《具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其制备和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其制备和应用.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 101712866 B (45)授权公告日 2013.03.06 CN 101712866 B *CN101712866B* (21)申请号 200810013548.4 (22)申请日 2008.10.07 C09K 11/06(2006.01) C08G 77/26(2006.01) C08G 77/28(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 吴晶 袁景利 关亚风 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 。
2、代理人 马驰 周秀梅 CN 1482459 A,2004.03.17, CN 1566954 A,2005.01.19, (54) 发明名称 具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其 制备和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种可见光激发的强荧光性纳 米铕荧光微粒的制备及其在生物检测技术中的应 用。首先利用氨基硅烷化试剂与可见光激发的三 元铕配合物形成荧光前驱体， 然后再与硅酸酯在 油包水型微乳液中共聚， 生成一种表面带有活性 基团的纳米铕荧光微粒。这种纳米铕荧光微粒具 有强可见激发峰， 荧光寿命在 390 微秒左右， 荧光 量子产率可达 66。将其作为生物荧光标记物 进行时间分辨荧光生物测定时。
3、可有效消除各种短 寿命背景荧光的干扰， 且采用可见光激发可显著 提高标记物的光稳定性并减少对生物样品的光损 伤， 在时间分辨荧光免疫分析、 活细胞及生物组织 染色以及时间分辨荧光显微镜成像分析等生化检 测领域中有重要的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丹 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 5 页 1/2 页 2 1. 具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒， 其特征在于 ： 其是由氨基硅烷化试剂与一 种可见光激发的三元铕配合物于有机溶剂中发生共价键合反应，。
4、 得到荧光前驱体， 然后其 再与硅酸酯及带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体发生共聚， 形成具有可见光激发性能 且可用于生物标记的功能性纳米铕荧光微粒 ； 其中所述的可见光激发的三元铕配合物是由三价铕离子与四齿 - 二酮类配位体和 2-(4-N， N- 二乙基苯胺基 )-4， 6- 二 (3， 5- 二甲基吡唑基 )-1， 3， 5- 三嗪配位体形成的三元 荧光配合物， 两种配位体的结构式为 ： 式中 R 为 C6F5或脂肪烃类取代基 CnH2n+1或 CnF2n+1， 其中 n 1、 2、 3、 4 或 5 ； 所述三价铕离子、 四齿 - 二酮类配位体及 2-(4-N， N- 二乙基苯胺基 )。
5、-4， 6- 二 (3， 5- 二甲基吡唑基 )-1， 3， 5- 三嗪， 它们之间的摩尔比例为 1 0.5 3 0.5 3， 并保持 四齿 - 二酮类配位体与氨基硅烷化试剂的摩尔比例为 1 1 4。 2. 根据权利要求 1 所述的纳米铕荧光微粒， 其特征在于 ： 所述硅酸酯的分子式为 Si(OR)4， 其中的 R 是 -CnH2n+1， n 1 5。 3. 根据权利要求 1 所述的纳米铕荧光微粒， 其特征在于 ： 所述氨基硅烷化试剂及带有 氨基的硅烷化单体均为 3- 氨基丙基三烷氧基硅或 N-(- 氨乙基 )- 氨丙基三乙氧基 硅， 带有巯基的硅烷化单体为 3- 巯基丙基三烷氧基硅。 4. 。
