间皮瘤诊断剂、间皮瘤诊断试剂盒和间皮瘤诊断方法.pdf

本发明的课题是提供间皮瘤诊断剂等，与目前为止报导的间皮瘤诊断试剂盒等相比，其能够有效地识别健康正常人与间皮瘤患者，从有接触石棉经历的人中鉴别出间皮瘤患者，识别肺癌等其它疾病的患者与间皮瘤患者，等等。本发明的间皮瘤诊断剂以下述抗体为有效成分，所述抗体识别将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在血液中或血清中室温下放置3小时以上而产生的片段的N端侧片段。

1.  识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗体。

2.  识别将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在体液中室温下放置而产生的片段的N端侧片段的抗体。

3.  识别将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在血液中或血清中室温下放置而产生的片段的N端侧片段的抗体。

4.  识别将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在血液中或血清中室温下放置3小时以上而产生的片段的N端侧片段的抗体。

5.  一种抗体，该抗体的识别部位包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34～229位。

6.  一种抗体，该抗体的识别部位包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34～139位。

7.  一种抗体，该抗体的识别部位包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第68～139位。

8.  根据权利要求1～7中任一项所述的抗体，该抗体还识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素。

9.  一种间皮瘤诊断剂，其具备权利要求1～8中任一项所述的抗体。

10.  一种间皮瘤诊断试剂盒，其具备权利要求1～8中任一项所述的抗体。

11.  一种间皮瘤诊断试剂盒，其由含有第1种抗体的第1试剂、和含有第2种抗体的第2试剂组合而成；所述第1种抗体识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽；所述第2种抗体识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽，且识别部位与所述第1种抗体的识别部位不同。

12.  一种间皮瘤诊断方法，其中，采用根据权利要求10或11所述的间皮瘤诊断试剂盒来测定试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的量，并以该量作为指标。

