一种碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统及其应用.pdf

本发明公开了一种碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统，该转化系统包括出发菌株即缺失己糖激酶基因1的营养缺陷型菌株H.jecorina TU-6H和携带有目的基因以及缺陷型回补基因己糖激酶基因1的载体。本发明还公开了此转化系统在利用瑞氏木霉表达促红细胞生成素和热休克蛋白HSP70上的应用。此转化系统在利用甘露醇作为碳源时可以得到更高的转化效率，是一种高效、低成本及方便的转化系统。

1.  一种碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统，包括出发菌株和携带有目的基因以及缺陷型回补基因的载体；其特征在于：所述出发菌株为缺失己糖激酶基因1的营养缺陷型菌株H.jecorina TU-6H，该菌株不能以甘露醇或山梨醇为唯一碳源生长；所述目的基因为人源激素基因或瑞氏木霉蛋白分泌相关基因；所述缺陷型回补基因为己糖激酶基因1即hxk1。

2.  如权利要求1所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统，其特征在于：所述人源激素基因是促红细胞生成素基因epo。

3.  如权利要求1所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统，其特征在于：所述瑞氏木霉蛋白分泌相关基因是热休克蛋白基因hsp70。

4.  权利要求1所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统在制备促红细胞生成素中的应用。

5.  权利要求1所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统在改造瑞氏木霉蛋白分泌途径中的应用。

一种碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域；具体地说，本发明涉及一种依赖于碳源的瑞氏木霉遗传转化系统，还涉及其在遗传转化中的应用。
背景技术
瑞氏木霉(Hypocrea jecorina，无性型为Trichoderma reesei)是一种嗜温性的腐生子囊真菌，它被大量地应用于纤维素酶和半纤维素酶的生产。瑞氏木霉于二战时被发现，一直以来都被认为是无性繁殖的，但是后来人们发现它的有性型为红褐肉座(Hypocreajecorina)。瑞氏木霉作为一种工业用酶生产菌株及研究木质纤维素降解的重要模式菌株已经有很长的历史。木质纤维素是地球上最为丰富的生物质，是细胞壁的主要组成成分，主要存在于农作物残留物、杂草和树木等。在能源危机，粮食危机，环境污染不断加剧的今天，利用降解木质纤维素产生生物能源变得前景诱人。而瑞氏木霉作为一种模式菌株在转化木质纤维素产生物能源和研究木质纤维素降解机制中起到了非常重要的作用(Martinez et al.，Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungusTrichoderma reesei(syn.Hypocrea jecorina)[J].Nat.Biotechnol.2008，26，553-560)。
另外，在过去的几十年里瑞氏木霉被广泛地应用于食品、制药、纺织和造纸等工业(Seiboth et al.，The D-xylose reductase of Hypocrea jecorina is the major aldose reductasein pentose and D-galactose catabolism and necessary for β-galactosidase and cellulaseinduction by lactose[J].Mol.Microbio，2007，66(4)：890-900)。由于具有很强的蛋白分泌能力和GRAS(一般被认为安全)的特征，瑞氏木霉被认为是一种十分诱人的可以用来生产同源或者异源蛋白的细胞工厂(Nevalainen K.M.H.，Te′o V.S.J.，Bergquist P.L，Heterologous protein expression in filamentous fungi[J].Trends in Biotechnology，2005，23(9)：468-474)。目前很多与蛋白分泌途径相关的基因已经被分离并进行了功能分析，以便能更好的改造瑞氏木霉使其适应各种同源或者异源蛋白的生产(Saloheimo M，Valkonen M，M，Activation mechanisms of the HAC1-mediated unfolded proteinresponse in filamentous fungi[J].Mol Microbiol，2003，47(4)：1149-61)。
