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用于产生诱导的多能干细胞的组合化学遗传方法
    对相关专利申请的交叉参考
     本申请要求于 2008 年 3 月 17 日提交的美国临时专利申请号 61/069,956 和于 2008 年 10 月 31 日提交的 61/197,986 的优先权利益，通过参考将其结合于此。
     发明背景
     干细胞通常分类为全能的或多能的。 全能干细胞具有完全的分化潜力 ：它产生 体内全部不同类型的细胞。 受精卵细胞是全能干细胞的实例。 多能干细胞可以在体内产 生源自三个主要生殖细胞层或其胚胎的任一细胞类型。
     多能干细胞，诸如胚胎干细胞 (ESCs)，快速增殖，同时保持多能性，即分化 为多种细胞类型的能力。 胚胎干细胞是对于细胞移植治疗有前景的供体来源。 然而， 人 ESC 还与关于人胚胎使用的伦理问题和异源移植后的排斥反应有关。 通过直接由 患者体细胞产生多能干细胞来克服这些问题是可能的。 体细胞核通过与 ESCs 融合获 得胚胎干样状态，这提示 “多能性诱导” 因子的存在。 以前的研究近期已经显示， 反转录病毒介导的将在 ESCs 中高度表达的四种转录因子 (Oct-3/4， Sox2， KLF4 和 c-Myc) 转染进入小鼠成纤维细胞导致诱导的多能干 (iPS) 细胞的产生。 参见 Takahashi， K.&Yamanaka，S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic andadult fibroblast cultures by defined factors( 通过确定的因子由小鼠胚胎和成熟成纤维细胞培养物中诱导 多能干细胞 ).Cell( 细胞 )126，663-676(2006) ；Okita， K.， Ichisaka， T.&Yamanaka， S.Generation of germline-competentinduced pluripotent stem cells( 产生种系能性诱导的多 能 干 细 胞 ).Nature( 自 然 )448，313-317(2007) ；Wernig， M. 等 In vitro reprogramming offibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state( 体外重编程成纤维细胞进入多能 ES- 细 胞 样 状 态 ).Nature( 自 然 )448，318-324(2007) ；Maherali， N. 等 Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling andwidespread tissue contribution( 直 接 重 编程的成纤维细胞显示整体外遗传重建和普遍的组织贡献 ).Cell Stem Cell( 细胞干细 胞 )1，55-70(2007) ；Meissner， A.， Wernig， M.&Jaenisch， R.Direct reprogramming of geneticallyunmodifed fibroblasts into pluripotent stem cells( 将未遗传修饰的成纤维细胞 直接重编程为多能干细胞 ).Nature Biotechnol( 自然生物技术 )25，1177-1181(2007) ； Takahashi， K. 等 Induction of pluripotent stem cells fromadult human fibroblasts by defined factors( 通 过 确 定 的 因 子 由 成 熟 的 人 成 纤 维 细 胞 诱 导 多 能 干 细 胞 ).Cell( 细 胞 )131， 861-872(2007) ；Yu， J. 等， Inducedpluripotent stem cell lines derived from human somatic cells( 源自人体细胞的诱导的多能干细胞系 ).Science( 科学 )318，1917-1920(2007) ； Nakagawa， M. 等 Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouseand human fibroblasts( 在无 Myc 的条件下由小鼠和人成纤维细胞产生诱导的多能干细胞 ) Nature Biotechnol( 自 然 生 物 技 术 )26，101-106(2007) ；Wernig， M.， Meissner， A.， Cassady， J.P.&Jaenisch， R.c-Myc is dispensablefor direct reprogramming of mouse fibroblasts(c-Myc 对于小鼠成纤维细胞直接重编程不是必要的 ).Cell Stem Cell( 细胞干细 胞 )2，10-12(2008)。 iPS 细胞在形态学、增殖、和多能性方面类似于 ESCs，这通过畸
     胎瘤形成和嵌合体贡献来判断。
     近期在将小鼠和人体细胞重编程为诱导的多能干 (iPS) 细胞中使用确定的遗传 操作，即在小鼠或人胚胎干 (ES) 细胞中高度和 / 或特异性表达的少数基因的病毒转导的 突破已经揭示了大量在无常规人 ES 细胞相关争议的条件下产生用于不同应用 ( 例如， 基于细胞的治疗或药物发现 ) 的患者特异性干细胞，以及研究外遗传反转过程的机会。 iPS- 细胞方法的最终临床应用应该在很大程度上需要定向分化人 PS 细胞以产生谱系特 异性细胞类型的同源群体以及消除与当前遗传操作的 iPS- 细胞缺陷和低效率 / 慢动力学 相关的风险。 近期的研究已经显示以前需要的四种基因之一， cMyc，对于在产生 iPS 细胞中过表达不是必须的。 参见， Nakagawa， M. 等， Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse andhuman fibroblasts( 在无 Myc 条件下由小鼠和人成纤 维细胞产生诱导的多能干细胞 )Nature Biotechnol( 自然生物技术 )26，101-106(2007) ； Wernig ， M. ， Meissner ， A. ， Cassady ， J.P.&Jaenisch ， R.c - Myc is dispensable for directreprogramming of mouse fibroblasts(c-Myc 对于小鼠成纤维细胞直接重编程不是必要 的 ).Cell Stem Cell( 细胞干细胞 )2，10-12(2008)。 然而，在缺乏 cMyc 条件下，重编程 效率随着也慢得多的重编程动力学而充分减小。 发明概述
     本发明提供用于筛选诱导哺乳动物细胞重编程或去分化成为多能干细胞的试剂 的方法。 在一些实施方案中，所述方法包括 ：
     a) 将 Oct 多肽、Klf 多肽、Myc 多肽、和 Sox 多肽中的至少一种，但非全部引入 非多能细胞中，以产生转染的细胞 ；
     b) 使所述转染的细胞与不同试剂文库相接触 ；
     c) 针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞 ；和
     d) 使干细胞特征的形成与来自所述文库的特定试剂相关联，由此鉴定刺激细胞 去分化成为多能干细胞的试剂。
     在一些实施方案中，步骤 a) 包括将一个或多个用于表达 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽中的至少一种，但非全部的表达盒引入所述非多能细胞。
     在一些实施方案中，步骤 a) 包括将外源 Oct 多肽、外源 Klf 多肽、外源 Myc 多 肽、和外源 Sox 多肽中的至少一种，但非全部引入所述非多能细胞。
     在一些实施方案中，所述特定试剂在 50-1500 道尔顿之间。
     在一些实施方案中，步骤 a) 包括将两个表达盒引入所述细胞，其中每个表达盒 包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽组成的组，且不将所述组的其余成员引入所述细胞内。
     在一些实施方案中，步骤 a) 包括将三个表达盒引入所述细胞，其中每个表达盒 包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽组成的组，且不将所述组的其余成员引入所述细胞内。
     在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。 在一些实施方案中，所述细胞是非人 哺乳动物细胞。 在一些实施方案中，所述非多能细胞是祖细胞。 在一些实施方案中，所 述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细胞。
     在一些实施方案中，所述 Oct 多肽是 Oct4，所述 Klf 多肽是 Klf 4，所述 Myc 多
     肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。
     本发明还提供筛选具有多能干细胞特征的哺乳动物细胞的方法。 在一些实施方 案中，所述方法包括 ：
     a) 使细胞与 MAPK/ERK 激酶 (MEK) 抑制剂相接触，从而抑制非多能细胞生长 并促进多能干细胞生长 ；和
     b) 针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞。
     在一些实施方案中，所述方法包括 ：
     在步骤 a) 之前，使所述细胞与试剂文库相接触 ；
     和，在步骤 b) 之后，基于步骤 b) 的结果筛选诱导多能干细胞的试剂。
     在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。 在一些实施方案中，所述细胞是小 鼠、狗、牛、猪、大鼠和非人灵长类动物细胞。
     在一些实施方案中，所述 MEK 抑制剂是 PD0325901。
     本发明还提供用由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法。 在一些 实施方案中，所述方法包括 ：
     a) 将 Oct 多肽、Klf 多肽、Myc 多肽、和 Sox 多肽中的一种或多种引入至所述非 多能细胞中 ； b) 使所述细胞与抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂相接触，由此生 成诱导的多能干细胞。
     在一些实施方案中，步骤 a) 包括使所述非多能细胞与一种或多种选自 Klf 多 肽、 Oct 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽的外源多肽相接触。 在一些实施方案中，步骤 a) 包括以下的至少两个 ( 例如，2，3，4，5，或更多个 ) 循环 ：
     i. 使所述非多能细胞与一种或多种选自 Klf 多肽、 Oct 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽的外源多肽相接触 ；
     ii. 随后在缺乏所述外源多肽的条件下培养所述细胞。
     在一些实施方案中，步骤 a) 包括将用于表达 Klf 多肽、 Oct 多肽、 Myc 多肽、 和 Sox 多肽的一个或多个表达盒引入至所述非多能细胞中。
     在一些实施方案中，所述方法还包括针对多能干细胞特征筛选相接触的细胞。
     在一些实施方案中，将用于表达 Oct 多肽的表达盒和用于表达 Sox 多肽的表达盒 引入至所述非多能细胞中。
     在一些实施方案中，所述引入步骤包括向所述非多能细胞中引入一个或多个用 于表达 KLF 多肽和 Oct 多肽的表达盒，其中用于 Myc 多肽和 / 或 Sox 多肽的表达盒不引 入至所述细胞中。
     在一些实施方案中，所述 Klf 多肽是 Klf4 且所述 Oct 多肽是 Oct4。
     在一些实施方案中，所述非多能细胞是体细胞。
     在一些实施方案中，所述非多能细胞是成纤维细胞。
     在一些实施方案中，用于表达 Myc 多肽的表达盒或用于表达 Klf 多肽的表达盒均 不引入所述非多能细胞。
     在一些实施方案中，所述引入步骤在体内进行。 在一些实施方案中，所述引入 步骤在体外进行。
     在一些实施方案中，所述方法还包括，
     c) 选择表现出多能干细胞特征的细胞。
     在一些实施方案中，所述非多能细胞获自动物 ；且所述诱导的多能干细胞分化 为所需的细胞类型。
     在一些实施方案中，将所述所需的细胞类型引入至动物中。 在一些实施方案 中，所述动物是人。 在一些实施方案中，所述动物是非人动物。
     在一些实施方案中，所选择的细胞不包括用于表达 Oct4 的外源表达盒。
     在一些实施方案中，所述试剂抑制 H3K9 甲基化。 在一些实施方案中，抑制 H3K9 甲基化的试剂是 BIX01294。
     在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。 在一些实施方案中，所述细胞是小鼠 细胞。 在一些实施方案中，所述非多能细胞是祖细胞。 在一些实施方案中，所述祖细胞 是神经祖细胞。
     在一些实施方案中，所述引入步骤包括引入下述 ：
     第一载体，其包含与第一表达盒可操作相连的启动子，所述第一表达盒包括编 码 Klf4 的多核苷酸 ； 第二载体，其包含与第二表达盒可操作相连的启动子，所述第二表达盒包括编 码 Sox2 的多核苷酸 ；和
     第三载体，其包含与第三表达盒可操作相连的启动子，所述第三表达盒包括编 码 c-Myc 的多核苷酸。
     在一些实施方案中，所述载体是反转录病毒载体、慢病毒 (lentiviral) 载体、腺 病毒载体、标准非病毒质粒、或附加型表达载体。
     本发明还包括哺乳动物细胞和抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂的 混合物，其中所述细胞表达 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Sox 多肽、和 Myc 多肽中的至少一种或 多种 ；和 / 或与外源 Oct 多肽、外源 Klf 多肽、外源 Sox 多肽、和外源 Myc 多肽中的至 少一种或多种相接触。
     在一些实施方案中，所述细胞包括第一、第二和第三重组表达盒，所述第一表 达盒包括与编码 Klf 多肽的多核苷酸可操作相连的启动子，所述第二表达盒包括与编码 Sox 多肽的多核苷酸可操作相连的启动子 ；且所述第三表达盒包括与编码 Myc 多肽的多 核苷酸可操作相连的启动子。
     在一些实施方案中，所述试剂抑制 H3K9 甲基化。 在一些实施方案中，抑制 H3K9 甲基化的试剂是 BIX01294。
     在一些实施方案中，所述细胞包括一种或多种反转录病毒质粒、慢病毒质粒、 腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体，所述一种或多种反转录病毒质粒、慢病 毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体包括所述第一、第二和第三表达 盒。
     在一些实施方案中，所述混合物包括第一、第二和第三反转录病毒质粒、慢病 毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体，所述第一反转录病毒质粒、慢 病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体包括所述第一表达盒 ；所述第 二反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体包括所
     述第二表达盒 ；所述第三反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或 附加型表达载体包括所述第三表达盒。
     在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。 在一些实施方案中，所述细胞是小鼠 细胞。 在一些实施方案中，所述细胞包括祖细胞。 在一些实施方案中，所述祖细胞是神 经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细胞。
     在一些实施方案中，所述 Klf 多肽是 Klf4，所述 Myc 多肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。
     本发明还提供内源性表达选自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽 组成的组的至少一种蛋白的哺乳动物细胞，其中 ：所述细胞不内源性表达所述组中的至 少一种蛋白，其中所述不内源性表达的蛋白由所述细胞内存在的异源重组表达盒编码的 RNA 来表达，其中所述细胞内源性或异源性表达 Oct 多肽、Klf 多肽、Myc 多肽、和 Sox 多肽的每一种 ；且经由所述异源表达盒的蛋白表达导致所述细胞由非多能细胞重编程或 去分化成为多能干细胞。
     在一些实施方案中，所述 Oct 多肽是 Oct 4，所述 Klf 多肽是 Klf 4，所述 Myc 多 肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。 在一些实施方案中，所述细胞内源性表达 Sox 多 肽和 Myc 多肽且异源性表达 Oct 多肽和 Klf 多肽。 在一些实施方案中，所述 Oct 多肽是 Oct4，所述 Klf 多肽是 Klf 4，所述 Myc 多肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。
     本发明还提供诱导细胞中 Oct4 表达的方法。 在一些实施方案中，所述方法使所 述细胞与抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂相接触，由此诱导细胞中的 Oct4 表达。
     在一些实施方案中，所述细胞在即将进行所述接触步骤前不表达 Oct4。 在一些 实施方案中，相接触的细胞不是多能细胞。 在一些实施方案中，所述细胞在所述接触步 骤后诱导为多能性。
     本发明还提供将非多能细胞诱导为多能细胞的方法。 在一些实施方案中，所述 方法包括使所述非多能细胞与一种或多种诱导多能性的试剂相接触和 / 或将表达盒引入 到细胞中以表达诱导多能性的蛋白，其中所述细胞不在饲养细胞上培养且所述细胞附着 于固体培养物表面。 在一些实施方案中，所述方法还包括针对多能干细胞特征筛选所述 接触的细胞。
     在一些实施方案中，所述细胞通过分子粘连 (molecular tether) 附着于固体培养物 表面，所述分子粘连选自由基质胶 (matrigel)、细胞外基质 (ECM) 或 ECM 类似物、层粘 连蛋白、纤连蛋白、和胶原蛋白组成的组。
     在一些实施方案中，所述接触步骤包括以下步骤 ：
     a) 将一种或多种用于表达 Klf 多肽、Oct 多肽、Myc 多肽、和 Sox 多肽的表达盒 引入非多能细胞中 ；
     b) 使所述细胞与抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂相接触，由此生 成诱导的多能干细胞。
     本发明还提供由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法。 在一些实 施方案中，所述方法包括 ：
     a) 使所述细胞与以下至少一种 ( 例如，1、2、3、4 或更多种 ) 相接触 ：抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂 ( 包括但不仅限于 BIX) ；
     L- 型 Ca 通道激动剂 ( 包括但不仅限于 Bay K) ；
     cAMP 途径活化剂 ( 包括但不仅限于毛喉素 (forskolin)) ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ( 包括但不仅限于 RG 108 或 5- 氮杂 -C) ；
     核受体配体 ( 包括但不仅限于地塞米松 (dexamethasone)) ；
     GSK3 抑制剂 ( 包括但不仅限于 CHIR99021) ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受 体 /ALK5 抑 制 剂 ( 包 括 但 不 仅 限 于 SB431542， A-83-01， 或 2-(3-(6- 甲基吡啶 -2- 基 )-1H- 吡唑 -4- 基 )-1，5- 二氮杂萘 )，
     HDAC 抑制剂 ( 包括但不仅限于 TSA， VPA，丁酸钠， SAHA 等 ) ；和
     Erk 抑制剂。
     由此生成诱导的多能干细胞。
     在一些实施方案中，所述方法还包括针对多能干细胞特征对所述接触的细胞进 行筛选。
     在一些实施方案中，所述方法包括 ：
     a) 使所述细胞与以下相接触 ：
     i. 抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂 ；和
     ii. 选自由以下组成的组的试剂 ：
     L- 型 Ca 通道激动剂 ( 包括但不仅限于 BayK) ；
     cAMP 途径活化剂 ( 包括但不仅限于毛喉素 ) ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ( 包括但不仅限于 RG108 或 5- 氮杂 -C) ；
     核受体配体 ( 包括但不仅限于地塞米松 ) ；
     GSK3 抑制剂 ( 包括但不仅限于 CHIR99021) ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受 体 /ALK5 抑 制 剂 ( 包 括 但 不 仅 限 于 SB431542， A-83-01， 或 2-(3-(6- 甲基吡啶 -2- 基 )-1H- 吡唑 -4- 基 )-1，5- 二氮杂萘 )，
     HDAC 抑制剂 ( 包括但不仅限于 TSA，VPA，丁酸钠，SAHA 等 ) ；和 Erk 抑制 剂。
     在一些实施方案中，所述方法还包括 ：
     b) 将一种或多种用于表达 Klf 多肽、Oct 多肽、Myc 多肽、和 / 或 Sox 多肽的表 达盒引入所述非多能细胞。
     在一些实施方案中，将 Klf4 和 Oct 4 引入所述细胞 ( 且任选地，不引入 Myc 和 Sox)。
     本发明还提供哺乳动物和以下至少一种 ( 例如，1、2、3、4 或更多种 ) 的混合 物：
     抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂，
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ； GSK3 抑制剂 ； MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；和 Erk 抑制剂。 在一些实施方案中，所述混合物包括 ： i. 抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂，和 ii. 选自由以下组成的组的试剂 ： L- 型 Ca 通道激动剂 ； cAMP 途径活化剂 ； DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ； 核受体配体 ； GSK3 抑制剂 ； MEK 抑制剂，TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     Erk 抑制剂。
     在一些实施方案中，所述细胞包括用于表达 Oct 多肽的异源表达盒和用于表达 Sox 多肽的异源表达盒。
     在一些实施方案中，所述细胞是非多能细胞。 在一些实施方案中，所述细胞是 成纤维细胞。
     在一些实施方案中，用于表达 Myc 多肽的表达盒和用于表达 Klf 多肽的表达盒均 不引入至所述非多能细胞中。
     本发明还提供组合物，其包括抑制 H3K9 甲基化的试剂和选自由以下组成的组的 试剂 ：
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     Erk 抑制剂。
     本发明还提供试剂盒，其包括 ：
     i. 抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂 ；和
     ii. 选自由以下组成的组的试剂 ：