13.  根据权利要求12所述的间皮瘤诊断方法，其中，所述试样为血清、血浆、胸腔积液或腹水。

间皮瘤诊断剂、间皮瘤诊断试剂盒和间皮瘤诊断方法
技术领域
本发明涉及可用于间皮瘤早期诊断的间皮瘤诊断剂、间皮瘤诊断试剂盒和间皮瘤诊断方法。
背景技术
近年来，具有接触石棉经历的人高频率地发生间皮瘤已经发展成社会问题。间皮瘤有恶性的也有良性的，多数恶性间皮瘤患者具有石棉接触经历，从接触石棉起经过30-35年的长潜伏期而发生恶性间皮瘤。因此，不能否认今后存在间皮瘤患者增加的可能性。
此外，间皮瘤是难以早期发现的疾病，现在通过使用MRI、CT等的方法来诊断间皮瘤，但这些方法难以进行早期诊断，存在的问题是：很多情况下，诊断出间皮瘤时疾病已经处于进展之中。仅仅考虑到这种情况，也迫切希望本疾病的早期诊断，但是目前为止还没有发现有效的早期诊断标志物。
目前为止，已经发现的间皮瘤相关的标志物包括被称作Erc、MPF和间皮素(Mesothelin)的蛋白。这其中的来龙去脉如下。
首先，1994年Yamaguchi等报导：从人胰脏癌细胞HPC-Y5上清纯化出了称作MPF(Megakaryocyte potentiating factor，巨核细胞强化因子)的蛋白(文献1)，而且1995年Kojima等报导：从人胰脏癌细胞HPC-Y5的cDNA克隆化了MPF(文献2)。
其后，Chang等制作了与在间皮细胞、卵巢癌和间皮瘤的表面表达的40kDa表位反应的单克隆抗体K1，在使用该抗体寻找编码其抗原蛋白的基因时，分离出了具有编码69kDa蛋白的1884bp开放阅读框(open readingframe)的基因。然后Chang等又阐明：该69kDa蛋白为上述40kDa蛋白的前体，该69kDa蛋白因磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PL)的作用而被切断，从而在细胞表面表达40KDa蛋白。这以后，Chang等将该69kDa蛋白命名为间皮素(文献3)，接下来又阐明：上述的MPF与间皮素是同一蛋白。
另一方面，Scholler等免疫卵巢癌细胞制作了单克隆抗体OV569，并对单克隆抗体OV569所识别的蛋白进行了检索，结果发现该蛋白具有与间皮素的膜结合区域相同的序列，其分子量为42-45kDa，并将其称作可溶性间皮素(Soluble member of mesothelin)。研究表明：该蛋白在中途发生了框移突变，其结果是变成C末端区域的GPI锚定部分不同的序列，因此变为可溶性。而且，使用与OV569识别相同蛋白的另一单克隆抗体4H3构建了夹心EIA(Sandwich EIA)测定系统，发现对卵巢癌患者血清的测定结果显示出比健康正常人高的上述蛋白的值(文献4)。而且，Robinson等报导：使用该测定系统对间皮瘤患者进行了测定，结果显示出比健康正常人高的上述蛋白的值(文献5)。
作为本发明人的樋野等通过长年对疾病模型动物进行研究，搜寻了肾癌发病模型Eker大鼠的原因基因。其结果，发现了与正常肾组织相比、在Eker大鼠肾癌来源的细胞系中显示高表达的基因，并将其中的1个命名为Erc。而且，对大鼠Erc的人同源物进行搜寻的结果表明：人的MPF与大鼠Erc具有56.1％的同源性(文献6、7)。
根据以上情况可以认为：(1)人Erc、MPF和间皮素(以下将它们称为“Erc/MPF/间皮素”)是全长622氨基酸的糖蛋白，其第290-295位氨基酸具有RPRFRR序列，因而受到费林(Furin)样蛋白酶的加工，裂解为31kDa和40kDa的片段；(2)40kDa片段的C末端侧区域因其C末端包含GPI锚定区域而以与细胞膜结合的形式保留下来，而N末端侧的31kDa片段以可溶性蛋白的形式分泌(以下将其称作“31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素”)；(3)此外，结合在细胞膜上的40kDa片段的C末端侧也可因磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C(phosphatidiylinositol-specific phospholipase C：PI-PLC)处理而从细胞中释放出来；等等。
有报导称：这些通过不同方法鉴定出的Erc/MPF/间皮素不仅在正常间皮细胞和间皮瘤中强表达，而且还存在于间皮瘤患者的血液中。然而，凭借这些认识还无法明确在间皮瘤中分泌什么类型的Erc/MPF/间皮素。
目前为止，本发明人等提示上述31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在间皮瘤患者的血清中以高浓度存在，并且报导了据此可以诊断间皮瘤(文献8)。但是，该报导不能对目的蛋白在患者试样中以怎样的状态存在进行可视化。此外，该报导中是使用识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的C末端区域的抗体来进行测定，因而仅能测定完整地保持了全长的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素，而不能测定C末端因某种作用分解缺损而产生的片段。
此外，在本发明人等的报导之后，还有人报导：通过检测31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素，能够诊断间皮瘤(文献9)，但该报导中ELISA系统测定的MPF的测定值并非以绝对值表示。此外，在该报导中，虽然实际测定了间皮瘤患者和健康正常人的血清，但其结果并非以MPF的绝对值表示，而只是简单地以吸光度表示，这样就无法对不同试验的值进行比较。推测其中的原因是无法将标准物质与血液中的MPF进行换算。此外，作为其中的原因，还可以推测是抗体的特异性、亲和性在重组体与血液中的天然型之间不同。而且，在该报导中虽然对所得数个抗体之间识别表位的差异进行了研究，但实际上仅考察了各自的表位是否不同，而并未明确各抗体的识别表位的位置。由此可以断定：现有技术并不适用于实用性诊断。
非专利文献1 Yamaguchi N，Hattori K，Oh-eda M，Kojima T，ImaiN，Ochi N.A novelcytokine exhibiting megakaryocyte potentiating activityfrom a human pancreatictumor cell line HPC-Y5.，J Biol Chem.269：805-808，1994.PMID：8288629
非专利文献2 Kojima，T.；Oh-eda，M.；Hattori，K.；Taniguchi，Y.；Tamura，M.；Ochi，N.；Yamaguchi，N.：Molecular cloning andexpression of megakaryocyte potentiating factor cDNA.，J.Biol.Chem.270：21984-21990，1995.PubMed ID：7665620
非专利文献3 Chang，K；Pastan，I.：Molecular cloning of mesothelin，adifferentiation antigen present on mesothelium，mesotheliomas，andovariancancers.，Proc.Nat.Acad.Sci.93：136-140，1996.PubMed ID：8552591
