技术领域
本发明涉及药品制备领域，尤其涉及一种苯甲酸阿格列汀的制备方法。
背景技术
糖尿病是一种因体内胰岛素绝对或者相对不足所导致的一系列临床综合 症。目前，糖尿病的治疗主要是饮食控制配合降糖药物(对于Ⅱ型糖尿病)或者胰 岛素补充相结合治疗糖尿病。据美国《新英格兰医学杂志》发布的《中国糖尿 病患病率》报告显示，中国糖尿病患者高达10％，即每10个成年人中就有一名 为糖尿病患者。而潜在糖尿病患病率更是高达15.5％。统计数据显示，内地城 市Ⅱ型糖尿病患者及其并发症的直接医疗成本占全国医疗卫生总费用4％，约为 190亿元人民币，且这一数据还在持续攀升，其中大多数糖尿病患者为Ⅱ型糖尿 病。Ⅱ型糖尿病患者不能正常地分泌或应答调节血糖的胰岛素。长时间高血糖 会增加患者发生严重综合症的风险，包括心脏病、失明、神经和肾损伤。
二肽基肽酶IV(DPP－IV)是体内、外主要促使胰高血糖素样肽－1(GLP－1) 降解、失活的关键酶之一，目前医学已经证实DPP－IV抑制剂是一种新型的糖 尿病治疗药物，临床结果显示该类药物具有良好的降糖效果，同时未发现其他 糖尿病药物所产生的常见体重增加和低血糖等不良反应。
苯甲酸阿格列汀(Alogliptin Benzoate)，化学名称为2-（（6-（（3R）-3-氨基 哌啶-1-基）-3-甲基-2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1（2H）基）甲基）苯甲腈苯甲酸， 是日本武田制药研发的一种DPP-IV抑制剂，它是高度选择的DPP-4活性抑制剂， 能通过提高机体内GLP-1的血浆浓度来促进与糖浓度有关的胰岛素的分泌。它 能维持体内胰高血糖素样-1肽和葡萄糖依赖性促胰岛素肽的水平，增加胰岛素 的分泌，从而发挥降糖疗效。临床研究显示患者对该药的耐受性良好，不良反 应轻微，仅包括胃部不适和血糖偏低。
苯甲酸阿格列汀片剂由日本武田制药有限公司制造，商品名为NESINA，规 格6.25mg/片、12.5mg/片、25mg/片，用于治疗2型糖尿病，于2010年4月16 日上市，2011年通过FDA批准在美国上市，其制备原料成本高、价格昂贵。
发明内容
本发明提供一种苯甲酸阿格列汀的制备方法，其原料价格低、收率高、杂 质少、产品质量高。
本发明实施例提供一种苯甲酸阿格列汀的制备方法，其包括以下步骤：
一）将6-氯尿嘧啶和2-氰基溴苄分别溶于DMF和DMSO的混合溶剂中， 搅拌冷却至-7～-3℃，在溶液中加入50～70%的氢化钠及溴化锂，形成反应液，将 2-氰基溴苄溶液滴入所述反应液中，加热至室温，反应至反应液中无2-氰基溴苄， 浓缩并水洗后生成大量固体，过滤并干燥，得类白色固体，将所得类白色固体 加入到三氯甲烷中加热回流后水洗，过滤并干燥，得到类白色第一中间体。
二）在步骤（一）所得第一中间体中加入DMF和四氢呋喃的混合溶液，加 入50～70%的氢化钠与溴化锂，然后滴入碘甲烷，保持温度在-5～0℃搅拌，升至 室温，水洗、浓缩并过滤，干燥后得到黄色固体。
三）将步骤（二）所得黄色固体、（R）-3-Boc-氨基哌啶及碳酸钾混合，加 入DMF，加热至70～80℃，反应至溶液中无所述黄色固体为止，冷却至室温并 过滤掉碳酸钾，洗涤并浓缩后冷却至室温，萃取并洗涤，除去溶剂后干燥，得 到第二中间体。
四）将步骤（三）所得第二中间体加入到二氯甲烷中溶解，然后滴入三氟 乙酸，控制温度在20～30℃，反应至溶液中无第二中间体，反应结束，浓缩后 萃取、洗涤并干燥后浓缩至干，得第三中间体。
五）在步骤（四）所得第三中间体中加入四氢呋喃，微热溶解后，加入苯 甲酸加热到55～65℃回流，反应液中逐渐有固体析出，待反应完毕后冷却至 15～20℃，搅拌析晶并过滤，洗涤除去残留的四氢呋喃并干燥后得到苯甲酸阿格 列汀粗品。
六）将步骤（五）所得苯甲酸阿格列汀粗品精制后得到成品。
