经由定型内胚层 (DE-hep) 衍生自人胚泡衍生干细胞的新 肝细胞群体 发明背景
本发明涉及经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干 (hBS) 细胞的新肝细胞样细胞 群体， 用于制备此种细胞的方法， 以及此种细胞在例如药学药物开发和发展、 毒性测试、 细 胞疗法和医学治疗中的潜在用途。细胞在本文中命名为 DE-hep 细胞。
此外， DE-Hep 细胞显示功能人肝细胞的性质， 这使得它们对于在肝生成的体外研 究中的使用非常有吸引力， 例如早期肝脏发育过程或肝脏再生障碍或畸形。
发明背景
多能人干细胞预期将改革各种人细胞类型的可及性。繁殖多能人胚泡衍生干 (hBS) 细胞和后续使它们分化成所需靶细胞类型的可能性将提供稳定和基本上无限的细胞 供应， 用于在体内和在体外的一系列应用。
肝脏衰竭和末期肝病负责全世界的大量死亡， 并且是卫生保健系统的重大负担。 肝脏移植仍是最成功的治疗。 然而， 这个操作的功效是有限的， 并且与许多并发症如感染或 排斥相关。肝脏移植还具有可用供体器官的短缺， 并且治疗患者将非常经常涉及终生免疫 抑制。通过减少对于器官的需求， 基于细胞的治疗将对社会和患有这些严重疾病的个体具 有极大重要性。
此外， 肝脏是人体中的代谢和解毒中心， 并且因此已付出巨大努力以便鉴定用于 体外测试的功能细胞类型的可靠来源。不幸的是， 肝脏的复杂性和功能未由目前可用的任 何细胞类型反映。 原代人肝脏细胞的可用性是非常有限的， 并且也已知当用于体外应用时， 细胞快速丧失其正常表型和功能性质 ( 即， 在 24 小时内 )。原代细胞的一种常用替代物是 肝细胞系， 其依次包含极低水平的代谢酶， 并且具有与体内天然肝细胞基本上不同的其他 重要蛋白质的分布。 因此， 许多测试仍使用动物材料来进行， 即使已知肝脏代谢是物种特异 性的， 并且因此产生在预测除测试那种外的另一个物种中的肝脏代谢和毒性中的困难。
在药学开发中， 不利肝脏反应仍是最突出的副作用。 因此， 当选择化合物进入临床 试验时， 人肝脏毒性倾向的早期预测是极其重要的。改善这个领域中的能力的努力必须解 决可用性问题和模型开发， 这提供针对复杂生物学过程的更大覆盖， 所述复杂生物学过程 与在人中诱导不利肝脏损伤一致。在 2 个领域中， 衍生自 hBS 细胞的分化细胞的使用提供 有希望的机会。
因此， 存在关于模型系统的迫切需要， 所述模型系统模拟人肝脏细胞， 并且能够预 测候选物分子在新药或化学制品开发中的效应。关于可用性和生理学相关性， 人多能干细 胞可以充当功能人肝细胞的理想再生来源。当 hBS 细胞以置于合适环境中时， 在分化 2-4 周后已观察到特定肝特征。
本发明基于下述事实 ： 定型内胚层 (DE) 细胞产生内胚层器官且因此产生肝细胞 类型。早期内胚层发育并未充分了解。培养的小鼠胚胎的定向研究 (Lawson 等人， 1986， 1991 ； Lawson 和 Pedersen， 1987) 已揭示 DE 在胚胎日期 6-6.5(E6-6.5) 时开始形成， 并且 到原肠胚形成结束时 (E7.5)， 某些标记细胞仅产生内胚层衍生物。未知起始 DE 细胞是否
是多潜能的。原基分布图研究 (Laws on 等人， 1991 ； Tremblay 和 Zaret， 2005) 暗示在 E6.5 时通过胚线 (PS) 移动的第一个内胚层细胞命运是成为肝脏、 腹胰、 肺和胃。共培养实验显 示这个阶段时的内胚层在早期胚胎阶段时并未完全定型 (Wells 和 Melton， 2000)。
内胚层研究中的复杂情况是哺乳动物具有胚外内胚层。胚外内胚层在胚泡期出 现， 并且最终形成 2 个亚群 ： 内脏内胚层和壁内胚层。胚外内胚层细胞与 DE( 产生内胚层 器官的细胞 ) 共享许多基因的表达， 包括经常分析的转录因子 Sox17(Kanai-Azuma 等人， 2002)、 FoxA1 和 HNF3b(Belo 等人， 1997 ； Sasaki 和 Hogan， 1993)。D′ Amour 等人已开发了 用于从 hBS 细胞衍生定型内胚层的方案 (D′ Amour 等人， 2005 ； D′ Amour 等人， 2006)。
在本发明中呈现了 hBS 细胞衍生的肝细胞样细胞群体， 其用于在药物开发和再生 医学中使用， 且具有至少 24 小时的重要肝脏表达的标记基因例如白蛋白、 CYP3A4 和 UGT2B7 及重要的代谢酶和药物转运蛋白的稳定表达。
发明概述
本发明涉及衍生自定型内胚层、 DE-Hep 祖先和 DE-Hep 细胞的成肝细胞样细胞和 肝细胞样细胞。