非专利文献4 Scholler，N；Fu，N；Yang，Y；Ye，Z；Goodman，G.E.；Hellstrom，K.E.；Hellstrom，I.：Soluble member(s)of themesothelin/megakaryocyte potentiating factor family are detectable in sera frompatients with ovarian carcinoma.，Proc.Nat.Acad.Sci.96：11531-11536，1999.PubMed ID：10500211
非专利文献5 Robinson BW，Creaney J，Lake R，Nowak A，MuskAW，de Klerk N，Winzell P，Hellstrom KE，Hellstrom I.Solublemesothelin-related protein-A blood test for mesothelioma.Lung Cancer.49 Suppl1：S109-111，2005.PMID：15950789
非专利文献6 Hino O，Kobayashi E，Nishizawa M，Kubo Y，Kobayashi T，Hirayama Y，Takai S，Kikuchi Y，Tsuchiya H，Orimoto K，et al.Renal carcinogenesis in the Eker rat.，J Cancer Res Clin Oncol.121：602-605，1995.PMID：7559744
非专利文献7 Yamashita Y，Yokoyama M，Kobayashi E，Takai S，Hino O Mapping  and determination of the cDNA sequence of theErc genepreferentially expressed in renal cell carcinoma in the Tsc2 genemutant(Eker)rat model.，Biochem Biophys Res Commun.275(1)：134-140，2000.PMID：10944454
非专利文献8 Shiomi K，Miyamoto H，Segawa T，Hagiwara Y，OtaA，Maeda M，Takahashi K，Masuda K，Sakao Y，Hino O.Novel ELISAsystem for detection of N-ERC/mesothelin in the sera of mesothelioma patients.Cancer Sci.97：928-932，2006.PMID：16776777
非专利文献9 Onda M，Nagata S，Ho M，Bera TK，Hassan R，Alexander RH，Pastan I.Megakaryocyte potentiation factor cleaved frommesothelin precursor is a useful tumor marker in the serum of patients withmesothelioma.Clin Cancer Res.12：4225-4231，2006.PMID：16857795
发明内容
发明所要解决的问题
因此，本发明的目的是提供间皮瘤诊断剂和间皮瘤诊断试剂盒，与目前为止报导的间皮瘤诊断试剂盒等相比，其能够有效地高灵敏度地识别健康正常人与间皮瘤患者，从有接触石棉经历的人中鉴别出间皮瘤患者，识别肺癌等其它疾病的患者与间皮瘤患者，等等。解决问题的方法
本发明人等使用间皮瘤患者来源的体液进行了详细研究，结果发现：在体液中，与31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素一起还存在其分解片段。于是知晓了下述情况：采用现有的测定系统无法检测出31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的片段，所述测定系统使用以下述多肽作为抗原而得到的抗体，所述多肽包含在抗体制作中常规使用的抗原部位即31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的N末端和C末端的氨基酸。
于是，本发明人等对能够测定31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素与其片段这两者的测定系统进行了深入研究，发现：通过选择识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的适当部位的抗体，能够与31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素一起高灵敏度地测定其片段，其结果是能够比传统上准确度更好地诊断间皮瘤；从而完成了本发明。
即，本发明涉及识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗体，更具体地说，本发明的抗体识别将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在体液中室温下放置而产生的片段的N端侧片段。此外，本发明涉及以识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗体为有效成分的间皮瘤诊断剂，更具体地说，本发明涉及以下述抗体为有效成分的间皮瘤诊断剂，所述抗体识别将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在体液中室温下放置而产生的片段的N端侧片段。
而且，本发明涉及具备识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗体的间皮瘤诊断试剂盒，更具体地说，所述间皮瘤诊断试剂盒由含有第1种抗体的第1试剂、和含有第2种抗体的第2试剂组合而成；所述第1种抗体识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽；所述第2种抗体识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽；并且，所述第2种抗体的识别部位与所述第1种抗体的识别部位不同。
而且，本发明涉及间皮瘤诊断方法，该方法采用上述间皮瘤诊断试剂盒测定试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的量，并以该量作为指标。发明的效果
本发明的抗体不仅可以检出31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素，还可以检出由31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素因种种原因而生成的片段中的N端侧片段。