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGF β 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     Erk 抑制剂。
     在一些实施方案中，所述试剂盒还包括哺乳动物细胞。
     本发明的一些实施方案在下文中直接以权利要求的形式描述 ：
     1. 一种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括 ：
     a) 将 Oct 多肽、Klf 多肽、Myc 多肽、和 Sox 多肽中的一种或多种引入所述非多 能细胞中 ；
     b) 使所述细胞与抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂相接触，由此生 成诱导的多能干细胞。 2. 权利要求 1 的方法，其中所述步骤 a) 包括使所述非多能细胞与一种或多种选 自 Klf 多肽、 Oct 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽的外源多肽相接触。
     3. 权利要求 2 的方法，其中所述步骤 a) 包括以下至少 2 个循环 ：
     i. 使所述非多能细胞与一种或多种选自 Klf 多肽、 Oct 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽的外源多肽相接触 ；
     ii. 随后在缺乏所述外源多肽的条件下培养所述细胞。
     4. 权利要求 1 的方法，其中所述步骤 a) 包括将用于表达 Klf 多肽、 Oct 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽的一个或多个表达盒引入至所述非多能细胞中。
     5. 权利要求 1 的方法，其中将用于表达 Oct 多肽的表达盒和用于表达 Sox 多肽的 表达盒引入所述非多能细胞。
     6. 权利要求 1 的方法，其中所述引入步骤包括向所述非多能细胞中引入一个或多 个用于表达 KlF 多肽和 Oct 多肽的表达盒，其中用于 Myc 多肽和 / 或 Sox 多肽的表达盒 不引入至所述细胞中。
     7. 权利要求 1-6 中任一项的方法，其中所述 Klf 多肽是 Klf4 且所述 Oct 多肽是 Oct4。
     8. 权利要求 1-7 中任一项的方法，其中所述非多能细胞是体细胞。
     9. 权利要求 1-7 中任一项的方法，其中所述非多能细胞是成纤维细胞。
     10. 权利要求 1-7 中任一项的方法，其中用于表达 Myc 多肽的表达盒和用于表达 Klf 多肽的表达盒均不引入所述非多能细胞中。
     11. 权利要求 1-10 中任一项的方法，其中所述引入步骤在体内进行。
     12. 权利要求 1-10 中任一项的方法，其中所述引入步骤在体外进行。
     13. 权利要求 1-13 中任一项的方法，还包括 ：
     c) 选择表现出多能干细胞特征的细胞。
     14. 权利要求 1-13 中任一项的方法，其中所述非多能细胞获自动物 ；且所述诱
     导的多能干细胞分化为需要的细胞类型。
     15. 权利要求 14 的方法，其中将所述需要的细胞类型引入所述动物中。
     16. 权利要求 15 的方法，其中所述动物是人。
     17. 权利要求 15 的方法，其中所述动物是非人动物。
     18. 权利要求 13 的方法，其中所选择的细胞不包括用于表达 Oct4 的外源表达 盒。
     19. 权利要求 1-8 中任一项的方法，其中所述试剂抑制 H3K9 甲基化。
     20. 权利要求 19 的方法，其中抑制 H3K9 甲基化的所述试剂是 BIX01294。
     21. 权利要求 1-20 中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。
     22. 权利要求 1-20 中任一项的方法，其中所述细胞是小鼠、狗、牛、猪、大鼠和 非人灵长类动物细胞。
     23. 权利要求 1-22 中任一项的方法，其中所述非多能细胞是祖细胞。
     24. 权利要求 23 的方法，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细 胞。
     25. 权利要求 1 或 4-24 中任一项的方法，其中所述引入步骤包括引入下述 ：
     第一载体，其包含与第一表达盒可操作相连的启动子，所述第一表达盒包括编 码 Klf4 的多核苷酸 ；
     第二载体，其包含与第二表达盒可操作相连的启动子，所述第二表达盒包括编 码 Sox2 的多核苷酸 ；和
     第三载体，其包含与第三表达盒可操作相连的启动子，所述第三表达盒包括编 码 c-Myc 的多核苷酸。
     26. 权利要求 1 或 4-25 中任一项的方法，其中所述载体是反转录病毒质粒、慢病 毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体。
     27. 一种筛选诱导哺乳动物细胞重编程或去分化成为多能干细胞的试剂的方法， 所述方法包括 ：
     a) 将 Oct 多肽、Klf 多肽、Myc 多肽、和 Sox 多肽中的至少一种，但非全部引入 非多能细胞中，以产生转染的细胞 ；
     b) 使所述转染的细胞与不同试剂的文库相接触 ；
     c) 针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞 ；和
     d) 使干细胞特征的形成与来自所述文库的特定试剂相关联，由此鉴定刺激细胞 去分化成为多能干细胞的试剂。
     28. 权利要求 27 的方法，其中步骤 a) 包括将一个或多个用于表达 Oct 多肽、Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽中的至少一种，但非全部的表达盒引入至所述非多能细胞 中。
     29. 权利要求 27 的方法，其中步骤 a) 包括将外源 Oct 多肽、外源 Klf 多肽、外源 Myc 多肽、和外源 Sox 多肽中的至少一种，但非全部引入至所述非多能细胞中。
     30. 权利要求 27-29 中任一项的方法，其中所述特定试剂在 50-1500 道尔顿之 间。
     31. 权利要求 27 的方法，其中步骤 a) 包括将两个表达盒引入所述细胞，其中每个表达盒包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽组成的组，且所述组的其余成员不引入至所述细胞内。
     32. 权利要求 27 的方法，其中步骤 a) 包括将三个表达盒引入所述细胞，其中每 个表达盒包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽组成的组，且所述组的其余成员不引入至所述细胞内。
     33. 权利要求 27-32 中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。
     34. 权利要求 27-33 中任一项的方法，其中所述细胞是非人哺乳动物细胞。
     35. 权利要求 27-34 中任一项的方法，其中所述非多能细胞是祖细胞。
     36. 权利要求 35 的方法，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细 胞。
     37. 权利要求 27-36 中任一项的方法，其中所述 Oct 多肽是 Oct4，所述 Klf 多肽 是 Klf4，所述 Myc 多肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。
     38. 一种筛选具有多能干细胞特征的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括 ：
     a) 使细胞与 MAPK/ERK 激酶 (MEK) 抑制剂相接触，从而抑制非多能细胞生长 并促进多能干细胞生长 ；和
     b) 针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞。
     39. 权利要求 38 的方法，其包括 ：
     在步骤 a) 之前，使所述细胞与试剂文库相接触 ；
     和，在步骤 b) 之后，基于步骤 b) 的结果筛选诱导多能干细胞的试剂。
     40. 权利要求 38-39 中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。
     41. 权利要求 38-39 中任一项的方法，其中所述细胞是小鼠、狗、牛、猪、大鼠 和非人灵长类动物细胞。
     42. 权利要求 38-41 中任一项的方法，其中所述 MEK 抑制剂是 PD0325901。
     43. 一种包括哺乳动物细胞和抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂的 混合物，其中所述细胞 ：
     表达 Oct 多肽、Klf 多肽、Sox 多肽、和 Myc 多肽中的至少一种或多种 ；和 / 或
     与外源 Oct 多肽、外源 Klf 多肽、外源 Sox 多肽、和外源 Myc 多肽中的至少一种 或多种相接触。
     44. 权利要求 43 的混合物，其中所述细胞包括第一、第二和第三重组表达盒，
     所述第一表达盒包括与编码 Klf 多肽的多核苷酸可操作相连的启动子，
     所述第二表达盒包括与编码 Sox 多肽的多核苷酸可操作相连的启动子 ；和
     所述第三表达盒包括与编码 Myc 多肽的多核苷酸可操作相连的启动子。
     45. 权利要求 43-44 中任一项的混合物，其中所述试剂抑制 H3K9 甲基化。
     46. 权利要求 45 的混合物，其中抑制 H3K9 甲基化的试剂是 BIX01294。
     47. 权利要求 43-46 中任一项的混合物，其中所述细胞包括一种或多种反转录病 毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体，所述一种或多种 反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体包括所述 第一、第二和第三表达盒。
     48. 权利要求 47 的混合物，所述混合物包括第一、第二和第三反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体，
     所述第一反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型 表达载体包括所述第一表达盒 ；
     所述第二反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型 表达载体包括所述第二表达盒 ；和
     所述第三反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型 表达载体包括所述第三表达盒。
     49. 权利要求 43-48 中任一项的混合物，其中所述细胞是人细胞。
     50. 权利要求 43-48 中任一项的混合物，其中所述细胞是小鼠、狗、牛、猪、大 鼠和非人灵长类动物细胞。
     51. 权利要求 43-50 中任一项的混合物，其中所述细胞包括祖细胞。
     52. 权利要求 51 的混合物，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖 细胞。
     53. 权利要求 43-52 中任一项的混合物，其中所述 Klf 多肽是 Klf 4，所述 Myc 多 肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。
     54. 一种内源性表达选自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽组成的 组的至少一种蛋白的哺乳动物细胞，
     其中 ：
     所述细胞不内源性表达所述组中的至少一种蛋白，其中不内源性表达的所述蛋 白由所述细胞内存在的异源重组表达盒编码的 RNA 来表达，
     所述细胞内源性或异源性表达 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽的每 一种 ；和
     经由所述异源表达盒的蛋白表达导致所述细胞由非多能细胞重编程或去分化成 为多能干细胞。
     55. 权利要求 54 的细胞，其中所述 Oct 多肽是 Oct 4，所述 Klf 多肽是 Klf4，所 述 Myc 多肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。
     56. 权利要求 54-55 中任一项的细胞，其中所述细胞内源性表达 Sox 多肽和 Myc 多肽且异源性表达 Oct 多肽和 Klf 多肽。
     57. 权利要求 56 的细胞，其中所述 Oct 多肽是 Oct4，所述 Klf 多肽是 Klf4，所述 Myc 多肽是 c-Myc，且所述 Sox 多肽是 Sox2。
     58. 一种诱导细胞中 Oct4 表达的方法，所述方法包括 ：
     使所述细胞与抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂相接触，由此诱导 细胞中的 Oct4 表达。
     59. 权利要求 58 的方法，其中所述细胞在即将进行所述接触步骤前不表达 Oct4。
     60. 权利要求 58-59 中任一项的方法，其中相接触的所述细胞不是多能细胞。
     61. 权利要求 58-59 中任一项的方法，其中所述细胞在所述接触步骤后诱导为多 能性。
     62. 一种将非多能细胞诱导为多能细胞的方法，所述方法包括 ：
     使所述非多能细胞与一种或多种诱导多能性的试剂相接触和 / 或将表达盒引入所述细胞以表达诱导多能性的蛋白，其中所述细胞不在饲养细胞上培养且所述细胞附着 于固体培养物表面。
     63. 权利要求 62 的方法，其中所述细胞通过分子粘连附着于固体培养表面，所述 分子粘连选自由基质胶、细胞外基质 (ECM) 或 ECM 类似物、层粘连蛋白、纤连蛋白、 和胶原蛋白组成的组。
     64. 权利要求 62 的方法，其中所述接触步骤包括权利要求 1 或引用权利要求 1 的 权利要求的步骤。
     65. 一种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括 ：
     a) 使所述细胞与以下至少两种相接触 ：
     抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂 ；
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂 ；
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂 ；
     HDAC 抑制剂 ；和
     erk 抑制剂，
     由此生成诱导的多能干细胞。
     66. 权利要求 65 的方法，其中所述接触步骤包括 ：
     使所述细胞与以下至少两种相接触 ：
     i. 抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂，和
     ii. 选自由以下组成的组的试剂 ：
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     erk 抑制剂。
     67. 权利要求 65 或 66 的方法，其还包括 ：
     b) 将一种或多种用于表达 Klf 多肽、Oct 多肽、Myc 多肽、和 / 或 Sox 多肽的表 达盒引入所述非多能细胞。
     68. 权利要求 65-67 中任一项的方法，其中将 Klf4 和 Oct 4 引入所述细胞。
     69. 一种哺乳动物和以下至少两种的混合物 ：
     抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂，L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     erk 抑制剂。
     70. 权利要求 69 的混合物，其中所述混合物包括 ：
     i. 抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂，和
     ii. 选自由以下组成的组的试剂 ：
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     erk 抑制剂。
     71. 权利要求 69-70 中任一项的混合物，其中所述细胞包括用于表达 Oct 多肽的 异源表达盒和用于表达 Sox 多肽的异源表达盒。
     72. 权利要求 69-71 中任一项的混合物，其中所述细胞是非多能细胞。
     73. 权利要求 69-72 中任一项的混合物，其中所述细胞是成纤维细胞。
     74. 权利要求 69-73 中任一项的混合物，其中用于表达 Myc 多肽的表达盒和用于 表达 Klf 多肽的表达盒均不引入至所述非多能细胞中。
     75. 一种组合物，其包括以下至少两种 ：
     抑制 H3K9 甲基化的试剂 ；
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     erk 抑制剂。
     76. 权利要求 75 的组合物，其包括 ：i. 抑制 H3K9 甲基化的试剂，和 ii. 选自由以下组成的组的试剂 ： L- 型 Ca 通道激动剂 ； cAMP 途径活化剂 ； DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ； 核受体配体 ； GSK3 抑制剂 ； MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；和 erk 抑制剂。 77. 试剂盒，其包括以下至少两种 ： 抑制 H3K9 甲基化的试剂 ； L- 型 Ca 通道激动剂 ； cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     erk 抑制剂。
     78. 权利要求 77 的试剂盒，其包括 ：
     i. 抑制 H3K9 甲基化的试剂，和
     ii. 选自由以下组成的组的试剂 ：
     L- 型 Ca 通道激动剂 ；
     cAMP 途径活化剂 ；
     DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；
     核受体配体 ；
     GSK3 抑制剂 ；
     MEK 抑制剂，
     TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，
     HDAC 抑制剂 ；和
     erk 抑制剂。
     79. 权利要求 77 或 78 的试剂盒，其还包括哺乳动物细胞。
     通过阅读整个本申请将清楚本发明的其他实施方案。
     附图简述
     图 1. 通过 Oct4/Klf4 病毒转导和 BIX01294 处理由确定的原代神经祖细胞 (primary neural progenitor cells) 产生 iPS 细胞。在有或无 BIX01294 处理的条件下，通过 Oct4/Klf4/Sox2/c-Myc，Oct4/Klf4/Sox2，或 Oct4/Klf4 的反转录病毒转导由 3.5x104 个原代 OG2 神 经祖细胞产生的 GFP+iPS 细胞集落数量的比较。
     图 2. 通过 Klf4/Sox2/c-Myc 病毒转导和 BIX01294 处理由原代神经祖细胞产生 iPS 细胞。 在有或无 BIX01294 处理的条件下，通过 Klf4/Sox2/c-Myc 的反转录病毒转导 由 3.5x104 个原代 OG2 神经祖细胞产生的 GFP+iPS 细胞集落数量。
     图 3. 由原代 OG2MEFs 产生 OK2B iPSCs。 柱形图表示在 3 个独立实验中由 OG2-MEFs 诱导的平均 GFP+ 集落数量。 该图显示关于用四种因子转导 (Oct4， Klf4， Sox2，和 cMyc ；4F) ；用 OK 转导 (OK) ；用 OK 转导并用 1μM 处理 BIX(OK+BIX) ； 用 OK 转导并用 1μM BIX+2μM BayK 处理 (OK+BIX+BayK) ；用 OK 转导并用 1μM BIX+0.04μM RG108 处理 (OK+BIX+RG108) 的 OG2MEF 细胞的数据，n ＝ 3，误差条表 示使用 Excel 计算的标准偏差。
     图 4.OK2B iPSC 具有与 mESCs 之一类似的转录特征。 (A)OK2B
     iPSCs 的 RT-PCR 分析说明它们表达特异于多能 mESCs 的基因。 R1mESCs 用作 阳性对照，而 OG2MEFs 用作阴性对照。 GAPDH 用作加样对照。 (B) 亚磷酸氢盐测序 法揭示 OK2B iPSCs 的 nanog 启动子去甲基化，进一步提示特异于 mESCs 的内源基因的再 活化。 示意性描述为进行该分析扩增的 Nanog 启动子区域中存在的胞嘧啶。 空心圆表示 去甲基化的胞嘧啶，而实心圆 / 黑色圆表示甲基化的胞嘧啶。
     图 5. 用 BIX、BayK 或二者的组合处理不增加 mES 细胞的增殖。 散点图表示用 DMSO( 对照 )，2μM BayK，1μM BIX 和二者的组合 (BayK+BIX) 处理后的 R1mES 细 胞数。 n ＝ 3。 误差条表示在 Excel 中计算的标准偏差。 如在 Excel 中利用 t 检验计算 的，对于各种处理均没有获得与 DMSO 相比的显著差异。
     图 6. 化合物处理后关于 Sox2 表达的 RT-PCR 分析。 OG2+/-/ROSA26+/-(OG2) MEFs 用 DMSO( 对照 )，1μM BIX，2μM BayK 和二者的组合处理 6 天。 然后利用 Qiagen RNAeasy 小型试剂盒提取 RNA。 通过半定量 PCR 评估 Sox2 表达。 OK2B iPSCs p37 和 R1 用作阳性对照， GAPDH 作为加样对照。
     定义
     “Oct 多肽” 意指 Octomer 转录因子家族的任一天然存在成员，或其保留与最 接近的相关天然存在家族成员相比类似的转录因子活性 ( 在至少 50 ％，80 ％，或 90 ％ 活性之内 ) 的变体，或至少包括天然存在家族成员的 DNA 结合结构域，和任选包括转 录活化结构域的多肽。 示范性 Oct 多肽包括，例如， Oct3/4( 本文中称为″ Oct4″ )， 其包含 POU 结构域。 参见 Ryan， A.K.&Rosenfeld， M.G.Genes Dev.( 基因发育 )11， 1207-1225(1997)。 在一些实施方案中，与天然存在 Oct 多肽家族成员诸如与以上列出的 那些相比，变体在其整个序列上具有至少 90％的氨基酸序列同一性。
     “Klf 多肽” 意指 Krüppel 样因子 (Klfs) 家族的任一天然存在成员，含有与果 蝇 (Drosophila) 胚胎模式调控子 Krüppel 类似的氨基酸序列的锌指蛋白，或保留与最接近 相关的天然存在家族成员相比类似的转录因子活性 ( 在至少 50％，80％，或 90％活性之 内 ) 的变体，或至少包括天然存在家族成员的 DNA 结合结构域，和任选包括转录活化结 构域的多肽。 参见，Dang，D.T.，Pevsner，J.&Yang，V.W..Cell Biol.( 细胞生物学 )32， 1103-1121(2000)。 示范性 Klf 家族成员包括，例如，Klf 1、Klf4、和 Klf5，其中每种均显示能够彼此替换，以产生 iPS 细胞。 参见， Nakagawa，等， Nature Biotechnology( 自 然生物技术 )26 ：101-106(2007)。 在一些实施方案中，与天然存在 Klf 多肽家族成员诸 如与以上列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少 90％的氨基酸序列同一性。 就 本文中描述的 KLF 多肽而言，其可以用 Essrb 替换。 因此，意图是对于本文中所述的各 种 Klf 多肽实施方案同等地描述 Essrb 替代 Klf4 多肽的应用。