6、一种权利要求 1 所述的纳米铕荧光微粒的制备方法， 其特征在于 ： 具体操作过程为， 1) 荧光前躯体 ： 在有机溶剂中， 先将四齿 - 二酮类配位体与氨基硅烷化试剂在室温 条件下搅拌0.54小时， 使之发生共价结合反应， 两者的摩尔比例为115， 体系中四 齿 - 二酮类配位体的摩尔浓度为 1 15mol/ml， 然后再加入 Eu3+和 2-(4-N， N- 二乙基 苯胺基)-4， 6-二(3， 5-二甲基吡唑基)-1， 3， 5-三嗪继续搅拌424小时， 保持Eu3+、 四齿 - 二酮类配位体及 2-(4-N， N- 二乙基苯胺基 )-4， 6- 二 (3， 5- 二甲基吡唑基 )-1， 。
7、3， 5- 三 嗪的摩尔比例为 1 0.5 3 0.5 3， 蒸发溶剂并干燥得到可见光激发的荧光前躯体 ； 2) 配制微乳液 ： 将有机溶剂、 助表面活性剂、 表面活性剂和水按摩尔比为 15 25 2 7 1 6 10 均匀混合后制成微乳液 ； 3)在微乳液中加入荧光前躯体， 室温条件下搅拌0.51小时， 然后加入硅酸酯和带有 活性基团氨基或巯基的硅烷化单体， 用重量含量 3-25的氨水引发聚合， 搅拌下室温反应 4 48 小时， 离心分离即可， 从而制备出可见光激发且具有生物标记功能的荧光纳米微粒 ； 荧光前躯体在微乳液体系中的浓度为 0.05 1mg/ml ； 权 利 要 求 书 CN 1。
8、01712866 B 2 2/2 页 3 硅酸酯与带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体的摩尔比为 1 0.05 0.2， 硅酸酯 在微乳液体系中的摩尔浓度为 14 45mol/ml ； 所述有机溶剂为 ： 苯、 正己烷、 环己烷或石油醚 ； 助表面活性剂为乙醇、 丙醇、 异丙醇、 正己醇、 乙二醇、 正辛醇或正癸醇 ； 表面活性剂为聚氧乙烯基辛基苯基醚或聚氧乙烯基壬基 苯基醚。 5. 按照权利要求 4 所述的纳米铕荧光微粒的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 1) 和 3) 中所述氨基硅烷化试剂及带有氨基的硅烷化单体均为 3- 氨基丙基三烷 氧基硅或 N-(- 氨乙基 )- 氨丙基三乙氧基硅 ； 。
9、步骤 3) 中所述带有巯基的硅烷化单体为 3- 巯基丙基三烷氧基硅。 6. 一种权利要求 1 所述纳米铕荧光颗粒作为生物标记物的应用， 其特征在于 ： 所述纳 米铕荧光颗粒作为纳米探针， 利用时间分辨荧光测定方式进行生化测定。 7. 按照权利要求 6 所述的应用， 其特征在于 ： 所述时间分辨荧光测定方式是指时间分 辨荧光免疫测定法、 时间分辨荧光 DNA 杂交测定法、 时间分辨荧光显微镜成像测定法、 时间 分辨荧光细胞活性测定法或时间分辨荧光生物芯片测定法。 权 利 要 求 书 CN 101712866 B 3 1/7 页 4 具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其制备和应用 技术领域 00。
10、01 本发明涉及一种可见光激发的纳米铕荧光生物标记材料， 具体地说是一种可用于 生物分子标记的具有可见光激发性质的纳米铕荧光微粒的制备及其在时间分辨荧光生物 检测中的应用。 背景技术 0002 稀土 ( 铕和铽 ) 荧光配合物具有非常特殊的荧光性质， 如长的荧光寿命， 大的 Stokes 位移和尖的发射光谱。基于这些特征， 以稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨 荧光免疫测定技术近 20 年来已经取得了重大的进展， 在医学与生命科学的实践与研究中 发挥着越来越重要的作用。近年来， 基于稀土荧光配合物的时间分辨荧光生物成像分析技 术也成为一种有用的工具， 在生物分子的可视化测定及环境病源微生物检测。
11、等方面得到 了成功的应用 ( 文献 1 ： K.Suhling， P.M.W.French， D.Phillips， Photochem.Photobiol. Sci.2005， 4， 13 ； 文 献 2 ： R.Connally， D.Veal， J.Piper， Microsc.Res.Techniq.2004， 64， 312)。时间分辨荧光生物分析技术的最大优点是通过在脉冲激发后引入适当的延迟时间， 完全消除各种散乱光和生物样品中各种短寿命背景荧光的干扰， 从而极大地提高测定灵敏 度。 0003 由于绝大多数铕、 铽配合物的荧光发光要经过分子内三线态能量传递过程， 其激发窗口被限制在。
