体连结, 用封闭液封闭, 洗涤去除未结合的抗体及杂质, 得固相抗体 ;
b 加待测样品 : 将待测样品与步骤 a 所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质, 得抗 原 -A 抗复合物 ;
c 与 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 反应 : 将浓度等于 25μg/mL 的 B 抗重组 UL51 蛋 白抗体 IgG 与步骤 b 所得抗原 -A 抗复合物保温反应并洗涤去杂质, 得抗原 -A 抗 -B 抗复合 物;
d 与酶标抗体反应 : 将酶标抗体作体积等于 2000 倍的稀释, 得酶标抗体稀释液, 将酶标抗体稀释液与步骤 c 所得抗原 -A 抗 -B 抗复合物保温反应, 得抗原 -A 抗 -B 抗复合 物 - 酶标抗体复合物 ;
e 显色 : 在步骤 d 所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后, 加入终止液终 止反应得显色样品液 ;
f 检测及结果判定 : 将步骤 e 所得显色样品液用酶标仪测定 OD450nm 值, 当 OD450nm 值 > 0.265 时判为阳性, 当 OD450nm ≤ 0.265 时判为阴性。
进一步, 步骤 a 中所述 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG、 步骤 b 中所述待测样品、 步骤 c 中所述 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 及步骤 d 中酶标抗体稀释液的加入量为等体积 ;
进一步, 步骤 a 中所述 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG、 步骤 b 中所述待测样品、 步骤 c 中所述 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 及步骤 d 中酶标抗体稀释液的加入量为 100 ~ 200μl ;
进一步, 步骤 a 中所述 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 为鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG, 步骤 c 中所述 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 为兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG, 步骤 d 中所述酶 标抗体为羊抗兔 IgG-HRP ;
进一步, 步骤 d 中所述色原底物为四甲基联苯胺 ;进一步, 步骤 e 中避光显色的时间为 20 分钟 ;
进一步, 所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。
本发明的有益效果在于 : 本发明基于抗重组 UL51 蛋白抗体建立的抗原捕获 ELISA(AC-ELISA) 法, 其特异性好, 可以检测阳性 DPV( 鸭瘟病毒 ) 细胞培养液及临床采 集样品泄殖腔棉拭纸中的 DPV 抗原, 而检测含 DHV 的鸭胚尿囊液、 含 RA 的菌体培养液和 含 E.coli 菌体培养液等结果均为阴性 ; 该方法批内和批间重复试验显示变异系数分别为 0.81%~ 1.68%和 0.99%~ 2.82%, 小于 5%, 能检出 16ng/mL 病毒抗原。 附图说明
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述, 其中 :
图 1-A 为 DPV UL51 基因的 PCR 扩增 : M 指 DL2000 相对分子质量标准, 1 指以正常 DEF 基因组 DNA 为模板的 PCR 扩增产物, 2 指以 DPV CHv 毒株基因组 DNA 为模板的 PCR 扩 增产物 ( 箭头所示的是其分子量大小, 约为 760bp) ; 图 1-B 为重组质粒 pMD18-UL51 的双 酶切鉴定 : M 指相对分子质量标准 III, 1 指重组质粒 pMD18-UL51 用 EcoR I 和 Xho I 双酶 切得到的两个片段 ( 箭头所示小片段的分子量大小约为 760bp) ; 图 1-C 为重组表达载体 pET28a-UL51 的双酶切鉴定 : M 指相对分子质量标准 III, 1 指重组表达载体 pET28a-UL51, 2 指重组表达载体 pET28a-UL51 用 EcoR I 和 Xho I 双酶切得到的两个片段 ( 箭头所示小片 段的分子量大小约为 760bp)。 图 2-A 为重组表达蛋白的 SDS-PAGE 鉴定 : M 为蛋白质相对分子质量标准, 1 为阴性 对照 ( 未加 IPTG 诱导 ), 2 为 IPTG 诱导 ( 箭头所示的蛋白质分子量大小约为 34KD) ; 图 2-B 为诱导剂 IPTG 不同终浓度诱导表达结果 : 1-7 的 IPTG 浓度分别为 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 和 1.2mmol/L ; 图 2-C 为不同温度诱导 pET28a-UL51 表达结果 : 1-3 的温度分别为 20、 30 和 37℃; 图 2-D 为不同时间诱导 pET28a-UL51 表达结果 : 1-7 的诱导时间分别为 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 和 8h。
图 3-A 为重组 UL51 蛋白纯化产物的 SDS-PAGE 分析 : M 为蛋白质分子量, 1 为 IPTG 诱导的 1ml 菌液, 2 为粗提的 UL51 蛋白包涵体, 3 为 50mM 咪唑洗脱峰 ( 不含纯化的重组 UL51 蛋白 ) ; 4 为 300mM 咪唑洗脱峰 ( 含有纯化的重组 UL51 蛋白 ) ; 图 3-B 为纯化的兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的 SDS-PAGE 分析 : M 指标准蛋白质分子量, 1 指过柱纯化的兔抗 UL51 蛋 白抗体 IgG。
图 4 为琼脂糖凝胶扩散试验检测兔抗重组 UL51 蛋白高免血清效价测定。
图 5 为纯化的抗重组 UL51 蛋白抗体的 SDS-PAGE 分析 : M. 标准蛋白质分子量 (KD) ; 1. 过柱纯化兔抗 UL51 蛋白抗体 IgG ; 2. 过柱纯化鼠抗 UL51 蛋白抗体 IgG。
图 6 为本方法的特异性试验结果照片图。
图 7 为本方法的敏感性试验结果照片图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下面结合附图对本发明的优选 实施例进行详细的描述。本实施例中将所述重组 UL51 蛋白的获得是通过构建原核表达质粒 pET28a-UL51、 转化表达菌并发酵培养, 收集到大量的含有重组 UL51 蛋白的菌体沉淀, 再 通过超声波破碎菌体、 重组 UL51 蛋白包涵体冼涤、 纯化及梯度透析而获得的 ; 用所述重组 UL51 蛋白对兔和鼠进行常规免疫程序和纯化, 获得兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和鼠抗重 组 UL51 蛋白抗体 IgG ; 进一步确定了兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和鼠抗重组 UL51 蛋白抗 体 IgG 的最佳浓度范围及酶标抗体最适浓度及阴阳性临界值的确定, 制定了一种特异性和 敏感性高的鸭瘟病毒抗原检测方法, 其能捕获 16ng/mL 鸭瘟病毒抗原。
实施例基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获 ELISA 检测方法
一鸭瘟病毒 UL51 基因的克隆、 原核表达及 UL51 蛋白的纯化
1 材料准备
1.1 菌株、 质粒和毒株
质粒 pMD18-T, 购自大连宝生物工程有限公司 ; 原核表达质粒 pET28a(+), Novagen 公司产品 ; 克隆宿主菌 E.coli DH5a、 表达宿主菌 E.coli BL21(DE3) 和 DPV CHv 强毒株, 由 四川农业大学禽病研究中心提供。
1.2 试验动物
10 日龄鸭胚, 其种鸭 DPV 和抗体均为阴性 ; 健康雄性白兔 4 只, 体重 2-3kg/ 只, 购 自雅安某兔场 ; 健康 Vista 大鼠 20 只, 购自四川大学。 2 实验方法
2.1DPV UL51 基因的克隆
2.1.1 引物设计
利用 Primer Premier5.0 软件, 参考 UL51 基因序列 (GenBank 登录号 : DQ072725), 由宝生物生物技术有限公司合成。引物 DPV-UL51F :
5’ -CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3’ ( 划 线 部 分 为 EcoRI 位 点 ) ; 引物 DPV-UL51R : 5’ -TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’ ( 划线部分为 XhoI 位点 )。合成后, 以适 量灭菌去离子水溶解, 使其终浓度为 20mmol/L, -20℃保存备用。
2.1.2DPV 基因组 DNA 的提取
a、 正常鸭胚成纤维细胞 (DEF) 的制作方法 : 取 10d 日龄健康鸭胚, 分别用 5%碘酒 和 75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用 PBS 将胚体洗净, 剪去头、 翅、 腿和内脏, PBS 冲洗后将胚体剪成 1mm 大小的小块, 加 PBS 适量, 之后置于三角瓶内, 加细胞 分散剂 (2.5%胰蛋白酶 )150μl/ 胚, 于 37℃水浴中消化 3min。立即将细胞悬液以 4000r/ min 离心 5min, 倾弃上清, 细胞沉淀用适量的 MEM 悬浮后, 用 5 层纱布过滤, 向滤液中加入 10%小牛血清和 100IU/mL 双抗后, 分装于 100mL 细胞培养瓶中, 7mL/ 瓶, 水平静置于 37℃ 细胞培养箱中进行培养。
b、 DPV 增殖 : 取刚刚长成致密单层的 DEF, 弃生长营养液, 用灭菌 PBS 清洗细胞表面 2 次后, 加入 DPV 病毒液 2 ~ 3mL 覆盖细胞表面进行吸附, 37℃吸附 120min 后弃病毒液, 然 后加含 3%小牛血清和 100IU/mL 双抗的 MEM 维持营养液, 之后 37℃培养。同时做未接毒的 DEF 对照。
c、 DNA 提取方法 : 直接从感染细胞中提取 DPV 基因组 DNA 的具体步骤如下 : (1) 选 取用 DPV 种毒感染后细胞病变 (CPE) 达 60 %~ 70 %的 DEF(100mL 细胞瓶 ) ; 同时选取细 胞形态正常的 DEF 作对照 ; (2) 倾去细胞培养液, 加入 500μL 的细胞裂解液, 同时加蛋白酶
K(10mg/mL) 至终浓度为 200μg/mL, 轻轻混匀后, 37 ℃孵育 10min ; (3) 将细胞悬浮液倒入 EP 离心管中, 并用 500μL 的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物, 倒入离心管中 ; (4) 用饱 和酚 : 氯仿及氯仿抽提 2 次, 再用水饱和乙醚处理 2 次 ; (5) 加 1/10 倍体积 3mol/LNaAC, 混 匀后, 加入 2 倍体积冷无水乙醇, -20℃放置 30 ~ 60min ; (6)13000r/min 离心 20min, 沉淀 用预冷的 70%乙醇洗涤两次 ; (7) 真空抽干后, 溶于适量 TE 缓冲液中, 加入 1μL RNA 酶, 37℃作用 30min, -20℃保存备用。
2.1.3PCR 扩增 DPV UL51 基因
PCR 反应体系为 :
轻轻混匀, 2000r/min 瞬时离心后进行 PCR。
反应参数 : 95℃预变性 5min, 95℃变性 1min, 56℃退火 1min, 72℃延伸 1min, 循环 40 次, 最后 72℃延伸 10min, 于 4℃保存备用。取 4μL PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳, 设 DL2000 和空白对照, 观察扩增片段的长度。
2.1.4UL51 基因 PCR 产物的回收
按北京赛百盛基因技术有限公司 DNA 回收试剂盒说明书进行, 回收后的 DNA 贮存 于 -20℃保存备用。
2.1.5 纯化的 UL51 基因与 pMD18-T 的连接
连接反应体系如下 :
将上述试剂加入 0.2mL 的 EP 管中, 小心混匀, 瞬时离心后, 于 16℃连接过夜。
2.1.6DH5a 感受态细胞的制备
采用氯化钙法制备新鲜的 DH5a 株大肠杆菌感受态细胞, 简述如下 : (1) 无菌挑取 平板上新鲜培养的 DH5a 单克隆菌落接种于 5mL LB 培养液中, 于 37℃振荡培养过夜 ; (2) 取 1mL 上述培养液接种于 100mL LB 培养液中, 37℃ 200r/min 振荡培养 2.5 ~ 3h, 使 OD600 = 0.5 左右 ; (3) 将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中, 冰浴 10min ; (4) 于 4 ℃ 4000r/ min 离心 8min, 弃上清 ; (5) 加 10mL 冰预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2, 温和悬起细菌沉淀, 冰浴
