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1、(10)授权公告号 CN 102191198 B (45)授权公告日 2012.12.12 CN 102191198 B *CN102191198B* (21)申请号 201110074336.9 (22)申请日 2011.03.28 CGMCC NO.3126 2009.06.18 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 郭坚华 周冬梅 张文芝 陈云 (74)专利代理机构 南京经纬专利商。
2、标代理有限 公司 32200 代理人 张素卿 CN 1358838 A,2002.07.17, 全文 . CN 1831116 A,2006.09.13, 全文 . E. Costa 等 .Production of the biocontrol agent Pantoea agglomerans strain CPA-2 using commercial products and by-products.Appl Microbiol Biotechnol .2001, 第 56 卷第 367-371 页 . 薛梦林等.拮抗菌B501的鉴定及其对采后冬 枣黑斑病的抑制效果 . 中国生物防治 .。
3、2008, 第 24 卷 ( 第 2 期 ), 第 122-127 页 . (54) 发明名称 防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株 JH21 及其生防菌剂 (57) 摘要 本发明涉及一种防治水稻纹枯病和稻瘟病的 生防菌株 JH21， 属于植物保护技术领域。该菌是 成团泛菌 (Pantoeaagglomerans)， 将该菌在 PDA 培养液 30 180rpm 振荡培养 20 24 小时， 然后 6000rpm 离心 10min， 取湿菌与本实验室的菌体保 藏液按 1 ： 40(g/ml) 配成菌剂， 成品中活菌总浓度 为 3109 310 12CFU/ml。JH21 菌剂对水稻稻 瘟病防效为 。
4、65 75% 左右， 增产可达 40 50% ； 水稻纹枯病防效为6070%以上， 增产可达40 60%。JH21 菌剂能够对水稻纹枯病和稻瘟病混合 发生田块进行防治， 同时该菌剂能够明显的促进 水稻的生长， 提高水稻产量。 该菌剂可以在播种时 通过浸种使用， 移栽后通过喷雾使用防治病害。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 代月函 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 1/1 页 2 1. 一 种 防 治 稻 瘟 病 及 水 稻 纹 枯 病 的 生 防 菌 株 JH2。
5、1， 为 成 团 泛 菌 (Pantoea agglomerans)， 2009 年 6 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 菌种保藏号为 CGMCC NO.3126。 2. 用权利要求 1 所述的生防菌株 JH21 制备的防治稻瘟病及水稻纹枯病的生防菌剂。 3、 制备权利要求 2 所述生防菌剂的方法， 其特征在于 ： 1） 将权利要求 1 所述的菌株接种到 PDA 培养液中 30 180rpm 培养 16 20 小时后在 超净工作台中分别取样测 600nm 处的 OD 值， 测定过程中以未接。
6、菌的培养液来调零 ； 2） 当培养至 OD 值在 0.5 0.8 之间时， 将种子菌液以 1 ： 100 体积比加入 PDA 培养液 中， 30 180rpm 振荡培养 20 24 小时， 然后 6000rpm 离心 10min， 每 1000ml 培养液获得 13 16g 湿菌， 每克湿菌含 41010 1015个菌体 ； 3）取湿菌与菌体保藏液按 1 g ： 40ml 配成菌剂， 成品中活菌总浓度为 3109 31012CFU/ml， 菌体保藏液为 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液， 还含有浓度为 0.001mol/L 的 Tween20 非离子型表面活性剂。 4、 根据权利要求 3 所述。