丝状真菌遗传转化是遗传操作的重要前提，到目前为止已经发展出很多适用于瑞氏木霉遗传转化的技术，如原生质体转化、生物弹射击法和农杆菌介导转化(AMT)等，它们已被广泛地应用于瑞氏木霉菌种改良和基因组功能研究(M，et al.A versatiletransformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei[J].Gene，1987，61(2)：155-64；Takafumi et al.，Transformation of Aspergillus sp.and Trichodermareesei Using the Pyrithiamine Resistance Gene(ptrA)of Aspergillus oryzae Biosci[J].Biotechnol.Biochem，2002，66(2)：404-406；Zhong YH et al.，Agrobacterium-mediatedtransformation(AMT)of Trichoderma reesei as an efficient tool for random insertionalmutagenesis[J].Appl Microbiol Biotechnol，2007，73(6)：1348-54)。遗传转化过程中选择标记基因是DNA介导的转化系统的核心，已经有很多选择标记被报道用于瑞氏木霉的遗传转化，其中主要分为两类：显性选择标记和营养缺陷型标记。前者如潮霉素、抗硫胺素等，后者如尿嘧啶缺陷型。前者如各种抗性标记存在成本高、改良菌株的工业应用受限等不足；后者如营养缺陷型选择标记具有转化效率高，操作方便等特点(Hartl &Seiboth，Sequential gene deletions in Hypocrea jecorina using a single blaster cassette[J].Curr Genet，2005，48(3)：204-11)，但是目前的选择标记对于同时进行多个基因功能的研究来说还是显得捉襟见肘，因此开发新的、低成本、高效的遗传转化系统便显得迫在眉睫。
发明内容
针对现有转化系统所使用的很多抗性标记成本高，不适宜于工业生产，而且有限的转化系统不能满足同时对多个基因尤其是基因家族进行功能研究的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于碳源(甘露醇和山梨醇)依赖型的瑞氏木霉遗传转化系统。利用本转化系统可以有效地对瑞氏木霉进行遗传转化。
本发明所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统，包括出发菌株和携带有目的基因以及缺陷型回补基因的载体；其特征在于：所述出发菌株为缺失己糖激酶基因1的营养缺陷型菌株H.jecorina TU-6H，该菌株不能以甘露醇或山梨醇为唯一碳源生长；所述目的基因为人源激素基因或瑞氏木霉蛋白分泌相关基因；所述缺陷型回补基因为己糖激酶基因1即hxk1。
其中：所述人源激素基因优选促红细胞生成素基因epo。
其中：所述瑞氏木霉蛋白分泌相关基因优选热休克蛋白基因hsp70。
本发明所述的转化系统为利用不能以甘露醇或山梨醇为唯一碳源的营养缺陷型菌株H.jecorina TU-6H与己糖激酶基因1(hxk1)互补后恢复为原养型，然后在以甘露醇或山梨醇为唯一碳源的培养基上筛选得到转化子的高效遗传转化系统。
本转化系统在对瑞氏木霉进行遗传转化时效率达80％，并且在以甘露醇为唯一碳源的转化培养基上的转化效率比以山梨醇为唯一碳源时高。
以绿色荧光蛋白基因egfp为目的基因，利用本转化系统转化瑞氏木霉。结果表明绿色荧光蛋白基因egfp可以高效转入瑞氏木霉并表达，表明本系统应用前景可观。
转化过程以H.jecorina TU-6H为出发菌株，按照常规原生质体转化方法转入含有己糖激酶基因1(hxk1)表达盒和绿色荧光蛋白基因egfp表达盒的载体pHxk1-EGFP(质粒图谱见图1)，然后在含有甘露醇或山梨醇为唯一碳源的选择性基本培养基上进行选择培养，挑取生长迅速的转化子。
上述转化子经含有甘露醇或山梨醇为唯一碳源的选择性基本培养基复筛，复筛后有约1/5不能生长，复筛生长者初步确定为阳性转化子。复筛得到的阳性转化子经PCR(见图3)、荧光显微镜观察(见图4)和荧光SDS-PAGE(见图5)检测后，均为转入绿色荧光蛋白基因egfp并表达的转化子，证实此转化系统具有很高的转化效率。
上述转化系统在利用甘露醇进行转化选择培养时能产生500-1000个转化子，而利用山梨醇则只能产生100-200个转化子(见图2)，显示甘露醇为碳源比山梨醇更为高效。
本发明所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统在工业生产中的应用。
以H.jecorina TU-6H为出发菌株，按照常规原生质体转化方法转入含有己糖激酶基因1(hxk1)的表达盒和目的基因表达盒的载体，然后在含有甘露醇或山梨醇为唯一碳源的选择性基本培养基上进行选择培养，挑取生长迅速的转化子，并对挑选的转化子进行各种分子、生化水平验证以确定其为阳性转化子，利用得到的目的基因阳性转化子可以实现对目的产物的制备。