因此，通过使用本测定系统，能够测定生物体内本来存在的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的量，与传统上采用的测定系统比较，能够准确度更好地诊断间皮瘤和判断进展状况。而且，通过使用本测定系统，能够进行高灵敏度测定，而不依赖于试样的采集条件、保存条件等。
附图说明
图1显示了单克隆抗体7E7的通过western印迹进行的特异性试验的结果(这里，各泳道分别显示以下述材料作为样品的结果：泳道1为导入了完整人Erc/MPF/间皮素的cDNA的COS-1细胞的裂解液，泳道2为导入了完整人Erc/MPF/间皮素的cDNA的COS-1细胞的培养上清，泳道3为仅导入了载体的COS-1细胞的培养上清，泳道4、5、6分别为HeLa细胞、MKN-28细胞、NRC-12细胞的培养上清)。
图2显示了单克隆抗体16K16的通过western印迹进行的特异性试验的结果(这里，各泳道分别显示以下述材料作为样品的结果：泳道1为导入了完整人Erc/MPF/间皮素的cDNA的CHO细胞的培养上清，泳道2为未导入基因的CHO细胞的培养上清，泳道3和4分别为上述两者的细胞裂解液)。
图3显示了单克隆抗体7E7的通过western印迹进行的识别部位确认试验的结果(图中×符号表示假阴性)。
图4显示了单克隆抗体16K16的通过western印迹进行的识别部位确认试验的结果(图中×符号表示假阴性)。
图5显示了多克隆抗体4的通过western印迹进行的特异性试验的结果(各泳道的样品与图1中相同)。
图6为使用各种抗体进行的间皮瘤患者胸腔积液中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的量的测定的结果(图中，I～VIII显示了用于ELISA试剂盒的抗体组合(I为4和34、II为211和34、III为7E7和34、IV为211和4、V为16K16和4、VI为7E7和4、VII为34和4、VIII为7E7和16K16的组合))。
图7显示了使用7E7-16K16试剂盒制作的代表性校正曲线。
图8显示了采用7E7-16K16试剂盒测定的培养细胞的培养上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素浓度。
图9显示了使用7E7-4试剂盒制作的代表性校正曲线。
图10显示了采用7E7-4试剂盒测定的培养细胞的培养上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素浓度。
图11显示了采用7E7-4试剂盒测定的健康正常人血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素浓度。
图12为采用7E7-16K16试剂盒对血清中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素浓度进行测定的结果(图中，A为对下述试样进行测定的结果，所述试样是这样获得的：采血并室温放置1小时，再于室温放置16小时，接着离心分离出血清，然后冷冻；B为对下述试样进行测定的结果，所述试样是这样获得的：采血并室温放置1小时，接着离心分离出血清，再于室温放置16小时，然后冷冻)。
图13为使用7E7-4试剂盒对血清中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素浓度进行测定的结果(图中，A为对下述试样进行测定的结果，所述试样是这样获得的：采血并室温放置1小时，再于室温放置16小时，接着离心分离出血清，然后冷冻；B为对下述试样进行测定的结果，所述试样是这样获得的：采血并室温放置1小时，接着离心分离出血清，再于室温放置16小时，然后冷冻)。
图14显示了使用间皮瘤患者胸腔积液、通过单克隆抗体7E7和多克隆抗体34、211、4进行的western印迹的结果(图中，各泳道分别显示以下述材料作为样品的结果：泳道1为未处理的间皮瘤患者胸腔积液，泳道2为C末端抗体柱吸附级分，泳道3为N末端、C末端抗体柱非吸附级分，泳道4为7E7抗体柱非吸附级分，泳道5为7E7抗体柱吸附级分；箭头表示31kDa)。
图15显示了采用ELISA测定系统(7E7-16K16试剂盒)，对间皮瘤患者、健康正常者、石棉关联疾病患者/有石棉接触经历者(胸膜斑块(胸膜プラ一ク)患者、有接触经历者、石棉沉着病(石綿症)患者、良性石棉胸膜炎患者)、肺癌患者、其它鉴别疾病患者的血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的浓度进行测定的结果。图中、横轴的MM表示间皮瘤患者、PP表示胸膜斑块患者、Ex表示有石棉接触经历者、As表示石棉沉积症患者、BAP表示良性石棉胸膜炎患者、LC表示肺癌患者、Others表示其它识别疾病患者、Volunteers表示健康正常人。此外，图中纵轴表示检出的Erc/MPF/间皮素的量[ng/mL]。
发明的具体实施方式
在本说明书中，对于“31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽(以下称为“N片段”)”没有特殊限制，只要是具有SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列的、31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽即可。在SEQ ID NO：1中，第1位的甲硫氨酸～第33位的脯氨酸为信号序列，作为N片段，优选除去了信号序列氨基酸的肽。对于N片段中缺失的C末端的氨基酸的数目，没有特殊限制，只要是1个以上即可，可以列举出例如5个以上、10个以上、15个以上、20个以上、25个以上、30个以上、35个以上、40个以上等。作为N片段中缺失的C末端的氨基酸的数目，对其上限没有特殊限制，可以列举出例如155个、150个、100个、90个、80个、70个、65个、60个等。此外，作为N片段，可以列举出例如：将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在体液中室温下放置而产生的片段的N端侧片段。作为所使用的体液，对其没有特殊限制，可以列举出例如血液、血清、血浆、胸腔积液、尿或腹水，优选血液或血清。此外，对于放置的时间没有特殊限制，优选为1小时以上，更优选为2小时以上，最优选为3小时以上。作为本说明书中的N片段，其为例如将具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列(该序列相当于登录号.AAV87530所述的人Erc/MPF/间皮素氨基酸序列的第1～295位)的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在血液中或血清中于室温放置3小时以上而生成的片段中的、N端侧片段，其包括长度不同的多个片段。此外，本说明书中的N片段优选下述抗体不能识别的片段，所述抗体是以通常的抗体制作中使用的包含C末端氨基酸的多肽为抗原、按常规方法制作的抗体。作为本说明书中的N片段，更优选下述片段，所述片段是31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素分解产生的片段，并且其具有31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中的第34～229位(优选第34～139位、特别优选第68～139位)的氨基酸序列。