7、的方法， 其特征在于， 所用 PDA 培养液配制方法为 ： 用 200 克土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至少煮 20 分钟以上， 接着用四层医 用纱布过滤， 滤液加 20 克普通蔗糖， 定容至 1000 毫升， pH 值调至 7.2 7.4， 然后 121灭 菌 20 分钟 ； 菌体保藏液为 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液， 还含有浓度为 0.001mol/L 的 Tween20 非离子型表面活性剂。 5、 权利要求 2 所述生防菌剂在防治稻瘟病和水稻纹枯病方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 102191198 B 2 1/7 页 3 防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株 JH21 。
8、及其生防菌剂 0001 一、 技术领域 0002 本发明涉及一种防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株 JH21 及其生防菌剂， 属于 农作物防病治病技术领域， 专用于水稻主产区对稻瘟病和水稻纹枯病的防治。 0003 二、 背景技术 0004 水稻是我国主要粮食作物之一， 目前种植面积约占全国耕地面积的 1/4， 年产量约 为全国粮食总产量的1/2。 然而， 水稻病害的持续发生一直严重影响着水稻的生产。 在现行 防治条件下， 全国平均每年因各种水稻病害造成稻谷减产达 200 亿 kg， 如不进行防治， 减产 可达 300 亿 kg。因此， 研究和防治水稻病害刻不容缓。在水稻病害中， 稻瘟病和纹枯病发。
9、生 面积大， 流行性强， 危害严重， 防治上难度较大， 是水稻生产中最主要的两大病害。 0005 水稻稻瘟病又称稻热病、 叩头瘟等， 是一种世界性真菌病害， 对全球水稻生产造成 极大危害， 被列为水稻三大病害之首， 是水稻苗期和抽穗期最重要的病害， 在我国所有稻区 均有发生， 在病害流行年份一般造成减产 10% 20%， 病害重的年份减产 40% 50%， 甚至颗 粒无收。20 世纪 90 年代以来， 我国稻瘟病的年发生面积均在 380 万 hm2 以上， 年损失稻 谷达数亿公斤。在生产上我国目前主要是应用化学农药来防治稻瘟病， 一般在苗期时采用 化学杀菌剂浸种防治苗瘟， 移栽本田后使用叶面喷。
10、雾防治叶瘟与穗颈瘟。现阶段生产上主 要应用春雷霉素、 三环唑或以三环唑与硫磺、 三环唑与异稻瘟净复配的复配杀菌剂在苗期 和抽穗期喷雾防治稻瘟病。但稻瘟病的发生受品种、 气候影响较大， 对稻瘟病的发生程度、 发生期的预测预报精度不高， 应用化学农药防治稻瘟病， 因药剂本身没有内吸性， 很难在防 治适期用药， 且由于病菌对常用药剂抗药性的逐渐增强， 使得防效不断下降。 另外化学药剂 的成倍使用， 农田生态系统已遭到严重破坏， 收获后加工成的大米农药残留严重， 已给人们 健康带来不可忽视的严重危胁。 0006 由茄丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病是水稻最难治理的水稻真 。
11、菌病害之一。随着矮杆品种和杂交稻的推广种植以及栽培管理水平的提高， 纹枯病发生日 益严重。其中， 尤以高产水稻区受害最重。纹枯病主要引起鞘枯和叶枯， 使水稻结实率降 低， 瘪谷率增加， 粒重下降， 一般减产 10-20%， 发生严重减产 40-50%。且由于纹枯病菌腐生 能力强和寄主范围广， 国内外至今尚未发现对该病的高抗品种 ； 该病对国内的主要防治药 剂井冈霉素已产生明显的抗药性， 每季用药次数已从 20 年前 2 次增加到现在的 4 7 次， 用药量也从以前的 1.5kg/ hm2 增加到目前的 4.5 6.0kg/ hm2。因防治纹枯病而长 期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药。