30min ; (6) 于 4 ℃ 4000r/min 离心 8min, 弃上清, 加 4mL 冰预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 再次 重悬沉淀, 加入终浓度为 15 %的灭菌甘油, 混匀后分装为 200μL/ 管, 直接用于转化或置 于 -70℃冰箱中保存备用。
2.1.7 转化感受态细胞
将 10μL 连接体系全部取出加到 200μL DH5a 感受态细胞中, 冰浴 30min ; 再置于 42℃温浴 90s, 之后再冰浴 2min ; 然后立即加入 0.8mL LB 培养基, 37℃水浴振荡培养 45min, 取 200μL 涂于含 (X-gal/IPTG/Kan) 的培养基上, 置 37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单 个白色菌落接种于 5mL LB( 含 50μg/mL Kan) 中, 37℃水浴振荡培养 18h 后进行质粒抽提。
2.1.8 质粒的抽提
按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行, 回收产物贮存 于 -20℃保存备用。
2.1.9 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定
将上一步抽提的重组质粒命名为 pMD18-UL51, 分别以 EcoR I/XhoI 双酶切消化与 Xho I 单酶切消化, 1.0%凝胶电泳观察结果。同时做 PCR 扩增目的基因。
2.1.10UL51 基因序列测定
将鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。
2.2 原核表达质粒 pET28a-UL51 的构建、 诱导表达与表达条件优化
2.2.1 原核表达质粒 pET28a-UL51 的构建与鉴定
a 目的片段的酶切与连接 : 限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I 分别双酶切 pMD18-UL51 质粒和原核表达载体 pET28a(+), 酶切体系均为 :
37℃水浴 4h, 按 DNA 回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后, 按照下列连接体 系 16℃连接过夜。
b 重组质粒的转化 : 采用氯化钙法制备 DH5a 感受态细胞。 之后, 取连接液 15μL 加 到含 200μL 感受态 DH5a 的离心管中, 混匀后冰浴 30min ; 置于 42℃水浴 90sec, 然后迅速 冰浴 2min ; 加入不含 Kan 的 LB 液体培养基 800μL, 37℃振摇 (150r/min) 培养 1 ~ 1.5h ; 取 200μL 培养物涂布于含 100μg/mL Kan 的 LB 平板, 37℃培养过夜, 次日挑取单个菌落接 种于 5mL 的 LB 液体培养基中, 37℃培养 12 ~ 16h, 同时设立空载体转化组 ( 空载体 10μL+ 感受态 DH5a 200μL)、 无载体对照组 ( 灭菌超纯水 10μL+ 感受态 DH5a 200μL)。
c 重组质粒的酶切和 PCR 鉴定 : 将上述保存的克隆菌种接种于 5mL 的 LB 液体培养 基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃水浴振摇培养过夜, 次日按常规方法提取重组质粒, 然后用 XhoI 单酶切、 EcoR I 和 Xho I 双酶切鉴定该重组质粒, 其酶切体系如下 :
然后, 以重组质粒为模板, 利用方法 2.1.1 中的引物进行 PCR 反应, 其方法和扩增 条件同上, 取 PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和 PCR 鉴定, 获得重组原核 表达质粒 pET28a-UL51。
2.2.2 重组表达质粒 pET28a-UL51 的诱导表达
a 重组质粒 pET28a-UL51 的提取 : 挑取已鉴定含阳性重组质粒 pET28a-UL51 的 DH5a 菌种划线接种于含 Kan 50g/mL 的 LB 琼脂平板上, 37℃培养过夜, 次日取单个菌落接 种于 5mLLB 液体培养基上, 剧烈振荡培养 10 ~ 16h, 离心收集菌液, 按 UltraPureTM 质粒 DNA 小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。
b 重组质粒 pET28a-UL51 转化表达菌 : 采用氯化钙法制备 E.coli BL(DE3) 感受态 细胞, 并将上述提取的重组质粒 pET28a-UL51 转化到表达宿主菌 E.coli BL(DE3) 中。
c 重组质粒 pET28a-UL51 的诱导表达 : 从上述 LB 固体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 上, 挑取阳性克隆菌, 接种 LB 液体培养基, 37℃培养过夜, 次日取菌液按 1 ∶ 50 的比例接入 5mLLB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 剧烈振荡培养至 OD600 = 0.4 时, 分别加入 IPTG 至终浓度为 1.0mmol/L, 诱导 3h 后, 收集 1mL 培养菌液, 4℃ 13000r/min 离心 2min, 弃上清, 沉淀中加入 80μL 超纯水和 20μL 5×SDS 上样缓冲液, 100℃水浴加热变性 5 ~ 10min, 进 行 12% SDS-PAGE 凝胶电泳, 观察表达结果。
d 重组质粒 pET28a-UL51 表达产物的可溶性分析 : 将诱导表达的 100mL 菌液和 未诱导表达的 100mL 菌液, 分别按下步骤处理 : 4 ℃, 10000r/min 离心 5min, 菌体沉淀用 20mL 20mmolTris-HCl(pH8.0) 悬浮 ; 置 -20℃过夜后, 加溶菌酶至终浓度为 1mg/mL, 4℃搅 拌 30min, 超声波 ( 冰浴 ) 间歇破碎菌体 (600w, 30sec/ 次, 10 次 ), 4 ℃, 10000r/min 离心 10min, 取上清备用① ; 沉淀用 10mL 洗液 (10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +0.2% Triton X-100) 悬浮, 4℃, 10000r/min 离心 10min 后, 沉淀再次用 10mL 洗液悬浮, 重复洗涤三次后, 用适量 尿素溶液 (10mmol/L PBS+8mol/L 尿素 ) 溶解沉淀②, 低温保存备用。分别取适量的上清① 和尿素溶液溶解的沉淀②, 向其中加入 80μL 超纯水和 20μL 5×SDS 上样缓冲液, 100℃水 浴加热变性 5 ~ 10min, 进行 12% SDS-PAGE 凝胶电泳, 将凝胶用考马斯亮蓝染色后, 观察结 果。 并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和 Quantity One 软件分析诱导菌液 中重组蛋白在胞浆 ( 上清①, 可溶性 ) 和沉淀中 ( 沉淀②, 包涵体形式 ) 的相对百分含量。
2.2.3 重组质粒 pET28a-UL51 表达条件的优化
a 诱导剂 IPTG 的浓度优化 : 取含重组质粒 pET28a-UL51 的表达宿主菌 BL21(DE3), 接种 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃振摇培养过夜。次日按 1 ∶ 50 转接 种于 5mLLB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃培养培养至 OD600 值约 0.4 时, 取其中 7 只试管, 分别加入 IPTG 至终浓度为 0mmol/L、 0.2mmol/L、 0.4mmol/L、 0.6mmol/L、 0.8mmol/ L、 1.0mmol/L、 1.2mmol/L 37℃诱导培养 4h 后, 按上述方法对样品进行处理, 12% SDS-PAGE 电泳, 观察结果。
b 温度条件优化 : 取含重组质粒 pET28a-UL51 的表达宿主菌 BL21(DE3), 接种 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃振摇培养过夜。 次日按 1 ∶ 50 转接种于 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃培养培养至 OD600 值约 0.4 时, 取其中 3 只试管, 分 别加入 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/L, 分别置于 20℃、 30℃、 37℃诱导培养 4h, 按上述常规方 法对样品进行处理, 12% SDS-PAGE 电泳, 观察结果。
c 诱导时间优化 : 取含重组质粒 pET28a-UL51 的表达宿主菌 BL21(DE3), 接种 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 上, 37℃振摇培养过夜。次日按 1 ∶ 50 转接种于 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 上, 继续培养至 OD600 值约 0.4 时, 加入 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/L, 37℃诱导培养, 分别于诱导后 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8h, 吸取 1mL 培养液, 按上述方 法对样品进行处理, 12% SDS-PAGE 电泳, 观察结果。
2.3 重组 UL51 蛋白的大量制备、 纯化与复性
2.3.1 重组 UL51 蛋白的大量制备 ( 包涵体处理 )
将 诱 导 表 达 1000mL 菌 液, 4 ℃、 10000r/min 离 心 10min,将 菌 体 沉 淀 用 40mL20mmolTris-HCl(pH8.0) 悬浮 ; 置 -20℃过夜后按 1mg/mL 加溶菌酶, 4℃搅拌 30min, 超 声波 ( 冰浴 ) 间歇破碎菌体 (200w, 30sec/ 次, 5 ~ 10 次 ), 4℃、 10000r/min 离心 10min。将 沉淀用 20mL 洗液 (10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +0.2% Triton X-100 悬浮, 4℃、 10000r/min 离心 10min 后, 用适量尿素溶液 (10mmol/L PBS+8mol/L 尿素 ) 溶解沉淀, 4℃保存备用。
2.3.2 重组 UL51 蛋白的纯化
镍琼脂糖凝胶 (Ni2+-NAT) 亲和层析纯化重组 UL51 蛋白 : 根据融合蛋白的 6-His 标 签对镍离子特殊的亲和作用, 使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼脂糖凝胶上, 改变洗 脱液的条件将其洗脱, 而达到纯化的目的。 具体操作步骤为 : (1) 装柱 : 镍琼脂糖凝胶装柱,柱床体积约为 40mL ; (2) 平衡 : 用平衡缓冲液 I 约 5 个床体积平衡层析柱, 流速为 1mL/min ; (3) 上样 : 将 0.45μm 滤膜过滤的可溶性包涵体样品约 5mL, 加入层析柱中, 流速为 0.5mL/ min ; (4) 洗涤 : 用平衡缓冲液 II 再洗 2-5 个床体积, 流速为 1mL/min ; (5) 洗脱 : 分别用含 50、 300、 500mmol 咪唑的洗脱缓冲液 III 进行梯度洗脱, 流速为 1mL/min, 收集各梯度的洗脱 峰, 用 SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度 ; (4) 清洗 : 用超纯水洗 5 个柱床体积, 再用 25%的乙醇洗 3 个柱床体积, 流速为 1mL/min, 回收镍琼脂糖凝胶柱, 于 4℃中保存。
2.3.3 重组 UL51 蛋白的复性
将过柱纯化的重组 UL51 蛋白, 于 4℃在不同浓度的尿素溶液 (6、 4、 3、 2、 1、 0mol/L) 中梯度透析, 使变性蛋白逐渐复性, 并用 Bradford 法测定蛋白的最终浓度, 分装后备用。
3 实验结果
3.1DPV UL51 基因的扩增、 T- 克隆与鉴定结果
3.1.1UL51 基因的 PCR 扩增结果
以 DPV CHv 毒株基因组 DNA 为模板对 UL51 基因进行 PCR 扩增, 其产物经 1.0%琼 脂糖凝胶电泳, 获得了一条约 760bp 的特异性 DNA 条带, 而以正常 DEF 基因组 DNA 为模板进 行 PCR 扩增, 无特异性条带, 这与预期结果一致 ( 图 1-A)。 3.1.2UL51 基因 T 克隆鉴定结果