其中，所述步骤（一）中，6-氯尿嘧啶、2-氰基溴苄、氢化钠及溴化锂的质 量比为1:1.25:0.3:0.53，所述步骤（二）中，第一中间体、氢化钠、溴化锂与碘 甲烷的质量比为1:0.18:0.27:1.23，所述步骤（三）中，黄色固体、（R）-3-Boc- 氨基哌啶、及碳酸钾的质量比为1:0.82:1，所述步骤（五）中，第三中间体与苯 甲酸的质量比为1:0.36
优选地，所述步骤（一）中，DMF和DMSO的体积比为6:1。
优选地，所述步骤（二）中，DMF和四氢呋喃的体积比为1:1。
优选地，所述萃取方法为：用二氯甲烷分两次萃取。
优选地，所述步骤（六）中精制方法为：在苯甲酸阿格列汀粗品中加入甲 醇，加热至固体完全溶解，然后加入1～1.4倍量甲醇体积的乙酸乙酯，加热回流， 趁热滤去不溶物，自然冷却至15～20℃，搅拌、析晶并抽滤，固体用少量乙酸乙 酯洗涤，40℃鼓风干燥，得成品。
优选地，所述步骤（一）中将6-氯尿嘧啶和2-氰基溴苄分别溶于DMF和 DMSO的混合溶剂中时、所述步骤（二）中在第一中间体中加入DMF和四氢呋 喃的混合溶液时、所述步骤（三）中将黄色固体、（R）-3-Boc-氨基哌啶及碳酸 钾混合时、所述步骤（四）中将第二中间体加入到二氯甲烷中溶解时、所述步 骤（五）中在第三中间体中加入四氢呋喃时都采用氮气保护。
本实施例所述苯甲酸阿格列汀的制备方法，有益效果是：
选用成本低、易购买的原料，经过反应最终生成苯甲酸阿格列汀产物，总体 制造成本低；在步骤中严格控制温度，副产物少，收率高，无毒性。
附图说明
附图1为血浆中DPP-4活性的示意图；
附图2为血浆中活性GLP-1浓度的示意图；
附图3为禁食时的血浆葡萄糖浓度变化示意图；
附图4为禁食时的血浆胰岛素浓度变化示意图；
附图5为血浆葡萄糖增加面积示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步 地详细描述。
实施例：
本实施例提供一种苯甲酸阿格列汀的制备方法，其是以6-氯尿嘧啶为起始 原料（SM001），与邻氰基苄溴(SM002)反应，得2-（（6-氯-2,4-二氧-3,4-二氢-2H- 嘧啶-1-基）甲基）苯甲腈（S100801），再与碘甲烷甲基化，得2-（（6-氯-3-甲基 -2,4-二氧-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基）甲基）苯甲腈(S100802)，然后与（3R）-3-叔 丁氧羰基氨基哌啶(SM003)反应，得N-（3-（2-氰基苄基）-1-甲基-2,6-二氧-1,2,3,6- 四氢嘧啶-4-基）哌啶-（3R）-3-氨基甲酸叔丁酯（S100803），经氯化氢气体脱保 护，再与苯甲酸成盐，得苯甲酸阿格列汀(S1008)。
其具体制备方法包括以下步骤：
一）采用氮气保护，将3.5kg起始原料6-氯尿嘧啶（SM001）投入100L反 应釜中，加入44L DMF和DMSO体积比为6:1的混合溶剂，搅拌冷至温度-5℃ 左右；分批加入1.05kg60%的氢化钠，保持反应液温度在0℃以下，加完后搅拌 1h，分批加入1.85kg溴化锂，加完后搅拌1h，将4.37kg2-氰基溴苄（SM002） 溶于18L DMF和DMSO体积比为6:1的混合溶剂中，溶解后滴入上述反应液中， 保持反应液温度在-5～0℃，滴加结束后，保持温度继续搅拌1h，加热至室温， 搅拌24h，TLC检测反应（石油醚：乙酸乙酯=1:1），原料SM002消失时反应结 束，缓慢加入约1.25L水，将反应液减压浓缩，剩余反应液约12L，搅拌，将反 应液缓慢倒入140L水中水洗，有大量固体生成，搅拌2h，抽滤，反复水洗三次， 50℃鼓风干燥约12h，得类白色固体4.64kg。将所得4.64kg类白色固体投入46L 三氯甲烷中，加热回流10h，趁热抽滤，得到的固体在50℃鼓风干燥约12h后， 溶于约5倍体积的DMF中至澄清后，缓慢倒入约10倍DMF体积的水中，搅拌， 抽滤，固体用20L水打浆洗涤两次后，于50℃鼓风干燥约12h，再投入10倍体 积的三氯甲烷中，加热回流10h，趁热抽滤，固体于50℃鼓风干燥12h，得类白 色固体1.95kg，即为第一中间体2-（（6-氯-2,4-二氧-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基）甲 基）苯甲腈（S100801），收率约为31%。表一为本步骤中的投料比。