如由下文描述显而易见的， 本发明还涉及用于制备这些细胞的分阶段方法， i) DE-Hep 祖先和 ii)DE-Hep 细胞。如在图 1A 和 B 中描述的， 这种方法涉及通过培养 hBS 细胞 ( 阶段 I) 的 DE 细胞的形成， 其后从 DE 细胞获得 DE-Hep 祖细胞 ( 阶段 II)， 和最终从 DE-hep 祖细胞形成 DE-Hep 细胞 ( 阶段 III)。
本发明的一个方面涉及用于制备经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干 (hBS) 细 胞的 DE-Hep 细胞的方法， 该方法包括对 hBS 细胞实施培养条件， 所述培养条件包括
i) 阶段 I， 其中诱导 hBS 细胞以发育成定型内胚层细胞， 阶段 I 包括在包括活化素 的第一种阶段 I 培养基中培养 hBS 细胞 2-6 天， 其中在培养 1 天后培养基由第二种阶段 I 培养基替换， 所述第二种阶段 I 培养基包括活化素、 一种或多种生长因子和任选地血清，
ii) 阶段 II， 其中繁殖得自阶段 I 的细胞， 并且阶段 II 包括在阶段 II 培养基中培 养来自阶段 I 的细胞， 所述阶段 II 培养基包括一种或多种生长因子和任选地成骨蛋白，
iii) 阶段 III， 其中使得自阶段 II 的细胞成熟为肝细胞样细胞 (DE-Hep 细胞 )， 阶 段 III 包括在阶段 III 培养基中培养来自阶段 II 的细胞， 所述阶段 III 培养基包括一种或 多种成熟因子和任选地分化诱导剂。
本发明的另一个方面涉及通过上述方法获得的 DE-hep 祖细胞。 得自阶段 I I 的细 胞显示 HNF1、 HNF3b、 HNF4a、 EpCAM、 AFP、 结蛋白、 CD133、 ICAM1(CD54)、 CK8、 CK18 和 CK19 中 的一种或多种的蛋白质和 / 或基因表达。DE-hep 祖细胞显示 CK8、 CK18 和 CK19、 ICAM 的基 因表达。如本文例子中证实的， DE-hep 祖细胞通常还显示 EpCAM， 以及 HNF1、 HNF3b、 HNF4a 中的一种或多种优选全部的蛋白质和 / 或基因表达。包括 DE-hep 祖细胞且根据本发明获 得的细胞群体通常包含至少 25％的 DE-hep 祖细胞， 优选 50％的细胞是 DE-hep 祖细胞。依 赖于细胞群体中的 DE-hep 祖细胞百分比， 特定百分比细胞可显示所需蛋白质和 / 或基因表 达。因此， 百分比非常依赖于细胞群体的 “纯度” ( 即， 相同细胞同一性 )。然而， 可以对具 有低百分比 DE-hep 祖细胞的细胞群体实施细胞选择和此种细胞的繁殖， 并且这将反过来 导致更高的百分比。特别地， DE-hep 祖细胞显示 CK8、 CK18 和 CK19 的蛋白质和 / 或基因表 达 ( 通常如本文所述获得的 DE-hep 祖细胞群体中至少 50％细胞或细胞显示 CK8、 CK18 和 /或 CK19 的蛋白质和 / 或基因表达 )。
本发明涉及具有上述特征的 DE-hep 祖细胞以及包括 DE-hep 祖细胞的细胞群体。
本 发 明 的 一 个 进 一 步 方 面 涉 及 可 通 过 本 文 描 述 的 方 法 获 得 的 DE-hep 细 胞。 DE-hep 细胞显示关于药物转运的一种或多种标记， 尤其是 BSEP、 MRP2、 OATP-2( ＝ OATP-C、 OATP1B1)、 OATP-8(OATP1B3)、 OATP-A( ＝ OATP1A2)、 NTCP、 MDR1、 MDR3、 OCT-1 的蛋白质和 / 或基因表达。 特别地， DE-hep 细胞显示关于药物转运的下述标记的蛋白质和 / 或基因表达 ： MRP2、 OATP-2( ＝ OATP-C、 OATP1B1)、 OATP-A( ＝ OATP1A2)、 NTCP 和 OCT-1。此外， 在本文描 述的至少某些方案中， 获得的 DE-hep 细胞还显示关于药物转运的下述标记的蛋白质和 / 或 基因表达 ： MDR1 和 / 或 MDR3。