本发明所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统在制备促红细胞生成素中的应用。
以促红细胞生成素基因epo为目的基因，利用本转化系统转化瑞氏木霉后得到表达促红细胞生成素的转化子，以该转化子用于制备促红细胞生成素。
转化过程以H.jecorina TU-6H为出发菌株，按照常规原生质体转化方法转入含有己糖激酶基因1(hxk1)的表达盒和促红细胞生成素基因epo表达盒的载体pHxk1-EPO，然后在含有甘露醇为唯一碳源的选择性基本培养基上进行选择培养，挑取生长迅速的转化子并进行复筛，复筛得到的转化子经PCR和Western blot验证后得到成功表达促红细胞生成素的瑞氏木霉epo转化子，以瑞氏木霉epo转化子进行发酵制备促红细胞生成素。
本发明所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统在改造瑞氏木霉蛋白分泌途径中的应用。
以热休克蛋白基因hsp70为目的基因，利用本转化系统转化瑞氏木霉后得到成功过表达热休克蛋白基因hsp70的转化子，该转化子的利用可以提高瑞氏木霉蛋白分泌量。
本发明所述的转化系统为瑞氏木霉的遗传转化提供了一种新的、低成本的、有效简便的途径。使用这一转化系统可以更好的避免转化过程中假阳性的出现，可以更为快捷地挑到更多的转化子，可以适用于工业生产菌株的遗传改造，还为同时进行瑞氏木霉多个基因的功能研究提供了一种高效的转化系统。
附图说明
图1pHxk1-EGFP载体物理图谱。
图2利用山梨醇和甘露醇作为选择碳源的转化板。
其中：A，山梨醇作为唯一碳源；B，甘露醇做唯一碳源。
图3瑞氏木霉egfp转化子的PCR验证电泳图。
其中：DL2000，分子marker；ΔHxk1，出发菌株H.jecorina TU-6H；1-9，瑞氏木霉egfp转化子。
图4瑞氏木霉egfp转化子的绿色荧光观察。
其中：A，普通光镜下观察结果；B，荧光显微镜下观察结果。
图5荧光SDS-PAGE检测绿色荧光蛋白条带。
其中：ΔHxk1，出发菌株H.jecorina TU-6H阴性对照；1-6，瑞氏木霉egfp转化子。
具体实施方式
实施例1.菌株H.jecorina TU-6H的构建
出发菌株H.jecorina TU-6H的构建参考Hartl L，Seiboth B(2005)Sequential genedeletions in Hypocrea jecorina using a single blaster cassette.Curr Genet 48(3)：204-11中制作过程，该菌株为敲除己糖激酶基因1(hxk1)的菌株，生理实验表明其不能在含有D-果糖作为唯一碳氮源的基本培养基上生长。
该菌株的出发菌株为H.jecorina TU-6(ATCC MYA-256)。本发明所述碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统的建立将以此菌株作为出发菌株。
己糖激酶基因1(hxk1)敲除载体pΔhxk1的构建。载体pΔhxk1含有己糖激酶基因1(hxk1)基因1.4kb的5’侧翼序列和1.8kb的3’侧翼序列及5’-乳清酸核苷酸脱羧酶基因pyr4，具体构建过程如下：
首先以质粒pPICZB(Invitrogen，Vienna，Austria)为模板，zeo1fw(XbaI)和zeo1rv(XhoI)及zeo2fw(XhoI)和zeo2rv(BamHI)为引物PCR扩增得到重复序列Sh ble，将两个片段分别用括号中引物所含的限制性内切酶酶切后连入经XbaI和BamHI双酶切的质粒pUC19(Takara，Japan)，之后再将pyr4基因(以H.jecorina TU-6染色体为模板扩增得到，含SalI酶切位点)连入其中构建得到含pyr4基因的质粒pLH1mb。
以H.jecorina TU-6染色体为模板，以hexo5’F(含EcoRI位点)和hexo5’R(含BamHI位点)为引物PCR扩增得到hxk1基因1.4kb的5’侧翼序列，以hexo3’F(含HindIII位点)和hexo3’R(含HindIII位点及其本身的EcoRI位点)为引物PCR扩增得到hxk1基因1.8kb的5’侧翼序列。对5’侧翼序列用EcoRI和BamHI双酶切后将其连入同样酶切的质粒pLH1mb，同样用HindIII酶切3’侧翼序列连入上述载体最终构建得到敲除载体pΔhxk1。
上述质粒构建过程中所使用引物序列如下：
zeo1fw     5’-GATCTCTAGAACCATGGCCAAGTTGACCAG-3’
zeo1rv     5’-GATCCTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCGG-3’
zeo2fw     5’-GATCCTCGAGACCATGGCCAAGTTGACCAG-3’
zeo2rv     5’-GATCGGATCCTCAGTCCTGCTCCTCGG-3’