12、残留量增加的问题也越来越突出。 0007 化学农药对农田生态系统的严重破坏， 病原菌对药剂的抗性越来越明显。 同时， 化 学农药不易降解， 高残留， 对人畜极不安全都严重限制了在将来的农业生产上的使用。因 此， 非化学性防治措施目前已成为防治水稻病害的核心方式， 而生物防治则为其中最有前 途的方法。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利 （公开专利号 CN1358838， 公开日 ： 2002 年 7 月 17 日） 方法， 菌体可室温保存 2 3 年。 0008 三、 发明内容 0009 技术问题 ： 说 明 书 CN 102191198 B 3 2/7 页 4 0010 本发明的目的是针对。
13、目前农业生产中稻瘟病和水稻纹枯病防治难度大， 成本高， 化学农药抗性日益突出， 农药残留高等问题， 筛选高效生防菌株并制得生防菌剂， 对水稻稻 瘟病和水稻纹枯病均有防效。 0011 技术方案 0012 一 种 防 治 水 稻 纹 枯 病 和 稻 瘟 病 的 生 防 菌 株 JH21 为 成 团 泛 菌 (Pantoea agglomerans)， 2009 年 6 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 菌种保藏号为 CGMCC NO.3126。 0013 生防菌株 JH21 用于制备生防菌剂的方。
14、法为 ： 0014 1） 将该菌株接种到 PDA 培养液中分别培养 30 180rpm， 16 20 小时后在超净工 作台中分别取样测 600nm 处的 OD 值， 测定过程中以未接菌的培养液来调零 ； 0015 2） 当培养至 OD 值在 0.5 0.8 之间时， 将种子菌液以 1 ： 100 体积比加入 PDA 培 养液中， 30 180rpm 振荡培养 20 24 小时， 然后 6000rpm 离心 10min， 每 1000ml 培养液 获得 13 16g 湿菌， 每克湿菌含 41010 1015个菌体， 取湿菌与菌体保藏液按 1 g ： 40ml 配成菌剂， 成品中活菌总浓度为 31。
15、09 31012CFU/ml， 用于防治稻瘟病和水稻纹枯病。 0016 所用PDA培养液配制方法为 ： 用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至 少煮 20 分钟以上， 接着用四层医用纱布过滤， 滤液加 20 克普通蔗糖， 定容至 1000 毫升， pH 值调至 7.2 7.4， 然后 121灭菌 20 分钟。菌体保藏液为 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液， 还含 有浓度为 0.001mol/L 的 Tween20 非离子型表面活性剂。 0017 有益效果 0018 本发明的优点和积极效果表现在 ： 本发明是专门针对稻瘟病和水稻纹枯病开发的 生防制剂。 由于是生物制剂， 完全没有因化。
16、学农药的使用所带来的一系列问题， 因而能够有 效保护农田生态系统， 有利于稻米无公害生产， 实施农业的可持续发展。该生防菌剂防效 好， 价格低于化学农药， 可为农民节省开支 ； 该菌剂还具有促生增产功能， 生产出的优质无 公害稻米， 可为农民增加收入。 0019 平板拮抗试验表明， JH21 制剂对稻瘟病病原菌和水稻纹枯病病原菌有明显的抑制 作用。温室试验表明 ： JH21 制剂能有效控制稻瘟病菌和水稻纹枯病菌对水稻的侵染， 抑制 菌丝生长， 达到控制病情发生的效果。 同时， JH21制剂能促进水稻植株的生长并提高其抗逆 性。大田试验结果显示 ： JH21 菌剂对对水稻稻瘟病防效为 65 70。
17、% 左右， 增产可达 40 45% ； 对水稻纹枯病防效为 60 70% 以上， 增产可达 40 60%。 0020 该菌剂用湿菌与本实验室的菌体保藏液 （属本实验室已授权专利， 专利号 ZL021125597， 公开专利号 CN1358838， 公开日 ： 2002 年 7 月 17 日） 按 1 ： 40(g/ml) 配成菌 剂， 可室温保存 2 3 年。 0021 该混合菌剂通过喷雾使用防治病害， 也可以通过浸种处理。 0022 四具体实施方式 0023 一种从水稻根围土中筛选得到的防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株 JH21， 该菌 为泛菌属(Pantoea agglomerans)， 。