PCR 产物经胶回收纯化后, 与 pMD18-T 载体连接并转化感受态细胞 DH5α, 得到的 T 克隆命名为 pMD18-UL51。对 pMD18-UL51 进行 PCR、 酶切 ( 图 1-B : 重组质粒 pMD18-UL51 用 EcoR I 和 Xho I 双酶切得到的两个片段 ( 箭头所示小片段的分子量大小约为 760bp) 和测 序鉴定, 结果表明, T 克隆获得的 UL51 基因序列同已知的 DPV UL51 基因序列完全一致。
3.2 原核表达质粒 pET28a-UL51 的构建与鉴定、 诱导表达及其优化结果
3.2.1 重组表达质粒 pET28a-UL51 的构建与酶切鉴定
以 EcoR I 和 Xho I 双 酶 切 T 克 隆 质 粒 后 回 收 目 的 片 断, 与经相同酶切的 pET-28a(+) 表达载体连接, 转化 DH5α, 得到重组表达质粒 pET28a-UL51, 该理论大小约为 6130bp, 经 EcoR I 和 Xho I 双酶切后得到的两条片断的大小分别约为 5370bp 和 760bp( 见 图 1-C), 与理论值相符, 表明原核表达载体被成功构建。
3.2.2 重组质粒 pET28a-UL51 的诱导表达
a 重组质粒 pET28a-UL51 的诱导表达将重组质粒 pET28a-UL51 转化表达 : 菌株 BL21(DE3), 在含 Kan 的 LB 琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒 pET28a-UL51 的 表达宿主菌 BL21(DE3) 用 IPTG 进行诱导表达、 未用 IPTG 诱导、 空载体 pET-28a(+) 转化菌 株诱导表达, 结果表明 : 空载体 pET-28a(+) 转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋 白条带 ; 重组表达质粒 pET28a-UL51 表达的重组 UL51 蛋白在 34KD 处 ( 图 2-A)。
b 重组质粒 pET28a-UL51 表达产物的可溶性分析 : 诱导表达的 100mL 菌液经可溶 性分析处理后, 电泳结果显示 : 表达蛋白主要存在于沉淀中, 说明重组表达蛋白在菌体中大 量以不溶的包涵体形式存在。 同时 Quantity One 软件分析显示 : 诱导菌液中重组蛋白在胞 浆上清 ( 可溶性 ) 和沉淀中 ( 包涵体形式 ) 的相对百分含量分别为 6.72%和 93.28%。
3.2.3 重组质粒 pET28a-UL51 表达条件的优化
a IPTG 浓 度 的 优 化 : 在 37 ℃ 条 件 下, 加 入 IPTG 使 其 终 浓 度 分 别 为 0mmol/L、 0.2mmol/L、 0.4mmol/L、 0.6mmol/L、 0.8mmol/L、 1.0mmol/L、 1.2mmol/L 诱导培养 4h, 结果显
示: 未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带 ; 随 IPTG 浓度的增高, 蛋白诱导量逐渐增加, 当 增加到 0.8mmol/L 蛋白表达量达到最大 ; 其后再增大 IPTG 浓度到 1.0mmol/ 和 1.2mmol/L 时, 其蛋白表达量与 0.8mmol/L 时没有明显差别 ( 图 2-B)。 因此, 可选择 0.8mmol/L 的 IPTG 浓度作为诱导表达浓度。
b 诱导温度条件的优化 : 37℃培养培养至 OD600 值约 0.4 时, 取 3 只灭菌试管, 分装 5mL/ 管, 分别加入 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/L, 分别置于 20℃、 30℃、 37℃诱导培养 4h, 结 果: 温度在 20℃时, 诱导蛋白量较少, 37℃时最高 ( 图 2-C), 说明随着温度升高, 蛋白诱导量 逐渐增加。因此, 选择温度 37℃为最佳诱导温度。
c 诱导时间的优化 : 在 IPTG 浓度为 0.8mmol/L, 37℃条件下, 采用 1 ~ 8h 不同诱导 时间进行诱导表达, 结果 1h 时几乎无特异的蛋白条带产生 ; 诱导 1 ~ 3h 的重组蛋白表达量 均低于 4h 诱导组 ; 诱导 5 ~ 8h, 其重组蛋白表达量同 4h 相比无明显变化 ( 图 2-D)。因此, 选择 4h 作为最佳诱导时间。
3.3 重组 UL51 蛋白的纯化结果
表达产物经过溶菌酶裂解、 超声波破碎、 尿素洗涤等一系列前处理后, 镍琼脂糖凝 胶亲和层析纯化重组 UL51 蛋白。 UL51 蛋白样品过柱纯化后的 UV 曲线图显示出 3 个峰, 峰1 为穿透峰, 峰 2 为 50mmol 咪唑洗脱峰, 峰 3 为 300mmol 咪唑洗脱峰。 同时收集不同浓度咪唑 洗脱峰, 进行 SDS-PAGE 电泳, 检验纯度及浓度, 结果显示 : 只有 300mmol 咪唑洗脱峰中含有 大量高纯度的重组 UL51 蛋白 ( 图 3-A)。将纯化的重组 UL51 蛋白透析复性后, 用 Bradford 法测定蛋白的终浓度, 并将其稀释为 1mg/mL, 分装后备用。
二基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原检测方法
1 抗重组 UL51 蛋白多克隆抗体的制备和纯化
1.1 弗氏佐剂
a 弗氏不完全佐剂 : 液体石蜡油 3 份, 羊毛脂 1 份, 混合均匀, 115℃, 15min 高压灭 菌后得弗氏不完全佐剂。使用前加热融化, 冷却至 50℃左右, 加抗原进行乳化处理 ; b 弗氏 完全佐剂 : 在上述基础上添加卡介苗至终浓度 1mg/mL 即可, 使用时将抗原溶液与其等量混 合, 充分乳化。
1.2 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的制备和纯化
1.2.1 兔抗重组 UL51 蛋白抗体的制备 ( 重复进行三次此试验, 每次间隔 1 周, 以制 备三个不同批次的抗体 )
a 免疫原的制备 : 将纯化并复性后的重组 UL51 蛋白, 首免与等量完全弗氏佐剂混 合并充分乳化, 第二、 三免与不完全弗氏佐剂混合并充分乳化, 第四免不加佐剂。
b 免疫程序 : 选择健康雄兔 4 只, 首免前一天分别采血, 分离血清作为阴性对照。 制 备兔抗 UL51 高免血清免疫程序如下表 :
四免后 14d 颈动脉放血, 收集血液。37℃放置 1h, 4℃冰箱过夜。第二天析出血清, 血凝块以 4000r/min 离心 15min 再次收集血清, -20℃保存备用。
按双向琼扩法, 用 100mL 0.85% NaCl 溶液溶解 1g 琼脂糖, 115℃高压灭菌 10min 后, 倒入培养皿中, 制成 4mm 后的凝胶板。用打孔器在凝胶板上打孔, 将倍比稀释的血清 (1 ∶ 2、 1 ∶ 4、 1 ∶ 8、 1 ∶ 16、 1 ∶ 32) 和阴性兔血清分别滴于梅花形外周孔内, 中间孔滴 加纯化的重组 UL51 蛋白或 DPV, 37℃湿盒孵育 24 ~ 48h, 观察琼扩结果。结果显示, 1 ∶ 2、 1 ∶ 4、 1 ∶ 8、 1 ∶ 16 和 1 ∶ 32 均出现清晰可见的琼扩沉淀线, 而阴性兔血清无沉淀线 ( 图 4), 这表明重组 UL51 蛋白, 具有较好的抗原性并能与 DPV 反应。本实施例中的稀释均按体 积比稀释方式进行。
1.2.2 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的纯化
a 正辛酸 - 硫酸铵法粗提兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG : 粗提兔抗重组 UL51 蛋白 抗体 IgG, 步骤如下 : (1) 取分离的 10mL 血清加入等量的 0.06mol/LpH4.8 醋酸盐缓冲液, 混匀 ; (2) 室温搅拌下逐滴加入正辛酸 75μg/mL 血清, 室温搅拌 30min, 4℃静置> 3h, 使其 充分沉淀后, 13000r/min 离心 30min ; (3) 取上清用滤纸过滤, 向滤液中加入 1/10 体积的 10mmol/LpH7.4 的 PBS, 用 2mol/L NaOH 调节 pH = 7.4 ; (4) 冰浴下向液体中缓缓加入饱和 硫酸铵 0.277g/mL 使其终浓度达到 45%, 搅拌 30min, 置 4℃静置> 3h 或过夜, 13000r/min 离心 30min 弃上清液 ; (4) 按 1 ∶ 4 的比例向沉淀中加入 PBS, 充分吹打使其充分溶解 ; (5) 将溶解液装入透析袋中, 在 4℃下用 10mmol/L pH7.4PBS 透析, 每 6h 换液一次, 直至奈氏试 剂检测透析液中无沉淀产生为止。
b High Q 柱阴离子交换色谱法纯化兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG : 纯化抗体 IgG, 步骤如下 : (1) 样品前处理 : 将粗提 IgG 用 0.45μm 滤膜过滤去除杂质, 以缓冲液 A(pH8.0, 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液 ) 在 4 ℃条件下进行透析平衡过夜 ; (2) 色谱柱前处理 : 经过 0.5mol/LNaOH、 水洗、 1.0mol/LNaCl、 水洗等前处理, 且以缓冲液 A 平衡 HighQ 色谱柱 ; (3) 上样 : 取 5mL 的粗提 IgG 样品 ; (4) 清洗 : 用 50mL 缓冲液 A 平衡并洗下未结合的蛋白质和杂 质; (5) 洗脱 : 以缓冲液 B(1.0mol/L NaCl) 进行线性梯度离子强度洗脱, 流速 0.5mL/min, 洗 脱时间为 200min, 分部收集洗脱组分。
c 抗体 IgG 纯度和浓度测定 : 将收集到的洗脱峰样品处理后, 进行 SDS-PAGE 电泳 ( 图 3-B 和图 5), 测定抗体 IgG 的纯度, 并用 Bradford 法测定抗体 IgG 的最终浓度, 并将其 稀释为 2mg/mL, 分装后于 -20℃保存备用。
1.3 鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的制备和纯化 ( 重复进行三次此试验, 每次间隔 1 周, 以制备三个不同批次的抗体 )
具体包括 (1) 免疫原的制备 : 将纯化的重组 UL51 蛋白, 首免与等量完全弗氏佐剂
混合乳化充分, 第二、 三免与不完全弗氏佐剂混合乳化充分, 第四免不加佐剂。(2) 免疫程 序: 选择健康 Vista 大鼠 20 只, 首免前一天分别采血, 分离血清作阴性对照。制备鼠抗重组 UL51 蛋白高免血清免疫程序如表 1。四免后 14d 摘眼球放血, 收集血液。37℃放置 1h, 4℃ 冰箱过夜。第二天析出血清, 血凝块以 4000r/min 离心 15min 再次收集血清, -20℃保存备 用。(3) 双向琼扩法测定鼠抗重组 UL51 蛋白高免血清的效价为 1 ∶ 64。其它可参照兔抗 重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的制备和纯化。
表 1 鼠抗重组 UL51 蛋白多克隆抗体的免疫程序
鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的纯化 : 多克隆抗体的纯化参照兔抗纯化步骤, 将得 到的鼠抗重组 UL51 蛋白抗血清进行纯化, 用 Bradford 法测定抗体 IgG 的最终浓度, 并将其 稀释为 2mg/mL, 分装后于 -20℃保存备用。分别对纯化后的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 进行 SDS-PAGE 鉴定 ( 图 5), 结果表明该抗体 IgG 具有很高的 纯度。 用 Bradford 法测定两种抗体 IgG 的最终浓度, 并将其稀释为 2mg/mL, 分装后于 -20℃ 保存备用。本实施例中, 将所制备的两种重组 UL51 蛋白抗体的动物选为大鼠和兔, 也可选 用其他不同种属动物。
1.4 检测菌株、 毒株
正常鸭胚成纤维细胞 (DEF) 培养液、 含 DPV 强毒的 DEF 培养液、 含鸭病毒性肝 炎病毒 (Duck virus hepatitis, DHV) 的鸭胚尿囊液、 含鸭疫里默氏杆菌 (Riemerella anatipestifer, RA) 的菌体培养液和含鸭大肠杆菌 (E.coli) 的菌体培养液均由本实验室 提供。
1.5 其它试剂
ELISA 相关溶液 ; 辣根过氧化酶标记的羊抗兔 IgG( 羊抗兔 IgG-HRP) 和四甲基联 苯胺 (TMB) 均购自美国 KPL 公司 ; 其它常规试剂如 0.01mol/L 的 PBS 缓冲液 (pH7.2) 均按 常规方法配置。
2 实验方法
2.1 待测样品的获得
2.1.1 细胞培养液、 鸭胚尿囊液或菌体培养液的处理
将待检的液体样品进行以下裂解处理 : 向待检样品液中加入等体积的裂解液 [2% TritonX-100/PBS(0.01mol/L, PH = 7.2) 溶液 ] 作用 5min( 剧烈振荡 ), 12000r/min、 4℃离心 5min, 收集上清液, 得待测样品。
2.1.2 泄殖腔棉拭子样品的处理
泄殖腔棉拭子的处理方法如下 : 用无菌棉拭子擦试病鸭泄殖腔后, 放入盛有约
500μL 生理盐水的灭菌 EP 管中, 将 EP 管在旋涡振荡器上剧烈振荡 1 ~ 3min 后, 用无菌镊 子将棉拭子在 EP 管壁上反复挤压后取出, 余下的的液体按细胞培养液、 鸭胚尿囊液或菌体 培养液的方法处理后得待测样品。