     “Myc 多 肽” 意 指 Myc 家 族 的 任 一 天 然 存 在 成 员 ( 参 见， 例 如 Adhikary， S.&Eilers， M.Nat.Rev.Mol Cell Biol.( 自然分子细胞生物学综述 )6 ：635-645(2005))， 或其保留与最接近相关的天然存在家族成员相比类似的转录因子活性 ( 在至少 50 ％， 80％，或 90 ％活性之内 ) 的变体，或至少包括天然存在家族成员的 DNA 结合结构域， 和任选包括转录活化结构域的多肽。 示范性 Myc 多肽包括，例如， c-Myc， N-Myc 和 L-Myc。 在一些实施方案中，与天然存在 Myc 多肽家族成员诸如与以上列出的那些相 比，变体在其整个序列上具有至少 90％的氨基酸序列同一性。
     “Sox 多肽”意指 SRY- 相关的 HMG-box(Sox) 转录因子的任一天然存在成员， 其特征在于存在高运动基团 (high-mobility group)(HMG) 结构域，或其保留与最接近相 关的天然存在家族成员相比类似的转录因子活性 ( 在至少 50％，80％，或 90％活性之内 ) 的变体，或至少包括天然存在家族成员的 DNA 结合结构域，和任选包括转录活化结构 域的多肽。 参见，例如， Dang， D.T.，等 Int.J.Biochem.Cell Biol.( 国际生物化学细胞生 物学杂志 )32 ：1103-1121(2000)。 示范性 Sox 多肽包括，例如， Sox1， Sox2， Sox3， Sox15，或 Sox18，其中每种均显示能够彼此替换，以产生 iPS 细胞。 参见，Nakagawa， 等， Nature Biotechnology( 自然生物技术 )26 ：101-106(2007)。 在一些实施方案中，与 天然存在 Sox 多肽家族成员诸如与以上列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少 90％的氨基酸序列同一性。
     “H3K9”指组蛋白 H3 赖氨酸 9。 H3K9 可以在 K9 处去甲基化 (di-methylated)。 参见，例如， Kubicek，等， Mol.Cell( 分子细胞 )473-481(2007)。
     术语 “多能” 或 “多能性” 意指具有产生这样的后代的能力的细胞，所述后代 能够在适当条件下经历分化成为共同展示与来自全部三胚层 ( 内胚层、中胚层和外胚层 ) 的细胞谱系相关的特征的细胞类型。 多能干细胞可以形成出生前、出生后或成年动物的 许多或全部组织。 标准的本领域公认测试，诸如在 8-12 周龄 SCID 小鼠中形成畸胎瘤的 能力，可以用于确定细胞群的多能性，然而，不同多能干细胞特征的鉴定也可以用于检 测多能细胞。
     “多能干细胞特征” 意指将多能干细胞与其他细胞相区别的细胞特征。 产生能 够在适当条件下经历分化成为共同展示与来自全部三胚层 ( 内胚层、中胚层和外胚层 ) 的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞特征。 表达或不表达某些 分子标记物组合也是多能干细胞特征。 例如，人多能干细胞表达至少一些，且任选地 全部，来自以下非限制性列表的标记物 ：SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60， TRA-1-81， TRA-2-49/6E， ALP， Sox2， E- 钙黏着蛋白， UTF-1， Oct4， Rex1，和 Nanog。 与多 能干细胞相关的细胞形态学也是多能干细胞特征。
     术语 “文库”，根据其在本领域中的一般用法，用于表示分子集合，其任选地 以可以鉴别各成员的方式来组织和 / 或分类。 文库可以包括，但不仅限于，组合化学药品文库，天然产物文库，和肽文库。
     “重组” 多核苷酸是不以其天然状态存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包 括自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸处于除其天然存在的背景以外的背景 中，例如，与其在自然界中典型接近的核苷酸序列分开，或与其典型不接近的核苷酸序 列相邻 ( 或相连 )。 例如，问题序列可以克隆至载体中，或否则与一种或多种另外的核酸 重组。
     “表达盒” 意指包括启动子或与编码蛋白的序列可操作相连的其他调控序列的 多核苷酸。
     术语 “启动子” 和 “表达控制序列” 在本文中用于意指指导核酸转录的核酸控 制序列阵列。 用于本文中时，启动子包括接近转录起始点的必需核酸序列，诸如在聚合 酶 II 型启动子的情形中， TATA 元件。 启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件， 其可以位于距转录起始点多至数千碱基对处。 启动子包括组成型和诱导型启动子。 “组 成型” 启动子是在大部分环境和发育条件下处于活性的启动子。 “诱导型” 启动子是在 环境或发育调节下处于活性的启动子。 术语 “可操作相连” 意指核酸表达控制序列 ( 诸 如启动子、或转录因子结合位点阵列 ) 和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表 达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸转录。
     “异源序列” 或 “异源核酸”，用于本文中时，是来源于与特定宿主细胞异源 的来源的序列或核酸，或如果来自相同来源，则由其初始形式进行修饰。 因此，细胞中 的异源表达盒不是特定宿主细胞内源的表达盒，例如通过与来自表达载体的核酸序列而 非染色体 DNA 相连，与异源启动子相连，或与报道基因相连等。
     术语 “试剂” 或 “测试化合物” 意指用于本文中所述的筛选测定中的任一化合 物。 试剂可以是，例如，有机化合物 ( 例如，小分子诸如药物 )，多肽 ( 例如，肽或抗 体 )，核酸 ( 例如， DNA、 RNA、双链、单链、寡核苷酸、反义 RNA、小抑制 RNA、 微小 RNA、核糖核酸酶等 )，寡糖，脂质。 通常，本发明筛选方法中使用的试剂具有 小 于 10,000 道 尔 顿， 例 如， 小 于 8000，6000，4000，2000 道 尔 顿， 例 如，50-1500， 500-1500，200-2000，500-5000 道尔顿的分子量。 测试化合物可以采用测试化合物文 库的形式，诸如提供充足多样性范围的组合文库或随机文库。 测试化合物任选地与融 合配偶体，例如靶向化合物，拯救化合物，二聚化合物，稳定化合物，可寻址化合物 (addressable compounds)，和其他功能结构部分相连。 常规地，具有有用特性的新化学个 体通过下述来产生 ：鉴定具有一些理想特性或活性，例如在某些条件下诸如本文中所述 的条件下诱导多能性的能力的测试化合物 ( 称为 “前导化合物” )，产生所述前导化合物 的变体，和评估那些变体化合物的特性和活性。 通常，将高通量筛选 (HTS) 方法用于所 述分析。
     术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 在本文中可互换地用于意指采用单链或双链形 式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。 该术语包括包含已知的核苷酸类似物或 修饰的主链残基或连锁的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有与 参考核酸类似的结合特性，且其以与参考核苷酸类似的方式代谢。 所述类似物的实例包 括，但不仅限于，硫代磷酸酯，磷酰胺，甲基膦酸酯 (methyl phosphonates)，手性 - 甲基 膦酸酯，2-O- 甲基核糖核酸，肽 - 核酸 (PNAs)。除非另外指出，特定核酸序列还包括其保守修饰变体 ( 例如，简并密码子置换 ) 和互补序列，以及明确指出的序列。 特别地，简并密码子置换可以通过产生这样的序 列来获得，在所述序列中，一个或多个所选 ( 或全部 ) 密码子的第三个位置被混合碱基 和 / 或脱氧肌苷残基取代 (Batzer 等， Nucleic Acid Res.( 核酸研究 )19 ：5081(1991) ； Ohtsuka 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )260 ：2605-2608(1985) ；Rossolini 等， Mol. Cell.Probes( 分子细胞探针 )8 ：91-98(1994))。
     表达或活性的 “抑制剂”、 “活化剂” 和 “调节剂” 分别用来指利用关于所述 靶蛋白 ( 或编码多核苷酸 ) 表达或活性的体外和体内测定所鉴定的抑制分子、活化分子或 调节分子，例如，配体、激动剂、拮抗剂、及其同系物和模拟物。 术语 “调节剂” 包括 抑制剂和活化剂。 抑制剂是，例如，抑制表达或结合，部分或全部阻断刺激或蛋白酶抑 制剂活性，降低、防止、延迟活化，失活，去稳定化，或下调所述靶蛋白活性的试剂， 例如拮抗剂。 活化剂是例如，诱导或活化所述靶蛋白表达或结合，刺激、增加、开放、 活化、促进、增强活化或蛋白酶抑制剂活性，致敏或上调所述靶蛋白 ( 或编码多核苷酸 ) 的活性，例如，激动剂。 调节剂包括天然存在的和合成的配体，拮抗剂和激动剂 ( 例 如，起激动剂或拮抗剂功能的小化学分子、抗体等 )。所述关于抑制剂和活化剂的测定包 括，例如，将推定的调节剂化合物应用到表达所述靶蛋白的细胞，然后确定对所述靶蛋 白活性的功能性作用，如上所述。 将用潜在的活化剂、抑制剂、或调节剂处理的包括所 述靶蛋白的样品或测定与无抑制剂、活化剂、或调节剂的对照样品进行比较，以检验作 用程度。 对照样品 ( 未用调节剂处理 ) 被赋予 100％的相对活性值。 当活性值相对于对 照为约 80％，任选 50％或 25，10％，5％或 1％时，实现所述靶蛋白的抑制。 当活性值 相对于对照为约 110％，任选 150％，任选 200，300％，400％，500％，或 1000-3000％ 或更高时，实现所述靶蛋白的活化。
     发明详述
     I. 介绍
     本发明部分地基于意外的发现，即小分子可以用于模拟参与引发诱导的多能干 细胞 (iPS) 的转录因子的作用。 例如，如本文中详细描述地， Oct4 可以用减少组蛋白 3 赖氨酸 9(H3K9) 甲基化的小分子 “代替”。 因此，例如， BIX01294，一种特异性抑 制 G9a( 关于 H3K9 的组蛋白甲基转移酶 ) 的小分子，在与其中已经表达 Klf4、c-Myc 和 Sox2 的哺乳动物细胞相接触时，引起多能干细胞的诱导。
     这些结果不仅关于 H3K9 的甲基化作用及其参与细胞编程方面令人感兴趣，而且 还表明可以鉴定代替以前证明是多能干细胞诱导所必需的转录因子的小分子。 这可以是 特别令人感兴趣的，其中目的是将诱导的多能干细胞，或随后分化的细胞，诸如源自 iPS 细胞的祖细胞引入 ( 或再引入 ) 至患者中。 因为这四种 iPS 转录因子中的数种 ( 例如， Oct4， Myc) 具有已知的致癌活性，所以用其他较小致癌性或非致癌性分子代替这些因子 可能是有益的。 此外，用不需要转化的小分子代替这四种因子中的一些或每一种 ( 且由 此 DNA 的潜在致癌作用插入染色体 ) 应该进一步有助于减少涉及 iPS 的治疗可能的癌症 副作用。
     本发明还提供诱导的多能细胞，其中至少一些 iPS 转录因子以内源性或更低水平 表达，然而是多能性的。 本发明部分地基于这样的发现，即某些内源性表达 Sox2 的细胞可以通过仅引入和异源表达 Oct4 和 Klf4 来诱导多能性。
     此外，如本文中所示，不内源或异源表达 Sox 多肽 ( 例如，Sox2) 的非多能细胞 可以利用本发明的方法来诱导多能性。 例如，多能性可以通过仅将 Oct4 和 Klf4 引入至 非多能细胞 ( 例如，成纤维细胞 ) 来诱导，所述非多能细胞也与抑制 H3K9 甲基化的试剂 相接触，且任选地也与下述中的至少一种相接触 ：L- 型钙通道激动剂， cAMP 途径活化 剂，DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂，核受体激动剂，GSK3 抑制剂，或 MEK 抑制剂。 本发明人还已经发现试剂组合诸如 GSK 抑制剂和 HDAC 抑制剂 ；或 GSK 抑制剂和 cAMP 途径活化剂 ；或 GSK 抑制剂和 ALK5 抑制剂 ( 有或无 G9a 抑制剂 ) 在异源性表达单独的 Oct4，或 Oct4/Sox2 或 Sox2/Klf4 的细胞中有效诱导多能性。 因此，本发明提供细胞和 试剂的混合物，其中所述细胞最初不是多能细胞 ( 例如，是非干细胞 ) 且任选地异源或内 源性表达 Oct4 和 / 或 Klf4 或否则与 Oct4 和 / 或 Klf4 接触 (in intact with)，且其中所述试 剂是下列中的一种或多种试剂 ：抑制 H3K9 甲基化的试剂，L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑 制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；和 / 或 Erk 抑制剂。
     如下文中进一步讨论地，本发明还提供筛选具有多能干细胞特征的细胞的新方 法，其通过以下步骤实现 ：用 MEK 抑制剂，抑制 H3K9 甲基化的试剂，L- 型 Ca 通道激 动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制 剂 ；MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂培养待筛 选细胞。 MEK 抑制剂，例如，抑制非 iPS 细胞生长，同时促进 iPS 细胞生长和稳定性重 编程，由此富集关于具有多能干细胞特征的细胞的特定细胞混合物。
     II. 多能干细胞的诱导
     A. 异源 / 内源表达
     在本发明的一些实施方案中，鉴定内源性表达来自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽组成的组的至少一种 ( 且任选地，2 或 3 种 ) 蛋白的非多能细胞。 然 后，来自该组的其余 ( 非内源性表达的 ) 蛋白可以在所述细胞中异源性表达，且筛选获得 重编程和 / 或去分化为多能细胞，任选地在存在下列中一种或多种的条件下 ：MEK 抑制 剂，抑制 H3K9 甲基化的试剂， L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转 移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；和 / 或 Erk 抑制剂。
     认为可以筛选任何类型的哺乳动物非多能细胞，以获得蛋白表达和随后转变为 多能细胞。 在一些实施方案中，起始细胞是分离的祖细胞。 示例性祖细胞包括，但不仅 限于，内胚层祖细胞、中胚层祖细胞 ( 例如，肌肉祖细胞、骨骼祖细胞、血液祖细胞 )、 和外胚层祖细胞 ( 例如，表皮组织祖细胞和神经祖细胞 )。 有效用于本发明这些方面的细 胞可以通过针对 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽的表达筛选细胞系，或通过 鉴定具有减小的启动子甲基化的细胞 ( 例如，通过 DNA 亚硫酸氢盐测序法 ) 或通过鉴定 具有修饰的组蛋白状态以确定这些基因降低的沉默状态来容易地鉴定。 然后，不内源表 达的转录因子可以异源表达，以在不异源表达已经内源表达的那些因子的条件下诱导多 能性。
     如实施例中所示，一些细胞 ( 例如，神经祖细胞和成纤维细胞 ( 数据未显示 ))可以通过仅异源表达 Oct4 和 Klf4 来诱导多能性。 这证明 Sox 和 Myc 蛋白，且可能的 Oct 和 Klf 蛋白，不需要都被过表达 ( 例如，使用高表达病毒载体 ) 来获得多能性。 相反，这 些蛋白中的一些可以以内源性或甚至更低的可检测水平来表达，且仍适合通过异源表达 该组中其他成员转变为多能细胞。 因此，在本发明的一些实施方案中，鉴定内源性表达 Sox 多肽和 / 或 Myc 多肽的细胞，且 Oct 多肽和 Klf 多肽在该细胞内异源性表达，由此诱 导该细胞转变为多能细胞。 在一些实施方案中，鉴定内源性表达 Oct 多肽和 / 或 Klf 多肽 和 / 或 Myc 多肽的细胞，且 Sox 多肽在该细胞内异源性表达，由此诱导该细胞转变为多能 细胞。 任选地，Sall4(Zhang 等，NatCell Biol.( 自然细胞生物学 )8(10) ：1114-23(2006)) 可以替换任一或全部的 Myc、 Klf4、和 Sox2 进行表达。
     诱导本文中所述的多能性的效率可以通过在非多能细胞内含例如 UTFl， SV40， TERT 中一种或多种 ( 通过引入编码这些基因产物的表达盒，或通过使所述细胞与蛋白本 身相接触 ) 和 / 或通过减少 p53 表达 ( 例如，通过 siRNA) 来进一步提高。 参见，例如， Zhao，等， Cell Stem Cell( 细胞干细胞 )3 ：475-479(2008)。
     B. 转录因子蛋白
     如本文中详述地，本发明的许多实施方案涉及将一种或多种多肽引入至细胞 中，由此在该细胞中诱导多能性。 如上讨论地，将多肽引入至细胞可以包括将包括一个 或多个表达盒的多核苷酸引入至细胞中和诱导表达，由此将所述多肽通过由所述表达盒 的转录和翻译引入至细胞中。 备选地，可以通过许多不同的方法将外源多肽 ( 即，由细 胞外提供的和 / 或不由细胞产生的蛋白 ) 引入至细胞中，所述方法不涉及引入编码所述多 肽的多核苷酸。
     因此，关于本文中所述的提到将多肽引入细胞，或将编码多肽的表达盒引入细 胞的本发明任一实施方案，应该理解本发明还明确地提供将多肽作为蛋白外源引入至细 胞中。因此，在一些实施方案中，哺乳动物非多能细胞通过以下来诱导多能性 ：a) 将 Klf 多肽、Oct 多肽、Myc 多肽、和 / 或 Sox 多肽中一种或多种外源性引入至非多能细胞中 ； 和任选地 b) 使细胞与 MEK 抑制剂，抑制 H3K9 甲基化的试剂， L- 型 Ca 通道激动剂 ； cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ； MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂中的一种或多 种相接触，由此生成诱导的多能干细胞。
     在一些实施方案中，在本发明的一些实施方案中，鉴定内源性表达来自由 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽组成的组中的至少一种 ( 且任选地，2 或 3 种 ) 蛋白的非多能细胞。 然后来自该组的其余 ( 非内源性表达的 ) 蛋可以外源性引入至该细 胞内，并筛选重编程和 / 或去分化为多能细胞，任选地，在存在下列中的一种或多种的 条件下 ：MEK 抑制剂，抑制 H3K9 甲基化的试剂， L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活 化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂。
     在一些实施方案中，鉴定这样的细胞，即内源性表达 Sox 多肽和 / 或 Myc 多肽， 且作为第二步将 Oct 多肽和 Klf 多肽外源性引入至该细胞中，由此诱导该细胞转变为多能 细胞。 在一些实施方案中，鉴定这样的细胞，即内源性表达 Oct 多肽和 / 或 Klf 多肽和 / 或 Myc 多肽，且将 Sox 多肽外源性引入至该细胞中，由此诱导该细胞转变为多能细胞。向细胞中外源性引入多肽可以以许多方式发生。 一种或多种蛋白可以简单地在 靶细胞存在下，在容许将该蛋白引入细胞内的条件下进行培养。 在一些实施方案中，外 源蛋白包括目的转录因子多肽，其与增强该转录因子进入细胞 ( 且任选地细胞核 ) 的能力 的多肽相连 ( 例如，作为融合蛋白相连或另外共价或非共价相连 ).
     增强跨膜转运的多肽序列的实例包括，但不仅限于，果蝇同源异型蛋白触角 足 转 录 蛋 白 (AntHD)(Joliot 等， New Biol.( 新 生 物 学 )3 ：1121-34，1991 ；Joliot 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国国家科学院学报 )，88 ：1864-8，1991 ；Le Roux 等， Proc. Natl.Acad.Sci.USA( 美国国家科学院学报 )，90 ：9120-4，1993)，单纯疱疹病毒结构蛋 白 VP22(Elliott 和 O’ Hare， Cell( 细胞 )88 ：223-33，1997) ；HIV-1 转录活化 TAT 蛋 白 (Green 和 Loewenstein， Cell( 细胞 )55 ：1179-1188，1988 ；Frankel 和 Pabo， Cell( 细 胞 )55 ：1289-1193，1988) ；递送增强转运蛋白诸如美国专利号 6,730,293 中记述的 ( 包 括但不仅限于包括至少 7-25 个连续的精氨酸的的肽序列 ) ；和可商购的 PenetratinTM 1 肽，和可获自法国巴黎的 Daitos S.A. 的 平台的 Diatos 肽载体 (″ DPVs″ )。 还参见， WO/2005/084158 和 WO/2007/123667 和其中记述的其他转运蛋白。 不仅这些 蛋白可以穿过质膜，而且其他蛋白，诸如本文中所述的转录因子的附着足以刺激细胞吸 收这些复合物。
     在一些实施方案中，本文中所述的转录因子多肽作为脂质体，或脂质混合物诸 如可商购的 Fugene6 和 Lipofectamine 的一部分外源性引入。 在另一种备选方案中，转录 因子蛋白可以显微注射或另外直接引入到靶细胞中。
     如实施例中所讨论地，本发明人已经发现，用本发明的转录因子多肽温育细胞 一段延长的时期对该细胞有毒。 因此，本发明用 Klf 多肽、Oct 多肽、Myc 多肽、和 / 或 Sox 多肽中的一种或多种间歇性温育非多能哺乳动物细胞，介于细胞温育之间的使其缺乏 所述一种或多种多肽。在一些实施方案中，使用和不用所述多肽的温育周期可以重复 2， 3，4，5，6，或更多次，且进行足够长时间 ( 即，使用和不用所述蛋白的温育 )，从而实 现多能细胞的发育。 可以包括不同试剂 ( 例如， MEK 抑制剂和 / 或 GSK 抑制剂和 / 或 TGFβ 抑制剂 )，以提高本方法的效率。
     C.iPS 转录因子的小分子替代
     在本发明的一些实施方案中，细胞表达 ( 内源或异源表达 ) 选自 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽中的至少一种蛋白 ( 例如，这些中的至少 1，2，或 3 种 ) 并与至少一种试剂相接触，其中所述试剂足以导致该细胞在不表达其余不表达蛋白中的 一种或多种 ( 即不在该细胞中表达的 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、或 Sox 多肽中的任 一种 ) 的条件下诱导为多能干细胞。
     如实施例中所示，细胞与某些试剂相接触可以 “补偿” 或替代为了产生多能细 胞通常另外必需表达这些蛋白之一的理解。 通过使细胞与在功能上替代以上所列蛋白之 一的表达的试剂相接触，可能产生表达除被该试剂替代或补偿的蛋白以外的全部以上所 列蛋白的多能细胞。 其余蛋白可以内源地、异源地、或以二者的一些组合表达 ( 例如， Sox 和 Myc 多肽可以内源表达， Klf 多肽可以异源表达，且相反， Oct 多肽可以通过使细 胞与补偿试剂诸如抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂相接触来 “替代” )。
     此外，小分子可以提高用于产生多能细胞 ( 例如，iPS 细胞 ) 的方法的效率。 例如，提高的效率可以通过加速产生所述多能细胞的时间来证明 ( 例如，通过与不用所述 小分子的相似或相同方法相比，将发育多能细胞的时间缩短至少一天 )。备选地，或组合 地，小分子可以增加由特殊方法产生的多能细胞数量 ( 例如，与不用所述小分子的相似 或相同方法相比，增加给定时期内的数量至少 10％，50％，100％，200％，500％等 )。
     如实施例中所述，异源性表达 Klf4、Sox2、和 Myc 的细胞可以通过在无 Oct4 异 源表达的条件下使该细胞与抑制 H3K9 甲基化的试剂相接触来诱导多能性。 实际上，已 经发现多能性可以通过使非多能细胞与抑制 H3K9 甲基化的试剂相接触和引入单独的 Oct 4( 例如，也不引入用于表达 Myc 多肽、Sox 多肽、或 Klf 多肽的载体 ) 或 Oct4 与 Klf4 来 诱导。可以诱导多能性的细胞包括，但不仅限于，神经祖细胞和成纤维细胞。抑制 H3K9 甲基化的试剂包括抑制靶向 H3K9 的甲基化酶 ( 也称为甲基转移酶 ) 的试剂。 例如，G9a 组蛋白甲基转移酶使 H3K9 甲基化，且已知对 G9a 组蛋白甲基转移酶的抑制减少 H3K9 的 甲基化。 参见，例如， Kubicek，等， Mol.Cell( 分子细胞 )473-481(2007)。 根据本发 明的方法有效使用的 G9a 组蛋白甲基转移酶的实例是 BIX01294( 参见，例如，Kubicek， 等， Mol.Cell( 分子细胞 )473-481(2007))，或其盐、水合物、同种型、消旋体、溶剂化 物和前体药物形式。 Bix01294 显示如下 ：