hexo5’F   5’-GATCGAATTCTATGAGGTACGTATGTAG-3’
hexo5’R   5’-GATCGGATCCATGGTGGTCAGTATTTTC-3’
hexo3’F   5’-CTAGAAGCTTTAGATTTGGAACATGTTTGTC-3’
hexo3’R   5’-GATCAAGCTTGAATTCAAGTTGGGCAG-3’
敲除载体pΔhxk1转化H.jecorina TU-6构建己糖激酶基因1(hxk1)敲除菌株H.jecorina TU-6H，具体构建过程如下：
转化方法采用原生质体转化，方法参照Gruber F，et al.(1990)Cloning of theTrichoderma reesei pyrG gene and its use as a homologous marker for a high-frequencytransformation system.Curr Genet 18：71-76介绍。以H.jecorina TU-6为出发菌株制备原生质体，将敲除载体pΔhxk1转化原生质体，然后将转化夜涂布于基本培养基上，30℃培养3-4天后挑取转化子，经PCR检验pyr4基因的存在及hxk1基因的缺失得到敲除己糖激酶基因1(hxk1)的转化子H.jecorina TU-6H。
上述基本培养基配方：葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 15g/L，MgSO₄ 0.6g/L，CaCl₂ 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005g/L，MnSO₄·H₂O 0.0016g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g/L，CoCl₂ 0.002g/L(pH5.5)。
实施例2.菌株H.jecorina TU-6H和H.jecorina TU-6在不同碳源上的生长状况的定性分析
将菌株H.jecorina TU-6H和H.jecorina TU-6分别接种在PDA培养基上，30℃培养3-4天。然后用打孔器在菌落边缘打取相同大小的菌块接种于基本培养基平板上，30℃培养5天。其中基本培养基中的葡萄糖被替换为10g/L的山梨醇或甘露醇作为唯一的碳源。
生长实验表明菌株H.jecorina TU-6H不能在含有山梨醇或甘露醇为唯一碳氮源的基本培养基上生长，而其出发菌株H.jecorina TU-6可以在以山梨醇或甘露醇为唯一碳氮源的基本培养基上生长。
上述PDA培养基配方：马铃薯200g，自来水煮沸30min，6层纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖20g，琼脂17g，补水至1000ml。
山梨醇和甘露醇为唯一碳源的基本培养基配方：山梨醇或甘露醇10g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄ 15g/L，MgSO₄ 0.6g/L，CaCl₂ 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005g/L，MnSO₄·H₂O0.0016g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g/L，CoCl₂ 0.002g/L(pH5.5)。
实施例3.己糖激酶基因1(hxk1)和绿色荧光蛋白基因egfp双表达载体pHxk1-EGFP的构建
质粒pHxk1-EGFP由含有绿色荧光蛋白基因egfp表达盒的pIG1783质粒插入己糖激酶基因1(hxk1)表达盒构建而成。其中pIG1783质粒(详见S，Masloff S，HoffB，Mayrhofer S，Kück U(2003)Versatile EGFP reporter plasmids for cellular localization ofrecombinant gene products in filamentous fungi.Curr Genet 43(1)：54-61)含有绿色荧光蛋白基因egfp表达盒；己糖激酶基因1(hxk1)表达盒由H.jecorina TU-6基因组DNA经PCR扩增得到，含有己糖激酶基因1(hxk1)基因本身的启动子和终止子。具体构建过程如下：
按照Seiboth，B.，et al.(2004)The galactokinase of Hypocrea jecorina is essential forcellulase induction by lactose but dispensable for growth on D-galactose.Mol Microbiol 51(4)，1015-25介绍的方法提取H.jecorina TU-6基因组DNA作为扩增己糖激酶基因1(hxk1)表达盒的模板。以HexF和HexR为引物进行PCR，引物两端引入HindIII酶切位点：
