一种用于微生物发酵培养原料的菊芋预处理方法 【技术领域】
本发明涉及菊芋原料的预处理方法，具体地说是一种处理菊芋原料获取培养微生物原料的方法，属于生物技术领域。
背景技术
菊芋又名洋姜、鬼子姜，是多年生菊科草本植物，它适宜于在滩涂地、盐碱地生长。菊芋块茎干物质亩产可达1.2吨，块茎中含有丰富的菊粉，占其干重的70％以上。菊粉是由D-呋喃果糖经β-2，1-糖苷键连接而成的一种果聚糖，呈直链结构，其还原性末端有一分子葡萄糖残基，每个菊粉分子约含30～50个果糖残基。与其它菊粉含量高的植物如大丽花和菊苣相比，菊芋块茎中菊粉的聚合度(DP值)在3～50表现(De Bates S，Vandamme EJ，Steinbuchel A.生物高分子.陈代杰，罗敏玉，译。北京：化学工业出版社，2004，398～425)，是微生物发酵的潜在原料。
菊芋块茎中含有少量单糖和二糖，可直接被微生物利用；但菊芋块茎中主要碳水化合物以低聚糖形式存在，微生物利用效率不及单糖和二糖。因此，虽然文献报道部分微生物可以直接利用菊芋汁或菊芋浆培养(葛向阳等.食品与生物技术学报，2006，25(2)：83～87；Bajpai P K，Bajpai P.Enzyme Microb.Technol.1991，13(4)，359～362；华艳艳等.中国生物工程杂志.2007，27(10)：59～63)，但存在菌体生长缓慢、目标产物得率不高、总糖利用度低等问题，不利于大规模工业生产。菊芋原料中还含有其它成份，如蛋白质、凝集素、果胶、多酚类化合物、粗纤维等，其中有的成份不利于微生物生长。因此，处理菊芋原料，使低聚糖成份高效水解为单糖，降解原料中抑制微生物生长的物质，具有重要工业应用价值。
菊粉水解通常在酶催化或酸催化条件下实现。酶水解反应条件温和但反应时间较长(李俊刚等.食品科学.1999，(1)：34～36)，而且目前报道的菊粉酶活力尚不高(Singh R S等.Bioresource Technology.2007，98：2518～2525)。而且，酶水解法处理菊芋成本较高，对原料中其它抑制微生物生长的物质没有灭活作用。文献报道在酸性条件下处理菊芋，是以获取果糖或高果糖浆为目的，采用的操作温度低于100摄氏度，酸解时间长，还原糖得率低，并且由于使用的物料浓度低，不适宜应用于发酵工业(胡嘉琦等.广州化学.2007，32(3)：46～50)。因此，需要发展更高效的菊芋原料处理技术，使其过程更适应微生物发酵工业的要求。
本发明将干菊芋粉或鲜菊芋浆与水以一定质量比混合，在酸性条件下加热处理，得到水解液，经中和得到用于培养微生物的原料。本发明处理时间短、简便易行、能耗小、成本低，并且可使原料处理和培养基灭菌同时进行，水解液单糖浓度高，用于微生物发酵菌体生长快，目标产物产量高，发酵废水中有机物含量低，为高效利用菊芋原料进行微生物培养和生物炼制提供了经济可行的新技术。
【发明内容】
本发明目的在于提供一种适合微生物发酵、成本低、简单有效的菊芋原料预处理方法，促进应用新型原料菊芋获取生物能源和生物基化学品的规模化发展。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将干菊芋粉或鲜菊芋块茎与水按质量比为1∶0.25～1∶10混合，调浆，加入酸调节pH至1～4，于101℃～140℃下处理2分钟～20分钟。水解液用碱中和，调节pH至5～8，得到用于微生物培养的原料。
本发明用于调节菊芋与水所得混合物料pH值的酸包括但不限于硫酸、盐酸、磷酸、甲酸和醋酸。
本发明用于调节菊芋水解液pH值的碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾和氨气。
本发明所得中和后的菊芋水解液使用方式包括但不限于：1)直接接种微生物，发酵；或2)进行其它的固液分离操作，得到无固体残渣的液体物料，接种微生物，发酵；或3)添加其它必要成份，接种微生物，发酵。
本发明采用蒽酮硫酸法(黄伟坤.食品检验与分析.北京：中国轻工业出版社，2000.32～34)测定菊芋浆及水解液中总糖浓度。
本发明采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)(Miller G L.AnalyticalChemistry，1959，31：426～428)测定菊芋水解液中总还原糖浓度，并经过离子色谱法(王建华等.理化检验-化学分册，2007，43：558～563)对主要单糖进行定性和定量分析。
本发明具有如下优点：
1.与酶水解方法相比，经济成本较低；
2.与其它酸水解相比，本发明操作时间短、可适用于总固形物含量高的物料，原料低聚糖水解充分、水解液单糖浓度高、粘度小，作为微生物培养原料有利于搅拌和气体传质；