12、小于 370nm 的近紫外区域 ( 文献 3 ： F.J.Steemers， W.Verboom， D.N.Reinhoudt， E.B.V.D.Tol， J.W.Verhoeven， J.Am.Chem.Soc.1995， 117， 9408)， 这种高 能量的短波长激发光不但对生物样品具有一定的损伤作用， 对标记物本身的光稳定性也有 显著影响。因此， 开发一种可见光激发的稀土荧光探针意义重大。目前已有几个研究小 组开发出了几种长波长激发的铕配合物 ( 文献 4 ： Y.Bretonnire， M.J.Cann， D.Parker， R.Slater， Chem.Commun.2002， 1。
13、930 ； 文献 5 ： J.H.Yu， D.Parker， R.Pal， R.A.Poole， M.J.Cann， J.Am.Chem.Soc.2006， 128， 2294 ； 文献 6 ： R.Pal， D.Parker， Chem.Commun.2007， 474 ； 文献 7 ： M.H.V.Werts， M.A.Duin， J.W.Hofstraat， J.W.Verhoeven， Chem.Commun.1999， 799 ； 文献 8 ： C.Yang， L.M.Fu， Y.Wang， J.P.Zhang， W.T.Wong， X.C.Ai， Y.F.Qiao， B.S.Zou。
14、， L.L.Gui， Angew.Chem.Int.Ed.2004， 43， 5010 ； 文献 9 ： S.M.Borisov， O.S.Wolfbeis， Anal. Chem.2006， 78， 5094)， 但是由于这些配合物存在着水不溶性、 极性溶剂中不稳定或量子产 率低等缺陷限制了其在生物标记中的应用。 0004 稀土荧光配合物直接作为标记物使用的另外一个缺点是抗光漂白能力差， 这也 是所有分子标记物的共同缺陷。随着纳米生物分析技术的发展， 各种功能性纳米荧光材 料相继出现， 并广泛应用在生物大分子的单分子原位检测、 荧光显微镜检测等生物测定技 术领域。纳米荧光生物探针由于可包覆大。
15、量的荧光分子使其荧光信号得到放大， 显著提 高测定的灵敏度， 并且在外层包覆基质的保护下荧光分子的光稳定性也可显著增强。目 前已经开发出的纳米荧光生物探针主要有 ： (1) 半导体纳米晶 ( 又称量子点 ) ； (2) 内包 荧光分子的复合纳米荧光颗粒 ( 一类是高分子塑料基质纳米荧光颗粒， 另一类是内包各 说 明 书 CN 101712866 B 4 2/7 页 5 种荧光物质的纳米硅胶颗粒 )( 文献 10 ： W.H.Liu， M.Howarth， A.B.Greytak， Y.Zheng， Nocera， D.G.A.Y.Ting， M.G.Bawendi， J.Am.Chem.Soc。
16、.2008， 130， 1274 ； 文献 11 ： X.J.Zhao， L.R.Hilliard， S.J.Mechery， Y.P.Wang， R.P.Bagwe， S.G.Jin， W.H.Tan， Proc.Natl.Acad. Sci.USA2004， 101， 15027)， 但这些荧光微粒用于生物测定时仍存在着发光闪烁、 标记过程 复杂、 荧光分子易泄漏以及严重的背景荧光干扰等问题。 0005 最近， 几种基于铕、 铽配合物的复合纳米荧光微粒已被开发出来并被用于高灵敏 度时间分辨荧光免疫分析及成像检测 ( 文献 12 ： Y.Xu， Q.G.Li， Clin.Chem.2007，。
17、 53， 1503 ； 文献 13 ： P.Huhtinen， M.O.Kuronen， V.Hagren， H.Takalo， H.Tenhu， T. ， H.， Anal.Chem.2005， 77， 2643 ； 文献 14 ： 袁景利， 谭明乾， 叶志强， 王桂兰， 一种功 能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用， 中国发明专利， 专利号 ： ZL02144517.6 ； 文献 15 ： 袁景利， 谭明乾， 海晓丹， 王桂兰， - 二酮 - 三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应 用， 中国发明专利， 专利号 ： ZL03133857.7 ； 文献 16 ： J.Wu， G.L.Wang， 。