3 基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法检测 DPV 抗原方法的建立
3.1 最佳鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 最佳浓度的 确定
采用方阵滴定法, 具体步骤如下 : (1) 将鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 用包被液倍 比稀释 (1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320、 1 ∶ 640), 包被酶标板, 100μL/ 孔, 置 4℃湿盒孵育过夜, 洗板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (2) 加入 100μL/ 孔封闭液, 37℃湿盒 封闭 1h, 洗板机洗涤 1 次, 5min/ 次, 拍干 ; (3) 加入待测样品, 100μL/ 孔, 37 ℃湿盒作用, 洗板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (4) 将兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 倍比稀释 (1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320、 1 ∶ 640), 加入酶标板中, 100μL/L, 37℃湿盒孵育 1h, 洗 板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (5) 加入 1 ∶ 2000 稀释的羊抗兔 IgG-HRP, 100μL/ 孔, 37℃ 反应 45min, 洗板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (6) 加入 TMB 底物 100μL/ 孔, 25℃避光显色 20min 后, 加入 50μL/ 孔 2mol/L 硫酸终止反应 ; (7) 检测 : 用酶标仪测 OD450nm 值。同时以 1%的 BSA/PBS 溶液作空白对照, 以 P/N 值最大的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的稀释度为最佳工作浓度。 分别将鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 作系列稀释, 进 行方阵试验, 结果见表 2。方阵滴定结果显示, 当鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 1 ∶ 160 倍稀 释, 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 以 1 ∶ 80 倍稀释时, OD450nm 值大于 1.0, 阴阳性血清 OD450nm 比值 (P/N) 最大。因此选择鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的最佳包被浓度为 1 ∶ 160, 即浓 度为 12.5μg/mL ; 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的最佳稀释倍数为 1 ∶ 80, 即最佳包被浓度 为 25μg/mL, 上述最佳包被浓度均为阈浓度, 在大于阈浓度时, 同样可以实现相同的作用, 但经济成本增加。
表 2 鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 最佳工作浓度的 确定
3.3.2 酶标抗体最适浓度的确定
以浓度为 12.5μg/mL 鼠抗重组 UL51 蛋白抗体浓度包被酶标板, 加入待测样品, 再 加入浓度为 25μg/mL 兔抗重组 UL51 蛋白抗体, 将酶标抗体做 1 ∶ 500、 1 ∶ 1000、 1 ∶ 2000、 1 ∶ 4000 系列稀释后进行 AC-ELISA 测定, 选择 P/N 值最大时的酶标抗体浓度作为最佳工作 浓度。
根据确定的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 最佳工作 浓度, 将酶标羊抗兔抗体 IgG 作不同的稀释, 进行 AC-ELISA 试验, 每个稀释度重复 3 次, 求 出样品的平均 P 值和 N 值, 确定酶标羊抗兔抗体 IgG 的最佳工作浓度。结果见表 3, 当酶标 羊抗兔抗体 IgG 作 1 ∶ 2000 稀释时, P/N 值最大为 7.113, 因此确定最佳酶标抗体稀释倍数 为 2000。其中 2000 为稀释倍数阈值, 当稀释倍数小于 2000 时, 同样可以实现相同的作用。
表 3 酶标抗体最佳工作浓度的确定
3.3.3 阴阳性临界值的确定
取 16 份 DPV 阴性鸭的泄殖腔棉拭子, 按照上述建立的基于抗重组 UL51 蛋白抗体 的 AC-ELISA 的方法检测, 同时以 1%的 BSA/PBS 溶液作空白对照。将 16 份棉拭子样品的 OD 值的平均值 (X) 和 3 倍标准方差 (SD) 之和作为阴性样品值的上限, 即待检棉拭子样品的 OD 值> X+3SD 时, 判断为阳性 ; 否则为阴性。
通过对 16 份 DPV 阴性鸭的泄殖腔棉拭子样品进行检测 ( 表 4), 求得其 X 值为 0.131, SD 值为 0.045, 确定阴阳性临界点为 X+3SD = 0.131+3×0.045 = 0.265。即待测样
品的 OD450nm 值大于 0.265 为 DPV 阳性, 小于或等于则为阴性。
表 416 份 DPV 阴性样品的 AC-ELISA 检测结果
3.2.4 特异性试验
取正常 DEF 培养液、 含 DPV 的 DEF 培养液、 含 DHV 的鸭胚尿囊液、 含 RA 的菌体培养 液和含 E.coli 菌体培养液各 3 份, 按照本实施例中的方法进行检测, 观察结果。
按照建立的 AC-ELISA 方法, 分别对正常 DEF 培养液、 含 DPV 的 DEF 培养液、 含 DHV 的鸭胚尿囊液、 含 RA 的菌体培养液和含 E.coli 菌体培养液进行检验, 结果见表 5 和图 6。
表 5AC-ELISA 特异性试验结果
3.2.5 敏感性检测结果
将含 DPV 的 DEF 培养液作倍比稀释 (1 ∶ 10、 1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320、 1 ∶ 640、 1 ∶ 1280), 100μL/ 孔加于酶标板中, 每个稀释度重复 3 次, 按建立的 AC-ELISA 方法检测, 同时设定阴性对照 ( 正常 DEF 细胞 ) 和空白 (PBS) 对照。
按照建立的 AC-ELISA 方法, 将含 DPV 的 DEF 培养液作一系列倍比稀释, 结果见表 6 和图 7。将含 DPV 的 DEF 培养液稀释至 1 ∶ 640 倍时, 浓度为 0.16μg/mL 时, OD450nm 值为 0.268, 稍大于临界值 0.265, AC-ELISA 呈现弱阳性反应, 由于在每一酶标孔中加 100μL, 因 此, 检测含 DPV 的 DEF 培养液中病毒蛋白最低含量为 16ng。
表 6AC-ELISA 敏感性试验结果
3.2.6 重复性试验结果
(1) 批内重复性测定试验 : 取 3 份不同时间收集到的含 DPV 的 DEF 培养液, 按最佳 稀释度稀释, 加到抗原包被孔中, 每份样品做 3 次重复 ELISA 测定。由每份样品的 OD450nm 值 计算出平均 OD450nm 值 (X) 与标准方差 (SD), 进而计算出每份样品批内变异系数 [CV = (SD/ X)×100% ] ; (2) 批间重复性测定试验 : 在其它条件相同的情况下, 用 3 份不同批次制备的 纯化的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体包被酶标板, 对 3 份不同时间收集到的含 DPV 的 DEF 培养液 进行检测。由每份样品的 OD450nm 值计算出平均 OD450nm 值 (X) 与 SD, 进而计算出每份样品的 批间变异系数。
经统计学分析, 3 份不同时间收集到的含 DPV 的 DEF 培养液之间批内重复试验 OD450nm 值的变异系数 (CV) 为 0.81%~ 1.68%, 小于 5% ; 3 份不同时间收集到的含 DPV 的
DEF 培养液的 3 次批间重复试验 OD450nm 值的 CV 为 0.99%~ 2.82%, 小于 5% ( 表 7)。表明 建立的 AC-ELISA 方法具有很好的批内及批间重复性。
表 7 重复性试验结果
4 讨论
本实施例建立的 AC-ELISA 法应用了双抗体夹心法的工作原理, 此法是检测抗原 的常规方法, 具有较强的特异性, 非常适合于检验各种大分子抗原。传统方法中的 2 种抗体 是用病毒免疫不同种属动物制备得到的, 而本实施例中的 2 种抗体则是用重组 UL51 蛋白免 疫不同种属动物制备得到的。
就基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法而言, 对人工感染 DPV 鸭的检测结 果表明, 基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法的阳性率为 100% ; 并且, 本方法与常规 PCR 方法检测鸭瘟病毒的结果符合率为 100%。然而, 其中的 PCR 检测方法的 DNA 模板的制 备过程非常复杂, 而且很容易造成污染, 导致结果为假阳性。基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法对 DPV 的最小检出量为 16ng/mL, 敏感度高。在检测鸭瘟病毒时若能同时运用 基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 和其它方法, 相互辅助, 将会为临床 DPV 检测带来了 很大的方便。
最后说明的是, 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制, 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述, 但本领域的普通技术人员应当理解, 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变, 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
背景技术 鸭瘟 (Duck plague, DP), 又称鸭病毒性肠炎 (Duck viral enteritis, DVE), 是鸭、 鹅、 天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病, 其致病特征是血管损伤、 组织出血、 消化 道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡, 对野生水禽也有不同的致 死率。DP 的病原为 DPV(Duck plague virus, DPV), DPV 是一种泛嗜性全身性感染的病毒, 目前大多数学者把其暂时列为 α 疱疹病毒亚科, 但尚未分属。目前, 已报道的 DPV 检测方 法有病毒分离鉴定、 聚合酶链式反应 (PCR)、 荧光实时定量 PCR、 间接免疫酶组化法、 间接免 疫荧光法、 电镜观察、 原位杂交、 间接原位 PCR 法、 血清中和试验 (SNT)、 琼脂凝胶扩散试验、 酶联免疫吸附试验 (ELISA)、 反向被动血凝试验、 微量固相放射免疫测定法、 生物素标记寡 核苷酸探针原位检测、 地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等, 这些方法各有特点。 但是, 传统的病毒分离鉴定方法大约需 4 ~ 5d, 且方法繁琐, 费时费力。一些免疫学方法以 及 PCR 方法也往往需要特殊的仪器、 设备以及熟练的技术人员。此外, 许多血清学检测方法 都是基于纯化的 DPV 全病毒产生的抗体来检测 DPV, 由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病 毒中会掺杂有许多宿主细胞成分, 而导致许多假阳性结果出现。
ELISA 方法是免疫学检验中最重要、 也是最常用的方法, 目前, 应用抗原捕获 ELISA(AC-ELISA) 方法对病毒进行检测的研究已有许多报道。 在检测 DPV 方法中, 贾仁勇在 《鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和 UL24 基因的发现、 原核表达及应用研究》 中公开了已有 基于 UL24 重组蛋白抗体的 AC-ELISA 的报道, 该方法用兔抗 UL24 重组蛋白多克隆抗体包被 酶标板, 以鸭抗重组 UL24 蛋白多克隆抗体作为抗原捕获抗体, 建立了敏感性、 特异性、 重复 性好的 DPV 抗原捕获 ELISA 检测方法。UL51 蛋白为鸭瘟病毒的一种皮层蛋白, 具有良好的 免疫原性和反应原性, 用抗重组 UL51 蛋白多克隆抗体建立检测 DPV 的 AC-ELISA 方法至今 无报道。
发明内容 有鉴于此, 本发明的目的在于提供一种基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗 原检测方法, 该方法特异性和敏感性高的鸭瘟病毒抗原检测方法, 其能捕获 16ng/mL 鸭瘟 病毒抗原。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为 :