     BIX-01294
     本发明的 Bix01294 化合物还包括盐、水合物、溶剂化物和前体药物形式。 Bix01294 具有不对称碳原子 ( 光学中心 ) 或双键 ；消旋体、非对映体、几何异构体和单 独异构体全部意欲包括在本发明的范围内。 例如，本发明的化合物可以是 R- 异构体或 S- 异构体，或其混合物。 另外，本发明的化合物可以是 E- 异构体或 Z- 异构体，或其组 合。
     在一些实施方案中，抑制 H3K9 甲基化的试剂是组蛋白甲基转移酶的底物类似 物。 许多甲基转移酶的底物是 S- 腺苷 - 甲硫氨酸 (SAM)。 因此，在一些实施方案中， 抑制 H3K9 甲基化的试剂是 SAM 类似物。 示例性 SAM 类似物包括，但不仅限于，甲基 硫代 - 腺苷 (MTA)，灭真菌素 (sinefungin)，和 S- 腺苷 - 高半胱氨酸 (SAH)。 在其他实 施方案中，抑制 H3K9 甲基化的试剂不与 SAM 竞争组蛋白甲基转移酶。
     由此产生的多能细胞 ( 来自异源表达和 / 或小分子 “替代” ) 可以发育为许多 或全部三种主要组织类型 ：内胚层 ( 例如，内部肠管 )，中胚层 ( 例如，肌肉、骨骼、血 液 )，和外胚层 ( 例如，表皮组织和神经组织 )，但是，任选地，可以表现出对其发育潜 力的局限 ( 例如，它们可能不形成胎盘组织，或确定种系的其他细胞类型 )。 所述细胞可 以是人或非人 ( 例如，灵长类动物、大鼠、小鼠、兔、牛、狗、猫、猪等 )。
     在其他实施方案中，BIX01294，或其他抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化
     的试剂可以用于在以前是非多能性的细胞中诱导多能性。 在一些实施方案中，抑制 H3K9 甲基化的试剂用于诱导细胞中的 Oct4 表达，或 Oct4 启动子 DNA 甲基化和 / 或组蛋白甲 基化中的至少一些改变，从而容许细胞被诱导为多能性。 因此，在一些实施方案中，使 最初不是多能细胞的细胞与抑制 H3K9 甲基化的试剂相接触，从而诱导该细胞成为多能 的。 实际上，在不希望将本发明的范围局限于具体的作用模式的条件下，本发明人认为 使非多能细胞与抑制 H3K9 甲基化或促进 H3K9 去甲基化的试剂相接触应该改善任何诱导 细胞多能性的方法。 例如，抑制 H3K9 甲基化的试剂可以与非多能细胞相接触，并在以 下述方法诱导多能性，所述方法包括使非多能细胞与抑制 H3K9 甲基化的试剂相接触， 任选地还使该细胞与下列中的一种或多种相接触 ：L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活 化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂，其中包括足以提高诱导效率 的量的各种化合物。 在如该段中所述一些实施方案中，单独的 Oct4，或 Oct4/Klf4，或 Sox2/Klf4 进一步在非多能细胞中异源表达，由此与本文中所述试剂相接触后导致多能性 的诱导。
     本发明人还已经发现， GSK 抑制剂和 HDAC 抑制剂、或 GSK 抑制剂和 cAMP 途径活化剂、或 GSK 抑制剂和 ALK5 抑制剂的组合可以诱导表达以下任一项的任意小鼠 或人成纤维细胞或角质形成细胞的多能性 ：单独的 Oct4，Oct4/Klf4 或 Sox2/Klf4 的多能 性 ( 数据未显示 )。 在其他实施方案中，以这样的方法诱导非多能细胞的多能性，所述 方法包括使非多能细胞与 GSK3 抑制剂相接触，任选地还使该细胞与下列中的一种或多 种相接触 ：L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制 剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑 制剂 ；或 Erk 抑制剂，其中包括足以提高诱导效率的量的各种化合物。 在其他实施方案 中，以这样的方法诱导非多能细胞的多能性，所述方法包括使非多能细胞与 TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂相接触，任选地还使该细胞与下列中的一种或多种相接触 ：L- 型 Ca 通道 激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑 制剂 ；MEK 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂，其中包括足以提高诱导效率的量的 各种化合物。 在其他实施方案中，以这样的方法诱导非多能细胞的多能性，所述方法包 括使非多能细胞与 HDAC 抑制剂相接触，任选地还使该细胞与下列中的一种或多种相接 触 ：L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受 体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂，TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，或 Erk 抑制剂，其中 包括足以提高诱导效率的量的各种化合物。 在其他实施方案中，以这样的方法诱导非多 能细胞的多能性，所述方法包括使非多能细胞与 MEK 抑制剂相接触，任选地还使该细胞 与下列中的一种或多种相接触 ：L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转 移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂，其中包括足以提高诱导效率的量的各种化合物。 在其他实施方 案中，以这样的方法诱导非多能细胞的多能性，所述方法包括使非多能细胞与 MEK 抑制 剂， L- 型 Ca 通道激动剂 ；抑制 H3K9 甲基化的试剂， cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转 移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂中的 2、3、4、5、6、7、8、9 或每一种相接触，其中包括足以提高诱导效率的量的各种化合物。在如该段中所述一些实施方案中，单独的 Oct4，或 Oct4/ Klf4，或 Sox2/Klf4 进一步在非多能细胞中异源表达，由此与本文中所述试剂相接触后导 致多能性的诱导。
     示 例 性 L- 型 钙 通 道 激 动 剂 包 括， 但 不 仅 限 于， BayK8644( 参 见， 例 如， Schramm，等， Nature( 自然 )303 ：535-537(1983))，脱氢膜海鞘素 B(Dehydrodidemnin B)( 参见，例如，美国专利号 6,030,943)， FPL 64176(FPL)( 参见，例如， Liwang，等， Neuropharmacology( 神 经 药 理 学 )45 ：281-292(2003))， S(+)-PN 202-791( 参 见， 例 如， Kennedy，等， Neuroscience( 神经科学 )49 ：937-44(1992)) 和 CGP 48506( 参见， 例如， Chahine，等， CanadianJournal of Physiology and Pharmacology( 加拿大生理学和药 理学杂志 )81 ：135-141(2003))。
     示例性 cAMP 途径活化剂包括，但不仅限于，毛喉素 ( 参见，例如， Liang， 等， Endocrinology( 内分泌学 )146 ：4437-4444(2005))， FSH( 参见， Liang，见上 )， 米 力 农 (milrinone)( 参 见， Liang， 见 上 )， 西 洛 酰 胺 (cilostamide)( 参 见， Liang， 见 上 )，咯利普兰 (rolipram)( 参见， Liang，见上 )， dbcAMP( 参见， Liang，见上 ) 和 8-Br-cAMP( 参见， Liang，见上 )。 示例性 DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂可以包括结合 DNMT 的抗体、 DNMT 的显性阴性变体、和抑制 DNMT 表达的 siRNA 和反义核酸。 DNMT 抑制剂包括，但不仅 限于， RG108( 可获自，例如， Sigma-Aldrich( 西格玛 - 奥德里奇 ))，5- 氮杂 -C(5- 阿 扎胞苷 (5-azacitidine) 或阿扎胞苷 (azacitidine))( 参见，例如， Schermelleh，等， Nature Methods( 自然方法 )2 ：751-6(2005))，5- 氮杂 -2′ - 脱氧胞苷 (5- 氮杂 -CdR)( 参见， 例如， Zhu， ClinicalMedicinal Chemistry( 临床医学化学 )3(3) ：187-199(2003))，地西 他滨 (decitabine)( 参见，例如， Gore， Nature Clinical Practice Oncology( 自然临床实践肿 瘤学 )2 ：S30-S35(2005))，多柔比星 (doxorubicin)( 参见，例如， Levenson， Molecular Pharmacology( 分子药理学 )71 ：635-637(2007))， EGCG((-)- 表没食子儿茶精 -3- 棓 酸酯 ((-)-epigallocatechin-3-gallate)( 参见，例如， Fang，等， Cancer Research( 癌症研 究 )63 ：7563-7570(2003))， RG108( 参见，例如， Carninci，等， WO2008/126932，通 过参考结合于此 ) 和 zebularine( 参见， Carninci，见上 )。
     示例性核受体配体，即，核受体的激动剂、拮抗剂、活化剂和 / 或抑制剂，可 以在递送位点处调节局部基因表达或转录。 可以使用核受体激动剂 ( 和还有核受体拮抗 剂 )。 在一些实施方案中，核受体是转录共调节剂。 活化或抑制某些核受体调节其结 合的特定基因座的外遗传状态。 本发明人已经发现地塞米松 (dexamethasone)( 例如，以 1μM，其是一种糖皮质素受体激动剂 )，环格列酮 (ciglitazone) 和 Fmoc-Leu( 均以 5μM 使用 )(PPAR 激动剂 )，和贝沙罗汀 (Bexarotene)( 例如，以 (3μM)(RXR 拮抗剂 ) 可以 增强细胞重编程。代表性核受体配体包括，但不仅限于，雌二醇 (estradiol)( 例如，17-β 雌二醇 )，全反式视黄酸 (all-trans retinoic acid)，13- 顺式视黄酸 (13-cis retinoic acid)， 地塞米松，氯倍他索 (clobetasol)，雄激素类 (androgens)，甲状腺素 (thyroxine)，维生素 D3 格列酮类 (vitamin D3glitazones)，曲格列酮 (troglitazone)，吡格列酮 (pioglitazone)， 罗西格列酮 (rosiglitazone)，前列腺素类 (prostaglandins)，和贝特类 (fibrates)( 例如， 苯 扎 贝 特 (bezafibrate)， 环 丙 贝 特 (ciprofibrate)， 吉 非 贝 齐 (gemfibrozil)， 非 诺 贝 特
     (fenofibrate) 和氯贝丁酯 (clofibrate))。 此外，内源性配体 ( 诸如激素雌二醇和睾丸激 素 ) 在与其同源核受体结合时的活性通常上调基因表达。 这种通过配体上调或刺激基因 表达可以称为激动剂反应。 内源激素的激动作用还可以由某些合成的配体，例如，糖皮 质素受体抗炎药地塞米松模拟。 激动剂配体通过诱导促进共活化剂结合的受体构象来起 作用。 ( 参见，例如，通过参考结合于此的 WO08011093A。 )
     GSK3 的 抑 制 剂 包 括 结 合 其 的 抗 体、 其 显 性 阴 性 变 体、 和 靶 向 GSK 的 siRNA 和 反 义 核 酸。 GSK3 抑 制 剂 的 特 殊 实 例 包 括， 但 不 仅 限 于， Kenpaullone， 1-Azakenpaullone， CHIR99021， CHIR98014， AR-A014418( 参 见， 例 如， Gould， 等， The International Journal of Neuropsychopharmacology( 国际神经心理病理学杂志 )7 ： 387-390(2004))， CT 99021( 参见，例如， Wagman， Current Pharmaceutical Design( 当前 药物设计 )10 ：1105-1137(2004))， CT 20026( 参见， Wagman，见上 )， SB216763( 参 见， 例 如， Martin， 等， Nature Immunology( 自 然 免 疫 学 )6 ：777-784(2005))， AR-A014418( 参 见， 例 如， Noble， 等， PNAS 102 ：6990-6995(2005))， 锂 ( 参 见， 例 如， Gould， 等， Pharmacological Research( 药 理 学 研 究 )48 ：49-53(2003))， SB 415286( 参 见， 例 如， Frame， 等， Biochemical Journal( 生 物 化 学 杂 志 )359 ： 1-16(2001)) 和 TDZD-8( 参 见， 例 如， Chin， 等， Molecular Brain Research( 分 子 脑 研究 )，137(1-2) ：193-201(2005))。 其他可获自 Calbiochem 的示例性 GSK3 抑制剂 ( 参见，例如， Dalton，等， WO2008/094597，通过参考结合于此 )，包括但不仅限于 BIO(2 ′ Z，3 ′￡)-6- 溴靛玉红 -3 ′ - 肟 (GSK3 抑制剂 IX) ；BIO- 丙酮肟 (2 ′ Z， 3′ E)-6- 溴靛玉红 -3′ - 丙酮肟 (GSK3 抑制剂 X) ；(5- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基 )-(2- 苯 基喹唑啉 -4- 基 ) 胺 (GSK3- 抑制 XIII) ；吡啶并咔唑 - 环戊二烯合钌复合物 (GSK3 抑制 剂 XV) ；TDZD-84- 苄基 -2- 甲基 -1，2，4- 噻二唑 -3，5- 二酮 (GSK3β 抑制剂 I) ； 2- 硫代 (3- 碘苄基 )-5-(1- 吡啶基 )-[1，3，4]- 噁二唑 (GSK3β 抑制剂 II) ；OTDZT 2，4- 二苄基 -5- 氧代噻二唑 -3- 硫酮 (GSK3β 抑制剂 III) ；α-4- 二溴乙酰苯 (GSK3β 抑制剂 VII) ；AR-AO 14418N-(4- 甲氧基苄基 )-N ′ -(5- 硝基 -1，3- 噻唑 -2- 基 ) 脲 (GSK-3β 抑 制 剂 VIII) ；3-(1-(3- 羟 丙 基 )-1H- 吡 咯 并 [2，3-b] 吡 啶 -3- 基 ]-4- 吡 嗪 -2- 基 - 吡咯 -2，5- 二酮 (GSK-3β 抑制剂 XI) ；TWS119 吡咯并嘧啶化合物 (GSK3β 抑 制 剂 XII) ；L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2 或 其 肉 豆 蔻 酰 化 形 式 (GSK3β 抑 制 剂 XIII) ；2- 氯 -1-(4，5- 二溴 - 噻吩 -2- 基 )- 乙酮 (GSK3β 抑制剂 VI) ；AR-AO144-18 ； SB216763 ；和 SB415286。 已经鉴定了与抑制剂相互作用的 GSK3b 残基。 参见，例如， Bertrand 等， J.Mol Biol.( 分子生物学杂志 )333(2) ：393-407(2003)。 GSK3 抑制剂可以 活化，例如，Wnt/β- 联蛋白途径。 许多 β- 联蛋白下游基因共调节多能性基因网。 例 如， GSK 抑制剂活化 cMyc 表达以及增强其蛋白稳定性和转录活性。 因此，在一些实施 方案中，GSK3 抑制剂可以用于刺激细胞中内源性 Myc 多肽表达，由此消除诱导多能性对 Myc 表达的需要。
     MEK 的 抑 制 剂 可 以 包 括 针 对 MEK 的 抗 体、 MEK 显 性 阴 性 变 体、 和 抑 制 MEK 表 达 的 siRNA 和 反 义 核 酸。 MEK 抑 制 剂 的 特 殊 实 例 包 括， 但 不 仅 限 于， PD0325901， ( 参见，例如， Rinehart，等， Journal of ClinicalOncology( 临床肿瘤学杂 志 )22 ：4456-4462(2004))， PD98059( 可获自，例如， Cell Signaling Technology( 细胞信号传导技术 ))， U0126( 可获自，例如， Cell Signaling Technology( 细胞信号传导技 术 ))， SL 327( 可获自，例如， Sigma-Aldrich( 西格玛 - 奥德里奇 ))， ARRY-162( 可 获 自， 例 如， ArrayBiopharma)， PD184161( 参 见， 例 如， Klein， 等， Neoplasia( 瘤 形 成 )8 ：1-8(2006))， PD184352(CI-1040)( 参 见， 例 如， Mattingly， 等， The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics( 药 理 学 和 实 验 治 疗 杂 志 )316 ： 456-465(2006))，舒尼替尼 (sunitinib)( 参见，例如， Voss，等，通过参考结合于此的 US2008004287)，索拉非尼 (sorafenib)( 参见， Voss 见上 )，凡德他尼 (Vandetanib)( 参 见， Voss 见上 )，帕唑帕尼 (pazopanib)( 参见，例如， Voss 见上 )，阿昔替尼 (Axitinib) ( 参见， Voss 见上 ) 和 PTK787( 参见， Voss 见上 )。
     当前，若干 MEK 抑制剂正在进行临床试验评估。 已在癌症的 I 期和 II 期临 床试验中评估 CI-1040( 参见，例如， Rinehart，等， Journal of ClinicalOncology( 临床 肿瘤学杂志 )22(22) ：4456-4462(2004))。 正在临床试验中评估的其它 MEK 抑制剂包 括 PD 184352( 参见，例如， English，等， Trends inPharmaceutical Sciences( 药物科学趋 势 )23(1) ：40-45(2002))， BAY 43-9006( 参见，例如， Chow，等， Cytometry( 细胞计 数法 )(Communications in ClinicalCytometry( 临床细胞计数法通信 ))46 ：72-78(2001))， PD-325901( 也为 PD0325901)，GSK1120212，ARRY-438162，RDEA119，AZD6244( 也 为 ARRY-142886 或 ARRY-886)， RO5126766， XL518 和 AZD8330( 也为 ARRY-704)。 ( 参见，例如，来自位于 www.clinicaltrials.gov 的全国卫生研究所的信息以及来自位于 www.cancer， gov/clinicaltrials 的国家癌症研究所的信息。
     TGFβ 受体 ( 例如， ALK5) 抑制剂可以包括 TGFβ 受体的抗体、 TGFβ 受体 的显性阴性变体、和抑制 TGFβ 受体 ( 例如， ALK5) 表达的反义核酸。 示例性 TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂包括，但不仅限于， SB431542( 参见，例如， Inman，等， Molecular Pharmacology( 分子药理学 )62(1) ：65-74(2002))， A-83-01，也称为 3-(6- 甲基 -2- 吡 啶基 )-N- 苯基 -4-(4- 喹啉基 )-1H- 吡唑 -1- 硫代酰胺 ( 参见，例如，Tojo，等，Cancer Science( 癌 症 科 学 )96(11) ：791-800(2005)， 和 例 如， 可 由 Toicris Bioscience(Toicris 生 物 科 学 ) 商 购 的 ) ；2-(3-(6- 甲 基 吡 啶 -2- 基 )-1H- 吡 唑 -4- 基 )-1，5- 二 氮 杂 萘， Wnt3a/BIO( 参见，例如， Dalton，等， WO2008/094597，通过参考结合于此 )， BMP4( 参 见， Dalton， 见 上 )， GW788388(-{4-[3-( 吡 啶 -2- 基 )-1H- 吡 唑 -4- 基 ] 吡 啶 -2- 基 }-N-( 四 氢 -2H- 吡 喃 -4- 基 ) 苯 甲 酰 胺 )( 参 见， 例 如， Gellibert， 等， Journal of MedicinalChemistry( 医 学 化 学 杂 志 )49(7) ：2210-2221(2006))， SM16( 参 见， 例 如， Suzuki， 等， Cancer Research( 癌 症 研 究 )67(5) ：2351-2359(2007))， IN-1130(3-((5-(6- 甲基吡啶 -2- 基 )-4-( 喹喔啉 -6- 基 )-1H- 咪唑 -2- 基 ) 甲基 ) 苯 甲酰胺 )( 参见，例如， Kim，等， Xenobiotica( 异型生物质 )38(3) ：325-339(2008))， GW6604(2- 苯基 -4-(3- 吡啶 -2- 基 -1H- 吡唑 -4- 基 ) 吡啶 )( 参见，例如，deGouville， 等， Drug News Perspective( 药物新观点 )19(2) ：85-90(2006))， SB-505124(2-(5- 苯并 [1，3] 间二氧杂环戊烯 -5- 基 -2- 叔 - 丁基 -3H- 咪唑 -4- 基 )-6- 甲基吡啶氢氯化物 )( 参 见，例如，DaCosta，等，Molecular Pharmacology( 分子药理学 )65(3) ：744-752(2004)) 和嘧啶衍生物 ( 参见，例如， Stiefl，等， WO2008/006583 中列出的那些，通过参考结合 于此 )。 此外，虽然″ ALK5 抑制剂″不意欲包括非特异性激酶抑制剂，但是″ ALK5抑制剂″应该理解为包括除 ALK5 外还抑制 ALK4 和 / 或 ALK7 的抑制剂，诸如，例 如， SB-431542( 参见，例如， Inman，等， J Mol.Phamacol.( 分子药理学杂志 )62(1) ： 65-74(2002)。 在不希望局限本发明范围的条件下，认为 ALK5 抑制剂影响间充质到上皮 的转变 / 转换 (MET) 过程。 TGFβ/ 激活蛋白途径是上皮到间充质转换 (EMT) 的驱动 子。 因此，抑制 TGFβ/ 激活蛋白途径可以促进 MET( 即重编程 ) 过程。
     考虑到本文中显示抑制 ALK5 的作用的数据，认为 TGFβ/ 激活蛋白途径的抑制 应该具有类似的作用。 因此，TGFβ/ 激活蛋白途径的任何抑制剂 ( 例如，上游或下游 ) 可以与如本文中每段所述的 ALK5 抑制剂组合使用，或代替其使用。 示例性 TGFβ/ 激 活蛋白途径抑制剂包括但不仅限于 ：TGFβ 受体抑制剂， SMAD 2/3 磷酸化的抑制剂， SMAD 2/3 和 SMAD 4 相互作用的抑制剂，和 SMAD 6 和 SMAD 7 的活化剂 / 激动剂。 此外，下文所述的分类仅用于组织目的且本领域中技术人员应该已知化合物可以影响途 径中的一个或多个点，且因此化合物可以在多于一个确定种类中起作用。