18、D.Y.Jin， J.L.Yuan， Y.F.Guan， J.Piper， Chem.Commun.2008， 365)， 然而， 这些纳米稀土荧光微粒仍无法避免使 用高能量的紫外激发光源， 因此在一些应用领域受到限制。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种具有可见光激发性能且可用于生物标记的强荧光性纳 米铕荧光微粒， 并将其作为荧光标记物用于时间分辨荧光免疫测定及复杂环境样品中病源 微生物的时间分辨荧光显微成像测定。 0007 本发明的技术方案如下 ： 0008 首先将四齿 - 二酮类配位体和氨基硅烷化试剂发生共价结合反应， 再与 EuCl3 和2-(4-N， N-二乙基苯胺基)-4，。
19、 6-二(3， 5-二甲基吡唑基)-1， 3， 5-三嗪(DPBT)反应制成 可见光激发的荧光前躯体， 然后将该前躯体与硅酸酯和带有活性基团氨基或巯基的硅烷化 单体用氨水引发共聚合， 从而制备出具有强可见激发和生物标记功能的纳米铕荧光微粒。 所用四齿 - 二酮类配位体及 DPBT 的结构式如下 ： 0009 0010 其中 R 为 C6F5或脂肪烃类取代基 CnH2n+1， CnF2n+1， 其中 n 1、 2、 3、 4 或 5(R 为 C3F7时配位体缩写为 BHHCT) ； 0011 所述三价铕离子、 四齿 - 二酮类配位体及 2-(4-N， N- 二乙基苯胺基 )-4， 6- 二 (3。
20、， 5-二甲基吡唑基)-1， 3， 5-三嗪， 它们之间的摩尔比例为1 ： 0.53 ： 0.53， 并保持四 说 明 书 CN 101712866 B 5 3/7 页 6 齿 - 二酮类配位体与氨基硅烷化试剂的摩尔比例为 1 ： 1 4 ； 0012 所述硅酸酯的分子式为 Si(OR)4， 其中的 R 是CnH2n+1， n 1 5。 0013 所述氨基硅烷化试剂及带有氨基的硅烷化单体均可为 3- 氨基丙基三烷氧基硅或 N-(- 氨乙基 )- 氨丙基三乙氧基硅， 带有巯基的硅烷化单体为 3- 巯基丙基三烷氧基 硅。 0014 可见光激发纳米铕荧光微粒的具体制备过程为 ： 0015 1) 荧光。
21、前躯体 ： 在有机溶剂中， 先将四齿 - 二酮类配位体与氨基硅烷化试剂在 室温条件下搅拌0.54小时， 使之发生共价结合反应， 两者的摩尔比例为1 ： 14， 体系中 四齿 - 二酮类配位体的摩尔浓度为 1 15mol/ml， 然后再加入 Eu3+和 2-(4-N， N- 二乙 基苯胺基)-4， 6-二(3， 5-二甲基吡唑基)-1， 3， 5-三嗪继续搅拌4-24小时， 保持Eu3+、 四齿 - 二酮类配位体及 2-(4-N， N- 二乙基苯胺基 )-4， 6- 二 (3， 5- 二甲基吡唑基 )-1， 3， 5- 三 嗪的摩尔比例为 1 ： 0.5 3 ： 0.5 3， 蒸发溶剂并干燥得到。
22、可见光激发的荧光前躯体 ； 0016 2) 配制微乳液 ： 将有机溶剂、 助表面活性剂、 表面活性剂和水按摩尔比为 15 25:2 7:1:6 10 均匀混合后制成微乳液 ； 0017 3)在微乳液中加入荧光前躯体， 室温条件下搅拌0.51小时， 然后加入硅酸酯和 带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体， 用重量含量 3-25的氨水引发聚合， 搅拌下室温 反应 4 48 小时， 离心分离即可。 0018 荧光前躯体在微乳液体系中的浓度为 0.05 1mg/ml ； 0019 硅酸酯与带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体的摩尔比为 1:0.05 0.2， 硅酸 酯在微乳液体系中的摩尔浓度为 14 45。