基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获 ELISA 法, 具体步骤为 :
a 固相抗体的制备 : 将浓度大于或等于 12.5μg/mL 的 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 与固相载体连结, 用封闭液封闭, 洗涤去除未结合的抗体及杂质, 得固相抗体 ;
b 加待测样品 : 将待测样品与步骤 a 所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质, 得抗
原 -A 抗复合物 ;
c 与 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 反应 : 将浓度大于或等于 25μg/mL 的 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 与步骤 b 所得抗原 -A 抗复合物保温反应并洗涤去杂质, 得抗原 -A 抗 -B 抗复合物 ;
d 与酶标抗体反应 : 将酶标抗体作体积小于或等于 2000 倍的稀释, 得酶标抗体稀 释液, 将酶标抗体稀释液与步骤 c 所得抗原 -A 抗 -B 抗复合物保温反应, 得抗原 -A 抗 -B 抗 复合物 - 酶标抗体复合物 ;
e 显色 : 在步骤 d 所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后, 加入终止液终 止反应得显色样品液 ;
f 检测及结果判定 : 将步骤 e 所得显色样品液用酶标仪测定 OD450nm 值, 当 OD450nm 值 > 0.265 时判为阳性, 当 OD450nm ≤ 0.265 时判为阴性。
步骤 a 所述的 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 中 A 为免疫学研究中常规实验动物中 除鸭外的任一种动物, 步骤 c 所述的 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 中 B 为免疫学研究中常规 实验动物中除 A 外的任一种动物, 步骤 d 中所述酶标抗体为 HRP 标记的免疫学研究中常规 实验动物中除 A 和 B 外的动物抗 B IgG。
进一步, 所述的基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获 ELISA 法, 具体步 骤为 :
a 固相抗体的制备 : 将浓度等于 12.5μg/mL 的 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 与固 相载体连结, 用封闭液封闭, 洗涤去除未结合的抗体及杂质, 得固相抗体 ;
b 加待测样品 : 将待测样品与步骤 a 所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质, 得抗 原 -A 抗复合物 ;
c 与 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 反应 : 将浓度等于 25μg/mL 的 B 抗重组 UL51 蛋 白抗体 IgG 与步骤 b 所得抗原 -A 抗复合物保温反应并洗涤去杂质, 得抗原 -A 抗 -B 抗复合 物;
d 与酶标抗体反应 : 将酶标抗体作体积等于 2000 倍的稀释, 得酶标抗体稀释液, 将酶标抗体稀释液与步骤 c 所得抗原 -A 抗 -B 抗复合物保温反应, 得抗原 -A 抗 -B 抗复合 物 - 酶标抗体复合物 ;
e 显色 : 在步骤 d 所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后, 加入终止液终 止反应得显色样品液 ;
f 检测及结果判定 : 将步骤 e 所得显色样品液用酶标仪测定 OD450nm 值, 当 OD450nm 值 > 0.265 时判为阳性, 当 OD450nm ≤ 0.265 时判为阴性。
进一步, 步骤 a 中所述 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG、 步骤 b 中所述待测样品、 步骤 c 中所述 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 及步骤 d 中酶标抗体稀释液的加入量为等体积 ;
进一步, 步骤 a 中所述 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG、 步骤 b 中所述待测样品、 步骤 c 中所述 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 及步骤 d 中酶标抗体稀释液的加入量为 100 ~ 200μl ;
进一步, 步骤 a 中所述 A 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 为鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG, 步骤 c 中所述 B 抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 为兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG, 步骤 d 中所述酶 标抗体为羊抗兔 IgG-HRP ;
进一步, 步骤 d 中所述色原底物为四甲基联苯胺 ;进一步, 步骤 e 中避光显色的时间为 20 分钟 ;
进一步, 所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。
本发明的有益效果在于 : 本发明基于抗重组 UL51 蛋白抗体建立的抗原捕获 ELISA(AC-ELISA) 法, 其特异性好, 可以检测阳性 DPV( 鸭瘟病毒 ) 细胞培养液及临床采 集样品泄殖腔棉拭纸中的 DPV 抗原, 而检测含 DHV 的鸭胚尿囊液、 含 RA 的菌体培养液和 含 E.coli 菌体培养液等结果均为阴性 ; 该方法批内和批间重复试验显示变异系数分别为 0.81%~ 1.68%和 0.99%~ 2.82%, 小于 5%, 能检出 16ng/mL 病毒抗原。 附图说明
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述, 其中 :
图 1-A 为 DPV UL51 基因的 PCR 扩增 : M 指 DL2000 相对分子质量标准, 1 指以正常 DEF 基因组 DNA 为模板的 PCR 扩增产物, 2 指以 DPV CHv 毒株基因组 DNA 为模板的 PCR 扩 增产物 ( 箭头所示的是其分子量大小, 约为 760bp) ; 图 1-B 为重组质粒 pMD18-UL51 的双 酶切鉴定 : M 指相对分子质量标准 III, 1 指重组质粒 pMD18-UL51 用 EcoR I 和 Xho I 双酶 切得到的两个片段 ( 箭头所示小片段的分子量大小约为 760bp) ; 图 1-C 为重组表达载体 pET28a-UL51 的双酶切鉴定 : M 指相对分子质量标准 III, 1 指重组表达载体 pET28a-UL51, 2 指重组表达载体 pET28a-UL51 用 EcoR I 和 Xho I 双酶切得到的两个片段 ( 箭头所示小片 段的分子量大小约为 760bp)。 图 2-A 为重组表达蛋白的 SDS-PAGE 鉴定 : M 为蛋白质相对分子质量标准, 1 为阴性 对照 ( 未加 IPTG 诱导 ), 2 为 IPTG 诱导 ( 箭头所示的蛋白质分子量大小约为 34KD) ; 图 2-B 为诱导剂 IPTG 不同终浓度诱导表达结果 : 1-7 的 IPTG 浓度分别为 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 和 1.2mmol/L ; 图 2-C 为不同温度诱导 pET28a-UL51 表达结果 : 1-3 的温度分别为 20、 30 和 37℃; 图 2-D 为不同时间诱导 pET28a-UL51 表达结果 : 1-7 的诱导时间分别为 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 和 8h。
图 3-A 为重组 UL51 蛋白纯化产物的 SDS-PAGE 分析 : M 为蛋白质分子量, 1 为 IPTG 诱导的 1ml 菌液, 2 为粗提的 UL51 蛋白包涵体, 3 为 50mM 咪唑洗脱峰 ( 不含纯化的重组 UL51 蛋白 ) ; 4 为 300mM 咪唑洗脱峰 ( 含有纯化的重组 UL51 蛋白 ) ; 图 3-B 为纯化的兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的 SDS-PAGE 分析 : M 指标准蛋白质分子量, 1 指过柱纯化的兔抗 UL51 蛋 白抗体 IgG。
图 4 为琼脂糖凝胶扩散试验检测兔抗重组 UL51 蛋白高免血清效价测定。
图 5 为纯化的抗重组 UL51 蛋白抗体的 SDS-PAGE 分析 : M. 标准蛋白质分子量 (KD) ; 1. 过柱纯化兔抗 UL51 蛋白抗体 IgG ; 2. 过柱纯化鼠抗 UL51 蛋白抗体 IgG。
图 6 为本方法的特异性试验结果照片图。
图 7 为本方法的敏感性试验结果照片图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下面结合附图对本发明的优选 实施例进行详细的描述。本实施例中将所述重组 UL51 蛋白的获得是通过构建原核表达质粒 pET28a-UL51、 转化表达菌并发酵培养, 收集到大量的含有重组 UL51 蛋白的菌体沉淀, 再 通过超声波破碎菌体、 重组 UL51 蛋白包涵体冼涤、 纯化及梯度透析而获得的 ; 用所述重组 UL51 蛋白对兔和鼠进行常规免疫程序和纯化, 获得兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和鼠抗重 组 UL51 蛋白抗体 IgG ; 进一步确定了兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和鼠抗重组 UL51 蛋白抗 体 IgG 的最佳浓度范围及酶标抗体最适浓度及阴阳性临界值的确定, 制定了一种特异性和 敏感性高的鸭瘟病毒抗原检测方法, 其能捕获 16ng/mL 鸭瘟病毒抗原。
实施例基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获 ELISA 检测方法
一鸭瘟病毒 UL51 基因的克隆、 原核表达及 UL51 蛋白的纯化
1 材料准备
1.1 菌株、 质粒和毒株
质粒 pMD18-T, 购自大连宝生物工程有限公司 ; 原核表达质粒 pET28a(+), Novagen 公司产品 ; 克隆宿主菌 E.coli DH5a、 表达宿主菌 E.coli BL21(DE3) 和 DPV CHv 强毒株, 由 四川农业大学禽病研究中心提供。
1.2 试验动物
10 日龄鸭胚, 其种鸭 DPV 和抗体均为阴性 ; 健康雄性白兔 4 只, 体重 2-3kg/ 只, 购 自雅安某兔场 ; 健康 Vista 大鼠 20 只, 购自四川大学。 2 实验方法
2.1DPV UL51 基因的克隆
2.1.1 引物设计
利用 Primer Premier5.0 软件, 参考 UL51 基因序列 (GenBank 登录号 : DQ072725), 由宝生物生物技术有限公司合成。引物 DPV-UL51F :
5’ -CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3’ ( 划 线 部 分 为 EcoRI 位 点 ) ; 引物 DPV-UL51R : 5’ -TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’ ( 划线部分为 XhoI 位点 )。合成后, 以适 量灭菌去离子水溶解, 使其终浓度为 20mmol/L, -20℃保存备用。
2.1.2DPV 基因组 DNA 的提取
a、 正常鸭胚成纤维细胞 (DEF) 的制作方法 : 取 10d 日龄健康鸭胚, 分别用 5%碘酒 和 75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用 PBS 将胚体洗净, 剪去头、 翅、 腿和内脏, PBS 冲洗后将胚体剪成 1mm 大小的小块, 加 PBS 适量, 之后置于三角瓶内, 加细胞 分散剂 (2.5%胰蛋白酶 )150μl/ 胚, 于 37℃水浴中消化 3min。立即将细胞悬液以 4000r/ min 离心 5min, 倾弃上清, 细胞沉淀用适量的 MEM 悬浮后, 用 5 层纱布过滤, 向滤液中加入 10%小牛血清和 100IU/mL 双抗后, 分装于 100mL 细胞培养瓶中, 7mL/ 瓶, 水平静置于 37℃ 细胞培养箱中进行培养。
b、 DPV 增殖 : 取刚刚长成致密单层的 DEF, 弃生长营养液, 用灭菌 PBS 清洗细胞表面 2 次后, 加入 DPV 病毒液 2 ~ 3mL 覆盖细胞表面进行吸附, 37℃吸附 120min 后弃病毒液, 然 后加含 3%小牛血清和 100IU/mL 双抗的 MEM 维持营养液, 之后 37℃培养。同时做未接毒的 DEF 对照。