表一步骤一的投料比
物料 投料量（kg） 质量比
SM001 3.5 1 SM002 4.37 1.25 60%NaH 1.05 0.3 LiBr 1.85 0.53 溶剂 DMF/DMSO/水 /
二）采用氮气保护，将1.9kg第一中间体S100801投入50L反应釜中，加入 38L DMF和四氢呋喃体积比为1:1的混合溶液，搅拌冷却至温度-5℃左右，分批 加入350g60%的氢化钠，加完继续搅拌1h，再分批加入510g溴化锂，加完继 续搅拌1h，滴入2.35kg碘甲烷，保持温度-5-0℃并搅拌1h，加热升温至室温， 搅拌12h，TLC检测（石油醚：乙酸乙酯=1:1）到原料S100801消失，反应结束， 在反应液中加入1.3L水，减压浓缩，残余物约10L，将约10L残余物倒入120L 水中水洗，搅拌，抽滤，反复水洗两次，固体于50℃鼓风干燥约12h，得黄色 固体2-（（6-氯-3-甲基-2,4-二氧-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基）甲基）苯甲腈（S100802） 1.85g，收率90%。表二为本步骤的投料比。
表二步骤二的投料比
物料 投料量（kg） 质量比 S100801 1.9 1 碘甲烷 2.35 1.23 LiBr 0.51 0.27 60%NaH 0.35 0.18 溶剂 DMF/四氢呋喃/水 /
三）采用氮气保护，将1.8kg黄色固体（S100802）、1.48kg（R）-3-Boc-氨 基哌啶（SM003）和1.8kg碳酸钾加入20L反应釜中，向反应釜中加入15L DMF， 加热至70～80℃反应8h，TLC检测（石油醚：乙酸乙酯=1:1）至黄色固体（S100802） 消失，反应结束，冷却至室温，过滤掉碳酸钾，固体用少量DMF洗涤，合并滤 液，减压浓缩，残余物为红棕色粘稠物，冷却至室温后加入10L二氯甲烷，搅 拌溶解，饱和食盐水洗涤，分液后，水层用3L二氯甲烷分两次萃取，合并有机 层，然后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤去干燥剂，滤液减压浓缩至 干，残余物为粘稠物，加入2L乙酸乙酯，减压浓缩，除去残余的二氯甲烷，得 淡棕色固体，于40℃鼓风干燥约12h，得2.8kg第二中间体N-（3-（2-氰基苄基） -1-甲基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氢嘧啶-4-基）哌啶-（3R）-3-氨基甲酸叔丁酯 （S100803），收率约为96%。表三为本步骤的投料比。
表三步骤三的投料比
物料 投料量（kg） 质量比 S100802 1.8 1 SM003 1.48 0.82 碳酸钾 1.8 1 溶剂 DMF/二氯甲烷/乙酸乙酯 /
四）采用氮气保护，将2.75kg第二中间体（S100803）投入50L反应釜中， 加入22L二氯甲烷，搅拌溶解，完全溶解后，滴入5.6L三氟乙酸，控制温度在 20～30℃，滴加结束后搅拌12h。TLC检测（石油醚：乙酸乙酯=1:3）至溶液中 无第二中间体（S100803），将反应液减压浓缩至干，残余物中加入15L二氯甲 烷，搅拌溶解后用15L饱和碳酸钠水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取 （5L*2），合并有机层，反复两次后用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥， 滤去干燥剂，滤液减压浓缩至干，残余物为粘稠状液体，加入10L乙酸乙酯， 继续减压浓缩至干，得粉色固体2.02kg。氮气保护下将2.02kg固体加入到7L 乙酸乙酯中，加热完全溶解后，回流1h，趁热抽滤，滤液自然冷却至15～20℃， 搅拌10h，析晶、抽滤得固体，再用少量乙酸乙酯洗涤固体，于40℃鼓风干燥 12h，再次将所得固体用3.5倍体积的乙酸乙酯重结晶，得1.17kg第三中间体 （S100804），收率约为58%。表四为本步骤的投料比。