18、在LB培养基上8h产生单菌落， 培养24h后菌落呈黄色， 质地均一， 圆形至不规则， 湿润， 中央隆起， 表面光滑， 菌体细胞为直杆状， G-。 0024 JH21 菌剂的制备方法采用常规细菌培养法 ： 说 明 书 CN 102191198 B 4 3/7 页 5 0025 1） 将该菌株接种到 PDA 培养液中分别培养 30 180rpm， 16 20 小时后在超净工 作台中分别取样测 600nm 处的 OD 值， 测定过程中以未接菌的培养液来调零 ； 0026 2） 当有 OD 值不在 0.1 1 之间时将各菌继续培养， 每隔 3 小时测一次， 直到各 OD 值均在此范围内 . 当培养至 。
19、OD 值在 0.5 0.8 之间时， 将种子菌液以 1 ： 100 体积比加入 PDA 培养液中， 30 180rpm 振荡培养 20 24 小时， 然后 6000rpm 离心 10min， 每 1000ml 培 养液获得 13 16g 湿菌， 每克湿菌含 41010 1015个菌体 ； 0027 取湿菌与菌体保藏液按 1 g ： 40ml 配成 JH21 生防菌剂， 成品中活菌总浓度 为 3109 31012CFU/ml 。菌体保藏液为 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液， 还含有浓度为 0.001mol/L 的 Tween20 非离子型表面活性剂。 0028 所用PDA培养液配制方法为 ： 。
20、用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至 少煮 20 分钟以上， 接着用四层医用纱布过滤， 滤液加 20 克普通蔗糖， 定容至 1000 毫升， pH 值调至 7.2 7.4， 然后 121灭菌 20 分钟。 0029 （一） 平板拮抗抑菌试验 0030 利用平板对峙培养法， 测定 JH21 菌株对水稻纹枯病菌和稻瘟病菌的抑制作用。 0031 （二） 温室试验 0032 1. 种子处理 ： 0033 水稻种子进行表面消毒处理 ： 用 75% 的酒精处理 15 s 后无菌水水洗三次， 5% 的 次氯酸钠溶液处理 15min 后无菌水水洗三次。表面消毒的水稻种子浸泡于浓度为 108CFU。
21、/ mlJH21 菌剂 30min 后， 保湿催芽后播种育秧苗。 0034 2. 病原菌的接种和 JH21 菌剂的施用 0035 用塑料小桶装水稻田间土壤， 每桶移栽 3 穴， 每穴 5 棵秧苗。水稻植株长至分蘖期 时接种病原菌。 以水稻纹枯病菌 （Rhizoctonia solani） AG-1 ( IA)为供试病原菌 （Inagaki K. Dispersal of rice sheath blight fungus, Rhizoctonia solani AG-1 ( IA) ,and subsequent disease development in paddy fields, fro。
22、m survey of vegetative compatibility groupsJ . Mycoscience,1998 (39) :391 - 397.） ， 采用牙签接种法 （易 润华 , 朱西儒 , 周而勋 . 水稻纹枯病菌人工接种方法的研究 J. 广州大学学报 ( 自然 科学版 ), 2003,(03)） 接种 ： 将经接菌培养的长 2 cm 左右木制短牙签嵌入植株的叶鞘内 侧， 保湿。 0036 以稻瘟病菌 （Magnaporthe grisea） 91-17-2 生理小种为病原菌 （穆常青 , 刘雪 , 陆庆光 , 蒋细良 , 朱昌雄 . 枯草芽孢杆菌 B-332 菌株对稻瘟。
23、病的防治效果及定殖作用 J. 植物保护学报 , 2007,(02)） ， 苗期接种 ： 将病菌诱导产孢后， 向叶面喷施孢子悬浮液 接种。 0037 待清水对照组水稻出现病情时， 开始喷施 JH21 菌剂处理。 0038 3. 统计结果 0039 统计 JH21 菌剂对水稻纹枯病和稻瘟病的防效， 及其对水稻的促生长作用。 0040 （三） 田间试验 0041 使用 JH21 菌剂在 08 年 5 月至 11 月在江苏省铜山县和安徽省庐江县进行田间防 治稻瘟病和水稻纹枯病的田间试验， 统计了 JH21 菌剂的对病害的防治效果和对水稻的促 生增产效果。 说 明 书 CN 102191198 B 5 。