c、 DNA 提取方法 : 直接从感染细胞中提取 DPV 基因组 DNA 的具体步骤如下 : (1) 选 取用 DPV 种毒感染后细胞病变 (CPE) 达 60 %~ 70 %的 DEF(100mL 细胞瓶 ) ; 同时选取细 胞形态正常的 DEF 作对照 ; (2) 倾去细胞培养液, 加入 500μL 的细胞裂解液, 同时加蛋白酶
K(10mg/mL) 至终浓度为 200μg/mL, 轻轻混匀后, 37 ℃孵育 10min ; (3) 将细胞悬浮液倒入 EP 离心管中, 并用 500μL 的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物, 倒入离心管中 ; (4) 用饱 和酚 : 氯仿及氯仿抽提 2 次, 再用水饱和乙醚处理 2 次 ; (5) 加 1/10 倍体积 3mol/LNaAC, 混 匀后, 加入 2 倍体积冷无水乙醇, -20℃放置 30 ~ 60min ; (6)13000r/min 离心 20min, 沉淀 用预冷的 70%乙醇洗涤两次 ; (7) 真空抽干后, 溶于适量 TE 缓冲液中, 加入 1μL RNA 酶, 37℃作用 30min, -20℃保存备用。
2.1.3PCR 扩增 DPV UL51 基因
PCR 反应体系为 :
轻轻混匀, 2000r/min 瞬时离心后进行 PCR。
反应参数 : 95℃预变性 5min, 95℃变性 1min, 56℃退火 1min, 72℃延伸 1min, 循环 40 次, 最后 72℃延伸 10min, 于 4℃保存备用。取 4μL PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳, 设 DL2000 和空白对照, 观察扩增片段的长度。
2.1.4UL51 基因 PCR 产物的回收
按北京赛百盛基因技术有限公司 DNA 回收试剂盒说明书进行, 回收后的 DNA 贮存 于 -20℃保存备用。
2.1.5 纯化的 UL51 基因与 pMD18-T 的连接
连接反应体系如下 :
将上述试剂加入 0.2mL 的 EP 管中, 小心混匀, 瞬时离心后, 于 16℃连接过夜。
2.1.6DH5a 感受态细胞的制备
采用氯化钙法制备新鲜的 DH5a 株大肠杆菌感受态细胞, 简述如下 : (1) 无菌挑取 平板上新鲜培养的 DH5a 单克隆菌落接种于 5mL LB 培养液中, 于 37℃振荡培养过夜 ; (2) 取 1mL 上述培养液接种于 100mL LB 培养液中, 37℃ 200r/min 振荡培养 2.5 ~ 3h, 使 OD600 = 0.5 左右 ; (3) 将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中, 冰浴 10min ; (4) 于 4 ℃ 4000r/ min 离心 8min, 弃上清 ; (5) 加 10mL 冰预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2, 温和悬起细菌沉淀, 冰浴
30min ; (6) 于 4 ℃ 4000r/min 离心 8min, 弃上清, 加 4mL 冰预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 再次 重悬沉淀, 加入终浓度为 15 %的灭菌甘油, 混匀后分装为 200μL/ 管, 直接用于转化或置 于 -70℃冰箱中保存备用。
2.1.7 转化感受态细胞
将 10μL 连接体系全部取出加到 200μL DH5a 感受态细胞中, 冰浴 30min ; 再置于 42℃温浴 90s, 之后再冰浴 2min ; 然后立即加入 0.8mL LB 培养基, 37℃水浴振荡培养 45min, 取 200μL 涂于含 (X-gal/IPTG/Kan) 的培养基上, 置 37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单 个白色菌落接种于 5mL LB( 含 50μg/mL Kan) 中, 37℃水浴振荡培养 18h 后进行质粒抽提。
2.1.8 质粒的抽提
按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行, 回收产物贮存 于 -20℃保存备用。
2.1.9 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定
将上一步抽提的重组质粒命名为 pMD18-UL51, 分别以 EcoR I/XhoI 双酶切消化与 Xho I 单酶切消化, 1.0%凝胶电泳观察结果。同时做 PCR 扩增目的基因。
2.1.10UL51 基因序列测定
将鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。
2.2 原核表达质粒 pET28a-UL51 的构建、 诱导表达与表达条件优化
2.2.1 原核表达质粒 pET28a-UL51 的构建与鉴定
a 目的片段的酶切与连接 : 限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I 分别双酶切 pMD18-UL51 质粒和原核表达载体 pET28a(+), 酶切体系均为 :
37℃水浴 4h, 按 DNA 回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后, 按照下列连接体 系 16℃连接过夜。
b 重组质粒的转化 : 采用氯化钙法制备 DH5a 感受态细胞。 之后, 取连接液 15μL 加 到含 200μL 感受态 DH5a 的离心管中, 混匀后冰浴 30min ; 置于 42℃水浴 90sec, 然后迅速 冰浴 2min ; 加入不含 Kan 的 LB 液体培养基 800μL, 37℃振摇 (150r/min) 培养 1 ~ 1.5h ; 取 200μL 培养物涂布于含 100μg/mL Kan 的 LB 平板, 37℃培养过夜, 次日挑取单个菌落接 种于 5mL 的 LB 液体培养基中, 37℃培养 12 ~ 16h, 同时设立空载体转化组 ( 空载体 10μL+ 感受态 DH5a 200μL)、 无载体对照组 ( 灭菌超纯水 10μL+ 感受态 DH5a 200μL)。
c 重组质粒的酶切和 PCR 鉴定 : 将上述保存的克隆菌种接种于 5mL 的 LB 液体培养 基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃水浴振摇培养过夜, 次日按常规方法提取重组质粒, 然后用 XhoI 单酶切、 EcoR I 和 Xho I 双酶切鉴定该重组质粒, 其酶切体系如下 :
然后, 以重组质粒为模板, 利用方法 2.1.1 中的引物进行 PCR 反应, 其方法和扩增 条件同上, 取 PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和 PCR 鉴定, 获得重组原核 表达质粒 pET28a-UL51。
2.2.2 重组表达质粒 pET28a-UL51 的诱导表达
a 重组质粒 pET28a-UL51 的提取 : 挑取已鉴定含阳性重组质粒 pET28a-UL51 的 DH5a 菌种划线接种于含 Kan 50g/mL 的 LB 琼脂平板上, 37℃培养过夜, 次日取单个菌落接 种于 5mLLB 液体培养基上, 剧烈振荡培养 10 ~ 16h, 离心收集菌液, 按 UltraPureTM 质粒 DNA 小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。
b 重组质粒 pET28a-UL51 转化表达菌 : 采用氯化钙法制备 E.coli BL(DE3) 感受态 细胞, 并将上述提取的重组质粒 pET28a-UL51 转化到表达宿主菌 E.coli BL(DE3) 中。
c 重组质粒 pET28a-UL51 的诱导表达 : 从上述 LB 固体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 上, 挑取阳性克隆菌, 接种 LB 液体培养基, 37℃培养过夜, 次日取菌液按 1 ∶ 50 的比例接入 5mLLB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 剧烈振荡培养至 OD600 = 0.4 时, 分别加入 IPTG 至终浓度为 1.0mmol/L, 诱导 3h 后, 收集 1mL 培养菌液, 4℃ 13000r/min 离心 2min, 弃上清, 沉淀中加入 80μL 超纯水和 20μL 5×SDS 上样缓冲液, 100℃水浴加热变性 5 ~ 10min, 进 行 12% SDS-PAGE 凝胶电泳, 观察表达结果。
d 重组质粒 pET28a-UL51 表达产物的可溶性分析 : 将诱导表达的 100mL 菌液和 未诱导表达的 100mL 菌液, 分别按下步骤处理 : 4 ℃, 10000r/min 离心 5min, 菌体沉淀用 20mL 20mmolTris-HCl(pH8.0) 悬浮 ; 置 -20℃过夜后, 加溶菌酶至终浓度为 1mg/mL, 4℃搅 拌 30min, 超声波 ( 冰浴 ) 间歇破碎菌体 (600w, 30sec/ 次, 10 次 ), 4 ℃, 10000r/min 离心 10min, 取上清备用① ; 沉淀用 10mL 洗液 (10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +0.2% Triton X-100) 悬浮, 4℃, 10000r/min 离心 10min 后, 沉淀再次用 10mL 洗液悬浮, 重复洗涤三次后, 用适量 尿素溶液 (10mmol/L PBS+8mol/L 尿素 ) 溶解沉淀②, 低温保存备用。分别取适量的上清① 和尿素溶液溶解的沉淀②, 向其中加入 80μL 超纯水和 20μL 5×SDS 上样缓冲液, 100℃水 浴加热变性 5 ~ 10min, 进行 12% SDS-PAGE 凝胶电泳, 将凝胶用考马斯亮蓝染色后, 观察结 果。 并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和 Quantity One 软件分析诱导菌液 中重组蛋白在胞浆 ( 上清①, 可溶性 ) 和沉淀中 ( 沉淀②, 包涵体形式 ) 的相对百分含量。
2.2.3 重组质粒 pET28a-UL51 表达条件的优化
a 诱导剂 IPTG 的浓度优化 : 取含重组质粒 pET28a-UL51 的表达宿主菌 BL21(DE3), 接种 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃振摇培养过夜。次日按 1 ∶ 50 转接 种于 5mLLB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃培养培养至 OD600 值约 0.4 时, 取其中 7 只试管, 分别加入 IPTG 至终浓度为 0mmol/L、 0.2mmol/L、 0.4mmol/L、 0.6mmol/L、 0.8mmol/ L、 1.0mmol/L、 1.2mmol/L 37℃诱导培养 4h 后, 按上述方法对样品进行处理, 12% SDS-PAGE 电泳, 观察结果。
b 温度条件优化 : 取含重组质粒 pET28a-UL51 的表达宿主菌 BL21(DE3), 接种 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃振摇培养过夜。 次日按 1 ∶ 50 转接种于 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 中, 37℃培养培养至 OD600 值约 0.4 时, 取其中 3 只试管, 分 别加入 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/L, 分别置于 20℃、 30℃、 37℃诱导培养 4h, 按上述常规方 法对样品进行处理, 12% SDS-PAGE 电泳, 观察结果。
c 诱导时间优化 : 取含重组质粒 pET28a-UL51 的表达宿主菌 BL21(DE3), 接种 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 上, 37℃振摇培养过夜。次日按 1 ∶ 50 转接种于 5mL LB 液体培养基 ( 含 Kan 50μg/mL) 上, 继续培养至 OD600 值约 0.4 时, 加入 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/L, 37℃诱导培养, 分别于诱导后 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8h, 吸取 1mL 培养液, 按上述方 法对样品进行处理, 12% SDS-PAGE 电泳, 观察结果。
2.3 重组 UL51 蛋白的大量制备、 纯化与复性
2.3.1 重组 UL51 蛋白的大量制备 ( 包涵体处理 )