在本说明书中，“间皮瘤”是指间皮细胞来源的恶性肿瘤，更具体地说，可以列举出例如上皮型间皮瘤、肉瘤型间皮瘤、二相性间皮瘤等。
对于本发明的抗体没有特殊限制，只要是识别N片段的抗体即可。作为N片段，可能存在多个片段，本发明的抗体只要能够作为间皮瘤的诊断剂应用即可，并非必须要识别所有的片段，识别这些片段中的一部分也是可以的。作为本发明的抗体，优选识别2种以上N片段的抗体。作为本发明的抗体，可以列举出例如：识别将31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在血液中或血清中室温下放置3小时以上而产生的片段的N端侧片段的抗体。作为本发明的抗体，更优选识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素、及N片段这两者的抗体。作为这样的抗体，可以列举出例如：识别在31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段中保守的氨基酸序列的抗体。作为这样的识别部位，可以列举出例如以下(a)～(d)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2～5)，这其中优选(a)～(c)，更优选(b)或(c)。
(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34～51位：SEQ ID NO：2)
(b)GFPCAE
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第68～73位：SEQ ID NO：3)
(c)PQACTH
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第134～139位：SEQ ID NO：4)
(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第211～229位：SEQ ID NO：5)
对于本发明抗体的来源没有特殊限制，也可以不是人来源的抗体。此外，本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但优选单克隆抗体，因其识别部位明确。
本发明的抗体可以这样制备：以完整的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素或其一部分作为抗原，按照本领域技术人员公知的方法例如《生物化学实验讲座续编(続生化学実験講座)、免疫生物化学研究方法(免疫生化学研究法)》(日本生化学会编)等所述的方法获得抗体，利用与N片段中保守的氨基酸序列的一部分一致的多肽等对这些抗体进行筛选，从而进行选择。
在本发明抗体的制造中，作为抗原使用的完整31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素或其一部分可以列举出：用合成仪合成的与SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第1～295位、优选第35～295位的全部或者一部分一致的多肽；或者，将编码上述氨基酸序列的cDNA(SEQ ID NO：6)的全长或者一部分按常规方法导入载体、使用该载体转化大肠杆菌等宿主微生物或培养细胞、培养转化的大肠杆菌等宿主微生物或培养细胞来进行生产，从而得到重组体蛋白或多肽，再用亲和柱、镍柱等进行纯化而得到的多肽等。此外，与编码上述氨基酸序列的cDNA的全长或者一部分一致的多核苷酸可以这样获得：以大鼠Erc/MPF/间皮素cDNA等哺乳动物来源的Erc/MPF/间皮素cDNA作为探针，从人肿瘤细胞系等cDNA文库进行克隆。
具体而言，制备本发明抗体的规程如下。即，为了以多克隆抗体的形式制备本发明的抗体，首先，采用PCR法制作编码人31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的cDNA序列(SEQ ID NO：6)的多核苷酸。然后，将其插入pGEX等载体，将该载体导入大肠杆菌等宿主微生物，用LB培养基等进行培养来生产多肽的重组体蛋白。然后，以所得重组体蛋白为抗原，将其溶解在磷酸钠缓冲液(PBS)中，再使它们与弗氏完全佐剂或不完全佐剂或者明矾等辅剂(補助剤)结合，然后以此为免疫原对哺乳动物等进行免疫。
作为免疫的动物，可以使用本领域常用的动物，例如：小鼠、大鼠、兔、羊、马或鸡等。此外，作为免疫时免疫原的施用方法，可以是皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射，优选皮下注射或腹腔内注射。免疫可以进行1次，或者可以以合适的间隔、优选以1周～5周的间隔，进行多次。
最后，按照常规方法，从免疫后的动物采集血液，从该血液分离出血清，从血清中采用下述方法获得作为多克隆抗体的本发明的抗体：使用固定有用作抗原的重组体蛋白的柱子来进行亲和柱层析，这样来进行抗原特异纯化，从而获得作为多克隆抗体的本发明的抗体。
此外，为了以单克隆抗体的形式制备本发明的抗体，按照单克隆抗体制备的常规方法例如《抗肽抗体实验规程(抗ペプチド抗体実験プロトコ一ル)》(大海忍、辻村邦夫、稻垣昌树著，秀润社，1994年)、《单克隆抗体实验指南(単クロ一ン抗体实験マニユアル)》(富山朔二·安东民卫/编著、讲谈社、1987年)等所述的方法，用上述重组体蛋白免疫动物获得免疫细胞，将该免疫细胞与骨髓瘤细胞融合从而得到杂交瘤，从该杂交瘤的培养物中采集抗体。对于这样采集的抗体，通过使用96孔微型滴定板的EIA方法进行筛选，可以获得作为单克隆抗体的本发明的抗体，其中，所述96孔微型滴定板上固定有用作抗原的、重组体蛋白或具有上述氨基酸序列的合成肽等。
更具体而言，作为包含在本发明诊断剂中作为有效成分的本发明的抗体所特别优选的识别下述氨基酸序列(b)或(c)的单克隆抗体，可以这样获得：通过使用微型滴定板的EIA法，对上述从杂交瘤的培养物采集的抗体，进行进一步筛选，其中，所述微型滴定板上固定了以下的氨基酸序列(a)或(b)作为抗原。
(b)GFPCAE
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第68～73位：SEQ ID NO：3)
(c)PQACTH
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第134～139位：SEQ ID NO：4)
如此获得的本发明的抗体，可以根据需要进行标记或固定化，来制备成适于本发明的本发明诊断剂的形式。这其中，标记可以通过结合辣根过氧化物酶(以下称为“HRP”)、碱性磷酸酶等酶，异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光物质，³²P、¹²⁵I等放射性物质，化学发光物质等标记物质来进行。此外，固定化可以通过将本发明的抗体结合在合适的固相上来进行。作为固相，可以使用免疫化学测定法中常用的任何固相，可以列举出例如聚苯乙烯制的96孔微型滴定板、氨基结合型微型滴定板等板，各种珠子。为了将本发明的抗体固定化，例如可以将包含抗体的缓冲液加在载体上，并进行温育。
