(一)技术领域
本发明涉及一种检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒， 以及利用该试剂盒检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的方法。
(二)背景技术
糖原累积症Ⅰ型又称VonGierke病，简称GSDⅠ，是遗传性肝内葡 萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)先天性缺乏而导致糖原分解或合成障碍的常染 色体隐性遗传性疾病。G6Pase体系主要由4个组分组成：葡萄糖-6-磷酸 酶-ɑ(G6PC)、葡萄糖-6-磷酸转运体(G6PT1)、无机磷酸盐转运体(T2)、 葡萄糖转运体(T3)，分别行使葡萄糖-6-磷酸的水解，G6p的转位，磷酸 的运输和葡萄糖运输的功能。根据缺陷的酶的不同将GSDⅠ分为4个亚 型：G6PC缺陷引起GSDⅠa；G6PTI缺陷引起GSDⅠb；磷酸盐转运体 缺陷引起GSDⅠc和葡萄糖转运体缺陷引起GSDⅠd。
研究表明，其中GSDⅠ型约占整个糖原累积症的25％，而Ⅰ型中Ⅰa 型约占80％，故GSDⅠa型是一种相对较为常见的糖原代谢障碍疾病,其 活产儿发病率约为十万分之一。临床表现主要为低血糖、肝脏肿大、高脂 血症、高尿酸血症、高乳酸血症等，主要累及肝脏、肾脏和小肠，在临床 上主要问题表现为诊断率低和诊断手段有限。控制GSDⅠa型的基因为 G6PC，该基因定位于G6Pase基因位于人类的17号染色体长臂2区l带, 全长12.5kb，包含5个外显子。G6PC蛋白为细胞内质网膜蛋白,包含357 个氨基酸，为高度疏水性蛋白，有9个跨膜单位,其N端位于内质网腔 内,C端位于质膜上。目前国内外学者对GSDⅠa型的基因型研究已确定 了多种突变，包括错义突变、剪接突变、移码突变、缺失、基因与假基因 融合与基因转化等，具有种族差异性，常见的突变位点为R83C、Q347、 R83H、R83C、V338F、D38V、G68R、IVS3-58T>A、IVS4+10G>A。中 国人GP6C基因突变等位基因中以R83H及R83C为最常见。
基因测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。目前常用的Sanger 测序法是Frederick Sanger于1975年发明的，测序过程需要先做一个聚合 酶连锁反应(PCR)。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入 到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸又少了一个氧原子， 一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的 结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。作为一种新型基因 检测技术，基因测序能够从血液或唾液中分析测定目的基因序列，助力相 关遗传病诊断，可以对那些即使没有临床症状的患者，也可以得到尽早的 诊断和治疗，为临床诊治提供科学依据。与患者拥有相同基因型的家族成 员，尽管没有临床症状也应该尽早治疗，而临床症状或生化检查都模棱两 可的家族成员，有可能是杂合子携帯者需加以关注，具有高度特异且精确， 低成本，操作简便，快速，高通量等优点，是国际上公认的检测基因突变 的“金标准”。
在G6PC基因克隆之前，GSDⅠa的诊断主要靠临床表现和生化检查， 确诊则需要肝穿刺检测肝标本中G6Pase的活性，对携带者无法进行检查， 产前诊断如果对胎儿肝脏进行活检会给胎儿带来危险。G6PC基因突变检 测使得以DNA为基础的基因诊断成为可能，该方法不仅显著提高了不典 型GSDⅠa型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率 的重要手段。同时对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症 状的临床前期，因而对于GSDⅠa型的基因测序检测，具有更准确、更经 济、更简便，利于开展，避免了以往该病的诊断有赖于肝穿刺及活检的诊 断方法，更易于被患者接受。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试 剂盒及方法，用于检测G6PC基因突变位点，特异性好，灵敏度高。
本发明采用的技术方案是：
检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒，主要包括特异性 引物和PCR反应试剂；
所述特异性引物序列如下：
外显子Exon1扩增引物：
上游引物：5’-AGCAATCACCACCAAGC-3’
下游引物：5’-TCCAAAGTCAGAGAGAGGG-3’；
外显子Exon2扩增引物：
上游引物：5’-TTCTCAGGCTACACTCTTC-3’
下游引物：5’-CGTGCCTCTCTGGAC-3’；
外显子Exon3扩增引物：
上游引物：5’-GTGGCTGGGTAGATGATGC-3’
下游引物：5’-ACATTCCCTGACTCTGAGGTTTA-3’；