将 诱 导 表 达 1000mL 菌 液, 4 ℃、 10000r/min 离 心 10min,将 菌 体 沉 淀 用 40mL20mmolTris-HCl(pH8.0) 悬浮 ; 置 -20℃过夜后按 1mg/mL 加溶菌酶, 4℃搅拌 30min, 超 声波 ( 冰浴 ) 间歇破碎菌体 (200w, 30sec/ 次, 5 ~ 10 次 ), 4℃、 10000r/min 离心 10min。将 沉淀用 20mL 洗液 (10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +0.2% Triton X-100 悬浮, 4℃、 10000r/min 离心 10min 后, 用适量尿素溶液 (10mmol/L PBS+8mol/L 尿素 ) 溶解沉淀, 4℃保存备用。
2.3.2 重组 UL51 蛋白的纯化
镍琼脂糖凝胶 (Ni2+-NAT) 亲和层析纯化重组 UL51 蛋白 : 根据融合蛋白的 6-His 标 签对镍离子特殊的亲和作用, 使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼脂糖凝胶上, 改变洗 脱液的条件将其洗脱, 而达到纯化的目的。 具体操作步骤为 : (1) 装柱 : 镍琼脂糖凝胶装柱,柱床体积约为 40mL ; (2) 平衡 : 用平衡缓冲液 I 约 5 个床体积平衡层析柱, 流速为 1mL/min ; (3) 上样 : 将 0.45μm 滤膜过滤的可溶性包涵体样品约 5mL, 加入层析柱中, 流速为 0.5mL/ min ; (4) 洗涤 : 用平衡缓冲液 II 再洗 2-5 个床体积, 流速为 1mL/min ; (5) 洗脱 : 分别用含 50、 300、 500mmol 咪唑的洗脱缓冲液 III 进行梯度洗脱, 流速为 1mL/min, 收集各梯度的洗脱 峰, 用 SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度 ; (4) 清洗 : 用超纯水洗 5 个柱床体积, 再用 25%的乙醇洗 3 个柱床体积, 流速为 1mL/min, 回收镍琼脂糖凝胶柱, 于 4℃中保存。
2.3.3 重组 UL51 蛋白的复性
将过柱纯化的重组 UL51 蛋白, 于 4℃在不同浓度的尿素溶液 (6、 4、 3、 2、 1、 0mol/L) 中梯度透析, 使变性蛋白逐渐复性, 并用 Bradford 法测定蛋白的最终浓度, 分装后备用。
3 实验结果
3.1DPV UL51 基因的扩增、 T- 克隆与鉴定结果
3.1.1UL51 基因的 PCR 扩增结果
以 DPV CHv 毒株基因组 DNA 为模板对 UL51 基因进行 PCR 扩增, 其产物经 1.0%琼 脂糖凝胶电泳, 获得了一条约 760bp 的特异性 DNA 条带, 而以正常 DEF 基因组 DNA 为模板进 行 PCR 扩增, 无特异性条带, 这与预期结果一致 ( 图 1-A)。 3.1.2UL51 基因 T 克隆鉴定结果
PCR 产物经胶回收纯化后, 与 pMD18-T 载体连接并转化感受态细胞 DH5α, 得到的 T 克隆命名为 pMD18-UL51。对 pMD18-UL51 进行 PCR、 酶切 ( 图 1-B : 重组质粒 pMD18-UL51 用 EcoR I 和 Xho I 双酶切得到的两个片段 ( 箭头所示小片段的分子量大小约为 760bp) 和测 序鉴定, 结果表明, T 克隆获得的 UL51 基因序列同已知的 DPV UL51 基因序列完全一致。
3.2 原核表达质粒 pET28a-UL51 的构建与鉴定、 诱导表达及其优化结果
3.2.1 重组表达质粒 pET28a-UL51 的构建与酶切鉴定
以 EcoR I 和 Xho I 双 酶 切 T 克 隆 质 粒 后 回 收 目 的 片 断, 与经相同酶切的 pET-28a(+) 表达载体连接, 转化 DH5α, 得到重组表达质粒 pET28a-UL51, 该理论大小约为 6130bp, 经 EcoR I 和 Xho I 双酶切后得到的两条片断的大小分别约为 5370bp 和 760bp( 见 图 1-C), 与理论值相符, 表明原核表达载体被成功构建。
3.2.2 重组质粒 pET28a-UL51 的诱导表达
a 重组质粒 pET28a-UL51 的诱导表达将重组质粒 pET28a-UL51 转化表达 : 菌株 BL21(DE3), 在含 Kan 的 LB 琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒 pET28a-UL51 的 表达宿主菌 BL21(DE3) 用 IPTG 进行诱导表达、 未用 IPTG 诱导、 空载体 pET-28a(+) 转化菌 株诱导表达, 结果表明 : 空载体 pET-28a(+) 转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋 白条带 ; 重组表达质粒 pET28a-UL51 表达的重组 UL51 蛋白在 34KD 处 ( 图 2-A)。
b 重组质粒 pET28a-UL51 表达产物的可溶性分析 : 诱导表达的 100mL 菌液经可溶 性分析处理后, 电泳结果显示 : 表达蛋白主要存在于沉淀中, 说明重组表达蛋白在菌体中大 量以不溶的包涵体形式存在。 同时 Quantity One 软件分析显示 : 诱导菌液中重组蛋白在胞 浆上清 ( 可溶性 ) 和沉淀中 ( 包涵体形式 ) 的相对百分含量分别为 6.72%和 93.28%。
3.2.3 重组质粒 pET28a-UL51 表达条件的优化
a IPTG 浓 度 的 优 化 : 在 37 ℃ 条 件 下, 加 入 IPTG 使 其 终 浓 度 分 别 为 0mmol/L、 0.2mmol/L、 0.4mmol/L、 0.6mmol/L、 0.8mmol/L、 1.0mmol/L、 1.2mmol/L 诱导培养 4h, 结果显
示: 未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带 ; 随 IPTG 浓度的增高, 蛋白诱导量逐渐增加, 当 增加到 0.8mmol/L 蛋白表达量达到最大 ; 其后再增大 IPTG 浓度到 1.0mmol/ 和 1.2mmol/L 时, 其蛋白表达量与 0.8mmol/L 时没有明显差别 ( 图 2-B)。 因此, 可选择 0.8mmol/L 的 IPTG 浓度作为诱导表达浓度。
b 诱导温度条件的优化 : 37℃培养培养至 OD600 值约 0.4 时, 取 3 只灭菌试管, 分装 5mL/ 管, 分别加入 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/L, 分别置于 20℃、 30℃、 37℃诱导培养 4h, 结 果: 温度在 20℃时, 诱导蛋白量较少, 37℃时最高 ( 图 2-C), 说明随着温度升高, 蛋白诱导量 逐渐增加。因此, 选择温度 37℃为最佳诱导温度。
c 诱导时间的优化 : 在 IPTG 浓度为 0.8mmol/L, 37℃条件下, 采用 1 ~ 8h 不同诱导 时间进行诱导表达, 结果 1h 时几乎无特异的蛋白条带产生 ; 诱导 1 ~ 3h 的重组蛋白表达量 均低于 4h 诱导组 ; 诱导 5 ~ 8h, 其重组蛋白表达量同 4h 相比无明显变化 ( 图 2-D)。因此, 选择 4h 作为最佳诱导时间。
3.3 重组 UL51 蛋白的纯化结果
表达产物经过溶菌酶裂解、 超声波破碎、 尿素洗涤等一系列前处理后, 镍琼脂糖凝 胶亲和层析纯化重组 UL51 蛋白。 UL51 蛋白样品过柱纯化后的 UV 曲线图显示出 3 个峰, 峰1 为穿透峰, 峰 2 为 50mmol 咪唑洗脱峰, 峰 3 为 300mmol 咪唑洗脱峰。 同时收集不同浓度咪唑 洗脱峰, 进行 SDS-PAGE 电泳, 检验纯度及浓度, 结果显示 : 只有 300mmol 咪唑洗脱峰中含有 大量高纯度的重组 UL51 蛋白 ( 图 3-A)。将纯化的重组 UL51 蛋白透析复性后, 用 Bradford 法测定蛋白的终浓度, 并将其稀释为 1mg/mL, 分装后备用。
二基于抗重组 UL51 蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原检测方法
1 抗重组 UL51 蛋白多克隆抗体的制备和纯化
1.1 弗氏佐剂
a 弗氏不完全佐剂 : 液体石蜡油 3 份, 羊毛脂 1 份, 混合均匀, 115℃, 15min 高压灭 菌后得弗氏不完全佐剂。使用前加热融化, 冷却至 50℃左右, 加抗原进行乳化处理 ; b 弗氏 完全佐剂 : 在上述基础上添加卡介苗至终浓度 1mg/mL 即可, 使用时将抗原溶液与其等量混 合, 充分乳化。
1.2 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的制备和纯化
1.2.1 兔抗重组 UL51 蛋白抗体的制备 ( 重复进行三次此试验, 每次间隔 1 周, 以制 备三个不同批次的抗体 )
a 免疫原的制备 : 将纯化并复性后的重组 UL51 蛋白, 首免与等量完全弗氏佐剂混 合并充分乳化, 第二、 三免与不完全弗氏佐剂混合并充分乳化, 第四免不加佐剂。
b 免疫程序 : 选择健康雄兔 4 只, 首免前一天分别采血, 分离血清作为阴性对照。 制 备兔抗 UL51 高免血清免疫程序如下表 :
四免后 14d 颈动脉放血, 收集血液。37℃放置 1h, 4℃冰箱过夜。第二天析出血清, 血凝块以 4000r/min 离心 15min 再次收集血清, -20℃保存备用。
按双向琼扩法, 用 100mL 0.85% NaCl 溶液溶解 1g 琼脂糖, 115℃高压灭菌 10min 后, 倒入培养皿中, 制成 4mm 后的凝胶板。用打孔器在凝胶板上打孔, 将倍比稀释的血清 (1 ∶ 2、 1 ∶ 4、 1 ∶ 8、 1 ∶ 16、 1 ∶ 32) 和阴性兔血清分别滴于梅花形外周孔内, 中间孔滴 加纯化的重组 UL51 蛋白或 DPV, 37℃湿盒孵育 24 ~ 48h, 观察琼扩结果。结果显示, 1 ∶ 2、 1 ∶ 4、 1 ∶ 8、 1 ∶ 16 和 1 ∶ 32 均出现清晰可见的琼扩沉淀线, 而阴性兔血清无沉淀线 ( 图 4), 这表明重组 UL51 蛋白, 具有较好的抗原性并能与 DPV 反应。本实施例中的稀释均按体 积比稀释方式进行。
1.2.2 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的纯化
a 正辛酸 - 硫酸铵法粗提兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG : 粗提兔抗重组 UL51 蛋白 抗体 IgG, 步骤如下 : (1) 取分离的 10mL 血清加入等量的 0.06mol/LpH4.8 醋酸盐缓冲液, 混匀 ; (2) 室温搅拌下逐滴加入正辛酸 75μg/mL 血清, 室温搅拌 30min, 4℃静置> 3h, 使其 充分沉淀后, 13000r/min 离心 30min ; (3) 取上清用滤纸过滤, 向滤液中加入 1/10 体积的 10mmol/LpH7.4 的 PBS, 用 2mol/L NaOH 调节 pH = 7.4 ; (4) 冰浴下向液体中缓缓加入饱和 硫酸铵 0.277g/mL 使其终浓度达到 45%, 搅拌 30min, 置 4℃静置> 3h 或过夜, 13000r/min 离心 30min 弃上清液 ; (4) 按 1 ∶ 4 的比例向沉淀中加入 PBS, 充分吹打使其充分溶解 ; (5) 将溶解液装入透析袋中, 在 4℃下用 10mmol/L pH7.4PBS 透析, 每 6h 换液一次, 直至奈氏试 剂检测透析液中无沉淀产生为止。
b High Q 柱阴离子交换色谱法纯化兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG : 纯化抗体 IgG, 步骤如下 : (1) 样品前处理 : 将粗提 IgG 用 0.45μm 滤膜过滤去除杂质, 以缓冲液 A(pH8.0, 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液 ) 在 4 ℃条件下进行透析平衡过夜 ; (2) 色谱柱前处理 : 经过 0.5mol/LNaOH、 水洗、 1.0mol/LNaCl、 水洗等前处理, 且以缓冲液 A 平衡 HighQ 色谱柱 ; (3) 上样 : 取 5mL 的粗提 IgG 样品 ; (4) 清洗 : 用 50mL 缓冲液 A 平衡并洗下未结合的蛋白质和杂 质; (5) 洗脱 : 以缓冲液 B(1.0mol/L NaCl) 进行线性梯度离子强度洗脱, 流速 0.5mL/min, 洗 脱时间为 200min, 分部收集洗脱组分。
c 抗体 IgG 纯度和浓度测定 : 将收集到的洗脱峰样品处理后, 进行 SDS-PAGE 电泳 ( 图 3-B 和图 5), 测定抗体 IgG 的纯度, 并用 Bradford 法测定抗体 IgG 的最终浓度, 并将其 稀释为 2mg/mL, 分装后于 -20℃保存备用。
1.3 鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的制备和纯化 ( 重复进行三次此试验, 每次间隔 1 周, 以制备三个不同批次的抗体 )
具体包括 (1) 免疫原的制备 : 将纯化的重组 UL51 蛋白, 首免与等量完全弗氏佐剂