此外，本发明的间皮瘤诊断试剂盒(以下称为“本发明试剂盒”)可以这样制作：使用视需要进行了标记或固定化的本发明的抗体，此外再组合稀释用缓冲液、标准物质、底物用缓冲液、终止液、清洗液等，按照常规方法来制备。本发明的间皮瘤诊断试剂盒优选具备识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的2种抗体，更优选具备识别部位各不相同的、识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的2种抗体。具体而言，在使用2种本发明的抗体来制作本发明试剂盒时，可以组合使用：含有识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的第1种抗体的第1试剂(例如固定化抗体)，以及含有作为识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗体的、与上述第1种抗体识别部位不同的第2种抗体的第2试剂(例如标记抗体)。
作为用于本发明试剂盒的第1种抗体和第2种抗体的组合，没有特殊限制，可以列举出例如：识别部位包含于31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的第34～229位、优选第34～139位、特别优选第68～139位的氨基酸序列中的抗体的组合。作为第1种抗体和第2种抗体的具体例子，可以列举出：识别以下(a)～(d)中任一项所述的氨基酸序列(SEQ ID NO：2～5)的抗体的组合；这些组合中，优选识别(a)或(b)所述的氨基酸序列的抗体、与识别(c)或(d)所述的氨基酸序列的抗体的组合，更优选识别(a)或(b)所述的氨基酸序列的抗体、与识别(c)所述的氨基酸序列的抗体的组合，特别优选(b)与(c)的组合。
(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34～51位：SEQ ID NO：2)
(b)GFPCAE
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第68～73位：SEQ ID NO：3)
(c)PQACTH
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第134～139位：SEQ ID NO：4)
(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG
(SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第211～229位：SEQ ID NO：5)
如上述地制作的本发明诊断剂和本发明试剂盒，通过其中包含的本发明的抗体，不仅可以测定间皮瘤患者的各种体液中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素，还可以测定因各种原因而产生的片段。
作为使用本发明诊断剂和本发明试剂盒的具体的、31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素与其片段这两者的存在或量的测定方法，可以列举出：放射性同位素免疫测定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall et al.，(1980)：Methodsin Enzymol.，70，419-439)、荧光抗体法、斑块法(プラ一ク法)、斑点法(スポツト法)、凝集法、奥克特洛尼(Ouchterlony)法、免疫色谱法等、通常在免疫化学测定法中使用的各种方法(《杂交瘤法与单克隆抗体》，株式会社R&D Planning发行，第30页～第53页，昭和57年3月5日)。
这些测定方法可以从各个角度出发进行适当地选择，但从灵敏度、简便性等观点来看，优选ELISA法。更具体地，关于31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素及其片段的测定，以ELISA法中的一种即夹心法为例，将其规程说明如下。
首先，作为步骤(A)，将识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的第一种抗体(以下称为“第一抗体”)固定在载体上。然后，作为步骤(B)，将未固定抗体的载体表面用与第一抗体无关的例如蛋白等封闭起来。而且，作为步骤(C)，向其上加入包含各种浓度的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和/或N片段的试样，生成31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和/或N片段、与第一抗体的复合体。其后，作为步骤(D)，加入标记的第二种抗体(以下称为“第二抗体”)，使其与上述复合体结合，其中，所述第二种抗体识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽，且其识别的部位与固定化的第一抗体的识别部位不同。最后，作为步骤(E)，通过测定上述复合体的标记量，可以从预先制作好的校正曲线确定试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的总量。
具体地，在步骤(A)中，对于用于固定第一抗体的载体，没有特殊限制，可以使用免疫化学测定法中常用的任何载体。具体地可以列举出聚苯乙烯制的96孔微型滴定板、或者氨基结合型微型滴定板。此外，为了固定第一抗体，例如可以将包含上述抗体的缓冲液加在载体上，并进行温育。作为缓冲液，可以使用公知缓冲液，可以列举出例如10mM的PBS。缓冲液中的上述抗体的浓度可以从一个宽范围中选择，通常为0.01～100μg/ml左右，优选为0.1～20μg/ml。此外，在使用96孔微型滴定板作为载体时，希望为300μl/孔以下、20～150μl/孔左右。而且，对于温育条件没有特殊限制，通常4℃左右温育一夜是合适的。
此外，在步骤(A)中的固定了第一抗体的载体上，有些情况下会存在与抗原抗体反应无关地吸附此后添加的试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和/或N片段的部分，出于防止这种情况的目的，进行步骤(B)的封闭。作为封闭剂，可以使用例如BSA、脱脂乳溶液、Block-Ace(大日本制药生产(编号.UK-25B))等市售的封闭剂。对于具体的封闭没有限定，例如可以这样进行：向固定了抗原的部分上添加适量的Block-Ace，约4℃温育一夜，然后用缓冲液进行清洗。
而且，在步骤(C)中，使包含31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和/或N片段的试样与固定化的第一抗体接触，用该固定化的第一抗体捕捉试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段，从而生成复合体。对于用来生成该复合体的条件没有限定，可以在4℃～37℃左右反应约1小时～1夜。反应结束后，优选用缓冲液清洗载体，来除去未反应的蛋白等。作为用于该反应的缓冲液，优选具有10mM的PBS(pH7.2)和0.05％(v/v)的Tween20的组成的缓冲液。