24、4/7 页 6 0042 实验结果 0043 1. 平板抑菌试验 0044 按照 植病研究法 中平板对峙培养试验方法， 对 JH21 对稻瘟病菌和水稻纹枯病 菌的抑制效果进行评价， 待清水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计结果如下， JH21 对稻 瘟病菌生长抑制率为 74.44%， 水稻纹枯病菌生长抑制率为 47.78%（表 1 所示） 。 0045 0046 2. 水稻叶瘟病温室试验 0047 接种稻瘟病菌孢子后， 至对照组开始发病时第一次喷施 JH21 菌剂， 此后每隔 7-10 天喷施一次 JH21 菌剂。至水稻抽穗期， 调查防效和生物量。以 20% 三环唑 WP（江苏丰登 农化有限公司。
25、） 为对照药剂。JH21 菌剂在温室试验中对水稻稻瘟病防效达 73.60%, 高于三 环唑处理组。同时， 使用 JH21 菌剂能够明显促进水稻植株的生长， 生物量增长率为 40.83% （表 2 所示） 。 0048 0049 3. 水稻纹枯病温室试验 0050 接种水稻纹枯病菌后， 对照组开始发病时第一次喷施 JH21 菌剂， 此后每隔 10-15 天喷施一次。水稻至乳熟期， 调查防效和生物量。以对照药剂为 20% 纹真清 SC ( 上海农乐 生物制品股份有限公司 )。JH21 菌剂在温室试验中对水稻纹枯病防效达 81.07%， 高于农药 对照组。同时， JH21 菌剂能促进水稻植株的生长，。
26、 生物量增长率为 62.41%（表 3 所示） 。 0051 说 明 书 CN 102191198 B 6 5/7 页 7 0052 4. 稻瘟病防治田间试验 0053 田间试验选择在稻瘟病连年发生较重的安徽省庐江县和江苏省铜山县水稻田 中。共设 3 个处理 ： A ： JH21 菌剂 450ml 兑水至 40L/667m2； B ： 20% 三环唑 （WP） 100g 兑水至 40L/667m2； C ： 清水对照。每处理设 4 小区重复， 每小区面积为 330m2， 各处理随机区组排列。 小区之间以保护行隔离， 试验田按常规进行肥水管理。 试验参照当地植保站病情预报用药， 分蘖前期第一次用。
27、药， 之后每隔 15 - 17d 结合每次田间水稻病虫总体情况防治用药。水稻 乳熟期停止用药并统计病害严重度。整个水稻生长期， 共防治 4 次。施药方法为 ： 播种前浸 种处理 ； 移栽本田后采用手动喷雾器细喷雾至水稻叶表。 为了评价JH21菌剂促进水稻生长 的能力， 在水稻孕穗前期进行了生物量测定， 水稻收割后统计产量。 0054 试验结果表明， JH21 菌剂在两省两地防治水稻稻瘟病的田间试验中均取得较好的 效果， 在安徽庐江县和江苏铜山县的防效分别61.99%和64.53%， 均高于农药处理组JH21菌 剂能促进水稻植株的生长和增加水稻产量， 增产量分别为 48.13% 和 36.26%。
28、（表 4 和 5 所 示） 。 0055 0056 说 明 书 CN 102191198 B 7 6/7 页 8 0057 5. 水稻纹枯病田间试验 0058 田间试验选择在稻瘟病连年发生较重的安徽省庐江县和江苏省铜山县水稻田 中。共设 3 个处理 ： A ： JH21 菌剂 450ml 兑水至 40L/667m2； B ： 20% 纹真清 SC 75ml 兑水至 40L/667m2； C ： 清水对照。每处理设 4 小区重复， 每小区面积为 330m2， 各处理随机区组排列。 小区之间以保护行隔离， 试验田按常规进行肥水管理。 试验参照当地植保站病情预报用药， 分蘖前期第一次用药， 之后每隔。
29、 15 - 17d 每次田间水稻病虫总体情况防治用药。水稻乳熟 期停止用药并统计病害严重度。整个水稻生长期， 共防治 4 次， 施药方法采用手动喷雾器粗 喷雾至稻丛基部。为了评价 JH21 菌剂对水稻的促生长能力， 水稻孕穗前期进行了生物量测 定。水稻收割后统计产量。 0059 试验结果表明， JH21 菌剂在两省两地田间防治水稻纹枯病均取得较好的效果， 在 安徽庐江县和江苏铜山县的防效分别为 67.81% 和 71.57%， 均高于农药处理组。JH21 菌剂 能促进水稻植株的生长和增加水稻产量， 增产量分别为 59.20% 和 56.57% （表 6 和 7 所示） 。 0060 0061 说 明 书 CN 102191198 B 8 7/7 页 9 说 明 书 CN 102191198 B 9 。