外显子Exon4扩增引物：
上游引物：5’-CCTGTGTTCTGTTATGGTT-3’
下游引物：5’-AGGATGTGGCTGGAA-3’；
外显子Exon5扩增引物：
上游引物：5’-CCATCTGCCATCTGTG-3’
下游引物：5’-AATAGTAGTCCTCCTCAATCC-3’。
所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、10*PCR 缓冲液、双蒸水、Tag酶等。
所述试剂盒还可包括GP6C基因外显子序列标准品，所述标准品序列 如下：
外显子Exon1：
5’-ATGGAGGAAGGAATGAATGTTCTCCATGACTTTGGGATCCAGTC AACACATTACCTCCAGGTGAATTACCAAGACTCCCAGGACTGGTTC ATCTTGGTGTCCGTGATCGCAGACCTCAGGAATGCCTTCTACGTCC TCTTCCCCATCTGGTTCCATCTTCAGGAAGCTGTGGGCATTAAACTC CTTTGGGTAGCTGTGATTGGAGACTGGCTCAACCTCGTCTTTAAGT G-3’；
外显子Exon2：
5’-GATTCTCTTTGGACAGCGTCCATACTGGTGGGTTTTGGATACTGA CTACTACAGCAACACTTCCGTGCCCCTGATAAAGCAGTTCCCTGTA ACCTGTGAGACTGGACCAG-3’；
外显子Exon3：
5’-GGAGCCCCTCTGGCCATGCCATGGGCACAGCAGGTGTATACTAC GTGATGGTCACATCTACTCTTTCCATCTTTCAGGGAAAGATAAAGC CGACCTACAGATTTCG-3’；
外显子Exon4：
5’-GTGCTTGAATGTCATTTTGTGGTTGGGATTCTGGGCTGTGCAGCT GAATGTCTGTCTGTCACGAATCTACCTTGCTGCTCATTTTCCTCATC AAGTTGTTGCTGGAGTCCTGTCAG-3’；
外显子Exon5：
5’-GCATTGCTGTTGCAGAAACTTTCAGCCACATCCACAGCATCTAT AATGCCAGCCTCAAGAAATATTTTCTCATTACCTTCTTCCTGTTCAG CTTCGCCATCGGATTTTATCTGCTGCTCAAGGGACTGGGTGTAGAC CTCCTGTGGACTCTGGAGAAAGCCCAGAGGTGGTGCGAGCAGCCA GAATGGGTCCACATTGACACCACACCCTTTGCCAGCCTCCTCAAGA ACCTGGGCACGCTCTTTGGCCTGGGGCTGGCTCTCAACTCCAGCAT GTACAGGGAGAGCTGCAAGGGGAAACTCAGCAAGTGGCTCCCATT CCGCCTCAGCTCTATTGTAGCCTCCCTCGTCCTCCTGCACGTCTTTG ACTCCTTGAAACCCCCATCCCAAGTCGAGCTGGTCTTCTACGTCTT GTCCTTCTGCAAGAGTGCGGTAGTGCCCCTGGCATCCGTCAGTGTC ATCCCCTACTGCCTCGCCCAGGTCCTGGGCCAGCCGCACAAGAAGT CGTTGTAA-3’。
PCR及测序所需野生型标准品的制备以Genebank中发布G6PC的基 因序列为标准，以健康体检人的外周血基因组为模板，用上述5对引物扩 增出5个特异性的PCR片段，合成与表1引物一致的野生型质粒，并与 G6PC的标准基因序列比对，确认质粒的正确性，作为检测分析中的标准 品。
所述的试剂盒在检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变中的应用。
具体的，所述应用方法如下：
(1)采集待测血液样本，提取DNA；
(2)以样品DNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组 成PCR反应体系，进行PCR扩增；
(3)步骤(2)得到的PCR反应产物进行进一步的测序，依据单基因 遗传病基因突变数据库或者对照标准品序列进行分析，确定是否 肝糖原累积症Ⅰa型致病突变位点。
所述PCR反应体系每25μL组成如下：
5*PrimeSTAR Buffer 5μL
dNTP Mixture(200uM) 2μL
正向引物(10μmol/L) lμL
反向引物(10μmol/L) lμL
模板lμL
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl；
ddH2O补足至25μL。
所述PCR反应条件如下：95℃3min；98℃10s、56℃15s，72℃30s， 30个循环；最后72℃8min。
对于扩增出来的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化后分别 对扩增引物测序，结果采用DNAStar软件子程序SeqMan分析，整理数 据并在国际通用标准人基因突变数据库中 (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)进行比对分析或者与对照标准序 列进行比对，进一步分析已明确的致病突变位点，可作为临床诊断的依据。