     TGFβ 受体抑制剂可以包括针对其的抗体、其显性阴性变体、和靶向 TGFβ 受体的 siRNA 或反义核酸。 抑制剂的特殊实例包括，但不仅限于 SU5416 ；2-(5- 苯 并 [1，3] 间 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基 -2- 叔 - 丁 基 -3H- 咪 唑 -4- 基 )-6- 甲 基 吡 啶 氢 氯 化 物 (SB-505124) ；乐 地 单 抗 (lerdelimumb)(CAT-152) ；美 替 木 单 抗 (metelimumab) ( CAT -192) ；GC -1008 ；ID 11 ；AP -12009 ；AP -11014 ；LY 550410 ；LY 580276 ； LY 364947 ；LY 2109761 ；SB -505124 ；SB-431542 ；SD -208 ；SM 16 ；NPC -30345 ； Ki26894 ；SB-203580 ；SD-093 ；格 列 卫 (Gleevec) ；3，5，7，2 ′，4 ′ - 五 羟 基 黄 酮 ( 桑色素 (Morin)) ；激活蛋白 -M108A ；P144 ；可溶性 TBR2-Fc ；和靶向 TGFβ 受 体的反义转染肿瘤细胞。 ( 参见，例如， Wrzesinski，等， Clinical Cancer Research( 临 床 癌 症 研 究 )13(18) ：5262-5270(2007) ；Kaminska， 等， Acta Biochimica Polonica 52(2) ：329-337(2005) ；和 Chang， 等， Frontiers in Bioscience( 生 物 科 学 前 沿 )12 ： 4393-4401(2007)。 )
     SMAD 2/3 磷酸化的抑制剂可以包括针对 SMAD2 或 SMAD3 的抗体、其显性阴 性变体和靶向 SMAD2 或 SMAD3 的反义核酸。 抑制剂的特殊实例包括， PD169316 ； SB203580 ；SB-431542 ；LY364947 ；A77-01 ；和 3，5，7，2′，4′ - 五羟基黄酮 ( 桑 色素 (Morin))。 ( 参见，例如， Wrzesinski，见上 ；Kaminska，见上 ；Shimanuki，等， Oncogene( 癌基因 )26 ：3311-3320(2007) ；和 Kataoka，等， EP1992360，通过参考结合 于此。 )
     SMAD 2/3 和 smad4 相互作用的抑制剂可以包括针对 SMAD2、 SMAD3 和 / 或 smad4 的抗体、其显性阴性变体和靶向 SMAD2、 SMAD3 和 / 或 smad4 的反义核酸。 SMAD 2/3 和 SMAD 4 相互作用的抑制剂的特殊实例包括，但不仅限于 Trx-SARA， Trx-xFoxH1b 和 Trx-Lef1。 ( 参 见， 例 如， Cui， 等， Oncogene( 癌 基 因 )24 ： 3864-3874(2005) 和 Zhao， 等， Molecular Biology ofthe Cell( 细 胞 分 子 生 物 学 )，17 ： 3819-3831(2006)。 )
     SMAD 6 和 SMAD 7 的活化剂 / 激动剂包括但不仅限于针对 SMAD 6 或 SMAD 7 的抗体、其显性阴性变体和靶向 SMAD 6 或 SMAD 7 的反义核酸。 抑制剂的特殊实例包 括，但不仅限于 smad7-as PTO- 寡核苷酸。 ( 参见，例如，Miyazono，等，US6534476，和 Steinbrecher，等， US2005119203，均通过参考结合于此。 )
     示例性 HDAC 抑制剂可以包括结合 HDAC 的抗体、 HDAC 的显性阴性变体、 和靶向 HDAC 的 siRNA 和反义核酸。 HDAC 抑制剂包括，但不仅限于， TSA( 曲古抑 菌素 A(trichostatin A))( 参见，例如， Adcock， BritishJournal of Pharmacology( 英国药理 学杂志 )150 ：829-831(2007))， VPA( 丙戊酸 )( 参见，例如， Munster，等， Journal of Clinical Oncology( 临 床 肿 瘤 学 杂 志 )25 ：18S(2007) ：1065)， 丁 酸 钠 (NaBu)( 参 见， 例 如， Han， 等， ImmunologyLetters( 免 疫 学 信 件 )108 ：143-150(2007))， SAHA( 辛 二酰苯胺异羟肟酸或伏林司他 (vorinostat))( 参见，例如， Kelly，等， Nature Clinical PracticeOncology( 自然临床实践肿瘤学 )2 ：150-157(2005))，苯基丁酸钠 ( 参见，例 如， Gore，等， Cancer Research( 癌症研究 )66 ：6361-6369(2006))，缩肽 (depsipeptide) (FR901228， FK228)( 参见，例如， Zhu，等， Current MedicinalChemistry( 当前医学化 学 )3(3) ：187-199(2003))， trapoxin(TPX)( 参见，例如， Furumai，等， PNAS 98(1) ： 87-92(2001))，含环异羟肟酸的肽 1(CHAP1)( 参见， Furumai 见上 )， MS-275( 参见， 例如， Carninci，等， WO2008/126932，通过参考结合于此 ))， LBH589( 参见，例如， Goh，等，通过参考结合于此的 WO2008/108741) 和 PXD101( 参见， Goh，见上 )。 通 常在整体水平上，多能细胞具有更多的组蛋白乙酰化作用，且分化的细胞具有较少的组 蛋白乙酰化作用。 组蛋白乙酰化作用也参与组蛋白和 DNA 甲基化调节。 在一些实施方 案中， HDAC 抑制剂促进沉默的多能性基因的活化。
     示 例 性 ERK 抑 制 剂 包 括 PD98059( 参 见， 例 如， Zhu， 等， Oncogene( 癌 基 因 )23 ：4984-4992(2004))， U0126( 参 见， Zhu， 见 上 )， FR 180204( 参 见， 例 如， Ohori，Drug News Perspective( 药物新观点 )21(5) ：245-250(2008))，舒尼替尼 ( 参见， 例如， Ma，等，通过参考结合于此的 US2008004287)，索拉非尼 ( 参见， Ma，见上 )， 凡德他尼 ( 参见， Ma，见上 )，帕唑帕尼 ( 参见， Ma，见上 )，阿昔替尼 ( 参见， Ma， 见上 ) 和 PTK787( 参见， Ma，见上 )。
     一旦将表达盒引入细胞和 / 或细胞与一种或多种试剂接触，则可以任选地针对 多能干细胞特征筛选细胞，由此鉴定混合物中具有多能性的那些细胞。 这样的细胞可 以，例如，分离自其他细胞并在适当时进一步使用。
     III. 非多能细胞
     用于本文中时， “非多能细胞” 指不是多能细胞的哺乳动物细胞。 这样的细胞 的实例包括分化的细胞以及祖细胞。 分化的细胞的实例包括，但不仅限于，来自选自骨 髓、皮肤、骨骼肌、脂肪组织和外周血的组织的细胞。 示例性细胞类型包括，但不仅限 于，成纤维细胞、肝细胞、成肌细胞、神经细胞、成骨细胞、破骨细胞、和 T 细胞。
     在使用由此产生的多能细胞处理个体的一些实施方案中，个体本身的非多能细 胞用于根据本发明的方法产生多能细胞。
     细胞可以来自，例如，人或非人哺乳动物。 示例性非人哺乳动物包括，但不仅 限于，小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、羊、猪、马、和牛。
     IV. 转化
     本发明依赖于重组遗传学领域中的常规技术。 公开本发明中使用的一般方法的 基础教科书包括 Sambrook 等 .Molecular Cloning，A LaboratoryManual( 分子克隆，实验室手册 )( 第 3 版，2001) ；Kriegler，Gene Transfer andExpression ：A Laboratory Manual( 基 因转移和表达 ：实验室手册 )(1990) ；和 Current Protocols in Molecular Biology( 现代分子 生物学方法 )(Ausubel 等，编，1994))。
     在一些实施方案中，细胞和待表达的蛋白的物种相同。 例如，如果使用小鼠细 胞，则将小鼠直向同源物引入该细胞。 如果使用人细胞，则将人直向同源物引入该细 胞。
     应该理解当要在细胞中表达两种或更多蛋白时，可以使用一个或多个表达盒。 例如，当一个表达盒用于表达多种多肽时，可以使用多顺反子表达盒。
     A. 质粒载体
     在某些实施方案中，预期质粒载体用于转化宿主细胞。 通常，源自与宿主细胞 相容物种的包含复制子和控制序列质粒载体可以连同这些宿主一起使用。 载体可以携带 复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。
     B. 病毒载体
     某些病毒通过受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞、和整合进入宿主细胞 基因组并稳定且有效表达病毒基因的能力已经使其成为将外源核酸转移至细胞 ( 例如， 哺乳动物细胞 ) 中的具有吸引力的候选者。 可以用于递送本发明的核酸的病毒载体的非 限制性实例记述如下。
     i. 腺病毒载体
     一种用于递送核酸的具体方法涉及使用腺病毒表达载体。 尽管已知腺病毒载体 具有低整合进入基因组 DNA 的能力，但是该特性被这些载体提供的高基因转移效率所弥 补。 “腺病毒表达载体” 意欲包括含有这样的腺病毒序列的那些构建体，所述腺病毒序 列足以 (a) 支持所述构建体的包装和 (b) 最终表达已经克隆在其中的组织或细胞特异性构 建体。 关于遗传组织或腺病毒 ( 即一种～ 36kb 线性双链 DNA 病毒 ) 的知识容许用至多 7kb 的外源序列来取代腺病毒 DNA 的大片段 (Grunhaus 等，Seminar inVirology( 病毒学研 究会 )，200(2) ：535-546，1992))。
     ii.AAV 载体
     核酸可以利用腺病毒辅助的转染引入细胞中。 已经在利用腺病毒偶联的系统的 细胞系统中报告了增加的转染效率 (Kelleher 和 Vos，Biotechniques( 生物技术 )，17(6) ： 1110-7，1994 ；Cotten 等， Proc Natl Acad Sci USA( 美国国家科学院学报 )，89(13) ： 6094-6098，1992 ；Curiel， Nat Immun( 自然免疫学 )，13(2-3) ：141-64，1994.)。 腺 伴随病毒 (AAV) 是有吸引力的系统，因为其具有高频整合并且其可以感染非分裂细胞， 由此使其有效用于将基因递送至哺乳动物细胞中，例如，在组织培养中 (Muzyczka，Curr Top MicrobiolImmunol( 当前顶尖微生物免疫学 )，158 ：97-129，1992) 或体内进行。 关 于产生和使用 rAAV 载体的详细信息记述在美国专利号 5,139,941 和 4,797,368，分别通过 参考结合于此。
     iii. 反转录病毒载体
     反转录病毒容许作为基因递送载体，这归因于其将它们的基因整合进入宿主基 因组、转移大量外源遗传物质、感染广谱物种和细胞类型和被包装在特定细胞系中的能 力 (Miller 等， Am.J.Clin.Oncol( 美国临床肿瘤学杂志 )，15(3) ：216-221，1992)。为了构建反转录病毒载体，将核酸 ( 例如，编码目的基因的核酸 ) 插入病毒基 因组中替代某些病毒序列，从而生成复制缺陷型病毒。 为了生成毒粒，构建含有 gag、 pol、 和 env 基 因 但 无 LTR 和 包 装 部 件 的 包 装 细 胞 系 (Mann 等， Cell( 细 胞 )，33 ： 153-159，1983)。 当将含有 cDNA，以及反转录病毒 LTR 和包装序列的重组质粒引入特 定细胞系 ( 例如，通过例如磷酸钙沉淀 ) 时，包装序列容许重组质粒的 RNA 转录物包装 在病毒颗粒中，所述病毒颗粒随后分泌到培养基中 (Nicolas 和 Rubinstein，在 ：Vectors ： Asurvey of molecular cloning vectors and their uses( 载体 ：分子克隆载体及其应用的调查 ) 中，Rodriguez 和 Denhardt，编，Stoneham ：Butterworth，第 494-513 页，1988 ；Temin， 在 ：Gene Transfer( 基因转移 )，Kucherlapati( 编 )，纽约 ：Plenum Press，第 149-188 页， 1986 ；Mann 等，Cell( 细胞 )，33 ：153-159，1983)。然后收集含有重组反转录病毒的培 养基，任选地浓缩，并用于基因转移。 反转录病毒载体能够感染广泛多样的细胞类型。 然而，整合和稳定表达典型地涉及宿主细胞的分裂 (Paskind 等，Virology( 病毒学 )，67 ： 242-248，1975)。
     慢病毒是复杂的反转录病毒，其除普通的反转录病毒基因 gag、 pol、和 env 外，包含其他具有调节或结构功能的基因。 慢病毒载体是本领域中公知的 ( 参见， 例 如， Naldini 等， Science( 科 学 )，272(5259) ：263-267，1996 ；Zufferey 等， Nat Biotechnol( 自 然 生 物 技 术 )，15(9) ：871-875，1997 ；Blomer 等， J Virol( 病 毒 学 杂 志 )，71(9) ：6641-6649，1997 ；美国专利号 6,013,516 和 5,994,136)。 慢病毒的一些实 例包括人免疫缺陷病毒 ：HIV-1， HIV-2 和猿免疫缺陷病毒 ：SIV。 慢病毒载体已经通 过加强地减弱 HIV 毒力基因来产生，例如，删除基因 env，vif，vpr，vpu 和 nef，以使载 体是生物学安全的。
     重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并可以用于核酸序列的体内和离体基因转 移和表达。 例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中用两种或更多携带包装功 能的载体，即 gag， pol 和 env，以及 rev 和 tat 转染合适的宿主细胞，记述在美国专利号 5,994,136，通过参考结合于此。 人们可以通过使包膜蛋白与靶向特殊细胞类型的受体的 抗体或特殊配体相联系来靶向重组病毒。 通过将目的序列 ( 包括调节区 )，以及例如编码 特异性靶细胞上受体的配体的另一种基因插入病毒载体中，载体现在是靶标特异性的。
     iv. 利用修饰的病毒递送
     待递送的核酸可以居于传染性病毒中，所述传染性病毒已经被改造为表达特异 性结合配体。 病毒颗粒应该因此特异性结合靶细胞的同源受体并将内容物递送至细胞。 基于通过向病毒薄膜化学添加乳糖残基进行的反转录病毒化学修饰，开发了一种设计用 于容许特异性靶向反转录病毒载体的新方法。 该修饰可以允许通过唾液酸糖蛋白受体特 异性感染肝细胞。
     设计另一种靶向重组反转录病毒的方法，其中使用生物素化的抗反转录病毒包 膜蛋白抗体和抗特异性细胞受体抗体。 所述抗体通过利用链霉抗生物素经由生物素成 分 偶 联 (Roux 等， Proc.Natl Acad.Sci.USA( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )，86 ：9079-9083， 1989)。 利用抗主要组织相容性复合物 I 类和 II 类抗原的抗体，它们证明多种具有那些表 面抗原的人细胞在体外被亲嗜性病毒感染 (Roux 等，1989)。
     C. 载体递送和细胞转化认为核酸递送以转化细胞、组织或生物体从而用于本发明的合适方法实质上包 括任何这样的方法，通过该方法可以将核酸 ( 例如，DNA) 引入至细胞、组织或生物体， 如本文中所述或本领域中普通技术人员应该已知地。 所述方法包括，但不仅限于，直接 递送 DNA，诸如通过离体转染 (Wilson 等， Science( 科学 )，244 ：1344-1346，1989， Nabel 和 Baltimore，Nature( 自然 )326 ：711-713，1987)，任选地使用 Fugene6(Roche( 罗 氏 )) 或 Lipofecyamine(Invitrogen)， 通 过 注 射 ( 美 国 专 利 号 5,994,624，5,981,274， 5,945,100，5,780,448，5,736,524，5,702,932，5,656,610，5,589,466 和 5,580,859， 分 别 通过参考结合于此 )，包括显微注射 (Harland 和 Weintraub， J.Cell Biol.( 细胞生物学杂 志 )，101 ：1094-1099，1985 ；美国专利号 5,789,215，通过参考结合于此 ) ；通过电穿 孔 ( 美国专利号 5,384,253，通过参考结合于此 ；Tur-Kaspa 等， Mol.Cell Biol.( 分子细 胞生物学 )，6 ：716-718，1986 ；Potter 等， Proc.Natl Acad.Sci.USA( 美国国家科学院学 报 )，81 ：7161-7165，1984) ；通 过 磷 酸 钙 沉 淀 (Graham 和 Van Der Eb， Virology( 病 毒 学 )，52 ：456-467，1973 ；Chen 和 Okayama， Mol.Cell Biol.( 分 子 细 胞 生 物 学 )， 7(8) ：2745-2752，1987 ；Rippe 等， Mol.Cell Biol.( 分子细胞生物学 )，10 ：689-695， 1990) ；通过使用 DEAE- 葡聚糖及随后使用聚乙二醇 (Gopal，Mol.Cell Biol.( 分子细胞生 物学 )，5 ：1188-1190，1985) ；通过直接声速加样 (sonic loading)(Fechheimer 等， Proc. Natl Acad.Sci.USA( 美国国家科学院学报 )，84 ：8463-8467，1987) ；通过脂质体介导的 转染 (Nicolau 和 Sene，Biochim.Biophys.Acta( 生物化学生物物理学报 )，721 ：185-190， 1982 ；Fraley 等， Proc.Natl Acad.Sci.USA( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )，76 ：3348-3352， 1979 ；Nicolau 等， Methods Enzymol( 酶 学 方 法 )，149 ：157-176，1987 ；Wong 等， Gene( 基因 )，10 ：87-94，1980 ；Kaneda 等， Science( 科学 )，243 ：375-378，1989 ； Kato 等， J Biol Chem.( 生物化学杂志 )，266 ：3361-3364，1991) 和受体 - 介导的转染 (Wu 和 Wu， Biochemistry( 生物化学 )，27 ：887-892，1988 ；Wu 和 Wu， J.Biol.Chem. ( 生物化学杂志 )，262 ：4429-4432，1987) ；分别通过参考结合于此 ) ；和所述方法的 任意组合。
     V. 培养细胞
     待诱导多能性的细胞可以按照本领域中已知的任何方法来培养。 一般性指导可 见于，例如， Maherali，等， Cell Stem Cell( 细胞干细胞 )3 ：595-605(2008)。
     在一些实施方案中，细胞与饲养细胞相接触来培养。 示例性饲养细胞包括，但 不仅限于成纤维细胞，例如，小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 细胞。 在饲养细胞上培养细胞 的方法是本领域中已知的。
     在一些实施方案中，细胞在缺乏饲养细胞的条件下培养。 细胞，例如，可以例 如，通过分子粘连，直接附着于固体培养物表面 ( 例如，培养皿 )。 本发明人已经发现， 与在饲养细胞上培养的其他方面相同处理的细胞的效率相比，当细胞直接附着于固体培 养物表面时，培养诱导多能性的细胞的诱导多能性效率高得多 ( 即，更大部分的细胞获 得多能性 )。 示例性分子粘连包括，但不仅限于，基质胶，细胞外基质 (ECM)，ECM 类 似物，层粘连蛋白，纤连蛋白，或胶原蛋白。 然而，本领域中技术人员公认这是非限制 性列表，且可以使用其他分子使细胞附着于固体表面。 该束缚最初附着于固体表面的方 法是本领域中已知的。用于该 “培养” 部分中时， “待诱导多能性的细胞” 包括在本领域中的任何方 法中，包括，但不仅限于本申请中所述的方法。
     VI. 多能细胞的应用
     本发明容许进一步研究和开发干细胞技术，包括但不仅限于，预防或治疗应 用。 例如，在一些实施方案中，将本发明的细胞 ( 多能细胞或诱导沿着需要的细胞命运 分化的细胞 ) 引入有此需要的个体中，包括但不仅限于，需要再生器官、组织、或细胞 类型的个体。 在一些实施方案中，细胞最初以活检方式由个体获得 ；如本文所述诱导多 能性，任选地诱导分化 ( 例如分化为特别需要的祖细胞 ) 并然后移植回该个体中。 在一 些实施方案中，细胞在其引入个体前进行遗传修饰。
     在一些实施方案中，按照本发明的方法产生的多能细胞随后被诱导，以形成， 例如，造血 ( 干 / 祖 ) 细胞，神经 ( 干 / 祖 ) 细胞 ( 和任选地，更加分化的细胞，诸如亚 型特异性神经细胞，少突胶质细胞，等 )，胰腺细胞 ( 例如，内分泌祖细胞或胰腺激素表 达细胞 )，肝细胞，心血管 ( 干 / 祖 ) 细胞 ( 例如，心肌细胞，内皮细胞，平滑肌细胞 )， 视网膜细胞，等。
     已知多种诱导多能干细胞分化为需要的细胞类型的方法。 描述诱导干细胞 分化为不同细胞命运的方法的近期专利公开文件的非限制列表如下 ：美国专利公开 号 2007/0281355 ；2007/0269412 ；2007/0264709 ；2007/0259423 ；2007/0254359 ； 2007/0196919 ；2007/0172946 ；2007/0141703 ；2007/0134215。
     许多疾病可以通过将本发明的多能细胞引入具体的受伤组织，和任选地靶向 具体的受伤组织而改善。 由组织损伤引起的疾病实例包括，但不仅限于，神经变性疾 病 (neurodegeneration disease)， 脑 梗 死 (cerebralinfarction)， 阻 塞 性 血 管 病 (obstructive vascular disease)， 心 肌 梗 死 (myocardial infarction)， 心 力 衰 竭 (cardiac failure)， 慢 性 阻 塞 性 肺 病 (chronic obstructive lung disease)， 肺 气 肿 (pulmonary emphysema)， 支 气 管 炎 (bronchitis)， 间 质 肺 病 (interstitial pulmonary disease)， 哮 喘 (asthma)， 乙 型 肝 炎 (hepatitisB)( 肝 损 伤 (liver damage))， 丙 型 肝 炎 (hepatitis C)( 肝 损 伤 )， 酒 精 性 肝 炎 (alcoholic hepatitis)( 肝 损 伤 )， 肝 硬 化 (hepatic cirrhosis)( 肝 损 伤 )， 肝 功 能 不 全 (hepatic insufficiency)( 肝 损 伤 )， 胰 腺 炎 (pancreatitis)， 糖 尿 病 (diabetes mellitus)， 局 限 性 回 肠 炎 (Crohn disease)， 炎 性 结 肠 炎 (inflammatory colitis)， IgA 肾 小 球 肾 炎 (IgAglomerulonephritis)， 肾 小 球 肾 炎 (glomerulonephritis)， 肾 功 能 不 全 (renalinsufficiency)， 褥 疮 (decubitus)， 烧 伤 (burn)， 缝 合 伤 口 (sutural wound)， 撕 裂 (laceration)，切伤伤口 (incised wound)，咬伤伤口 (bite wound)，皮炎 (dermatitis)，瘢痕 性瘢痕疙瘩 (cicatricial keloid)，瘢痕疙瘩 (keloid)，糖尿病性溃疡 (diabetic ulcer)，动脉 溃疡 (arterial ulcer) 和静脉溃疡 (venousulcer)。
     本文中所述的多肽 ( 例如， Klf 多肽、 Oct 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽中的一 种或多种 ) 本身单独地或如本文中所述组合地，是有效的治疗剂。 例如，多肽，或其组 合，有效用于减小组织损伤并因此可以施用，以治疗、改善、或预防组织损伤。 在一些 实施方案中，将本发明的化合物施用于患有组织损伤或处于患有组织损伤风险的个体的 内部器官。 内部器官包括，但不仅限于，脑、胰腺、肝、肠、肺、肾、或心脏、伤口， 例如，通过烧伤或割伤的伤口。 例如，在一些实施方案中，本发明的化合物有效用于在缺血后再灌输中减小梗死尺寸。 因此，本发明的蛋白可以施用于处于患有中风风险、正 患有中风、或患过中风的个体中。 类似地，本发明的蛋白可以施用于处于患有心脏病发 作或心脏损伤风险、正患有心脏病发作或心脏损伤、或患过心脏病发作或心脏损伤的个 体中。