此外，进一步在步骤(D)中，向固定化的第一抗体与31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素或N片段的复合体加入与固定化的第一抗体识别部位不同的标记的第二抗体，从而生成由固定化第一抗体-31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素或N片段-标记的第二抗体构成的复合体。该反应结束后，优选用缓冲液清洗载体，来除去未反应的蛋白等。作为用于该反应的缓冲液，可以使用上述的缓冲液。该步骤(D)中使用的标记的第二抗体的量为稀释成固定化第一抗体的约5,000～10,000倍的量，优选稀释为最终吸光度为1.5～2.0的量。稀释可以使用缓冲液，对于反应条件没有特殊限制，可以优选在4℃～37℃左右进行约1小时，反应后用缓冲液进行清洗。通过以上反应，能够生成由固定化的第一抗体-31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素或N片段-标记的第二抗体构成的复合体。
最后在步骤(E)中，向固定化的第一抗体-31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素或N片段-标记的第二抗体的复合体加入与标记物质反应的生色底物溶液，测定吸光度。当上述反应中使用过氧化物酶作为标记物质时，例如可以使用包含过氧化氢和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(以下称为“TMB”)的生色底物溶液。此外，吸光度可以这样测定：向由固定化的第一抗体-31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素或N片段-标记的第二抗体构成的复合体加入生色底物溶液，约25℃反应约30分钟，然后加入1～2N的硫酸来终止酶反应，在450nm的波长下进行测定。另一方面，当使用碱性磷酸酶作为标记物质时，采取下述方法是合适的：以磷酸对硝基苯酯作为底物来生色，加入2N的氢氧化钠来终止酶反应，测定415nm处的吸光度。
而且，将已知浓度的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素用于上述夹心法等，预先作成校正曲线，使用该校正曲线能够计算出试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量。
通过上述测定方法等，能够计算出试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量、即生物体内本来存在的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的量，据此，可以从健康正常者中诊断出间皮瘤患者、区分间皮瘤患者的外科手术是否成功、预见间皮瘤的复发等。对于用于间皮瘤诊断等的试样没有特殊限制，只要是存在31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和/或N片段的试样即可，可以列举出例如全血、血清、血浆、尿、淋巴液、胸腔积液(胸水)、腹水等体液。在这些试样中，优选血清、血浆、胸腔积液或腹水。
具体地，间皮瘤的诊断可以以试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量为指标，当判定该量与健康正常者的平均值相比显著地高时，诊断为间皮瘤。作为判定试样中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量与健康正常者的平均值相比显著地高的指标的例子，可以列举出例如：采用从健康正常人血清组获得的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量的平均值+2x标准偏差的值、优选从健康正常人血清组获得的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量的平均值+5x标准偏差的值，作为统计学上的截留值，但不限于此。而且，上述间皮瘤的诊断中，还可以用试样中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的浓度来代替
试样中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量作为指标。
此外，间皮瘤的外科手术是否成功，或复发的预测，可以基于间皮瘤患者试样中的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量因有无间皮瘤细胞的存在而变化来进行。即，在间皮瘤外科手术前后测定试样中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量，比较手术前后的该量，如果手术后的量显著低于手术前的量，则可以确认通过该外科手术除去了间皮瘤细胞。此外，如果在间皮瘤外科手术后也对试样中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量进行监测，则在该量增加时，可以预测存在间皮瘤细胞即出现复发。
通过使用本发明诊断剂和本发明试剂盒测定试样中31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素和N片段的量，不仅可以如上述地从健康正常者中诊断出间皮瘤患者、区分间皮瘤患者的外科手术是否成功、预见间皮瘤的复发等，还可以用来从有石棉接触经历者中鉴别间皮瘤患者、识别皮瘤患者与肺癌等其它疾病的患者。即，有石棉接触经历者中胸膜胼胝(pleural callosity)、良性胸膜炎、肺纤维症、肺癌等的发病率被认为高于健康正常者。但是，这些疾病中，31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的测定值显著低于间皮瘤患者，可以与间皮瘤患者区分开来。这对治疗方法的最优化是非常有用的。即，如果能够识别间皮瘤患者与例如肺癌患者，那么就可以采取完全不同的治疗策略。这样可以避免枉然施用无效抗癌剂而给患者造成痛苦，可以成为面向近年受到关注的定制医疗的策略。
实施例
以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例1
单克隆抗体的制作(1)：
(1)免疫用抗原的制作
以完整人Erc/MPF/间皮素cDNA(登录号.AY743922)为模板，使用以下所示的引物No.5’-3和No.3’-3，对与SEQ ID NO：1所表示的31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的氨基酸序列的第35位～295位区域对应的核苷酸(SEQ IDNO：6的核苷酸序列的103～885位)进行了聚合酶链反应(PCR法)扩增。然后，在上述得到的寡核苷酸上附加编码GST(Glutathione S-transferase)标签的序列，并在其C末端侧区域附加编码组氨酸(Histidine)标签的序列，将该GST-31kDa分泌型间皮素-His区域插入pGEX-6P-1(Amershambiosciences公司制造)，以此作为表达载体，将其导入大肠杆菌，以融合蛋白的形式进行了表达。