本 发 明 的 一 个 进 一 步 方 面 涉 及 可 通 过 本 文 描 述 的 方 法 获 得 的 DE-hep 细 胞。DE-hep 细 胞 显 示 关 于 药 物 代 谢 酶 的 一 种 或 多 种 标 记， 尤 其 是 GSTA1-1、 GSTM1-1、 CYPs(CYP1A1、 CYP1A2、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP2B6、 CYP2C8、 CYP2C9、 CYP2C19、 CYP2D6、 CYP2E1、 CYP3A4、 CYP3A7、 CYP7A1、 UGT1A6、 UGT1A 和 / 或 UGT2B7 的蛋白质和 / 或基因表达。特别 地， DE-hep 细胞显示下述药物代谢酶的蛋白质和 / 或基因表达 ： CYP 2C9、 CYP2C19、 CYP2D6。 此外， 如本文例子中证实的， DE-hep 细胞还显示 CYP1A1、 CYP1A2、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP2B6、 CYP2C8、 CYP2E1、 CYP3A4、 CYP3A7、 CYP7A1 以及 UGT1A6、 UGT1A、 UGT2B7 的蛋白质和 / 或基因 表达。 本 发 明 的 一 个 进 一 步 方 面 涉 及 可 通 过 本 文 描 述 的 方 法 获 得 的 DE-hep 细 胞。 DE-hep 细胞显示关于转录因子的一种或多种标记， 尤其是 FXR、 RXRα、 RXRβ、 RXRγ、 HNF1α、 HNF3α、 HNF3β、 HNF4α、 HNF6、 C/EBP A、 C/EBP B 的蛋白质和 / 或基因表达。特别 地， DE-hep 细胞显示关于转录因子的下述标记的蛋白质和 / 或基因表达 ： RXRγ。 此外， 如本 文例子中证实的， DE-hep 细胞还显示 FXR、 RXRα、 RXRβ、 HNF1α、 HNF3α、 HNF3β、 HNF4α、 HNF6、 C/EBP A、 C/EBP B 的蛋白质和 / 或基因表达。
在一个具体实施方案中， DE-hep 细胞显示关于药物转运蛋白和药物代谢酶的一种 或多种标记的蛋白质和 / 或基因表达， DE-hep 细胞显示关于药物转运蛋白和转录因子的一 种或多种标记的蛋白质和 / 或基因表达， DE-hep 细胞显示关于药物代谢酶和转录因子的一 种或多种标记的蛋白质和 / 或基因表达， 并且 DE-hep 细胞显示关于药物转运蛋白、 药物代 谢酶和转录因子的一种或多种标记的蛋白质和 / 或基因表达 ( 参考在上文段落中具体提及 的标记 )。
此外， 与使用相同种类的细胞但对细胞实施固有分化比较， 通过上述方法获得的 DE-hep 细胞可能显示下述增加的蛋白质和 / 或基因表达 ： 白蛋白、 UGT2B7、 CYP3A4。如本 文例子中显示的， 基于根据本发明的 DE-hep 细胞的白蛋白表达增加至少 5 倍， 但使用特定 方案 ( 方案 2 或 4) 可以高至约 140。平均起来， 白蛋白表达增加约 80 或 90 倍。如本文例 子中显示的， 基于根据本发明的 DE-hep 细胞的 UGT2B7 表达增加至少 3 倍， 但使用特定方案 ( 方案 2) 可以高至约 85。平均而言， UGT2B7 表达增加约 30 或 40 倍。如本文例子中显示 的， 基于根据本发明的 DE-hep 细胞的 CYP 3A4 表达增加至少 20 倍， 但使用特定方案 ( 方案 3) 可以高至约 200。平均而言， 白蛋白表达增加约 100 或 110 倍。
本发明的 DE-hep 细胞特别良好地适合于在药物开发和毒性测试中使用， 因为它 们表达药物转运蛋白和 / 或代谢酶。此外， 通过本发明的获得的 DE-hep 细胞显示对于成熟
肝脏细胞重要的标记基因的表达， 例如白蛋白、 CYP3A4 和 UGT2B7。
包括 DE-hep 细胞且根据本发明获得的细胞群体通常包含至少 25％的 DE-hep 细 胞， 优选 50％的细胞是 DE-hep 细胞。依赖于细胞群体中的 DE-hep 细胞百分比， 特定百分 比细胞可能显示所需蛋白质和 / 或基因表达。 因此， 所述百分比非常依赖于细胞群体的 “纯 度” ( 即， 相同细胞同一性 )。然而， 可以对具有低百分比 DE-hep 细胞的细胞群体实施细胞 选择和此种细胞的繁殖， 并且这将反过来导致更高的百分比。
本发明涉及具有上述特征的 DE-hep 细胞以及包括 DE-hep 细胞的细胞群体。
在本发明的一个方面， DE-hep 细胞或细胞核显示下述特征中的至少一种， 例如至 少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种或全部 ： 葡萄糖 6 磷酸酶、 载脂蛋白 E、 CYP7A1( 胆固 醇 7α 羟化酶 )、 醇脱氢酶 1、 细胞色素 P450 还原酶、 HNF4a、 α-1- 抗胰蛋白酶、 CK18、 HNF 3b(HNF 3B)、 白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白和下述 11 种特征中的至少 2 种， 例如至少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种或全部