HexF(5’-CCGAAGCTTTCGCCCTGCTTGGAGCTTTC-3’)
HindIII
HexR(5’-GCGAAGCTTTGCGGACCTT CATCATGGAGTG-3’)，
HindIII
PCR扩增条件为95℃5min，94℃0.5min→58.5℃0.5min→72℃6min(35个循环)，72℃10min。聚合酶为普通Taq和高保真pfu混合。
PCR产物经琼脂糖凝胶纯化回收后用HindIII酶切，并与同样经过HindIII酶切处理的pIG1783质粒进行连接，构建得到含有己糖激酶基因1(hxk1)表达盒和绿色荧光蛋白基因egfp表达盒的双表达载体pHxk1-EGFP，pHxk1-EGFP质粒图谱见图1。
实施例4.pHxk1-EGFP载体转化H.jecorina TU-6H
转化过程采用常规的原生质体转化法，方法参照Taina Karhunen，et al.Highfrequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei.I.Endoglucanase Ioverproduction.Mol Gen Genet，1993，241：515-522.介绍，转化培养基采用含有1mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压稳定剂和唯一碳源的基本培养基。具体转化方法如下：
原生质体的制备：
①在PDA培养基平板上放置一张玻璃纸，其上涂布H.jecorina TU-6H孢子悬液，30℃培养20hr。
②将平板中玻璃纸上的菌丝转移，悬浮于1.2mol/L山梨醇-10mmol/L磷酸钾溶液(pH5.6，含5mg/ml-10mg/ml Lysing Enzymes)中，30℃温浴1.5～2hr。在此过程中不时镜检，观察原生质体的生成情况。
③通过G3烧结漏斗过滤，将原生质体与未被消化的菌丝体分离开，并用1.2mol/L山梨醇-10mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)洗涤2次。
④4000rpm离心15min，弃上清，收集原生质体，并用1mol/L山梨醇-10mmol/LTris·HCl(pH 7.5)洗涤2次。最后重悬于1mol/L山梨醇-10mmol/L CaCl₂-10mmol/LTris·HCl(pH 7.5)中，使原生质体浓度为5×10⁶-5×10⁷/ml。
原生质体的转化：
将纯化后的pHxk1-EGFP质粒5μg与H.jecorina TU-6H原生质体(100μl)混合，加入50μl 25％PEG6000-50mmol/L CaCl₂-10mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)，冰浴20min，后加入1ml 60％PEG4000-50mmol/L CaCl₂-10mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)(加入体积为原生质的10倍)，室温放置5min。最后加入2ml 1mol/L山梨醇-10mmol/L CaCl₂-10mmol/LTris·HCl(pH 7.5)，混匀。
再生和选择：将适量(100μl～200μl)上述转化液涂布于1mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压稳定剂和唯一碳源的基本培养基，30℃培养3～4d，挑选在转化培养基上生长较快菌落较大的转化子。同时对于没有加入目的质粒的原生质体按同样的方法进行，按相同的量涂布在相同的转化培养基上作为原生质体再生情况检测以及阴性对照。
以上转化基本培养基：山梨醇或甘露醇1mol/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 15g/L，MgSO₄ 0.6g/L，CaCl₂ 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005g/L，MnSO₄·H₂O 0.0016g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g/L，CoCl₂ 0.002g/L(pH 5.5)。
此转化系统的转化结果显示，在甘露醇作为碳源的转化板上每μg质粒可以得到500-1000个转化子(三次重复)，而在山梨醇在作为碳源的转化板上则只有100-200个转化子，转化板如图2。因此在以甘露醇为唯一碳源的转化系统中转化效率高。
将选择平板上长出的转化子进一步挑取到甘露醇培养基平板(转化基本培养基)上进行复筛，大约每50个随机挑取的转化子中有约40个可以在复筛培养基上生长。将复筛培养基上挑选到的转化子转接于PDA培养基斜面，30℃培养3～5d左右，洗孢子，进行分单孢，依次传代5次使转化子性状得到稳定。之后收集孢子并加入80％甘油等体积混合保藏。同时对其进行PCR验证和绿色荧光验证。
实施例5.PCR验证瑞氏木霉egfp转化子