表四步骤四的投料比
物料 投料量（kg） 质量比
S100803 2.75 1 三氟乙酸 5.6L / 溶剂 二氯甲烷/乙酸乙酯 /
五）采用氮气保护，将1.15kg第三中间体（S100804）投入20L反应釜中， 加入11.5L四氢呋喃，微热溶解，待固体溶解完全后，加入415g苯甲酸，加热 回流，反应液中有固体析出，5h后停止加热，自然冷却至15～20℃，搅拌10h， 析晶并抽滤，洗涤除去残余的四氢呋喃，40℃鼓风干燥约12h，得类白色固体 1.45kg，即为苯甲酸阿格列汀粗品，收率约为91%。表五为本步骤的投料比。
表五步骤五的投料比
物料 投料量（kg） 质量比 S100804 1.15 1 苯甲酸 415g 0.36 溶剂 四氢呋喃 /
六）采用氮气保护，将1.45kg苯甲酸阿格列汀粗品投入20L反应釜中，加 入9.5L甲醇，加热至固体完全溶解，再加入12.3L乙酸乙酯，加热回流1h，趁 热滤去不溶物，自然冷却至15～20℃，搅拌10h后析晶并抽滤，固体用少量乙酸 乙酯洗涤，于40℃鼓风干燥约12h，得苯甲酸阿格列汀成品0.94kg，收率约为 65%。
用本实施例制成的苯甲酸阿格列汀添加辅助物制成药物阿格列汀，对其药 效做以下研究。
1、体外试验
（1）对酵素抑制活性的研究
通过DPP-4和阿格列汀的结晶体结构发现，阿格列汀不仅仅是与DPP-4的 活性部分结合形成，Glu205与Glu206通过静电相互作用，Arg125和Tyr631通 过氢键结合，Tyr547和π-π键通过堆叠等多种作用达到平衡，根据利用效率， DPP-4优先与小分子量的结合，且结合作用较强。事实上，阿格列汀对DPP-4 的IC50值为6.9nM，对DPP-4类绿酵素如DPP-2、DPP-8、DPP-9、PREP、FAP 的IC50值>100000nM，阿格列汀与西他列汀与维格列汀相比，对酶的选择性能 更好，表现出极强的DPP-4抑制活性。
（2）对DPP-4的抑制效果
①对DPP-4活性的抑制作用
人结肠腺癌取得细胞粗提液中提取出DPP-4或者以人、犬、大鼠血浆作为 酶原使用，作为基质使用Gly-Pro-Pna·Tos，反应1小时后的吸光度（405nm）作 为指标来测定酶原活性。计算出IC50值。
对人类结肠腺癌细胞中取得的人型DPP-4以及人、犬、大鼠血浆中DPP-4 的抑制效果如表六所示。
表六阿格列汀对DPP-4的抑制活性
②对亲合酶的抑制作用
人类组使用纯化的重组酶。DPP-4、DPP-2、DPP-8、DPP-9以及FAP/seprase 的酶原活性利用Ala-Pro-AFC作为基质，发生反应的AFC荧光强度（Ex： 400nm/Em：505nm）为指标进行测定。PERP的酶原活性用苄氧羰基Gly-Pro-AMC 为基质，发生反应的AFC荧光强度（Ex：375nm/Em：460nm）为指标进行测定。 类胰蛋白酶的酶原活性以α-N-苄氧羰基-赖氨酸苄硫基酯为基质，发生反应的苄 硫基乙醇的吸光强度（OD405nm）为指标进行测定。
结果发现对任何一种DPP-4的亲合酶（DPP-2、DPP-8、DPP-9、PREP、 FAP/seprase以及类胰蛋白酶）的抑制活性都很低，但对DPP-4，阿格列汀表现 出了高度选择的抑制活性。
表七阿格列汀对DPP-4类亲合酶的抑制活性
酶原 IC50值（nmol/L）