本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测G6PC基因突 变位点，特异性好，灵敏度高，可显著提高不典型GSDⅠa型病例的诊断 率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。同时对患者 的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，具有更准 确、更经济、更简便，利于开展，避免了以往该病的诊断有赖于肝穿刺及 活检的诊断方法，更易于被患者接受。
(四)附图说明
图1为患者A的检测结果；其G6PC基因外显子2处出现点突变(G→A 纯合p.Arg83His)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例1：
⑴样品准备。临床医生怀疑该患者A为遗传代谢性肝病糖原累积症Ⅰa 型，但是不能确诊，决定实施基因检测。
⑵样品处理。抽取受检者A静脉血2ml左右，置于肝素抗凝管内，低温 避光保存运输至检验室；全血DNA提取向样品中抽取300μL血液加入 900μL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几 次。10000rpm离心1分钟，吸去上清，留下白细胞。
⑶基因组DNA提取。向上述装有白细胞的1.5ml离心管加入20μl Proteinase K(20mg/ml)溶液，混匀后简短离心加入200μl缓冲液GB， 充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖 内壁的水珠；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出 现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状 沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将 吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000 rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3 中加入600μl缓冲液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱 CB3放回收集管中；再重复上一步骤操作；将吸附柱CB3放回收集管中， 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心 管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱液TE，室温放置3min， 12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
⑷PCR扩增。
表1：可扩增出G6PC中5个特异性外显子及其附近区域的引物
外显子 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’) Exon1 AGCAATCACCACCAAGC TCCAAAGTCAGAGAGAGGG Exon2 TTCTCAGGCTACACTCTTC CGTGCCTCTCTGGAC Exon3 GTGGCTGGGTAGATGATGC ACATTCCCTGACTCTGAGGTTTA Exon4 CCTGTGTTCTGTTATGGTT AGGATGTGGCTGGAA Exon5 CCATCTGCCATCTGTG AATAGTAGTCCTCCTCAATCC
表2：G6PC中5个特异性外显子标准品序列
利用表1中G6PC外显子部位特异性PCR扩增引物，以样品DNA 作为模板，进行PCR扩增。
PCR反应体系组成如下(共25μL)：
5*PrimeSTAR Buffer 5μL
dNTP Mixture(200μM) 2μL
正向引物(10μmol/L) lμL
反向引物(10μmol/L) lμL
模板 1μL
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl) 0.5μL；
ddH2O补足至25μL。
野生型标准品和待测样品的模板均稀释成同一浓度5ng/μL。
PCR反应条件如下：
95℃3min；
98℃10s、56℃15s，72℃30s，30个循环；
最后72℃8min；
同时利用表2中标准品设置阴阳性对照。
5对引物分别扩增出466bp，434bp，379bp，260bp，和726bp的 片段。
⑸上机测序。利用测序仪进行目的片段测序。
⑹利用DNAMAN8软件对的测序结果进行序列分析，在单基因遗传病基 因突变数据库进行确定诊断，分析出外显子2处出现的纯合点突变G→A (c248)造成了氨基酸的变化(p.Arg83His)，从而可确诊患者A属于遗 传代谢性肝病糖原累积症Ⅰa型(参见图1)。