23、mol/ml。 0020 所述有机溶剂为 ： 苯、 正己烷、 环己烷或石油醚 ； 助表面活性剂为乙醇、 丙醇、 异丙 醇、 正己醇、 乙二醇、 正辛醇或正癸醇 ； 表面活性剂为聚氧乙烯基辛基苯基醚或聚氧乙烯基 壬基苯基醚。 0021 总之， 本发明以可见光激发强荧光性三元铕配合物为发光物质， 采用共价键合的 方法将稀土荧光配合物牢固地固定在硅胶的网络体系中， 通过反相微乳液共聚合成粒技术 制备而成， 并且纳米微粒表面同时引入可与生物分子共价键结合的活性官能团。 0022 本发明的可见光激发纳米铕荧光微粒可作为标记物用于各种时间分辨荧光生物 分析法， 包括时间分辨荧光免疫分析法， 时间分辨荧光 。
24、DNA 杂交分析法， 时间分辨荧光显微 镜成像分析法及时间分辨荧光生物芯片分析法。 0023 本发明的纳米铕荧光微粒作为标记物具有如下优点 ： 0024 (1)实现了具有可见激发峰的长荧光寿命生物标记物。 在水溶液中， 本发明的纳米 铕荧光微粒在可见光区仍有强激发峰， 其激发光谱可延伸到 450nm 以上的蓝光区。 0025 (2) 显著提高了纳米荧光生物探针的荧光发光强度。本发明采用的新型三元铕配 合物前驱体本身具有很强的荧光发光强度， 采用该前驱体与硅酸酯共聚合的方法使得单个 纳米颗粒中固定有大量的铕配合物， 极大地提高了纳米荧光微粒的荧光发光强度。 0026 (3)光稳定性增强。 相对于。
25、绝大多数紫外光激发的稀土荧光化合物而言， 低能量的 可见光激发使纳米铕荧光颗粒的抗光漂白能力显著提高， 可延长标记物的连续测定时间， 同时， 外层二氧化硅基质可以有效屏蔽周围溶剂和活性自由基， 进一步保护内部的铕配合 物。 说 明 书 CN 101712866 B 6 4/7 页 7 0027 (4) 本发明建立了基于可见光激发纳米铕荧光标记物的高灵敏度病源微生物的时 间分辨荧光显微成像分析新方法。 该方法不仅可完全消除复杂环境样品中各种短寿命背景 荧光对测定的干扰， 使得测定的特异性及灵敏度得以极大地提高， 而且由于可见光激发的 时间分辨荧光测定可避免激发光对生物样品的损伤， 预示了新方法在。
26、活细胞及生物组织时 间分辨荧光显微成像测定领域也应具有很好的应用前景。 附图说明 0028 图 1 是可见光激发纳米铕荧光颗粒的透射电子显微镜照片。a， b， c， d， e 分别为加 入不同量 (2， 4， 6， 8， 10 毫克 ) 荧光前驱体时得到的纳米铕荧光颗粒。 0029 图2是荧光前驱体APS-BHHCT-Eu3+-DPBT在不同溶剂中的时间分辨荧光激发光谱。 a， N， N- 二甲基甲酰胺 ； b， 四氢呋喃 ； c， 乙醇 ； d， 丙酮 ； e， 正庚烷 ； f， 甲苯 ； g， 氯仿 ； h， 二氯甲 烷。 0030 图 3 是可见光激发纳米铕荧光颗粒在 pH 值 7.8 。
27、的 Tris-HCl 缓冲溶液中的时间分 辨荧光光谱。 0031 图 4 是可见光激发纳米铕荧光颗粒 (A) 和纯硅胶纳米微粒 (B) 的紫外 - 可见吸收 光谱。 0032 图 5 是可见光激发纳米铕荧光颗粒 (A) 和罗丹明 B(B) 的光稳定性实验结果。 0033 图 6 是用可见光激发纳米铕荧光颗粒标记链霉亲合素时间分辨荧光免疫测定人 血清中的前列腺特异抗原 (PSA) 的工作曲线。 0034 图 7 是用可见光激发纳米铕荧光颗粒标记链霉亲合素时间分辨荧光显微成像测 定环境水样品中病源微生物蓝氏贾第鞭毛虫的成像图片。(a) 明场成像 ； (b)330-380nm 激 发常规荧光成像 ；。
28、 (c)380-420nm 激发常规荧光成像 ； (d)330-380nm 激发时间分辨荧光成 像 ； (e)380-420nm 激发时间分辨荧光成像。 0035 图 8. 用可见光激发纳米铕荧光颗粒标记链霉亲合素时间分辨荧光显微成像测定 环境水中蓝氏贾第鞭毛虫对照实验的显微镜成像图片。(a) 明场成像 ； (b)330-380nm 激发 常规荧光成像 ； (c)380-420nm 激发常规荧光成像 ； (d)330-380nm 激发时间分辨荧光成像。 0036 图 9 是可见光激发纳米铕荧光颗粒特异性识别蓝氏贾第鞭毛虫后在显微镜下的 光稳定性实验测定结果。(A) 在汞灯 330-380nm 。