混合乳化充分, 第二、 三免与不完全弗氏佐剂混合乳化充分, 第四免不加佐剂。(2) 免疫程 序: 选择健康 Vista 大鼠 20 只, 首免前一天分别采血, 分离血清作阴性对照。制备鼠抗重组 UL51 蛋白高免血清免疫程序如表 1。四免后 14d 摘眼球放血, 收集血液。37℃放置 1h, 4℃ 冰箱过夜。第二天析出血清, 血凝块以 4000r/min 离心 15min 再次收集血清, -20℃保存备 用。(3) 双向琼扩法测定鼠抗重组 UL51 蛋白高免血清的效价为 1 ∶ 64。其它可参照兔抗 重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的制备和纯化。
表 1 鼠抗重组 UL51 蛋白多克隆抗体的免疫程序
鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的纯化 : 多克隆抗体的纯化参照兔抗纯化步骤, 将得 到的鼠抗重组 UL51 蛋白抗血清进行纯化, 用 Bradford 法测定抗体 IgG 的最终浓度, 并将其 稀释为 2mg/mL, 分装后于 -20℃保存备用。分别对纯化后的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 进行 SDS-PAGE 鉴定 ( 图 5), 结果表明该抗体 IgG 具有很高的 纯度。 用 Bradford 法测定两种抗体 IgG 的最终浓度, 并将其稀释为 2mg/mL, 分装后于 -20℃ 保存备用。本实施例中, 将所制备的两种重组 UL51 蛋白抗体的动物选为大鼠和兔, 也可选 用其他不同种属动物。
1.4 检测菌株、 毒株
正常鸭胚成纤维细胞 (DEF) 培养液、 含 DPV 强毒的 DEF 培养液、 含鸭病毒性肝 炎病毒 (Duck virus hepatitis, DHV) 的鸭胚尿囊液、 含鸭疫里默氏杆菌 (Riemerella anatipestifer, RA) 的菌体培养液和含鸭大肠杆菌 (E.coli) 的菌体培养液均由本实验室 提供。
1.5 其它试剂
ELISA 相关溶液 ; 辣根过氧化酶标记的羊抗兔 IgG( 羊抗兔 IgG-HRP) 和四甲基联 苯胺 (TMB) 均购自美国 KPL 公司 ; 其它常规试剂如 0.01mol/L 的 PBS 缓冲液 (pH7.2) 均按 常规方法配置。
2 实验方法
2.1 待测样品的获得
2.1.1 细胞培养液、 鸭胚尿囊液或菌体培养液的处理
将待检的液体样品进行以下裂解处理 : 向待检样品液中加入等体积的裂解液 [2% TritonX-100/PBS(0.01mol/L, PH = 7.2) 溶液 ] 作用 5min( 剧烈振荡 ), 12000r/min、 4℃离心 5min, 收集上清液, 得待测样品。
2.1.2 泄殖腔棉拭子样品的处理
泄殖腔棉拭子的处理方法如下 : 用无菌棉拭子擦试病鸭泄殖腔后, 放入盛有约
500μL 生理盐水的灭菌 EP 管中, 将 EP 管在旋涡振荡器上剧烈振荡 1 ~ 3min 后, 用无菌镊 子将棉拭子在 EP 管壁上反复挤压后取出, 余下的的液体按细胞培养液、 鸭胚尿囊液或菌体 培养液的方法处理后得待测样品。
3 基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法检测 DPV 抗原方法的建立
3.1 最佳鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 最佳浓度的 确定
采用方阵滴定法, 具体步骤如下 : (1) 将鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 用包被液倍 比稀释 (1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320、 1 ∶ 640), 包被酶标板, 100μL/ 孔, 置 4℃湿盒孵育过夜, 洗板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (2) 加入 100μL/ 孔封闭液, 37℃湿盒 封闭 1h, 洗板机洗涤 1 次, 5min/ 次, 拍干 ; (3) 加入待测样品, 100μL/ 孔, 37 ℃湿盒作用, 洗板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (4) 将兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 倍比稀释 (1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320、 1 ∶ 640), 加入酶标板中, 100μL/L, 37℃湿盒孵育 1h, 洗 板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (5) 加入 1 ∶ 2000 稀释的羊抗兔 IgG-HRP, 100μL/ 孔, 37℃ 反应 45min, 洗板机洗涤 3 次, 5min/ 次, 拍干 ; (6) 加入 TMB 底物 100μL/ 孔, 25℃避光显色 20min 后, 加入 50μL/ 孔 2mol/L 硫酸终止反应 ; (7) 检测 : 用酶标仪测 OD450nm 值。同时以 1%的 BSA/PBS 溶液作空白对照, 以 P/N 值最大的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的稀释度为最佳工作浓度。 分别将鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 作系列稀释, 进 行方阵试验, 结果见表 2。方阵滴定结果显示, 当鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 1 ∶ 160 倍稀 释, 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 以 1 ∶ 80 倍稀释时, OD450nm 值大于 1.0, 阴阳性血清 OD450nm 比值 (P/N) 最大。因此选择鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的最佳包被浓度为 1 ∶ 160, 即浓 度为 12.5μg/mL ; 兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 的最佳稀释倍数为 1 ∶ 80, 即最佳包被浓度 为 25μg/mL, 上述最佳包被浓度均为阈浓度, 在大于阈浓度时, 同样可以实现相同的作用, 但经济成本增加。
表 2 鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 最佳工作浓度的 确定
3.3.2 酶标抗体最适浓度的确定
以浓度为 12.5μg/mL 鼠抗重组 UL51 蛋白抗体浓度包被酶标板, 加入待测样品, 再 加入浓度为 25μg/mL 兔抗重组 UL51 蛋白抗体, 将酶标抗体做 1 ∶ 500、 1 ∶ 1000、 1 ∶ 2000、 1 ∶ 4000 系列稀释后进行 AC-ELISA 测定, 选择 P/N 值最大时的酶标抗体浓度作为最佳工作 浓度。
根据确定的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 和兔抗重组 UL51 蛋白抗体 IgG 最佳工作 浓度, 将酶标羊抗兔抗体 IgG 作不同的稀释, 进行 AC-ELISA 试验, 每个稀释度重复 3 次, 求 出样品的平均 P 值和 N 值, 确定酶标羊抗兔抗体 IgG 的最佳工作浓度。结果见表 3, 当酶标 羊抗兔抗体 IgG 作 1 ∶ 2000 稀释时, P/N 值最大为 7.113, 因此确定最佳酶标抗体稀释倍数 为 2000。其中 2000 为稀释倍数阈值, 当稀释倍数小于 2000 时, 同样可以实现相同的作用。
表 3 酶标抗体最佳工作浓度的确定
3.3.3 阴阳性临界值的确定
取 16 份 DPV 阴性鸭的泄殖腔棉拭子, 按照上述建立的基于抗重组 UL51 蛋白抗体 的 AC-ELISA 的方法检测, 同时以 1%的 BSA/PBS 溶液作空白对照。将 16 份棉拭子样品的 OD 值的平均值 (X) 和 3 倍标准方差 (SD) 之和作为阴性样品值的上限, 即待检棉拭子样品的 OD 值> X+3SD 时, 判断为阳性 ; 否则为阴性。
通过对 16 份 DPV 阴性鸭的泄殖腔棉拭子样品进行检测 ( 表 4), 求得其 X 值为 0.131, SD 值为 0.045, 确定阴阳性临界点为 X+3SD = 0.131+3×0.045 = 0.265。即待测样
品的 OD450nm 值大于 0.265 为 DPV 阳性, 小于或等于则为阴性。
表 416 份 DPV 阴性样品的 AC-ELISA 检测结果
3.2.4 特异性试验
取正常 DEF 培养液、 含 DPV 的 DEF 培养液、 含 DHV 的鸭胚尿囊液、 含 RA 的菌体培养 液和含 E.coli 菌体培养液各 3 份, 按照本实施例中的方法进行检测, 观察结果。
按照建立的 AC-ELISA 方法, 分别对正常 DEF 培养液、 含 DPV 的 DEF 培养液、 含 DHV 的鸭胚尿囊液、 含 RA 的菌体培养液和含 E.coli 菌体培养液进行检验, 结果见表 5 和图 6。
表 5AC-ELISA 特异性试验结果
3.2.5 敏感性检测结果
将含 DPV 的 DEF 培养液作倍比稀释 (1 ∶ 10、 1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320、 1 ∶ 640、 1 ∶ 1280), 100μL/ 孔加于酶标板中, 每个稀释度重复 3 次, 按建立的 AC-ELISA 方法检测, 同时设定阴性对照 ( 正常 DEF 细胞 ) 和空白 (PBS) 对照。
按照建立的 AC-ELISA 方法, 将含 DPV 的 DEF 培养液作一系列倍比稀释, 结果见表 6 和图 7。将含 DPV 的 DEF 培养液稀释至 1 ∶ 640 倍时, 浓度为 0.16μg/mL 时, OD450nm 值为 0.268, 稍大于临界值 0.265, AC-ELISA 呈现弱阳性反应, 由于在每一酶标孔中加 100μL, 因 此, 检测含 DPV 的 DEF 培养液中病毒蛋白最低含量为 16ng。
表 6AC-ELISA 敏感性试验结果
3.2.6 重复性试验结果
(1) 批内重复性测定试验 : 取 3 份不同时间收集到的含 DPV 的 DEF 培养液, 按最佳 稀释度稀释, 加到抗原包被孔中, 每份样品做 3 次重复 ELISA 测定。由每份样品的 OD450nm 值 计算出平均 OD450nm 值 (X) 与标准方差 (SD), 进而计算出每份样品批内变异系数 [CV = (SD/ X)×100% ] ; (2) 批间重复性测定试验 : 在其它条件相同的情况下, 用 3 份不同批次制备的 纯化的鼠抗重组 UL51 蛋白抗体包被酶标板, 对 3 份不同时间收集到的含 DPV 的 DEF 培养液 进行检测。由每份样品的 OD450nm 值计算出平均 OD450nm 值 (X) 与 SD, 进而计算出每份样品的 批间变异系数。
经统计学分析, 3 份不同时间收集到的含 DPV 的 DEF 培养液之间批内重复试验 OD450nm 值的变异系数 (CV) 为 0.81%~ 1.68%, 小于 5% ; 3 份不同时间收集到的含 DPV 的
DEF 培养液的 3 次批间重复试验 OD450nm 值的 CV 为 0.99%~ 2.82%, 小于 5% ( 表 7)。表明 建立的 AC-ELISA 方法具有很好的批内及批间重复性。
表 7 重复性试验结果
4 讨论
本实施例建立的 AC-ELISA 法应用了双抗体夹心法的工作原理, 此法是检测抗原 的常规方法, 具有较强的特异性, 非常适合于检验各种大分子抗原。传统方法中的 2 种抗体 是用病毒免疫不同种属动物制备得到的, 而本实施例中的 2 种抗体则是用重组 UL51 蛋白免 疫不同种属动物制备得到的。
就基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法而言, 对人工感染 DPV 鸭的检测结 果表明, 基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法的阳性率为 100% ; 并且, 本方法与常规 PCR 方法检测鸭瘟病毒的结果符合率为 100%。然而, 其中的 PCR 检测方法的 DNA 模板的制 备过程非常复杂, 而且很容易造成污染, 导致结果为假阳性。基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 法对 DPV 的最小检出量为 16ng/mL, 敏感度高。在检测鸭瘟病毒时若能同时运用 基于抗重组 UL51 蛋白抗体的 AC-ELISA 和其它方法, 相互辅助, 将会为临床 DPV 检测带来了 很大的方便。
最后说明的是, 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制, 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述, 但本领域的普通技术人员应当理解, 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变, 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
19101982777 A CN 101982779
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