按照Seiboth，B.，et al.(2004)The galactokinase of Hypocrea jecorina is essential forcellulase induction by lactose but dispensable for growth on D-galactose.Mol Microbiol 51(4)，1015-25介绍的方法提取实施例4中复筛到的转化子染色体DNA，并以此为PCR模板扩增egfp基因，扩增得到728bp egfp基因的转化子即为阳性转化子。PCR所用引物如下：
GfpF 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’
GfpR 5’-CGGCCGCTTTACTTGTACAGCTC-3’
PCR扩增条件为95℃5min，94℃0.5min→54℃0.5min→72℃1min(35个循环)，72℃10min。聚合酶为普通Taq。
对9个复筛阳性的转化子进行PCR验证发现其均能扩增得到728bp egfp基因条带，表明这些转化子已转入绿色荧光蛋白基因egfp。PCR电泳图如图3。
实施例6.H.jecorina TU-6H及其绿色荧光蛋白基因egfp转化子的绿色荧光观察
将出发菌株H.jecorina TU-6H及其绿色荧光蛋白基因egfp转化子分别接种至液体基本培养基中于30℃培养10h，收集菌丝直接在Nikon Eclipse 80i荧光显微镜下观察，照相。
结果显示复筛板上的绿色荧光蛋白基因egfp转化子均能观察到绿色荧光，而出发菌株H.jecorina TU-6H未见荧光。绿色荧光蛋白基因egfp转化子荧光图如图4。
上述液体基本培养基配方：葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 15g/L，MgSO₄0.6g/L，CaCl₂ 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005g/L，MnSO₄·H₂O 0.0016g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g/L，CoCl₂ 0.002g/L(pH 5.5)。
实施例7.SDS-PAGE检测瑞氏木霉egfp转化子绿色荧光蛋白的表达
对PCR验证得到的阳性转化子进一步进行绿色荧光蛋白观察以验证其表达，即通过SDS-PAGE分离转化子蛋白，然后在荧光(488nm)激发下观察绿色荧光，结果显示挑得的绿色荧光蛋白基因egfp阳性转化子均能观察到绿色荧光条带，而出发菌株H.jecorina TU-6H而未见该条带，结果见图5。具体步骤如下：
①转化子蛋白提取：
接种转化子至液体基本培养基中使孢子终浓度为1×10⁸/ml，30℃，200rpm培养24hr后过滤收集菌丝，用无菌的去离子水洗涤菌丝两次后液氮研磨，将约0.1g菌丝粉末加到1ml蛋白抽提缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄和0.001％PMSF)中，10,000×g，4℃离心10min，取上清即为蛋白抽提物。上清的蛋白含量用Bradford蛋白定量试剂盒进行定量，并据此将各转化子的蛋白含量用上述抽提缓冲液调节一致。
②SDS-PAGE观察绿色荧光蛋白的表达
SDS-PAGE及绿色荧光蛋白条带的观察依据Niu Y，Kong J，Xu Y(2008)A novelGFP-fused eukaryotic membrane protein expression system in lactococcus lactis and itsapplication to overexpression of an Elongase.Curr Microbiol 57(5)：423-8的方法进行。将蛋白与5×上样缓冲液(250mM Tris-HCl pH 6.8，10％SDS，0.5％溴酚兰，50％甘油和5％β-巯基乙醇)混合后点样至12％的SDS-PAGE胶，电泳分离蛋白。电泳结束后用去离子水清洗胶两次，然后在Amersham STORM 840照相系统下检测绿色荧光蛋白条带。
实施例8.利用本转化系统生产促红细胞生成素EPO。
利用本遗传转化系统以人源促红细胞生成素基因为目的基因转化瑞氏木霉，得到能表达人源促红细胞生成素的瑞氏木霉epo转化子。
含己糖激酶基因1(hxk1)和促红细胞生成素基因(epo)双表达载体pHxk1-EPO的构建。
以构巢曲霉染色体为模板，G1(EcoRI)和G2(EcoRI)为引物PCR扩增得到3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA启动子的DNA片断。该片段经EcoRI酶切后连入同样经EcoRI酶切的pUC19质粒(Takara，Japan)得到质粒pGA；同样以构巢曲霉染色体为模板，T1(BamHI)和T2(HindIII)为引物PCR扩增得到色氨酸合成基因trpC转录终止子序列的DNA片断。该片段经BamHI和HindIII双酶切后连入同样酶切后的质粒pGA得到质粒pGT。以人肾脏组织得到的cDNA为模板，E1和E2为引物扩增得到人源促红细胞生成素基因epo，将该基因连入经SmaI酶切的pGT载体构建得到表达人源促红细胞生成素的载体pE。