29、波段强光下照射 5 分钟的时间分辨荧光图 片 (330-380nm 氙灯激发 ) ； (B) 在汞灯 380-420nm 波段强光下照射 5 分钟的时间分辨荧光 图片 (380-420nm 氙灯激发 )。 具体实施方式 0037 下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例仅用于对本发明进行说明， 基 于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。 0038 实施例 1 ： 可见光激发纳米铕荧光颗粒的制备及表征 0039 (1) 荧光前驱体 APS-BHHCT-Eu3+-DPBT 的制备 0040 将 25mol BHHCT 溶于 4mL 无水四氢呋喃中， 搅拌下加入 62.5mol 氨丙基三乙。
30、 氧基硅烷 (APS)， 室温搅拌 3 小时， 然后加入 15mL 溶有 50molDPBT 的无水四氢呋喃溶液， 稍加搅拌后加入 25mol EuCl36H2O， 搅拌 24 小时， 用旋转蒸发仪将溶剂蒸干并真空干燥 说 明 书 CN 101712866 B 7 5/7 页 8 即得荧光前驱体 APS-BHHCT-Eu3+-DPBT。 0041 (2) 可见光激发纳米铕荧光生物探针的制备 0042 将上述荧光前驱体 APS-BHHCT-Eu3+-DPBT(2 毫克， 4 毫克， 6 毫克， 8 毫克和 10 毫 克 ) 溶于 1.5mL 甲苯中， 分别加入到含有 7.25 克环己烷、 2.3。
31、7 克 Triton X-100、 1.82 克正 辛醇和 0.55mL 水的反相微乳液中， 室温搅拌 15 分钟， 然后加入 100L 正硅酸乙酯 (TEOS) 和 5LAPS， 再加入 100L 氨水引发聚合。反应液室温反应 24 小时后， 加入乙醇将固体纳 米微粒沉淀出来， 离心后用乙醇和水洗， 以除去未反应的原料和表面活性剂。 0043 (3) 纳米铕荧光微粒的形态及大小尺寸表征 0044 图 1 是可见光激发纳米铕荧光颗粒的透射电子显微镜照片， 从图可见当前驱体加 入量为 2-8 毫克时， 纳米荧光颗粒呈均匀的圆球形， 粒径均小于 50nm， 且单分散性好。继续 增大前驱体加入量到 。
32、10 毫克， 则纳米荧光颗粒表面变得粗糙并出现聚集。此外， 粒径的大 小可以通过调整前驱体的量、 水与表面活性剂的比例、 助表面活性剂的种类、 氨水的浓度、 硅酸酯 ( 如 TEOS) 的量以及反应时间等来进行控制。 0045 (4) 荧光前驱体 APS-BHHCT-Eu3+-DPBT 的荧光光谱特性 0046 图 2 是荧光前驱体 APS-BHHCT-Eu3+-DPBT 在不同有机溶剂中的时间分辨荧光激 发光谱。从图中可见在极性小的非配位型溶剂中 ( 如甲苯、 氯仿、 正庚烷和二氯甲烷等 )， 前驱体在 406nm 处的可见激发峰非常强， 而在强极性配位型溶剂中 ( 如 N， N- 二甲基甲。
33、酰 胺、 四氢呋喃、 乙醇和丙酮等 )， 可见激发峰严重减弱甚至消失， 可见溶剂性质对荧光前驱体 APS-BHHCT-Eu3+-DPBT 的荧光激发性质有很大的影响。 0047 (5) 纳米铕荧光颗粒的荧光光谱特性 0048 图3是纳米铕荧光颗粒在pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光光谱。 从图中可见纳米颗粒在缓冲溶液中仍然具有很强的 406nm 可见激发峰， 说明该制备方法得 到的纳米铕荧光颗粒在很大程度上保留了荧光前驱体的可见光激发特性。此外， 该方法制 得的纳米荧光颗粒的荧光寿命经测定为 0.39 毫秒， 说明纳米荧光微粒的荧光仍然保持了 铕配合物的长荧光寿命特征。 0。
34、049 (6) 纳米铕荧光颗粒和纯硅胶纳米颗粒的紫外 - 可见吸收光谱 0050 如图 4， 与纯硅胶纳米颗粒的紫外 - 可见吸收光谱图相比， 纳米铕荧光颗粒出现了 几个明显的吸收峰， 包括在以 416nm 为中心的可见光区的宽吸收峰， 说明荧光前驱体已被 有效地结合到了硅胶基质当中。 0051 (7) 纳米铕荧光颗粒的光稳定性实验 0052 纳米铕荧光颗粒的光稳定性实验结果如图 5 所示， 所用光源为 30W 氘灯。在氘灯 发出的强光照射 60 分钟后， 有机荧光化合物罗丹明 B 的荧光强度衰减到起始时的 32， 而 纳米铕荧光颗粒的荧光强度仅衰减到起始时的 70， 说明制成的纳米铕荧光颗粒。