     本文中所述的试剂 ( 例如，抑制 H3K9 甲基化的试剂 ；L- 型 Ca 通道激动剂 ； cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ； MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂 ) 单独地或如 本文中所述彼此组合地，也是有效的治疗剂。 例如，所述试剂，或其组合，有效用于减 小组织损伤并因此可以施用，以治疗、改善、或预防组织损伤。 在一些实施方案中，将 本发明的试剂施用于患有组织损伤或处于患有组织损伤风险的个体的内部器官。 内部器 官包括，但不仅限于，脑、胰腺、肝、肠、肺、肾、或心脏、伤口，例如，通过烧伤或 割伤的伤口。 例如，在一些实施方案中，本发明的试剂有效用于在缺血后再灌输中减小 梗死尺寸。 因此，本发明的试剂可以施用于处于患有中风风险、正患有中风、或患过中 风的个体中。 类似地，本发明的试剂可以施用于处于患有心脏病发作或心脏损伤风险、 正患有心脏病发作或心脏损伤、或患过心脏病发作或心脏损伤的个体中。
     本文中所述的活性化合物还包括其盐、水合物、溶剂化物和前体药物形式。 本 发明的化合物还包括其异构体和代谢物。 本发明的某些化合物具有不对称的碳原子 ( 光 学中心 ) 或双键 ；消旋体、非对映体、几何异构体和单独异构体全部意欲包括在本发明 的范围内。 例如，本发明的化合物可以是 R- 异构体或 S- 异构体，或其混合物。 另外， 本发明的化合物可以是 E- 异构体或 Z- 异构体，或其组合。
     本发明的酸性化合物的药用盐是用碱形成的盐，即阳离子盐诸如碱金属盐和碱 土金属盐，诸如钠、锂、钾、钙、镁、以及铵盐，诸如铵、三甲基铵、二乙基铵、和三 ( 羟甲基 )- 甲基铵盐。 在一些实施方案中，本发明提供盐酸盐。 在其他实施方案中，所 述化合物是盐酸玫瑰树碱 (ellipticinehydrochloride)。
     类似的酸性加成盐，诸如矿物酸、有机羧酸和有机磺酸，例如，盐酸、甲磺 酸、马来酸的加成盐也是可能的，条件是碱性基团，诸如吡啶基，构成该结构的一部 分。
     所述化合物的中性形式可以通过使所述盐与碱或酸接触和以常规方式分离母体 化合物来再生。 化合物的母体形式可以在某些物理特性，诸如在极性溶剂中的溶解性方 面与多种盐形式不同，然而在别的方面所述盐却与用于本发明的目的所述化合物的母体 形式等价。
     本发明的化合物可以通过多种本领域中技术人员已知的方法来制备 ( 参见 Comprehensive Organic Transformations( 综合有机转化 )Richard C.Larock，1989)。 本领域 中技术人员应该理解其他制备所述化合物的方法也有效用于本发明。
     本文中所述的细胞或化合物的施用可以通过通常用于引入药物的任何途径进 行。 本发明的药物组合物可以包括药用载体。 药用载体部分地通过施用的具体组合物， 以及通过用于施用该组合物的具体方法来确定。 因此，存在广泛多样的本发明的药物组 合物的合适剂型 ( 参见，例如 .Remington′ sPharmaceutical Sciences( 雷明顿药物科学 )， 第 17 版 1985))。适合于施用的剂型包括水性和非水性溶液，等渗无菌溶液，其可以包含抗氧化 剂、缓冲剂、抑菌剂、和致使制剂等渗的溶质，和水性或非水性无菌混悬液，其可以包 括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂。 在本发明的实践中，组合物可以，例 如，口服、经鼻、局部、静脉内、腹膜内、鞘内或进入眼睛 ( 例如，通过滴眼液或注射 ) 来施用。 化合物制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和小瓶中。 溶 液和混悬液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒、和片剂来制备。 还可以施用调节剂，作 为制备的食品或药物的一部分。
     施用于患者的剂量，在本发明的情形中，应该足以随时间在受试者中诱导有益 反应，即，改善受试者的状况。 对于任何患者的最佳剂量水平应该取决于多种因素，包 括所用特定调节剂的功效，患者的年龄、体重、体育活动、和饮食，并取决于与其他药 物的可能组合。 剂量大小还应该通过具体化合物或载体在具体受试者中的施用所伴随的 任何有害副作用的存在、性质、和程度确定。 施药可以通过单剂量或分开剂量实现。
     VII. 筛选诱导多能干细胞形成的试剂
     本发明提供筛选这样的试剂的方法，所述试剂可以 “替代” 四种 iPS 转录因 子 ( 即， Oct 多肽， Klf 多肽， Myc 多肽，和 Sox 多肽 ) 之一，或备选地可以在其中不 需要 Myc 来使细胞重编程为多能细胞的细胞中替代 Oct 多肽， Klf 多肽，或 Sox 多肽 (Nakagawa， M. 等 Nature Biotechnol.( 自 然 生 物 技 术 )26，101-106(2007) ；Wernig， M.， Meissner， A.， Cassady， J.P.&Jaenisch， R.Cell Stem Cell( 细 胞 干 细 胞 )2， 10-12(2008))，或备选地提高诱导多能性的效率。
     在一些实施方案中，所述方法包括将一个或多个用于表达 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、和 Sox 多肽中的至少一种，但非全部的表达盒引入非多能细胞，以产生转染 的细胞 ；随后使所述转染的细胞与不同试剂的文库相接触 ；针对多能干细胞特征筛选所 接触的细胞 ；和使干细胞特征的形成与来自所述文库的特定试剂相关联，由此确定刺激 细胞去分化成为多能干细胞的试剂。 在一些实施方案中，所述细胞与抑制 H3K9 甲基化 的试剂 ；L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ； 核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂，TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，HDAC 抑制剂 ； 或 Erk 抑制剂中的至少一种以及小分子或其他试剂文库的一个或多个成员相接触，以鉴定 诱导或提高细胞诱导多能性的文库成员。 因此，本发明中提供非多能细胞和抑制 H3K9 甲基化的试剂 ；L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑 制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂， TGF β 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂中的至少一种 ( 例如，1，2，3，4，5 或更多 ) 的混合物。
     所述库中的试剂可以是任何小化学化合物，或生物实体，诸如蛋白、糖、核 酸或脂质。 典型地，测试试剂应该是小化学分子和肽。 在本质上，任何化学化合物 可以在本发明的测定中用作潜在试剂，尽管最经常使用可以溶于水性或有机 ( 特别地 基于 DMSO 的 ) 溶液中的化合物。 设计测定，以通过自动化测定步骤和向测定提供 来自任何便利来源的化合物来筛选大化学品文库，所述测定典型地平行运行 ( 例如， 在机器人测定中在微滴定板上以微滴定形式运行 )。 应该理解存在许多化学化合物 的 供 应 商， 包 括 Sigma( 西 格 玛 )(St.Louis， MO)， Aldrich( 奥 德 里 奇 )(St.Louis， MO)， Sigma-Aldrich( 西格玛 - 奥德里奇 )(St.Louis， MO)， FlukaChemika-B iochemicaAnalytika(Buchs，瑞士 ) 等。
     在一些实施方案中，高通量筛选方法包括提供组合型化学品或肽文库，其包含 大量潜在 iPS 替代剂 ( 潜在地起替代 iPS 蛋白之一的作用 )。 然后在一种或多种测定中筛 选所述 “组合型化学品文库”，如本文中所述，以鉴定表现出理想特性活性，即，诸如 在表达 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽和 Sox 多肽中的一些，而非全部的细胞中诱导多能 干细胞特征的那些文库成员 ( 具体的化学品种类或亚类 )。
     组合型化学品文库是通过化学合成或生物合成，通过组合许多化学 “积木” 诸 如试剂产生的不同化学化合物的集合。 例如，线性组合型化学品文库诸如多肽文库通过 以每一种对于给定化合物长度 ( 即多肽化合物中的氨基酸数 ) 可能的方式组合一组化学积 木 ( 氨基酸 ) 形成。 通过所述组合性混合化学积木可以合成数百万化学化合物。
     制备和筛选组合型化学品文库是本领域中技术人员公知的。 所述组合型化 学品文库包括，但不仅限于，肽文库 ( 参见，例如，美国专利 5,010,175， Furka， Int. J.Pept.Prof.Res.( 国际肽专业研究杂志 )37 ：487-493(1991) 和 Houghton 等， Nature( 自 然 )354 ：84-88(1991))。 也可以使用用于产生化学品多样性文库的其他化学品。 所 述化学品包括，但不仅限于 ：拟肽 ( 例如， PCT 公开号 WO 91/19735)，编码肽 ( 例 如， PCT 公开 WO 93/20242)，随机生物低聚物 ( 例如， PCT 公开号 WO 92/00091)， 苯并二氮杂 (benzodiazepines)( 例如，美国专利号 5,288,514)， diversomers 诸如乙内 和二肽 (Hobbs 等， Proc.Nat.Acad.Sci.USA( 美国国家 酰脲 (hydantoins)，苯并二氮杂科 学 院 学 报 )90 ：6909-6913(1993))， 插 烯 多 肽 (vinylogouspolypeptide)(Hagihara 等， J.Amer.Chem.Soc.( 美国化学协会杂志 )114 ：6568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽假 肽 (peptidomimetics)(Hirschmann 等， J.Amer.Chem.Soc.( 美 国 化 学 协 会 杂 志 )114 ： 9217-9218(1992))，小化合物文库的类似有机综合体 (Chen 等， J.Amer.Chem.Soc.( 美 国 化 学 协 会 杂 志 )116 ：2661(1994))， 寡 聚 氨 基 甲 酸 酯 (oligocarbamates)(Cho 等， Science( 科学 )，261 ：1303(1993))，和 / 或肽基磷酸酯 (Campbell 等，J.Org.Chem.( 有机 化学杂志 )59 ：658(1994))，核酸文库 ( 参见 Ausubel， Berger 和 Sambrook，均见上 )， 肽核酸文库 ( 参见，例如，美国专利 5,539,083)，抗体文库 ( 参见，例如， Vaughn 等， Nature Biotechnology( 自然生物技术 )，14(3) ：309-314(1996) 和 PCT/US96/10287)， 碳水化合物文库 ( 参见，例如， Liang 等， Science( 科学 )，274 ：1520-1522(1996) 和 美国专利 5,593,853)，小有机分子文库 ( 参见，例如，苯并二氮杂 Baum C&EN，1 月 18 日，第 33 页 (1993) ；类异戊二烯，美国专利 5,569,588 ；噻唑啉酮 (thiazolidinones) 和间噻嗪烷酮 (metathiazanones)，美国专利 5,549,974 ；吡咯烷，美国专利 5,525,735 和 5,519,134 ；吗啉代化合物 (morpholino compounds)，美国专利 5,506,337 ；苯并二氮杂 5,288,514，等 )。
     用于制备组合文库的装置可商购 ( 参见，例如，357MPS，390MPS， Advanced Chem Tech( 高级化学技术 )， Louisville KY， Symphony， Rainin， Woburn， MA，433A Applied Biosystems( 应用生物系统 )， Foster City， CA，9050Plus， Millipore， Bedford， MA)。 另外，许多组合文库本身可商购 ( 参见，例如， ComGenex， Princeton， N.J.， Tripos， Inc.(Tripos 公司 )， St.Louis， MO，3D Pharmaceuticals(3D 医药品 )， Exton， PA， Martek Biosciences(Martek 生物科学 )， Columbia， MD，等 .)。然后，可以筛选与试剂相接触、且任选地表达 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽、 和 Sox 多肽中一些而非全部 ( 例如 Oct 多肽、 Klf 多肽、 Myc 多肽和 Sox 多肽中的 1、2 或 3 种的组合 ) 的细胞，以获得多能细胞的形成，例如，通过针对一种或多种多能干细胞 特征进行筛选。 最初的筛选可以通过用表达盒转化待筛选的细胞来设计，所述试剂盒包 括已知在多能干细胞中活化的 ( 任选地，在其他细胞中不活化的 ) 启动子部件，其与可 选择或另外可鉴定的标记物可操作相连接。 例如，可以使用可检测的标记物诸如 GFP 或 其他报道系统。 已知在多能细胞中活化的示例性启动子部件包括，但不仅限于， Oct4， Nanog，SSEA1 和 ALP 启动子序列。 还可以针对其他多能细胞标记物的表达 ( 例如，通 过免疫荧光，等 ) 筛选细胞，所述多能细胞标记物如本领域中已知地，包括，但不仅限 于 Nanog， SSEA1 和 ALP。 在一些实施方案中，检验细胞形态学。
     在一些实施方案中，在存在 MAPK/ERK 激酶 (MEK) 抑制剂的条件下培养细 胞。 本发明人已经发现 MEK 抑制剂的存在导致抑制非多能细胞生长和刺激多能干细 胞生长。 该作用因此放大筛选 “信号” 并容许更有效和灵敏地检测诱导细胞重编程为 多能干细胞的试剂。 已知广泛多样的 MEK 抑制剂，包括但不仅限于， PD0325901( 参 见，例如， Thompson，等， CurrentOpinion in Pharmacology( 当前药理学观点 )5(4) ： 350-356(2005)) ；MEK 抑 制 剂 U0126(Promega)， ARRY-886(AZD6244)(Array Biopharma( 阵 列 生 物 药 物 )) ；PD98059(Cell Signaling Technology( 细 胞 信 号 传 导 技 术 )) ；和氨基 - 硫代 - 丙烯腈 ( 美国专利号 6,703,420)。 除了别的以外，其他 MEK 抑 制剂记述在，例如，美国专利号 6,696,440 和 WO 04/045617 中。
     VIII. 细胞混合物
     如本文中讨论地，本发明提供与一种或多种化合物混合的非多能细胞，所述化 合物选自由下列各项组成的组 ：抑制 H3K9 甲基化的试剂 ；L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑 制剂，TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂，HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂。 在一些实施方案中， 所述化合物以足以诱导或提高诱导多能性效率的浓度存在于混合物中。 例如，在一些实 施方案中，所述化合物的浓度为至少 0.1nM，例如，至少 1，10，100，1000，10000，或 100000nM， 例 如，0.1nM-100000nM， 例 如，1nM-10000nM， 例 如，10nM-10000nM。 在一些实施方案中，混合物在合成容器 ( 例如，试管、培养皿等 ) 中。 因此，在一些实 施方案中，所述细胞是分离的细胞 ( 不是动物的一部分 )。 在一些实施方案中，所述细 胞分离自动物 ( 人或非人 )，置于容器中，与一种或多种如本文中所述的化合物相接触。 细胞可以随后培养并任选地，放入回相同或不同动物中，这任选地，在细胞已经被刺激 成为特定的细胞类型或种系后。
     如本文中解释地，在一些实施方案中，所述细胞包括用于异源表达 Oct 多肽， Myc 多肽， Sox 多肽和 Klf 多肽中的至少一种或多种的表达盒。 在一些实施方案中，所 述细胞不包括用于表达 Oct， Myc， Sox 或 Klf 多肽中的任一种的表达盒。 具有或不具有 这种表达盒的细胞是例如如本文中所述的有效筛选方法。
     非多能细胞的实例包括本文中所述的那些，包括但不仅限于，来自选自骨髓、 皮肤、骨骼肌、脂肪组织和外周血的组织的细胞。 示例性细胞类型包括，但不仅限于， 成纤维细胞、肝细胞、成肌细胞、神经细胞、成骨细胞、破骨细胞、和 T 细胞。本发明还提供抑制 H3K9 甲基化的试剂 ( 包括但不仅限于 BIX-01294) 与选自以 下各项中至少一种的化合物的混合物 ：L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂，TGFβ 受体 / ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂。 在一些但非局限性实施方案中，以上列 出的试剂和至少一种化合物处于如上所述的浓度。 所述混合物有效地，例如，作为在细 胞中诱导多能性的 “预混合物”。
     IX. 试剂盒
     本发明还提供例如用于诱导或提高在细胞中诱导多能性的效率的试剂盒。 所述 试剂盒可以包括选自由以下各项组成的组的一种或多种化合物 ：抑制 H3K9 甲基化的试 剂 ；L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂 ；核受 体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑制剂 ；或 Erk 抑制剂。 在一些实施方案中，所述试剂盒包括抑制 H3K9 甲基化的试剂 ( 包括但不仅 限于 BIX-01294) 和第二化合物 ( 分离的或与抑制 H3K9 甲基化的试剂混合 )，所述第二 化合物选自 L- 型 Ca 通道激动剂 ；cAMP 途径活化剂 ；DNA 甲基转移酶 (DNMT) 抑制 剂 ；核受体配体 ；GSK3 抑制剂 ；MEK 抑制剂， TGFβ 受体 /ALK5 抑制剂， HDAC 抑 制剂 ；或 Erk 抑制剂中的至少一种。
     在一些实施方案中，所述试剂盒还包括非多能细胞。 非多能细胞的实例包括本 文中所述的那些，包括但不仅限于，来自选自骨髓、皮肤、骨骼肌、脂肪组织和外周血 的组织的细胞。 示例性细胞类型包括，但不仅限于，成纤维细胞、肝细胞、成肌细胞、 神经细胞、成骨细胞、破骨细胞、和 T 细胞。 实施例 实施例 1
     为了确定能够替代致癌转录因子 ( 例如 cMyc 和 Oct4(Hochedlinger， K. 等， Cell( 细胞 )121，465-477(2005)) 的病毒转导和提高重编程效率的条件，我们试图使用两 种方法的组合 ：一种是基于这样的观念检查确定的祖细胞类型，所述观念是某些易获得 的成熟祖细胞可以以一定水平内源性表达，一些诱导多能性所需的基因和 / 或这些基因 的基因座可以较小程度地沉默，从而使该祖细胞可以更有效地重编程和 / 或具有较少遗 传操作 ；另一种方法是筛选能够替代特异性转录因子的病毒整合和 / 或促进重编程过程 的小分子。
     在易由不同组织获得的不同成熟干细胞 / 祖细胞中，我们最初将我们的努力集 中在神经祖细胞上，原因如下 ：(i) 与可以含有不同类型的干细胞 / 祖细胞的异种原代 成纤维细胞培养物 ( 例如， MEF) 相对比，神经祖细胞是相对确定的细胞群并可以在化 学确定的条件下克隆性扩增， (ii) 神经祖细胞内源性表达特异性 Sox 基因 ( 例如 Sox1 或 Sox2)，这尽管处于比过表达更低的水平，但是足以产生 iPS 细胞， (iii) 神经祖细胞或表 达 Sox 基因的细胞可以分离自其他组织 (Fernandes， K.J.L. 等， Nature Cell Biology( 自然 细胞生物学 )6，1082-1093(2004) ；Seaberg， R.M. 等， Nature Biotechnol.( 自然生物技 术 )22，1115-1124(2004)) 并体外扩增。 因此，确定的神经祖细胞代表用于解决重编程 过程 / 机制中的以上问题的优秀模型系统。 为了确定可以在高通量筛选中使用的无限、
     可高度繁殖且确定的神经祖细胞源，我们选择使用 mESC- 来源的神经祖细胞，其含有受 Oct4 调节元件控制的 GFP-IRES-Puro/GiP 报道基因，因为 mESCs 可以大量生长且充分确 定它们分化为同种神经祖细胞群 (Conti， L. 等， PLoS Biol.3， e283(2005))，以及证实的 报道基因活性 (Ying，Q.L. 等，Nature( 自然 )416，545-548(2002)) 可以促进容易的测定 检测。
     报道神经祖细胞利用充分确定的流程产生，其通过以下步骤实现 ：使在缺乏血 清和其他生长因子 / 细胞因子的化学确定培养基 /CDM 条件下，将以低细胞密度在明胶 上以单层生长的 Oct4-GiP mESCs 分化 8 天，随后进行神经球 (neurophere) 形成并随后在 增补 10ng/ml bFGF 和 EGF 的神经细胞扩增培养基中将单细胞连续传代，以单层超过 6 代 /24 天。由此产生的神经祖细胞通过细胞形态学和神经标记物表达显示是同种的，并证实 是 GFP 阴性和嘌呤霉素 (puromycin) 敏感的。 所述单层涂布在常规 mESC 生长培养基中 的神经祖细胞用四种因子的 4、3、或 2 种的组合来转导，随后用来自小的已知药物集合 的单独小分子，以典型的 6 孔形式处理转导的细胞。 化合物处理和培养持续另外 10 天， 之后加入嘌呤霉素。 在第 14 天计数绿色和抗嘌呤 (puro-resistant) 集落数。 与作为阳性 对照的仅四种基因转导的神经细胞比较，将产生比仅相应基因条件更多绿色集落的化合 物条件选作主要击中 (primary hit)。 为了进一步验证这些主要击中条件，我们选择使用源 自 OG2+/-/ROSA26+/- 转基因小鼠胎儿脑 ( 其包含 Oct4-GFP 报道基因 ) 并在具有 10ng/ml bFGF 和 EGF 的与上相同的神经 CDM 条件下单层扩增的小鼠 CNS 神经祖细胞的晚期传代 (Do，J.T. 等，Stem Cells( 干细胞 )25，1013-1020(2007))。 这样的真正来自非多能组织 的细胞应该缺少在以上筛选系统中存在任何污染 ES 细胞的问题，尽管这对于所有的合适 对照是高度不可能的。 利用 OG2 神经祖细胞进行相似的培养条件和重编程测定，区别为 不使用嘌呤霉素，并且挑出绿色集落并通过 Nanog、 SSEA1 和 ALP 染色对其进行表征。 我们发现几乎全部在第 12-14 天时可以识别的绿色集落可以扩增为长期稳定的 iPS 细胞， 所述 iPS 细胞不能通过形态学和典型的多能性标记物表达与经典 mESCs 区分开。
     我们首先将我们的表征努力集中于两种可以利用胎儿神经祖细胞再次验证的新 条件。 正如假设的，即具有某些相关重编程基因内源表达的某些组织特异性祖细胞可以 需要减少的外源遗传操作来产生 iPS 细胞，我们发现仅 Oct4 和 Klf4 一起的病毒转导足以 在 10-14 天内由神经祖细胞产生 iPS 细胞。 尽管该重编程效率 (1-2 个 GFP 集落 /3.5x104 个细胞 ) 低于具有另外的 Sox2 和 cMyc 病毒转导的条件 (8-10 个 GFP 集落 /3.5x104 个细 胞 )( 图 1)，但是令人感兴趣的是，仅由这两种基因 (Oct4 和 Klf4) 引起的重编程动力学 不比由最初四种基因引起的重编程动力学显著更慢。 这与近期的观察相反，在近期的观 察中，由 MEF 产生 iPS 细胞中省略 cMyc 比具有 cMyc 过表达甚至胚胎成纤维细胞内源性 表达 cMyc 的条件显著更慢 ( 例如，另外 2 周 )。 最有趣的是，我们发现小分子，即特 异性抑制 G9a(H3K9me2 的组蛋白甲基转移酶 ) 的 BIX01294(Kubicek， S. 等， Molecular Cell( 分子细胞 )25，473-481(2007))，可以将重编程效率显著提高至或高于利用全部四 种因子的病毒转导的水平，同时其不显著缩短重编程动力学。 重编程事件典型地通过识 别 iPS 细胞集落的能力来测定，所述能力受体许多因素的影响，包括细胞培养、细胞鉴定 和 / 或选择的方法，以及输入细胞类型、数量，和重编程效率和动力学。 因此，对任何 给定基因重编程的要求与该特定设置有关并且很大程度上取决于重编程效率 / 动力学。在这一点上，该单个小分子， BIX01294，在功能上很大程度替代 cMyc 和 Sox2 的病毒转 导。