同实施例3扩增得到两端含有HindIII酶切位点的己糖激酶基因1(hxk1)表达盒。将经HindIII酶切的己糖激酶基因1(hxk1)表达盒与同样经HindIII酶切的pE载体连接构建得到含有己糖激酶基因1(hxk1)和促红细胞生成素基因epo的双表达载体pHxk1-EPO。
其中，上述构建过程所需引物如下：
G1    5′-CCGGAATTCAGACCTAATACAGCCCCTAC-3′
G2    5′-CCGGAATTCTGTCTGCTCAAGCGGGGTAG-3′
T1    5′-CGCGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCATCAAA-3′
T2    5′-GCCCAAGCTTGAGTGGAGATGTGGAGTGGG-3′
E1    5′-CACAGCTCGTGCTCAGGCCCCACCACGCCTCATC-3′
E2    5′-TCTGTCCCCTGTCCTGCA-3′
双表达载体pHxk1-EPO转化H.jecorina TU-6H构建表达促红细胞生成素的瑞氏木霉生产菌株。转化方法采用常规原生质体转化，方法参照Taina Karhunen，et al.Highfrequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei.I.Endoglucanase Ioverproduction.Mol Gen Genet，1993，241：515-522.介绍，转化培养基采用含有1mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂和唯一碳源的基本培养基。转化的具体步骤可参照实施例4实施。
提取阳性转化子的染色体，以上述E1和E2为引物扩增促红细胞生成素基因epo，证明该基因已成功转入瑞氏木霉。
对瑞氏木霉epo转化子进行Western blot分析显示，瑞氏木霉epo转化子有免疫条带出现，而出发菌株并未发现相应条带，具体过程如下：
①蛋白质的转膜
将瑞氏木霉epo转化子和出发菌株的蛋白质经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行转膜。将硝酸纤维素膜浸泡在转移缓冲液(5.8g/L Tris·HCl，2.9g/L Glycine，0.37g/L SDS，甲醇100ml/L，pH 8.3)中15～20min；组装转移系统，打开转移盒并放置于浅盘中，用转移缓冲液(pH 8.3)将海绵垫完全浸透后放于转移盒壁上，在海绵上再放置一张浸湿的Whatman 3MM滤纸；将凝胶放置于滤纸上，用玻璃棒轻轻赶走气泡；用转移缓冲液(pH8.3)润湿胶面，将硝酸纤维素膜放在胶面上；在硝酸纤维素膜上放一张浸湿的Whatman3MM滤纸，用玻璃棒轻轻赶走所有气泡；将另一块海绵用转移缓冲液(pH 8.3)浸透后放在滤纸上，关上转移盒并插入转移槽，注意膜一侧靠正极，胶一侧靠负极；连接好电极，恒压40V转移4～5h。
②蛋白质的免疫检测
蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜上之后，将利用抗体检测促红细胞生成素。一抗为来自小鼠的促红细胞生成素蛋白特异性抗体，二抗为羊抗鼠的辣根过氧化物酶标记的IgG(H+L)抗体。膜的封闭：拆卸转移装置，将膜放入容器中，加入适量含5％脱脂奶粉的PBS(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，2.9g/L Na₂HPO₄，0.24g/L KH₂PO₄，pH 7.4)，直到将膜完全浸泡在溶液中；4℃放置过夜，确保蛋白封闭完全；洗膜：用PBS洗膜3次，每次10min；一抗反应：洗膜后，根据膜的大小，取适量一抗按比例稀释到含有3％脱脂奶粉的PBS中，将膜放入塑料袋中，加入封闭液，除去气泡，以免造成假阴性结果，封口；温和摇动，37℃孵育至少1h；弃去一抗，用PBS洗膜两次，每次10min，然后转入TBS(100mmol/L Tris·HCl，9g/L，pH 7.5)中，洗膜10min；二抗反应：洗膜后，根据膜的大小，取适量二抗按比例稀释到含有1％脱脂奶粉的PBS中，将膜放入塑料袋中，加入封闭液，除去气泡，封口；温和摇动，37℃孵育至少1h；弃去二抗，用TBS洗膜3次，每次10min；将6mg DAB溶于9ml 10mmol/L Tris·HCl(pH 7.6)中，加入10μl 30％H₂O₂，充分混匀，放入膜，显色5～10min；用水冲洗膜，终止反应，然后将膜转入PBS中，拍照。
结果发现瑞氏木霉epo转化子的胞外蛋白中多出一条30KD左右的带，这条带即是促红细胞生成素的蛋白带。
将瑞氏木霉epo转化子接种至液体基本培养基中发酵培养，培养完毕后以常规方式离心，取上清，经进一步分离纯化即得促红细胞生成素。
序列表