35、具有远优 于有机荧光化合物的光稳定性。 0053 实施例 2 ： 纳米铕荧光颗粒作为标记物用于时间分辨荧光免疫测定人前列腺特异 抗原 ( 简称 PSA) 0054 (1) 纳米铕荧光微粒标记链霉亲和素 ( 简称 SA) 0055 将 1.0 毫克纳米铕荧光颗粒和 3.0 毫克牛血清白蛋白 (BSA) 用 pH 值 7.1 的 0.1mol L-1磷酸缓冲溶液 1.2mL 完全溶解后， 搅拌下加入 0.3mL 的 1戊二醛水溶液， 室温 说 明 书 CN 101712866 B 8 6/7 页 9 搅拌 24 小时。将纳米颗粒离心收集并用磷酸缓冲溶液充分洗涤后， 加入 0.9mL 含有 0.2 。
36、毫 克 SA 的磷酸缓冲溶液和 0.2mL 的 1戊二醛水溶液， 4搅拌 22 小时， 加入 2.0 毫克硼氢 化钠继续反应 2 小时。表面标有 SA 分子的纳米颗粒经离心、 磷酸缓冲溶液充分洗涤后， 以 pH 值 8.0 的 0.05molL-1碳酸氢铵水溶液为洗脱液， 用 1.029.1cm 的 SephadexG-50 柱 进一步纯化， 得到 2.6mL 纳米颗粒标记的 SA 溶液。加入 5.2 毫克的 BSA 和 2.6 毫克的叠氮 化钠， 4保存备用。当用于免疫测定时， 用含有 0.2 BSA-0.1 NaN3-0.9 NaCl 的 pH 值 7.8 的 0.05molL-1Tris。
37、-HCl 缓冲溶液稀释。 0056 (2) 生物素标记山羊抗人 PSA 抗体的制备 0057 1.0mL 的山羊抗人 PSA 抗体 (0.5mgmL-1) 在 4、 24 小时对 3L 水两次透析后， 加 入8.4毫克的碳酸氢钠和3毫克的NHS-LC-biotin， 室温搅拌1小时后， 4下24小时放置。 反应液在 4、 24 小时对 3L 含有 0.25 克叠氮化钠的 0.1mol/L 碳酸氢钠水溶液两次透析后 加入 5 毫克的 BSA 和 5 毫克的叠氮化钠， 放置 -20备用。当用于免疫测定时， 用缓冲溶液 1 稀释 300 倍后使用。 0058 (3) 时间分辨荧光免疫测定人 PSA 。
38、0059 (a)96 微孔板的包被 ： 在 96 微孔板的各孔中分别加入 50L 含有 10gmL-1小 鼠抗人 PSA 单克隆抗体的 pH 值 9.6 的 0.1mol L-1碳酸氢钠缓冲溶液， 4、 24 小时包被后， 用含有 0.05 Tween20 的 pH 值为 7.8 的 0.05mol L-1Tris-HCl 缓冲溶液 ( 缓冲溶液 1) 洗 两次， 再用 pH 值为 7.8 的 0.05mol L-1Tris-HCl 缓冲溶液 ( 缓冲溶液 2) 洗 1 次， 包被后的 微孔板 -20下保存。 0060 (b) 人 PSA 的免疫测定 ： 将 PSA 抗原标准溶液用含有 5 B。
39、SA-0.9 NaCl-0.1 NaN3 的 pH 值为 7.8 的 0.05mol L-1Tris-HCl 缓冲溶液稀释到一定浓度， 取标准溶液 45L 注入上述包被后的微孔板的各孔中， 37、 1 小时反应后， 用上述缓冲溶液 1 洗两次， 缓冲溶 液 2 洗一次。将 45L 生物素标记的抗 PSA 抗体溶液加入到各微孔中， 37、 1 小时反应后， 用上述缓冲溶液 1 洗两次， 缓冲溶液 2 洗一次。将 45L 纳米粒子标记的 SA 溶液加入到各 微孔中， 37、 1 小时反应后， 用缓冲溶液 1 洗 4 次， 然后进行固相时间分辨荧光测定。测定 用仪器为 Perkin Elmer Vi。
40、ctor1420 多标记计数仪， 测定条件为 ： 激发波长， 340nm ； 检测波 长， 615nm ； 迟延时间， 0.2ms ； 窗口时间， 0.4ms ； 循环时间， 1.0ms。 0061 用该法测定人 PSA 的工作曲线如图 6 所示， 本法的最低检出下限为 29.8pg/mL( 计 算方法 ： d1 (3SDC)/(I-I0)， SD 是本底信号的标准偏差， C 是最低测定液浓度， I 是其对 应的荧光强度， I0是本底信号的荧光强度 )， 工作曲线上限可达 50ng/mL。 0062 实施例 3 ： 纳米铕荧光颗粒作为标记物用于时间分辨荧光显微镜成像测定复杂环 境样品中的病源微。