     GFP+iPS 细胞集落容易在用 Oct4/Klf4 反转录病毒转导和用 BIX01294 处理 OG2 神经祖细胞后 12 天时出现。 第 14 天时，由 Oct4-Klf4 病毒转导和 BIX01294 处理产生的 iPS 细胞可以容易地在常规 mESC 培养条件中，在 MEF 饲养细胞上，在存在 LIF、不需要 继续 BIX01294 处理的条件下扩增。 由 Oct4-Klf4 病毒转导和 BIX01294 处理产生的 iPS 细胞可以在无继续 BIX01294 处理的条件下，在 mESC 生长培养基中，在 MEF 支持细胞上 长期自我更新。 它们生长为紧密的圆顶集落。 通过免疫细胞化学、组织染色和 RT-PCR 分析，这些 iPS 细胞保持特有的 mESC 集落形态学，以与 mESC 相似的水平均匀表达典 型的多能性标记物，包括 Oct4， Nanog， SSEA1 和 ALP。 此外，这样的 iPS 细胞，其已 经连续传代超过 10 代，可以有效地分化为特殊神经细胞 (βIII- 微管蛋白 )，心跳心肌细 胞 ( 心肌肌钙蛋白 ) 和胰腺或肝细胞 (Pdx1 或清蛋白 )，其源自标准胚状体条件下的三种 主要胚层或定向分化方法。 且最重要地，所述 iPS 细胞可以在与 8- 细胞胚胎聚集后有效 引入胚泡的 ICM，在将聚集的胚胎植入小鼠后导致高级嵌合状态，并在体内为种系做贡 献。 这些体外和体内特征证实通过 Oct4 和 Klf4 病毒转导及同时的 BIX01294 处理产生 的 iPS 细胞不能通过形态学、通过功能和通过典型的多能性标记物表达，与最初四种因子 iPS 细胞和经典 mESCs 区分开。
     一个问题是 Oct4， Sox2， Klf4 和 cMyc 的表达，无论内源性还是外源性表达， 是否是产生 iPS 细胞的先决条件。 有趣的是，近期关于由成纤维细胞产生人 iPS 细胞的 重编程研究已经显示尽管 Klf4 和 cMyc 的外源表达在功能上可以与 Nanog 和 Lin28 互换， 但是至今由所有公开的 iPS 细胞研究，Oct4 和 Sox2 的表达似乎是需要的。 有趣的是，我 们发现在缺乏 Oct4 表达的条件下， Klf4、 Sox2、和 cMyc 的病毒转导及同时的 BIX01294 处理也可以产生 iPS 细胞 ( 图 2)，尽管单独这三种因子 /KSM 的病毒转导在我们的测定条 件下不能生成任何 iPS 细胞集落。 类似地，所述 KSM-BIX01294 产生的 iPS 细胞可以在 无 BIX01294 的常规 mESC 生长条件下在 MEF 饲养细胞上稳定地扩增并长期自我更新数 代，保持特有的 mESC 形态学，均匀表达典型的多能性标记物，包括 ALP，Oct4，Nanog 和 SSEA1，并在体外分化为三胚层中的细胞。 应该注意到，在缺乏 Oct4 表达条件下的重 编程效率相对较低。
     最后，我们观察到 MEK 的特异性小分子抑制剂 PD0325901 对重编程晚期 ( 例 如 Oct4-GFP 活化后 ) 的应用可以作为一种用于产生 iPS 细胞的优秀选择策略。 由于非常 低的重编程效率， iPS 细胞典型地利用受多能性标记物的调节元件控制的报道基因 ( 例如 Neo/Puro 或 GFP)，使用遗传修饰的体细胞系选出，或基于细胞形态学手动选出。尽管适 用于遗传未修饰细胞的后者方法更好地适合于 iPS 细胞的最终临床应用，但是它是更加冗 长乏味且不太可靠的技术，该技术典型地需要挑选和繁殖若干代许多集落，其中只有小 部分会有效地成为真正的 iPS 细胞。这部分地因为大百分比的相似外观的集落可能是部分 重编程的细胞和 / 或仅转化的细胞，其迅速生长并可以干扰 iPS 细胞的生长和重编程。 因 此，具有关于遗传未修饰细胞的备选选择策略应该是非常需要的。 我们发现 PD0325901 抑制非 iPS 细胞生长，同时其有效促进 iPS 细胞生长和稳定重编程，由此导致更大和更多 同种 iPS 细胞集落。 该观察可以部分地归因于这样的机制，即体细胞的细胞周期进展需要 MEK 活性，而 mESCs 缺少所述关于生长的限制，并且 MEK 的抑制作用也抑制 mESCs 的分化 ( 有助于 iPS 细胞状态的进一步稳定 )。
     在此显示的结果具有许多重要含义。 (1)( 组织特异性祖 ) 体细胞重编程所需关 键基因的较低内源表达水平 ( 低于过表达 ) 可以足以通过病毒转导来替代相应的外源基 因表达，以产生 iPS 细胞。 这指向利用较少遗传操作，通过使用实践中易获得的内源表 达某些相关重编程基因的细胞，经由固有组织特异性和 / 或离体培养操作，由体细胞产 生 iPS 细胞的备选策略。 (2) 这是有原则的证据的证明，即小分子可以由理性设计的基 于细胞的筛选来鉴定，从而在功能上替代某些转录因子的病毒转导，提高重编程效率， 或作为产生 iPS 细胞的选择条件。 不仅许多这样的替代特定遗传操作的药理学方法充分 降低与插入癌基因 ( 例如 cMyc 和 Oct4) 和插入的诱变相关的风险，而且还开启了容许确 定的小分子的精确受控和高度有效的重编程过程的可能性。 这对于研究重编程的分子机 制特别重要，所述机制目前由于其非常低的效率和缓慢的动力学非常难处理。 (3) 与产 生 iPS 细胞的获功能方法对比，这些特异性小分子抑制剂的高度有效应用提示在产生 iPS 细胞中特异性基因的功能丧失可能是至少同等重要和有效的。 更重要地， BIX01294 的 功能确定产生 iPS 细胞中的特异性外遗传机制 / 靶标，即抑制 G9a- 介导的 H3K9me2。 这与以前的发现相一致，所述发现是抑制的 H3K9 甲基化与分化过程中的 Oct4 失活相关 (Feldman， N. 等， Nature CellBiology( 自然细胞生物学 )8，188-194(2006))，并且组蛋 白赖氨酸甲基化，尽管很强，却是动态的且受 HMT 酶 (HMTases) 和赖氨酸去甲基化酶的 调节。 BIX01294 可以起促进外遗传平衡由 Oct4 沉默状态转换至活性转录。 (4) 通过使 用 MEK 抑制剂用于容易的 iPS 细胞选择所例证地，小分子利用体细胞和 ESC 之间的差异 代表一种备选的 / 有吸引力的选择 iPS 细胞策略。 最后，可以想到此处报告的策略和小 分子可以进行进一步的探究，以获得产生 iPS 细胞的改良方法和更好的机制理解，且可以 与另外的小分子 ( 可以替代其余转导的转录因子的功能和改进重编程的小分子 ) 以及其他 非遗传方法 ( 例如蛋白转导 ) 组合，从而最终容许在无任何遗传修饰的完全化学确定的条 件下高效产生 iPS 细胞。
     方法
     神 经 祖 细 胞 培 养。 神 经 祖 细 胞 按 照 Conti 等 (Conti， L. 等， PLoS Biol.3， e283(2005)) 报告的流程，来源于 mESCs 或小鼠胎儿脑。 简言之，将 mESCs 涂布在覆盖 有 0.1％明胶的培养皿中，在神经诱导培养基中 (50％ DMEM/F12 基础培养基，50％神经 基础培养基，0.5X N2，0.5X B27，1XGlutamax，50ug/ml BSA) 中 1x104 细胞 /cm2，并分 化 7-8 天。 然后，将形成的神经玫瑰花环结构 (rosette) 胰蛋白酶化为单细胞并再涂布于 超低附着培养皿 (Corning) 中，以在神经祖细胞扩增培养基 (DMEM/F12，1X N2，10ng/ ml bFGF，10ng/ml EGF，50ug/ml BSA) 中形成神经球。 在混悬液中 3 天后，神经球重 新附着于覆盖明胶的培养皿并进一步分化 4-6 天，随后使它们进一步以单细胞传代并在 神经祖细胞扩增培养基中在覆盖有明胶的培养皿上单层生长超过 5-6 代。
     来 自 12.5-16.5dpc ROSA26/OG2 杂 合 胎 儿 脑 的 神 经 球 如 上 所 述 产 生 (Do， J.T. 等， Stem Cells( 干细胞 )25，1013-1020(2007))。 简言之，将皮质切下，酶分解， 并穿过 70μm 尼龙网 (Falcon ；Franklin Lakes， NJ)。 通过在 0.5x HBSS 中的 0.9M 蔗 糖中以 750g 离心 10min 和在 4％ BSA 的 EBSS 溶液中以 200g 离心 7min 来进一步纯化神经细胞。 所述细胞在混悬液中进一步生长，以形成神经球，并随后在神经祖细胞扩增培 养基中在覆盖有明胶的培养皿上单层连续传代，如上所述。 动物实验得到批准并根据德 国 Max Planck 协会政府的动物保护指导 (Animal Protection Guidelines of theGovernment of Max Planck Society) 进行。
     反转录病毒转导。 将 Oct4，Klf4，Sox2 和 c-Myc 的鼠科 cDNA 克隆至 pMSCV 反转录病毒载体中并通过测序验证。 基于 pMX 的反转录病毒载体获自 Addgene。 病毒 生成和转导如所述进行 2-3。
     由神经祖细胞的 iPS 细胞诱导。 将 mESC 来源的或原代 OG2 小鼠神经祖细胞以 4 3.5x 10 细胞 / 孔涂布在覆盖有基质胶 (1 ∶ 50，BD Biosciences(BD 生物科学 )) 的 6 孔板 中的神经祖细胞扩增培养基中。 一天后，用反转录病毒转导这些细胞过夜，并将培养基 换为具有或无 BIX01294(0.5-1μM) 的 mESC 生长培养基 [DMEM，5％ FBS，10％ KSR， 1x 非必需氨基酸 (Gibco)，2mM L- 谷氨酰胺 (Gibco)，0.1mM β- 巯基乙醇 (Gibco) 和 103 单位 /ml LIF(Chemicon)]。 GFP- 阳性 iPS 细胞集落在 9-14 天后出现，将其挑出并在 MEF 饲养细胞上用 mESC 生长培养基来扩增。
     表征测定。 ALP 染色如由碱性磷酸酶检测试剂盒 (Alkaline PhosphataseDetection Kit)(Chemicon) 指导来进行。细胞在 4％低聚甲醛中固定，由 PBS 清洗三次，并然后在含 有 0.3％ TritonX-100(Sigma( 西格玛 )) 和 10％正常驴血清 (Jackson ImmunoResearch( 杰克 逊免疫研究 )) 的 PBS 中室温温育 30min。然后将细胞用下述一级抗体在 4℃温育过夜 ：小 鼠抗 Oct4 抗体，小鼠抗 SSEA 1 抗体 (1 ∶ 200，Santa Cruz)，兔抗 Sox2 抗体 (1 ∶ 200， Chemicon)，兔抗 Nanog 抗体 (AbCam)，兔抗 Pdxl(1 ∶ 200，来自 C.Wright 博士 )，小鼠 抗 βIII- 微管蛋白抗体 (1 ∶ 500，Covance)，小鼠抗心肌肌钙蛋白 T(1 ∶ 200，DSHB)， 兔抗白蛋白抗体 (DAKO)。 清洗后，经细胞进一步用第二抗体在 RT 下温育 30 分钟 ： Alexa Fluro555 驴抗小鼠 IgG 或 Alexa Fluro555 驴抗兔 IgG(1 ∶ 500， Invitrogen)。 通过 DAPI(Sigma( 西格玛 )) 染色检测细胞核。 图像由 Nikon TE2000-U 捕获。
     iPS 细胞与无带 (zona-free) 胚胎的聚集。 iPS 细胞与裸露的密集后 8 细胞阶段胚 胎聚集，以获得聚集嵌合体。 将在 2.5dpc 由雌性中冲出的 8 细胞胚胎 (B6C3F 1) 在在矿 物油条件下，在 KSOM 培养基 (10％ FCS) 微滴中培养。 选择短暂胰蛋白酶处理后的 iPS 细胞 (10-20 个细胞 ) 团块，并将其转移至含有无带 8 细胞胚胎的微滴中。 在 37℃，5％ CO2 下培养与 iPS 细胞聚集的 8 细胞胚胎过夜。 将由 8 细胞阶段发育的聚集的胚泡转移 至 2.5dpc 假孕受体的子宫角中。
     实施例 2
     体细胞可以用四种转录因子的组合，即 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 或 Oct4/Sox2/ Nanog/LIN28 诱导为多能干细胞 (iPSC)。 这提供能够针对不同治疗和研究应用获得患 者特异性细胞的平台。 然而，为使该方法成为治疗相关的仍存在若干问题，这归因于 与效率和病毒基因组整合相关的缺点。 如以上解释地，用 Oct4/Klf4 转导的神经祖细胞 (NPCs) 可以重编程为 iPSCs。 然而，NPCs 内源表达 Sox2，这可能促进在缺乏外源 Sox2 条件下的重编程。 同样地，我们鉴定了容许 Oct4/Klf4 转导的小鼠胚胎成纤维细胞重编程 的小分子组合，即 BIX-01294 和 BayK8644，所述成纤维细胞不内源性表达重编程所必需 的因子。 该研究证明通过表型筛选鉴定的小分子可以补偿关键因子 ( 诸如 Sox2) 的病毒转导，和提高重编程效率。
     该实施例的目的是评估小分子是否能够替代特异性病毒转导，以由一般细胞 谱系获得 iPSCs，在所述一般细胞谱系中不表达被认为是重编程所需要的任何 TFs，即 Oct4、 Sox2 和 Klf4。 因此，使用小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs)。 发现能够在诱导 MEF 重编程中替代这些 TFs 的小分子可以导致识别参与该过程的一般途径。 这样的化学策略 可能更适用于治疗应用。因此，我们筛选已知药物集合，以鉴定能够容许由用 OK 转导的 MEF 产生 iPSC、并因此可以补充缺乏 Sox2 过表达的小分子。通过进行的不同筛选，我们 鉴定了 BFX 与 Bayk8644(BayK)( 即一种 L- 通道钙激动剂 )(Schramm，M. 等，Nature( 自 然 )，303 ：535-537(1983)) 的组合是最有效的组合之一。 Bayk 是令人感兴趣的，因为 它在细胞信号传导途径中在上游发挥作用，且不直接导致外遗传修饰。 可能地，该分子 类型，诸如 Bayk 或 Wnt 信号传导途径的活化剂 (Marson， A. 等， Cell Stem Cell( 细胞干 细胞 )，3 ：132-135(2008)) 可以用于以比直接在外遗传水平上作用引起 DNA 或组蛋白 修饰的分子更特异的方式诱导重编程。 这些外遗传修饰基因中的一些已经显示出促进重 编程过程，诸如 BFX(Shi， Y. 等， Cell Stem Cell( 细胞干细胞 )，2 ：525-528(2008))， 丙戊酸 (Huangfu， D. 等， Nat Biotechnol( 自然生物技术 )，26 ：795-797(2008)) 和 5′ 阿扎胞苷 (Mikkelsen， T. 等， Nature( 自然 )，454 ：49-55(2008))。
     本研究证明通过表型筛选识别的小分子可以用于有效补偿另一种不在成纤维细 胞中内源性表达的关键 iPSC TF 即 Sox2 的病毒转导。 而且，它强调了这样的重要贡献， 即小分子筛选将最终导致发现参与复杂生物过程诸如重编程的新分子靶标和机制。
     结果
     表型筛选导致发现容许 MEF 在用仅两种 TFs 转导时重编程的小分子。
     使用源自 129 只小鼠的 E13-14 胚胎的未修饰 MEFs 进行最初的筛选。 将 MEFs 涂布在 6 孔板的 Matrigel 上，3.5x104 细胞 / 孔，并仅用 OK( 表达 Oct4 和 Klf4 的反转录病 毒载体 ) 转导。 在 14-21 天内，评估受处理细胞出现具有特有胚胎干细胞 (ESC) 集落形 态学和对多能性标记物碱性磷酸酶 (ALP) 表现阳性的集落。 所述 OK 转导的细胞仅产生 少量小的非紧密集落，其对 ALP 表达表现出弱阳性。 这些集落在病毒转导后 21 天内最初 出现并且很难扩增。 因此，所述测定为了鉴定具有所需重编程诱导活性的小分子提供干 净的背景。 利用该细胞，对来自约 2000 种已知小分子的文库的化合物 ( 参见以下实验程 序 ) 进行筛选，并在它们在处理后 14-21 天内诱导出现对 ALP 表现出强阳性的 ESC 集落 时鉴定为击中 (hit)。 这种基于图像的方法与基于同种报道基因的测定相比，提供更精确 的重编程评估。 BIX 似乎具有最强的超过 1-2 个具有高 ALP 表达紧密 ESC 样集落的可重 现诱导作用。 我们观察到当在 OK 病毒转导后用 BIX 处理 MEFs 时，可以在约 14-21 天 内容易地检测到具有强 ALP 表达的紧密集落。 这些细胞也对 Nanog，Oct4 和 SSEA-1 表 达表现出阳性。 这种获自不内源表达任何这三种必需重编程基因的更一般细胞类型的结 果进一步验证我们以前的观察，即 BIX 具有强重编程诱导活性，且 G9a HMT 酶的抑制可 以促进重编程 (Shi，Y. 等，Cell Stem Cell( 细胞干细胞 )，2 ：525-528(2008))。 然而， 与四因子诱导的 MEFs 重编程或 OK/BIX NPC 重编程相比，在用 OK 转导并用 BIX 处理的 MEFs 中的重编程效率仍很低，约 2 集落 /3.5x104 细胞 (Shi， Y. 等， Cell StemCell( 细胞 干细胞 )，2 ：525-528(2008))。 因此，我们利用相似流程进行第二次筛选，但是其中在OK 病毒转导后将 BIX 加入至基础培养基中。 这为鉴别能够进一步提高重编程效率的新 型小分子提供更自由的平台。 更重要地，该第二次筛选可以促进发现以更特异性方式， 例如通过作用于信号转导途径而非作用于组蛋白或 DNA 修饰酶来影响重编程的小分子。 在该第二次筛选中，我们再次评估约 2000 个已知小分子的文库 ( 参见实验程序 )，并基于 筛选标准验证能够以与 BIX 协同的方式作用从而提高重编程的两种化合物。 一个实例是 RG108，即一种 DNA 甲基转移酶 (DMNT) 抑制剂 (Brueckner， B. 等， Cancer Res( 癌症 研究 )，65 ：6305-6311(2005))，其在存在 BIX 的条件下增强 OK 转导的 MEFs 的重编程 ( 图 3)。 然而，与 BIX 类似，已知 RG108 以一般外遗传水平影响细胞，且另一种 DNA 甲 基转移酶抑制剂，即 5- 阿扎胞苷已经显示出增强重编程 (Mikkelsen，T.S. 等，Nature( 自 然 )，454 ：49-55(2008))。 因此，为了该研究没有进一步跟进 RG108。 相反，我们将 我们的表型和功能表征集中于在第二次筛选中鉴别的另一种小分子 BayK，即一种 L- 钙 通道激动剂。 进一步研究这种小分子，除了其是已知的 DNA/ 组蛋白修饰基因外其在筛 选中显示最强作用，因为它在缺乏 BIX 条件下对 OK 转导的 MEFs 不具有可观察到的重编 程活性，并且已知不直接以外遗传水平，而以细胞信号转导水平影响细胞。 因此，BayK 可能在重编程过程中扮演更特异性的角色。 当用空反转录病毒转导 129MEFs 时 ( 阴性 对照 )，没观察到集落。 当在无小分子条件下用 OK 转导 129MEFs 时，出现少量具有弱 ALP 表达的小扁平集落。 在用 OK 转导并用 BIX/BayK 处理 129MEFs 后 14-21 天时观察 到 ESC 样 iPSC 集落 ；这些 ESC 样集落表现出强 ALP 表达。 当用 BIX 与 BayK 的组合处 理 OK 转导的 MEFs 时，可以观察到与用单独 BIX 处理 OK 转导的 MEFs( ～ 2 集落 ) 相比 显著增加的接近类似 mESC 形态学的 ALP+ 集落数量 ( ～ 7 集落 )。 这些原代 iPSC 集落 的进一步表征显示它们对典型的多能性标记物诸如 Oct4， Sox2， Nanog，和 SSEA1 表现 出阳性，如通过免疫荧光确定地。 获自用 OK 转导并用 BIX/BayK 处理的 MEFs 的 iPSCs 具有 mESCs 特有的多能性特性。
     为了进一步验证和表征 OK 转导和 BIX/BayK 处理可以诱导 MEFs 成为 iPSCs， 我们使用源自 OG2+/-/ROSA26+/-(OG2) 转基因小鼠的初级 MEFs，其含有 Oct4-GFP 报道 基因 (Do，J.T. 和 Scholer，H.R.，Stem Cells( 干细胞 )，22 ：941-949(2004))。 一旦重编 程，这些细胞然后可以用于常规评估嵌合体和种系资格。 与 129MEFs 类似，用 OK 转导 的 OG2MEFs 在用 BayK/BIX 组合处理时可以产生 iPSCs(OK2B iPSCs)( 图 3)。 GFP+iPSC 集落可以最初在病毒转导和化合物处理后第 14-21 天时检测到。 当 OG2MEFs 用 OK 转导 但不用任何化合物处理时，仅出现少量小集落，平均 0.5±0.7 个集落 /3.5x104 细胞。 这 些集落很难传代并因此不再研究。 用单独的 BIX 处理 OK 转导的 OG2MEFs，与单独的 OK 相比，容易地和可重复地容许重编程，其具有 2.5±0.7 个集落 /3.5x104 细胞。 当对用 OK 转导的 OG2MEFs 使用 BIX(2μM) 和 BayK(2μM) 的组合处理时，存在重编程效率 的进一步显著提高，其中我们观察到 7.7±1.5 个集落 /3.5x104 细胞 ( 图 3)。 在缺乏 BIX 的条件下，用单独的 BayK 处理 OK 转导的 OG2MEFs 不使重编程效率增加高于 OK 转导 的 MEF 对照 ( 数据未显示 )。
     挑出 OK2B 集落并在缺乏小分子的常规 mESC 生长条件中，在受照射的 MEF 饲 养细胞上连续扩增超过 20 代。 染色和 / 或 RT-PCR( 图 4A) 显示这些 GFP+OK2B iPSCs 表达典型的多能性标记物，包括 ALP， Nanog， Sox2， Oct4， SSEA1， c-Myc， eRas，Esg1， Ecat1， 和 Fgf4。 RT-PCR 测 定 还 证 明 OK2B iPSCs 表 达 内 源 Oct4 和 Klf4( 图 4A)。 Nanog 启动子的亚硫酸氢盐基因组测序法分析揭示其在 OK2B iPSCs 中去甲基化， 与 mESC 对照 (R1) 相似，而 MEF 的 Nanog 启动子过度甲基化 ( 图 4B)。 该结果进一步提 示这些 OK2B iPSCs 中的干细胞转录程序的再活化。 另外，转录组 (transcriptome) 分析显 示 OK2B iPSCs 的表达特征非常类似 mESC 的表达特征，其 Pearson 相关性值为 0.96，同时 与 MEF 的特征显著不同，其 Pearson 相关性值为 0.84，如在群集分析 (clustering analysis) 中例证地。
     为了比较 OK2B 转录组与 mES 细胞和 MEF 细胞，进行转录组分析。 利用 Qiagen RNAeasy 小型试剂盒，由第 13 代 OK2B iPS 细胞提取 RNA。 OK2B iPS 的 RNA 表达数 据利用基因芯片小鼠基因组 4302.0 阵列 (Affymetrix) 由多腺苷酸 RNA(polyA RNA) 产 生。 关于 MEF 细胞和 mES 细胞的表达数据获自基因表达全集 (Gene Expression Omnibus) (GEO) 网站 ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。 mES 细胞数据登记号 ：GSM 198062. GSM198063，和 GSM198064。 MEF 细胞数据登记号 ：GSM198070 和 GSM198072。 预 加工、标准化 (GC-RMA) 和分等级群集利用 dChip(http://biosunl.harvard.edu/complab/ dchip/ ；( 公制距离 ：相关性 (Pearson) ；连锁方法 ：质心 (centroid) ；基因排序 ：通过 群集紧度 ) 来进行，关于 OK2BiPSC 对比 MEF 细胞的 p 值 ：0.84 ；关于 OK2B iPSC 对比 mES 细胞的 p 值 ：0.96。 p 值利用 Pearson 相关性检验获得。
     OK2B iPSCs 由全部三胚层分化为细胞并促进种系传递。
     OK2B iPSCs 可以在混悬液中有效形成胚状体 (EB)，其可以分化为内胚层细胞 ( 白蛋白和 Pdx1)，中胚层细胞 / 心肌细胞 (CT3) 和外胚层细胞 / 神经细胞 (βIII- 微管 蛋白， Tuj1)，三种主要胚层的衍生物。 另外， OK2B iPSCs 可以在与 8 细胞胚胎聚集后 有效结合到胚泡的内细胞团中，并在将聚集的胚胎植入假孕小鼠中后，在体内引起具有 种系贡献的嵌合状态。 而且，一只获自这些胚泡的成年雄性后代与雌性 CD1 野生型小鼠 交配导致产生 LacZ+ 后代，其中三只显示 Oct4-GFP+ 生殖腺，进一步验证这些 iPSCs 能够 促进种系传递。 这些体外和体内表征证实仅使用两种基因，即 OK 的反转录病毒转导， 并与 BIX/BayK 处理联合，足以使 MEFs 重编程为 iPSCs，这在表型上和功能上类似经典 mESCs。
     讨论