<110>山东大学
<120>一种碳源依赖型瑞氏木霉遗传转化系统及其应用
<141>2009-6-2
<160>18
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>zeo1fw
<400>1
gatctctaga accatggcca agttgaccag                        30
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>zeo1rv
<400>2
gatcctcgag tcagtcctgc tcctcgg                           27
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>zeo2fw
<400>3
gatcctcgag accatggcca agttgaccag                        30
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>zeo2rv
<400>4
gatcggatcc tcagtcctgc tcctcgg                           27
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>hexo5’F
<400>5
gatcgaattc tatgaggtac gtatgtag                    28
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>hexo5’R
<400>6
gatcggatcc atggtggtca gtattttc                    28
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>hexo3’F
<400>7
ctagaagctt tagatttgga acatgtttgt c                31
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>hexo3’R
<400>8
gatcaagctt gaattcaagt tgggcag                     27
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>HexF
<400>9
ccgaagcttt cgccctgctt ggagctttc                   29
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>HexR
<400>10
gcgaagcttt gcggaccttc atcatggagt g                31
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>GfpF
<400>11
atggtgagca agggcgagga                        20
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>GfpR
<400>12
cggccgcttt acttgtacag ctc                    23
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>G1
<400>13
ccggaattca gacctaatac agcccctac              29
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>G2
<400>14
ccggaattct gtctgctcaa gcggggtag              29
<210>15
<211>34
<212>DNA
<213>T1
<400>15
cgcggatcca cttaacgtta ctgaaatcat caaa        34
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>T2
<400>16
gcccaagctt gagtggagat gtggagtggg             30
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>E1
<400>17
cacagctcgt gctcaggccc caccacgcct catc            34
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>E2
<400>18
tctgtcccct gtcctgca                              18