引物No.5’-3(SEQ ID NO：7)：
5’-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3’
引物No.3’-3(SEQ ID NO：8)：
5’-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3’
将该大肠杆菌在5mL添加氨苄西林的LB培养基中37℃振荡培养一夜。再将其加入到1,000mL的LB培养基中，37℃振荡培养4小时，添加500mM的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)1mL，再振荡培养3小时。将这样获得的培养液于4℃、6,000rpm离心分离15分钟，将沉淀用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗2次。其后，加入添加有1mM的EDTA、1％的Triton X-100的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)20ml，对该液进行30秒×4次的超声波处理来破碎菌体，提取目的蛋白后，于4℃、10,000rpm、离心分离30分钟，获得了上清。从该上清中使用谷胱甘肽-sepharose珠子Glutathion-sepharosebeads：Amershambiosciences公司制造)纯化出GST-31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素-His蛋白后，通过PreScission蛋白酶(PreScission Protease：Amershambiosciences公司制造)处理切除GST部分，得到了31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素-His。
(2)单克隆抗体的制作
使用上述(1)获得的蛋白作为免疫用抗原，每隔1周或2周施用50μl(50μg)来免疫小鼠。抗原仅在初次免疫中与弗氏完全佐剂混和，而在第二次以后与弗氏不完全佐剂混和。将免疫化小鼠的脾单核细胞和融合配偶体(partner)X63-Ag8-653用于聚乙二醇介导的细胞融合，按文献(J.Immunol.146：3721-3728)所述方法选择出杂交瘤。该选择通过选择与固定化31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素反应的细胞来进行。
使上述选择的细胞在作为无血清培养基的GIT培养基(和光纯药)中产生抗体，直至80％的细胞死亡。然后，对该培养基进行离心(1,000rpm、15分钟)来除去细胞，再添加硫酸铵至50％饱和状态，于4℃静置一夜，通过离心回收了沉淀(1,000rpm、30分钟)。进一步，将该沉淀溶解在2倍稀释的结合缓冲液(binding buffer：Protein AMAPS II kit制造)中，然后在蛋白A柱(Pharmacia-Amersham制造)上吸附IgG。其后，进行一夜的PBS透析来纯化抗体，得到了多种识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的抗体。并且，将这些抗体中的两个命名为7E7和16K16。
(3)利用western印迹确认单克隆抗体7E7和16K16的特异性
使用在COS-1细胞或者CHO细胞中强制表达的Erc/MPF/间皮素蛋白等样品，通过western印迹确认了上述(2)中所得单克隆抗体7E7和16K16识别31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素。在进行western印迹之前，向每种样品中添加2-巯基乙醇(2Me)来使之处于还原状态。western印迹按常规方法(例如《分子生物学基本实验方法(分子生物学基礎実験法)》，南江堂)进行。
western印迹的结果示于图1和图2。根据图1和图2，使用单克隆抗体7E7和16K16中的任何一个，对于强制表达的Erc/MPF/间皮素样品，在71kDa完整型Erc/MPF/间皮素和31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的表达部位上均有条带，可以确认这些抗体对Erc/MPF/间皮素具有反应性。
实施例2
单克隆抗体7E7和16K16的抗原识别部位的探索：
制作了六个六个氨基酸地缺损(即逐次地缺损六个氨基酸)31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素的C末端区域的一系列融合蛋白，使它们与单克隆抗体7E7和16K16反应，来探索抗原识别部位。
首先，以实施例1中制作的GST-31kDa分泌型间皮素-His区域为模板，制作能够六个六个地缺失氨基酸的反义引物，利用PCR反应进行了扩增。接下来，将其插入pGEX-6P-1(Amershambio sciences公司制造)，以此作为表达载体，再将其导入大肠杆菌。将该大肠杆菌在5mL添加氨苄西林的LB培养基中37℃振荡培养一夜。再将其加入到1,000mL的LB培养基中，37℃振荡培养4小时，添加500mM的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)1mL，再振荡培养3小时。将这样获得的培养液于4℃、6,000rpm离心分离15分钟，将沉淀用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗2次。其后，加入添加有1mM的EDTA、1％的Triton X-100的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)20ml，对该液进行30秒×4次的超声波处理来破碎菌体，提取目的蛋白后，于4℃、10,000rpm、离心分离30分钟，获得了上清。从该上清中使用谷胱甘肽-sepharose珠子G1utathion-sepharose beads：Amershambiosciences公司制造)纯化出31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素逐次缺损六个氨基酸而得到的GST-31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素-His缺损蛋白。
接下来，对于这些缺损蛋白，利用单克隆抗体7E7和16K16按常规方法(例如《分子生物学基本实验方法(分子生物学基礎実験法)》，南江堂)进行western印迹和斑点印迹，确定了其识别部位。western印迹和斑点印迹的结果如图3和图4所示。对应于图3和图4中的1～6和A～H的蛋白的氨基酸序列如表1所示。表中的数字表示从31kDa分泌型间皮素的N末端起向其C末端方向的连续的氨基酸的个数。根据该图可以判明：单克隆抗体7E7抗体识别134位～139位的区域，而单克隆抗体16K16识别N末端起第68位～73位的区域。
表1