3.本发明处理菊芋原料的过程在酸性、加热条件下实现，同时达到了物料灭菌的效果，具有能耗低、处理时间短、提高设备产能的优势；
4.本发明处理菊芋原料的过程在酸性、加热条件下实现，还达到了破坏原料中其它有害物质及促进大分子有机物(如蛋白质、核酸等)降解为可被微生物直接吸收的成份，具有提高原料利用率和发酵目标产物产率，降低发酵废水中残余有机质的突出特点。
总之，本发明操作时间短、简便易行、能耗小、成本低，并且可使原料处理和培养基灭菌同时进行，可适用于总固形物含量高的物料，水解液单糖浓度和有效成份含量高，粘度小，作为微生物培养原料有利于搅拌和气体传质，用于微生物发酵菌体生长快，目标产物产量高，发酵废水中残余有机质含量低，是一种可提高菊芋原料微生物利用和生物炼制整体效率的新技术，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
以下实施例有助于了解本专利，但不以任何形式限制本发明的应用。
对比实施例1
新鲜菊芋块茎(总糖质量含量17％)100克，水100毫升，混合，粉碎匀浆，获得固液混合物(pH 6.3)，搅拌条件下常压蒸煮60分钟。水解液用蒽酮法测得总糖浓度为93克/升，用DNS法测得单糖浓度为7.7克/升，水解率8％。
对比实施例2
菊芋粉(总糖质量含量68％)13克，水100毫升，充分混合，用10摩尔/升硫酸调节pH至1.0，搅拌条件下常压蒸煮30分钟。分析表明，总糖浓度为85克/升，单糖浓度为60克/升，水解率70％。
实施例1
新鲜菊芋块茎(总糖质量含量17％)100克，水100毫升，混合，粉碎匀浆。将前述所得菊芋浆用6mol/L硫酸调节pH至1.0，在105℃处理15分钟，冷却后，取水解液样品，分析表明总糖浓度为93克/升，单糖浓度为91克/升，水解率97％。
实施例2
新鲜菊芋块茎(总糖质量含量17％)100克，水100毫升，混合，粉碎匀浆。将前述所得菊芋浆用6mol/L盐酸调节pH至1.0，在135℃处理2分钟，冷却后，取水解液样品，分析表明总糖浓度为93克/升，单糖浓度为86克/升，水解率92％。
实施例3
菊芋粉(总糖质量含量68％)13克，水100毫升，用10摩尔/升硫酸调节pH至3.0，在140℃处理20分钟，冷却后，取水解液样品，分析表明总糖浓度为85克/升，单糖浓度为76克/升，水解率89％。
实施例4
菊芋粉(总糖质量含量68％)30克，水300毫升，充分混合，用5摩尔/升硫酸调节pH至1.5，在121℃处理10分钟，冷却后，取水解液样品，分析表明总糖浓度为65克/升，单糖浓度为60克/升，水解率92％。
实施例5
菊芋粉(总糖质量含量68％)30克，水120毫升，充分混合，用5摩尔/升硫酸调节pH至2.0，在140℃处理8分钟，冷却后，取水解液样品，分析表明总糖浓度为165克/升，单糖浓度为159克/升，水解率96％。本实施例得到了糖浓度很高的菊芋水解液，可用于微生物发酵培养的补料原料或适当稀释后使用。
实施例6
新鲜菊芋块茎(总糖质量含量17％)100克，水25毫升，混合，粉碎匀浆。将前述所得菊芋浆用6mol/L盐酸调节pH至1.0，在130℃处理5分钟，冷却后，取水解液样品，分析表明总糖浓度为148克/升，单糖浓度为137克/升，水解率92％。本实施例结果表明，即使利用含水量很高的新鲜菊芋块茎，按本发明专利处理，也可以得到糖浓度很高的水解液，直接用作微生物发酵培养原料或用于补料原料。
实施例7
菊芋粉(总糖质量含量68％)30克，水60毫升，充分混合，用5摩尔/升硫酸调节pH至2.0，在130℃处理15分钟，冷却后，取水解液样品，分析表明总糖浓度为335克/升，单糖浓度为310克/升，水解率92％。实施例5～7虽然总固形物含量达到约20％～50％，但水解充分、水解液糖浓度很高，可用于微生物发酵培养的补料原料或适当稀释后使用。在传统常压酸水解条件下，由于操作温度低、不能有效水解。因此，本发明表现出明显的优势。
对比实施例3
取对比实施例1所得水解液，经200目无菌纱布过滤。取滤液25毫升，用浓氨水调节pH至7.0，接种1.5×106个/毫升大肠杆菌BL21(菌株来源于北京鼎国生物技术公司)，在37℃，200转/分钟条件下培养，分别于12和24小时测得培养样品在600纳米的光密度值(OD600)为2.9和4.9。
实施例8
取实施例1所得水解液，经200目无菌纱布过滤。取滤液25毫升，用浓氨水调节pH至7.0，接种1.5×106个/毫升大肠杆菌HB101(菌株来源于北京鼎国生物技术公司)，在37℃，200转/分钟条件下培养，分别于12和24小时条件下测得OD600为3.8和7.6。与对比实施例3相比，按本发明方法处理的水解液明显促进了大肠杆菌的生长。因此，在其它以获取微生物菌体为目标的发酵过程中采取本发明的方法处理菊芋，也可能达到提高菌体得率，降低成本的目的。
