一种从基因文库钓取未知基因的方法 【技术领域】
本发明涉及一种利用部分重叠PCR的方法从基因文库钓取未知基因的方法。
背景技术
传统方法利用核酸杂交从文库中钓取基因，这种方法的缺点是需要用同位素标记的探针、需要筛选基因库，不仅有放射性而且工作量极大、假阳性率高的缺点。近年来，虽然已有从文库中钓取未知基因的相关方法，例如Conner等(Isolation of Drosophila Activin and Follistatin cDNAs using novel MACHamplification protocols，2002，Gene)利用一对完全重叠引物，对来自文库DNA进行扩增，经Dpn I消化后，转化细胞，这种方法的缺点是PCR为线性扩增，扩增产物不可见，转化效率低，操作性差；Celniker等(Rapid and efficient cDNAlibrary screening by self‑ligation of inverse PCR products，2005，Nucleic AcidsResearch)利用一对没有任何重叠、磷酸化的反向引物，进行扩增，然后连接环化，从cDNA文库中钓取基因，这种方法的缺点是效率低，而且费时。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是利用部分重叠引物扩增，使扩增产物可见，操作性强，转化效率高，同时利用DpnI酶切，和细胞降解甲基化模板。用此方法从基因文库中钓取基因具有效率高，简单、省时的优点。用这种方法做成试剂盒，将大大方便使用者，实现从基因文库中快速钓取未知基因。
本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种利用部分重叠PCR的方法从基因文库钓取基因的方法。其步骤包括：
(1)模板甲基化：用甲基化酶对文库DNA甲基化，
(2)引物设计：根据未知基因的部分序列设计一对部分重叠的引物，引物长度为25‑30个碱基，引物包括5′端重叠部分和3′端非重叠部分，引物长度为25‑30个碱基，引物重叠部分碱基为15‑18个，非重叠部分碱基至少10个，
(3)PCR扩增：以甲基化文库DNA为模板，加入上述部分重叠引物，进行PCR扩增，
(4)DpnI消化：在步骤(3)获得的扩增产物中，加入DpnI限制性内切酶，消化甲基化模板，
(5)转化DMT细胞：用DpnI消化产物转化DMT细胞，
(6)筛选得到包含目的基因的质粒DNA。
所述根据未知基因的已知部分序列是指来自同一物种或相关物种的已知基因。
所述甲基化酶为dam甲基转移酶。
所述步骤(4)中，加入DpnI限制性内切酶，消化甲基化模板的条件为37℃60min。
所述步骤(5)中，消化产物转化DMT细胞后，可进一步消化清除甲基化模板。
与传统方法相比，本发明提供的一种利用部分重叠PCR方法从基因文库钓取基因的方法，具有快速、高效的特点。
【附图说明】
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明
图1：使用本发明方法钓取未知基因的示意图，
其中：A：文库DNA；
B：甲基化的文库DNA；
C：筛选得到的包含目的基因的质粒DNA。
【具体实施方式】
实施例中所用的材料及来源分别为：人脑细胞cDNA文库(Invitrogen公司)，人肝细胞cDNA文库(Invitrogen公司)，dam甲基转移酶、DpnI限制性内切酶(NEB公司)，引物合成(北京英俊生物技术有限公司)。TransStartFastPfu DNA Polymerase、DMT化学感受态细胞、EasyPure PCR Purification Kit(北京全式金生物技术有限公司)。
实施例1：从人脑细胞cDNA文库中扩增hRrp46p基因
1.模板的甲基化
首先用CpG甲基转移酶对人脑细胞eDNA文库进行甲基化：
cDNA文库(1μg/μl) 1μl
dam甲基转移酶(8u/μl) 0.4μl
10×NEBuffer 2 1μl
SAM(32mM) 0.05μl
dd H
2O 加至10μl
37℃反应1小时。
2.引物设计
根据已知部分序列设计重叠引物：
hRrp46‑F：5’‑tcaccgtggtgctgcaggttgtcagcgatg‑3’
hRrp46‑R：5’‑cctgcagcaccacggtgatggaggtgcg‑3’
3.hRrp46p基因的扩增
PCR反应体系：
甲基化处理的cDNA文库 1μl
hRrp46‑F(10μM) 1μl
hRrp46‑F(10μM) 1μl
5×TransStart FastPfu DNA Polymerase Buffer 10μl
dNTPs(10mM) 1μl
TransStart FastPfu DNA Polymerase(2.5unit/l) 1μl
dd H
2O 加至50μl
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，共25个循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
4.甲基化的cDNA文库的降解
在扩增产物中加入0.5μl DpnI(20U/μl)，于37℃处理60min，以消化甲基化的cDNA文库。
5.转化
取2‑5μl消化产物于50μl DMT感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟。然后42℃准确热激45秒，立即置于冰上2min。加250μl平衡至室温的SOC，225转，37℃培养1小时。4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100‑150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜。
6.筛选
挑选克隆，测序验证。
实施例2：从人肝细胞cDNA文库中扩增hRrp41p基因
1、模板的甲基化
用dam甲基转移酶对人肝细胞cDNA文库进行甲基化：
cDNA文库(1μg/μl) 1μl
dam甲基转移酶(8u/μl) 0.4μl
10×NEBuffer 2 1μl
SAM(32mM) 0.05μl
dd H
2O 加至10μl
37℃反应1小时。
2、引物设计
根据已知部分序列设计重叠引物：
hRrp41‑F：5’‑cacacagctgcacccacgctcccagattgat‑3’
hRrp41‑R：5’‑cgtgggtgcagctgtgtgaggatggctgct‑3’
3、hRrp41p基因的扩增
PCR反应体系：
甲基化处理的cDNA文库 1μl
hRrp41‑F(10μM) 1μl
hRrp41‑F(10μM) 1μl
5×TransStart FastPfu DNA Polymerase Buffer 10μl
dNTPs(10mM) 1μl
TransStart FastPfu DNA Polymerase(2.5unit/μl) 1μl
ddH
2O 加至50μl
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，共25个循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
4.甲基化的cDNA文库的降解
在扩增产物中加入0.5μl DpnI(20U/μl)，于37℃处理60min，以消化甲基化的cDNA文库。
5.转化
取2‑5μl消化产物于50μl DMT感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟。然后42℃准确热激45秒，立即置于冰上2min。加250μl平衡至室温的SOC，225转，37℃培养1小时。4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100‑150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜。
6.筛选
挑选克隆，测序验证。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。