     本文中描述的研究提供有原则的证据的证明，即小分子可以由理性设计的筛选 来鉴定，从而在功能上替代某种 ( 某些 )TF 的病毒转导以及提高由一般细胞类型如 MEFs 产生 iPSCs 的重编程效率。 这样的产生 iPSCs 的化学方法，其提供关于靶标 / 过程的更精 确和短暂控制，应该比用癌基因遗传操作更有利，所述用癌基因遗传操作还可以引入有 害的难以检测的插入性基因组变化。 类似策略用于发现可以最终容许在完全化学定义的 条件下使谱系局限性的细胞重编程为多能 (pluripotent 或 multipotent) 状态的其它小分子。 BIX 最初鉴定和表征为 G9a HMT 酶的特异性抑制剂 (Kubicek， S. 等， Mol Cell( 分子细 胞 )，25 ：473-481(2007))。 其已经显示降低 G9a 靶基因处的 H3K9me2 水平 (Feldman， N. 等， Nat Cell Biol( 自然细胞生物学 )，8 ：188-194(2006))。 有趣地，由 G9a 介导的 组蛋白 H3K9 甲基化，和异染色质化代表外遗传沉默胚胎基因诸如 Oct4 和 Rex1 的高度特 异性机制 (Feldman， N. 等， Nat Cell Biol( 自然细胞生物学 )，8 ：188-194(2006))。 此外，还证明 G9a 的击倒可以有助于基于融合的成熟神经细胞重编程 (Ma， D.K. 等， Stem Cells( 干细胞 )，26 ：2131-2141(2008))。 因此这与我们先前观察到的 BIX 可以促进由 用 OK 或 Klf4/Sox2/c-Myc 转导的 NPC 产生 iPSC(Shi， Y. 等， Cell Stem Cell( 细胞干细 胞 )，2 ：525-528(2008)) 相一致，这提示其可以补偿 Sox2 或 Oct4 的外源表达。 然而， NPC 已经表达显著水平的 Sox2，这可能导致这些细胞更易于在上述条件下重编程。 本研 究的目的是鉴定可以容许不表达任何被认为是重编程所必需的 TFs 的 MEFs 重编程的小分 子。 我们幸运地在 NPC 和 MEF 筛选中均鉴定了 BIX，并进一步验证该分子具有容许和 提高由体细胞产生 iPSC 的作用。 在提供 BIX 特有作用机制的条件下，我们的研究潜在地 鉴定这样的分子靶标，其经由药物抑制的功能丧失足以补偿必需 iPSC 重编程基因的功能 获得。 这进一步在机制上将特异性外遗传过程，G9a- 介导的 H3K9me2 的抑制，与 iPSC 产生联系起来。 BIX 可以起促进由多能性基因的沉默状态到活性转录状态的外遗传平衡 转换。 明显地， BIX 与其他染色质 - 改性小分子的组合可以用于更好的重编程，其他染 色质 - 改性小分子具有不同的靶标和作用机制，诸如 RG108。 另一方面，我们的观察， 即具有特有活性如特异性 L- 型钙通道激动剂的 BayK(Schramm，M. 等，Nature( 自然 )， 303 ：535-537(1983)) 提高重编程效率，是令人感兴趣的。 已知 L- 型钙通道在不同组织 中介导胞内过程诸如血液调节，平滑肌收缩性，胰岛素分泌，心脏发育，等 (Tosti， E.， Reprod BiolEndocrinol( 生殖生物内分泌学 )，4 ：26(2006))。 此外，由不同激动剂，包 括 BayK 活化 L- 型钙通道已经显示出通过 CREB 活化，肌质网 Ca2+ 释放，和 cAMP 变 化改变来诱导胞内信号传导。 更重要地，一些报告提示钙可能在控制 mES 细胞增殖中 起作用 (Heo， J.S. 等， Am J Physiol Cell Physiol( 美国生理学细胞生理学杂志 )，290 ： C123-133(2006))。 然而，据我们所掌握地，用 2μM BayK 单独地或与 1μM BIX 组合地 处理 mES 细胞不导致增殖改变 ( 图 5)。 此外，用 2μM BayK 单独地或与 1μM BIX 组合 地处理 OG2MEF 不诱导 SOX2 表达 ( 图 6)。 不必说，需要进行更多工作来剖析 BayK 影 响重编程过程的精确机制。 然而，有趣地发现具有以前已经与重编程相联系的信号传导 途径活性的小分子可以显著增强其效率。 迄今为止，这是除 Wnt3 蛋白以外这种类型的第 一种小分子 (Marson，A. 等，Cell Stem Cell( 细胞干细胞 )，3 ：132-135(2008))，其显示 出在不直接作用于染色质改性剂的条件下影响重编程。 因为，至今为止，发现影响重编 程的大多数其他小分子似乎直接改变细胞的外遗传状态 ：即，BIX(Shi，Y. 等，Cell Stem Cell( 细胞干细胞 )，2 ：525-528(2008))，丙戊酸 (Huangfu，D. 等，Nat Biotechnol( 自然 生物技术 )，26 ：795-797(2008)) 和 5′阿扎胞苷 (Mikkelsen，T.S. 等，Nature( 自然 )， 454 ：49-55(2008))。 重要地， BayK 似乎具有若干重要的特征，所述特征应该是在治疗 上与体内重编程和 / 或再生相关的分子最终需要的。 这样的事实，即其本身不作用 / 重 编程，而是需要存在 BIX 来发挥其作用，提示已经经历一种可能由损伤导致的重编程形 式的细胞可能更易受其作用的影响。 这可能容许我们最终在不像直接外遗传改性剂可能 的那样系统影响健康细胞的条件下，以更特异性的方式重编程靶细胞。
     总之，我们已经鉴定了确定的小分子条件，即， BIX，和 BIX/BayK 组合，或 BIX/RG108 组合，其可以容许和提高在仅两种 TFs ：Oct4 和 Klf4 转导协作下将成纤维细 胞重编程为 iPSC。 该研究进一步验证表型筛选法在鉴定能够有效补充必需 iPSC TF( 诸 如本研究中的 Sox2 或以前报告的 Oct4) 的病毒转导的小分子中的效用 (Shi， Y. 等， CellStem Cell( 细胞干细胞 )，2 ：525-528(2008))。 最后，表型小分子筛选可以引起鉴定这 样的小分子，所述小分子将成为我们提供对重编程过程新的领悟的有力工具，并可以最 终对体内干细胞生物学和治疗有效。
     实验程序
     MEFs 来源
     129S2/SvPasCrlf 或 ROSA26+/-/OG2+/-MEFs 根据 WiCell ResearchInstitute(WiCell 研 究 所 ) 网 站 上 报 告 的 流 程 获 得 ： ″ Introduction to humanembryonic stem cell culture methods( 人胚胎干细胞培养方法介绍 ) ″。 动物实验按照德国 Max Planck Institute for Biomolecular Research(Max Planck 生物分子研究所 ) 的 Animal Protection Guidelines( 动物 保护指导 ) 进行。
     反转录病毒转导和化合物
     小 鼠 Oct4， Klf4， c-Myc 和 Sox2 的 基 于 pMX 的 反 转 录 病 毒 载 体 获 自 Addgene(Cambridge， MA)。 病 毒 生 成 和 转 导 过 程 如 所 述 进 行 (Takahashi， K. 等， Cell( 细胞 )，131 ：861-872(2007))。 化合物 BIX-01294 的合成和完全表征如前所述 (Kubicek， S. 等， Mol Cell( 分 子 细 胞 )，25 ：473-481(2007))， 且 Bayk8644 商 购 自 EMD/Calbiochem Biochemical( 圣地亚哥， CA)。
     筛选来自 MEFs 的 iPSC 产生
     关于第一次和第二次筛选，使用已知化合物集合。 该集合包括大约 2000 种 已知的可商购生物活性分子，包括 FDA 批准的药物，特殊的酶已知抑制剂和活化剂 ( 包括来自 Sigma-Aldrich( 西格玛 - 奥德里奇 )(St.Louis， MO) 的 LOPAC 集合，来自 BIOMOL(Plymouth 会议， PA) 的已知生物活性物文库和来自 EMD Calbiochem( 圣地亚 哥， CA) 的非重合已知化合物 )。
     将 原 代 129S2/SvPasCrlf( 第 一 次 筛 选 ) 或 ROSA26+/-/OG2+/-( 第 二 次 筛 选 ) MEFs 涂布在覆盖有基质胶 (1 ∶ 50 ；BD Biosciences(BD 生物科学 )， Bedford， MA) 的 培养皿上，在 6 孔板上的密度为 3.5x104 细胞 / 孔。 24 小时后，用确定的反转录病毒在 37℃，5％ CO2 转导这些细胞过夜。 12-14 小时后，将转导细胞上的培养基改变为 mESC 培养基 [ 敲除 DMEM，10％ ES- 合格的 FBS，10％敲除血清替换物，1％ Glutamax，1％ 非必需氨基酸，青霉素 / 链霉素，0.1mM β- 巯基乙醇，1％ EmbryoMax ESC 合格的核 苷 (Millipore， Temecula， CA)，和 103U/ml LIF(Millipore)]( 除提到的，全部产品来自 Invitrogen， Carlsbad， CA)。 在同一天，将来自我们已知的药物集合的单独小分子以 0.5-2μM 的范围添加至细胞。 化合物处理持续 10-14 天 ；在第 10-14 天用标准 ALP 检测 试剂盒 (Millipore) 对细胞进行固定和染色。 为了第二次筛选，在转导后 1 天，将 1μM BIX 加入至 mESC 培养基。 5 天后，除 1μM BIX 外，将来自已知药物集合的单独小分 子加入至每个孔，范围为 0.5-2μM。 具有确定的小分子的小鼠 ESC 培养基每三天更新 一次，直至观察到具有与 mESC 相似的形态学的集落，这通常在转导后 14-21 天之间观察 到。 除验证如上下文中提到的化合物外，来自第二次协同筛选的没有进一步探究的主要 击中还包括 PD 173074， reversine，5′阿扎胞苷， pluripotin，和地塞米松。 其他表征研 究和重复针对原代 129S2/SvPasCrlf 或 ROSA26+/-/OG2+/-MEFs 进行。 当使用 ROSA26+/-/ OG2+/-MEFs 时， iPSC 集落还可以通过 GFP 表达来鉴定， GFP 表达作为 Oct4 表达的标记物。 一旦鉴定 iPSC 集落，将其挑出以用于在 mESC 培养基中，在 MEF 饲养细胞上扩 增。 一些集落在存在浓度为 0.5-2μM 的 MEK 抑制剂即 PD0325901 的条件下扩增，从而 进一步验证其多能性。
     免疫细胞化学和免疫荧光测定
     ALP 染 色 利 用 碱 性 磷 酸 酶 检 测 试 剂 盒 (Millipore)， 按 照 制 造 商 的 说 明 来 进 行。 关于免疫荧光测定，将细胞在 4 ％低聚甲醛中室温 (RT) 下固定 15 分钟，并用 PBS 清 洗。 然 后 将 它 们 在 封 闭 缓 冲 液 (BB)[ 处 于 PBS(Invitrogen) 中 的 0.3 ％ Triton X-100(Sigma-Aldrich( 西格玛 - 奥德里奇 ))，10％正常驴血清 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc( 杰克逊免疫研究实验室公司 ))]RT 温育 30min。 然后用在 BB 中的一级 抗体在 4℃温育它们。 之后，用 PBS 清洗细胞并在 BB 中用二级抗体 RT 温育 45-60min。 一 级 抗 体 是 ；小 鼠 抗 Oct4(1 ∶ 200)(Santa Cruz Biotechnology， Inc.(SantaCruz 生 物 技 术 公 司 )， Santa Cruz， CA)， 小 鼠 抗 SSEA1(1 ∶ 200)(Santa CruzBiotechnology Inc. (Santa Cruz 生 物 技 术 公 司 ))， 兔 抗 Nanog(1 ∶ 500)(AbeamInc.， Cambridge， MA)， 小 鼠 抗 Sox2(1 ∶ 200)(Millipore)， 兔 抗 Pdx1(1 ∶ 200)( 来 自 C.Wright 博 士 的 友 好 礼 物 )，小鼠抗 βIII- 微管蛋白 (Tuj 1)(1 ∶ 500)(Covance Research Products Inc.(Covance 研究产品公司 )， Denver， PA)，小鼠抗心肌肌钙蛋白 T(CT3)(1 ∶ 200)(Developmental Studies HybridomaBank at the University ofIowa( 爱荷华大学的发育研究杂交瘤库 )， Iowa City， IA)，兔抗白蛋白 (DAKO)。 二级抗体是 Alexa Fluor555 驴抗小鼠或兔 IgG(1.500) (Invitrogen)。 细胞核通过 DAPI(Sigma-Aldrich( 西格玛 - 奥德里奇 )) 染色来检测。 图 像利用装有光度 CoolSnap HQ2 照相机的 Nikon EclipseTE2000-U/X-cite 120EXFO 显微镜 来捕获。
     RT-PCR 测定
     利用 RNeasy Plus 小型试剂盒与 QIAshredder 结合，由 iPSCs 和对照细胞系提 取 RNA。 利 用 iScriptTMcDNA 合 成 试 剂 盒 (BioRad， Hercules， CA) 将 RNA 转 变 为 cDNA。 特定基因的扩增利用以前公开的引物 (Takahashi， K. 等， Cell( 细胞 )，131 ： 861-872(2007) ；Takahashi， K. 和 Yamanaka， S.， Cell( 细胞 )，126 ：663-676(2006)) 和在 Mastercycler ep 梯度 PCR 仪 (Eppendorf) 上的 Platinum PCR SuperMix(Invitrogen) 进 行。
     甲基化测定
     来自 R1，OG2MEFs 和 OK iPSCs( 第 10 代 ) 细胞的 DNA 利用 NonOrganic DNA Isolation Kit( 非有机 DNA 分离试剂盒 )(Millipore) 分离。然后处理 DNA，从利用 EZ DNA Methylation-Gold KitTM(Zymo ResearchCorp.(Zymo 研究公司 )， Orange， CA) 进行亚硫 酸氢盐测序。 处理的 DNA 再用于扩增目的序列。 用于启动子片段扩增的引物如以前公 开的 (Blelloch，R. 等，Stem Cells( 干细胞 )，24 ：2007-2013(2006))。 由此产生的片段 利用用于测序的 TOPO TA 克隆试剂盒 (Invitrogen) 来克隆并进行测序。
     iPSCs 细胞与无带胚胎的聚集
     iPSCs 与裸露的紧密后 8 细胞阶段胚胎聚集，以获得聚集嵌合体。 在 2.5dpc 由 雌性中冲出的 8 细胞胚胎 (B6C3F1)，并在矿物油条件下，在 KSOM 培养基 (10％ FCS) 微滴中培养。 选择短暂胰蛋白酶处理后的 iPSCs 细胞 (10-20 个细胞 ) 团块，并将其转移至含有无带 8 细胞胚胎的微滴中。 在 37℃，5％ CO2 培养与 iPSCs 细胞聚集的 8 细胞胚 胎过夜。 将由 8 细胞阶段发育的聚集的胚泡转移至 2.5dpc 假孕受体的子宫角中。 一只成 年雄性嵌合体与雌性 CD1 野生型小鼠交配。 X-gal 染色显示由该嵌合小鼠和野生型小鼠 的自然交配获得的 6 只 F1 胚胎通过种系传递产生。
     统计学分析
     柱状图和统计学分析利用在 Excel 上的标准 t 检验来进行。
     微阵列分析
     OK2B iPSCs 在明胶 (Millipore， Temecula， CA) 上的完全 mES 细胞培养基中 生长 2 天 [ 敲除 DMEM，10 ％ ES- 合格的 FBS，10 ％敲除血清替换物，1 ％ Glutamax， 1 ％非必需氨基酸，青霉素 / 链霉素，0.1mM β- 巯基乙醇，1 ％ EmbryoMax ESC 合格 的核苷 (Millipore， Temecula， CA)，和 103U/ml LIF(Millipore)]( 除提到的，全部产品 来自 Invitrogen， Carlsbad， CA)。 然后利用 RNAeasy 小型试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 分离来自两个相同孔的 RNA。 利用 MessageAmp II- 生物素增强试剂盒 (Ambion， Austin，TX) 扩增和标记总 RNA 样品。 然后使扩增的标记样品与小鼠基因组 4302.0 阵列 (Affymetrix) 杂交，并利用 GenePattern(www.broad.mit.edu/cancer/software/)，使用等级 聚类 (Pearson， log- 转化的，排 - 中心值 ) 进行分析。
     扩增测定
     将 mES R1 涂布在覆盖有明胶的 6 孔板上，在完全 mES 细胞培养基中密度为 5 2x10 细胞 / 孔。 当细胞贴壁时，约 12 小时，用 DMSO，1μM BIX，2μM BayK，和二 者的组合处理细胞，一式三份。 在 15，24 和 48 小时，利用胰蛋白酶分离细胞，并利用 血细胞计数器对细胞计数。 使用锥虫蓝 (Sigma-Aldrich( 西格玛 - 奥德里奇 )，St.Louis， MO) 排除死细胞。
     化合物处理后评估 SOX2 表达
     将 /OG2+/-/ROSA26+/-MEFs 涂布在 6 孔板上，密度为 3.4x104 细胞 / 孔。 第二 天，用 DMSO，1μM BIX，2μM BayK，和二者的组合处理细胞 6 天，一式三份。在第 3 天更新培养基。 然后利用 RNAeasy 小型试剂盒 (Qiagen) 分离来自每个孔的 RNA。 利用 iScriptTM cDNA 合成试剂盒 (BioRad， Hercules， CA) 来进行 RNA 的反转录。 内源 Sox2 的扩增利用以前公开的引物 (Takahashi，K.，Okita，K.，Nakagawa，M.，和 Yamanaka， S.(2007)。 Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures( 由成纤维细胞培养物 诱导多能干细胞 ).Nat Protoc( 自然流程 )2，3081-3089 ；Takahashi， K.，和 Yamanaka， S.(2006).Induction of pluripotent stem cells from mouseembryonic and adult fibroblast cultures by defined factors( 通过确定的因子由小鼠胚胎和成熟成纤维细胞培养物诱导多能干细 胞 ).Cell( 细 胞 )126，663-676)， 用 ep 梯 度 PCR 仪 (Eppendorf) 上 的 Platinum PCRSuperMix(Invitrogen) 进行。
     实施例 3
     本实施例证明用转录因子温育哺乳动物细胞足以诱导多能性。
     基因构建
     为了在大肠杆菌 (E.coli) 中获得高水平蛋白表达，首先最优化全部四种人 TF 基 因密码子区 (G A Gutman 和 G W Hatfield(1989).PNAS. 卷 86. 第 ：3699-3703 页 )，并利用基于 DNA 寡核苷酸 /PCR 基因装配技术 (Danilo RCasimiro，Peter E Wright&H Jane Dyson. (1997).Structure( 结构 ). 卷 5. 第 ：1407-1412 页 .) 对其进行全长合成。 将多聚 - 精氨酸 标记 ：ESGGGGSPGRRRRRRRRRRR 按设计加入至每种蛋白的 C 端 (Gump JM， Dowdy SF.(2007)Trends Mol Med.( 分子医学趋势 )2007 年 10 月 ；13(10) ：443-8)。 最终 DNA 片段侧邻 NdeI 和 XhoI 位点，并插入 pET41 表达载体 NdeI-XhoI 位点，以进行蛋白表达。 各质粒使用 DNA 序列来验证，然后转化到 BL21 起始感受态细胞中，从而利用自诱导培 养基过夜生产重组蛋白 (Studier F W， (2005)Protein Expr Purif.( 蛋白表达和纯化 )41(1). 第 ：207-234 页 .)。
     蛋白制备
     大肠杆菌 BL21(DE3) 细胞分别用 pET-Oct4-PTD( ″ PTD ″指蛋白转导结构 域 )， pET-Sox2-PTD， pET-Klf4-PTD， 和 pET-c-Myc-PTD 来 转 化， 并 利 用 自 诱 导 法进行蛋白表达 (Studier F.W.， Protein Expression and Purification( 蛋白表达和纯化 )， 41(2005)207-234.)。 溶 解 内 含 体 并 如 上 述 再 折 叠 蛋 白 (LaFevre BM， Wu S.&Lin X.Molecular Cancer Therapeutics( 分子癌症治疗 )7，1420-1429，2008 年 6 月 1 日 .doi ： 10 . 1158/1535-7163 ；Medynski D. ， Tuan M. ， Liu ， W. ， Wu ， S.&Lin ， X.Protein Expression and Purification( 蛋白表达和纯化 ) 卷 52，395-402，2007 年 4 月 ；Hou W.， Medynski D.，Wu，S.，Lin，X.&Li，LY.Clinical Cancer Research( 临床癌症研究 ) 卷 11， 5595-5602，2005 年 8 月 1 日 )。
     简言之，将包含表达质粒的大肠杆菌接种到含有卡那霉素 (kanamycin) 的 1.0L 升 Luria-Bertani 培养液中，在 A600nm ＝ 0.6 时用 500umol/L IPTG 诱导，并在 37℃搅拌 3 小时。 细胞通过离心收集，并且使沉淀经历冻融循环。 释放的内含体用含有 20mmol/ L tris，100mmol/L NaCl，1 ％ TritonX-100 的缓冲液 (pH8.0) 充分清洗，并溶解在含有 8mol/L 尿 素，0.1mol/L Tris，1mmol/L 甘 氨 酸，1mmol/L EDTA，10mmol/L b- 巯 基 乙醇，10mmol/L DTT，1mmol/L 还原的谷胱甘肽，0.1mmol/L 氧化的谷胱甘肽的缓冲 液 (pH 10) 中，具有 A280nm ＝ 2.0。 溶解的内含体使用快速稀释法来重折叠，如所述 (Lin XL， Lin YZ， Tang J.， Methods Enzymol( 酶 学 方 法 )1994.241.195-224 ；Lin X， Koelsh G.， Wu.S， Downs D， Dashti A.Tang J.Proc Natl Acad Sci USA( 美国国家科学院 学报 ).2000 ；97.1556-1560 ；Kim YT.Downs D.Wu S，等 Eur J Biochem( 欧洲生物化学杂 志 )2002.269 ：5669-77 ；MichelleLaFevre-Bernt，Shili Wu，和 Xinli Lin.(2008).Molecular Cancer Therapeutics( 分子癌症治疗 ).7 ：第 1420-1429 页 )。 重折叠蛋白通过 N2- 超滤来 浓缩并通过使用 Sephacryl S 300 的大小排阻层析来纯化。 每种蛋白制剂中的内毒素浓度 小于 100EU/mg。 大多数重折叠蛋白样品具有至少＞ 1.5mg/ml 溶解度。
     重 折 叠 蛋 白 利 用 切 向 流 过 滤 来 浓 缩， 并 利 用 使 用 Superdex-200 柱 (XK26x850-mm， GE， Piscataway， NJ) 的大小排阻层析来纯化，并利用 SDS-PAGE 验 证。
     小鼠成纤维细胞在增补 8μg/ml Oct4/Sox2/Klf4 或 Oct4/Sox2/Klf4/Myc( 如上 所述全部蛋白包含多聚 Arg) 的 mESC 培养基中生长 6-8 小时，清洗，并在无以上所列转 录因子的 mESC 培养基中温育 2-3 天。 对此 (4-12 小时有，1-3 天无 ) 重复数次 (1，2， 3，4，或更多次 ) 并然后使细胞在 mESC 中培养 2 周。 在该时期结束时，通过集落形态学和标记物表达确定培养物包含多能细胞 ( 数据未显示 )。 显著地，发现使用转录因子持 续温育细胞 ( 即，不存在无蛋白的 1-3 天期间 ) 对细胞有毒。 虽然不是必需的，但是有 时使用 MEK 抑制剂 (PD0325901) 和 / 或 GSK 抑制剂 (CHIR99021) 和 / 或 TGFβ 抑制剂 (SB431542) 来温育细胞，并且这些试剂的存在提高多能细胞发育的效率和速度。
     提供以上实施例是为了举例说明本发明而非限制其范围。 本发明的其他变化应 该是本领域中普通技术人员显而易见地，且包括在所附权利要求中。 本文中引用的全部 出版物、数据库、基因库序列、专利、和专利申请通过参考引入。