对比实施例4
取对比实施例2所得水解液25毫升，用5摩尔/升碳酸钠溶液调节pH至8.0，接种3.0×106个/毫升圆红冬孢酵母AS 2.1609(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，在30℃，200转/分钟下培养96小时，参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.微生物学通报，2001，28(6)：72-75)的方法分析，测得发酵液菌体为26克/升，菌体油脂含量为20％。
实施例9
取实施例3所得水解液25毫升，用5摩尔/升碳酸钠溶液调节pH至8.0，接种3.0×106个/毫升圆红冬孢酵母AS 2.1609(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，在30℃，200转/分钟下培养96小时，参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.微生物学通报，2001，28(6)：72-75)的方法分析，测得菌体得率为35克/升，菌体油脂含量为31％。与对比实施例4相比，按本发明方法处理的水解液显著提高了油脂发酵菌体得率，菌体油脂含量高。这是因为菊芋粉在较高温度、较短时间下处理得到了更高浓度的糖和营养成份，促进了微生物生长和代谢产物积累。
对比实施例4
取对比实施例2所得水解液25毫升，用5摩尔/升氢氧化钠调节pH至6.3，接种2.6×106个/毫升黄曲霉CICC 2242(菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)的孢子，在30℃，200转/分钟下培养120小时，参照文献(Bentley R.Methods Enzymology，1957，3：238-241)的方法，分析表明发酵液中曲酸含量为3.0克/升。
实施例10
取实施例3所得水解液25毫升，用5摩尔/升氢氧化钠调节pH至6.3，接种2.6×106个/毫升黄曲霉CICC 2242(菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)的孢子，在30℃，200转/分钟下培养120小时，参照文献(Bentley R.Methods Enzymology，1957，3：238-241)的方法，分析表明发酵液中曲酸含量为10.5克/升。实施结果表明，按本发明方法处理的菊芋水解液用于曲酸发酵，明显提高了发酵液中曲酸含量。因此，在其它有机酸或氨基酸发酵工业中采用本专利的处理方法，应该也可以达到提高发酵液中产物浓度的目地。
对比实施例5
取对比实施例1所得水解液25毫升，用5摩尔/升盐酸调节pH至5.0，接种2.5×106个/毫升弯曲隐球酵母ATCC 20509(菌株来源于美国典型菌种保藏中心)，在28℃，200转/分钟下培养120小时，参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.微生物学通报，2001，28(6)：72-75)的方法分析，测得菌体得率为10.5克/升，菌体油脂含量为18％。
实施例11
取实施例1所得水解液25毫升，用5摩尔/升氢氧化钠调节pH至5.0，接种2.5×106个/毫升弯曲隐球酵母ATCC 20509(菌株来源于美国典型菌种保藏中心)，在28℃，200转/分钟下培养96小时，参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.微生物学通报，2001，28(6)：72-75)的方法分析，测得菌体得率为35克/升，菌体油脂含量为51％。同对比实施例5比，菌体得率和油脂含量增加非常显著，并且发酵时间缩短了24小时。这是因为按本专利得到的菊芋水解液营养成份更加丰富，微生物生长和代谢产物合成速度更快。所以，本发明可以使菊芋原料得到更充分地被微生物利用，降低发酵过程成本，减少发酵废水中有机质含量，具有显著的经济效益。
实施例12
取实施例5所得水解液10毫升，加入15毫升无菌液体培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，pH 5.8～6.0)，用5摩尔/升氢氧化钠调节pH至5.0，接种2.0×106个/毫升酿酒酵母INV sc1(菌株来源于美国Invitrogen公司)，在30℃，200转/分钟下培养72小时。离心，得到湿菌体45克。说明按本实施例方法处理的菊芋水解液在添加其它成份后也可以用于生产微生物菌体或发酵产品。