41、生物 - 蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia) 0063 (1) 复杂环境样品中蓝氏贾第鞭毛虫的时间分辨荧光显微镜成像测定取 5L 蓝 氏贾第鞭毛虫 (2106个 /mL) 加入到 15L 含有大量各种杂质的 10000 倍浓缩环境水样 品中， 然后依次加入16L抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体(50g/mL)， 16L生物素标记的 兔抗鼠二次抗体 (50g/mL， 制备方法同生物素标记山羊抗人 PSA 抗体 ) 和 6L 纳米荧光 颗粒标记的 SA 溶液， 室温孵育 24 小时， 低速离心 (500 转 / 分 ) 收集蓝氏贾第鞭毛虫并重 新分散在水中， 反复几次除去未反应的纳米微粒。
42、和抗体。将纳米微粒免疫染色后的蓝氏贾 第鞭毛虫用环境水稀释， 然后取少量置于载波片上进行显微镜成像测定。 说 明 书 CN 101712866 B 9 7/7 页 10 0064 图 7 是环境水中蓝氏贾第鞭毛虫的显微镜成像测定结果。由图可见， 分别用 330-380nm 及 380-420nm 的激发光测得的常规荧光成像图片中存在着非常强的样品中共 存杂质的背景荧光干扰， 而采用时间分辨荧光成像模式测得的图片中杂质的背景荧光被 完全消除， 只可观察到被纳米颗粒特异性染色的蓝氏贾第鞭毛虫的红色信号， 说明时间 分辨荧光成像模式具有极高的选择性及灵敏度。此外， 对比两个激发波段 (330-380。
43、nm 和 380-420nm) 的荧光成像图片可以看出， 紫光 (380-420nm) 激发下的荧光信号强度仅仅稍弱 于紫外光 (330-380nm) 激发下的荧光信号强度， 足以满足时间分辨荧光显微成像测定的需 要。 0065 (2) 免疫染色及成像测定的特异性 - 对照实验 0066 在 5L 蓝氏贾第鞭毛虫 (2106个 /mL) 中加入 16L 生物素标记的兔抗鼠二次 抗体 (50g/mL) 和 6L 纳米荧光探针标记的 SA 溶液， 室温孵育 24 小时， 低速离心 (500 转/分)收集蓝氏贾第鞭毛虫并重新分散在水中， 反复几次除去未反应的纳米微粒和抗体， 最后用二次水稀释， 取少。
44、量置于载波片上进行显微镜成像测定。 0067 图 8 是该反应条件下蓝氏贾第鞭毛虫的显微镜成像测定结果。由图可见在不加入 抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的情况下， 蓝氏贾第鞭毛虫表面没有纳米微粒的红色荧光， 说明该条件下纳米荧光颗粒不会非特异性地吸附在蓝氏贾第鞭毛虫的表面而产生假阳性 的结果。 0068 (3) 蓝氏贾第鞭毛虫表面的纳米铕荧光标记物的光稳定性 0069 将纳米铕荧光颗粒特异性免疫染色的蓝氏贾第鞭毛虫用显微镜装备的 100W 汞灯 的 330-380nm 和 380-420nm 波段光分别照射 5 分钟， 每隔一分钟采集一次时间分辨荧光成 像图片， 观察蓝氏贾第鞭毛虫表面的纳米铕荧光。
45、标记物的光稳定性。 0070 图 9 给出了该条件下的实验结果。由图可见， 在高能量的 330-380nm 光照射下， 蓝 氏贾第鞭毛虫表面的纳米铕荧光标记物的红色荧光漂白速度很快， 到 5 分钟时已基本完全 消失， 而在低能量的 330-380nm 光照射下， 纳米铕荧光标记物的红色荧光漂白速度明显变 慢， 5分钟后红色荧光信号仍然清晰可见。 此结果有力地证明了可见光激发能够显著减弱标 记物的光漂白速度， 从而延长样品的可连续测定时间， 这种优点在某些需要长时间连续示 踪测定的研究中应具有很好的应用价值。 说 明 书 CN 101712866 B 10 1/5 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101712866 B 11 2/5 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101712866 B 12 3/5 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101712866 B 13 4/5 页 14 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 101712866 B 14 5/5 页 15 图 9 说 明 书 附 图 CN 101712866 B 15 。