阿格列汀 西他列汀 维格列汀 DPP-4 6.9±1.5 12.1±0.8 23.8±1.6 DPP-2 >100000 >50000 >100000 DPP-8 >100000 19000±2000 1400±200 DPP-9 >100000 62000±4000 81.5±8.1 PREP >100000 >100000 >50000 FAP/seprase >100000 >100000 73000±8000 类胰蛋白酶 >390000 >400000 >200000
体内试验
对非肥胖型2型糖尿病的改善作用：
（1）对N-STZ-1.5大鼠血浆中的DPP-4抑制及活性GLP-1的促进作用
41周龄的雄性N-STZ-1.5大鼠（每组8只），禁食1日后，分别按0.1、0.3、 1和3mg/kg剂量经口给药阿格列汀，给药1.5小时后采血。用Gly-Pro-Pna·Tos 为基质，生成的pNA的吸光度（405nm）为指标测定血浆中DPP-4的活性。另 外给药2小时后经口给予液体样品（20kcal/kg），给予液体样品5分钟后采血， 测定活性GLP-1。结果发现，阿格列汀给药后，血浆中DPP-4活性的剂量依存 性下降，活性GLP-1浓度的剂量依存性则上升。具体结果如图1和图2所示。
（2）对N-STZ-1.5大鼠的降血糖作用
23周龄的雄性N-STZ-1.5大鼠（每组6只），禁食一晚后，分别按0.03、0.1、 0.3、1和3mg/kg剂量经口给药阿格列汀，给药1小时侯后按1g/kg剂量口服给 药葡萄糖。分别在葡萄糖给药前和给药后10、30、60以及120分钟后采血，检 测血浆葡萄糖浓度以及血浆胰岛素浓度。给药阿格列汀后，糖浓度增加后的血 浆血糖增加面积显著降低了0.3mg/kg以上，糖浓度增加后10分钟的血浆胰岛素 浓度显著上升了0.1mg/kg以上。
（1）对Wistar Fatty大鼠的活性GLP-1增加作用
13周龄的雄性Wistar Fatty大鼠（每组9只），绝食一晚后，分别按0.3、1 和3mg/kg口服给药阿格列汀。给药1小时后按1g/kg剂量口服葡萄糖。分别在 给药葡萄糖前后给药后10分钟采血，测定血浆中活性GLP-1浓度。给药阿格列 汀后，活性GLP-1浓度显著增加。
（2）对Wistar Fatty大鼠的降血糖作用
11周龄的雄性Wistar Fatty大鼠（每组6只），禁食一晚后，分别按0.01mg/kg、 0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg剂量口服给药阿格列汀，给药1小时 后按1g/kg剂量口服给药葡萄糖。分别在葡萄糖给药前后给药后10、30以及60 分钟后采血，测定血浆葡萄糖浓度和血浆胰岛素浓度。给药阿格列汀后，糖增 加后的血浆血糖增加面积显著降低了0.3mg/kg以上，糖增加10分钟后的血浆胰 岛素浓度显著上升了1mg/kg以上。
对健康动物进行试验：
7周的雄性SD大鼠，每组6只。禁食一晚后分别按30mg/kg、100mg/kg剂 量灌胃给药阿格列汀，分别在给药前和给药后30、60以及120分钟采血，应用 酶原法用生化自动分析仪测定血浆葡萄糖浓度，用放射免疫法测定血浆胰岛素 浓度。具体结果如图3-5所示。
对肥胖2型糖尿病动物的胰腺β细胞的影响：
7周龄的雄性ob/ob小鼠（每组7只）已经正常对照组小鼠（4只）。ob/ob 小鼠按0.03%（w/w）混合给药阿格列汀，持续4周，测定各种参数。以 Gly-Pro-pNA·Tos为基质，生成的pNA的吸光度（405nm）为指标测定血浆中 DPP-4活性。胰脏的免疫染色时用Bouin氏液将胰脏固定后，用胰岛素抗体进行 染色。给药阿格列汀后，血浆中的DPP-4活性受到抑制，血中糖化血红蛋白浓 度显著降低，血浆胰岛素浓度以及胰腺胰岛素的含量显著增加。另外，在免疫 组织染色方面，阿格列汀给药后，胰脏的胰岛素染色特性保持不变。
以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也视为本发明的保护范围。