A. 药物转运蛋白
i) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 BSEP 的蛋白质和 / 或基因表达，
ii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MRP2 的蛋白质和 / 或基因表达， iii) 至少 1 ％的细胞或相关的细胞核显示 OATP-2( ＝ OATP-C、 OATP1B1) 和 / 或 OATP-8(OATP1 B3) 的蛋白质和 / 或基因表达，
iv) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 OATP-A( ＝ OATP1A2) 的蛋白质和 / 或基 因表达，
v) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 NTCP 的蛋白质和 / 或基因表达，
vi) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MDR1 的蛋白质和 / 或基因表达，
vii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MDR3 的蛋白质和 / 或基因表达，
viii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 OCT-1 的蛋白质和 / 或基因表达
B. 药物代谢酶
ix) 至少 20％的细胞或相关的细胞核显示 GST A1-1 和 GSTM1-1 的蛋白质和 / 或 基因表达，
x) 至少 5％的细胞或相关的细胞核显示下述 CYPs-1A1、 -1A2、 -1B1、 -2A6、 -2B6、 -2 C8、 -2C9、 -2C19、 -2D6、 -2E1、 -3A4、 -3A7 和 -7A1 中的至少 2 种的蛋白质和 / 或基因表达，
xi) 至少 5％的细胞或相关的细胞核显示 UGT1A6 和 / 或 UGT2B7 的蛋白质和 / 或 基因表达。
特别地， 本发明涉及显示全部下述特征的 DE-hep 细胞 ： 葡萄糖 6 磷酸酶、 载脂蛋白 E、 CYP7A1( 胆固醇 7α 羟化酶 )、 醇脱氢酶 1、 细胞色素 P450 还原酶、 HNF4a、 α-1- 抗胰蛋白 酶、 CK18、 HNF3b(HNF3B)、 白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白。这些特征指示细胞是肝脏细胞。
此外， 如上所述， DE-hep 细胞具有就药物转运和药物代谢而言的特征。因此， 包括 DE-hep 细胞的细胞群体通常具有下述特征 ： 至少 20％的细胞显示 OATP-2、 CYP1A2、 CYP2C9、 CYP2C19、 CYP2D6、 CYP3A4 的蛋白质表达。
包括 DE-hep 细胞的细胞群体通常是这样的群体， 其中至少 20％的细胞显示关于 药物转运的下述标记中的至少 5 种、 优选 7 种、 更加优选全部的蛋白质和 / 或基因表达 ： BSEP、 MRP2、 OATP-2( ＝ OATP-C、 OATP1B1)、 OATP-8(OATP1B3)、 OATP-A( ＝ OATP1A2)、 NTCP、
MDR1、 MDR3、 OCT-1， 和
至少 20％的细胞显示 GST A1-1 和 / 或 GSTM1-1 的蛋白质和 / 或基因表达， 和
至少 20％的细胞显示下述 CYPs-1A1、 -1A2、 -1B1、 -2A6、 -2B6、 -2C8、 -2C9、 -2C19、 2D6、 -2E1， -3A4、 -3A7 和 -7A1 中的至少 7 种、 优选 9 种、 更加优选全部的蛋白质和 / 或基因 表达
至少 5％的细胞显示 UGT1A6 和 / 或 UGT2B7 的蛋白质和 / 或基因表达。
人胚泡衍生干细胞 (hBS 细胞 ) 是多能的， 并且可以产生所有 3 个胚胎胚层 ( 内胚 层、 外胚层和中胚层 ) 的细胞， 并且进一步产生所有体细胞和生殖细胞。因此， 在未来， 衍生 自具有肝细胞功能特征的 hBS 细胞的分化细胞不仅具有用于移植或在生物反应器中用于 在具有肝衰竭的患者中的额外身体肝脏支持的潜力， 以及作为测试系统用于研究药物靶、 异生物质的肝代谢和肝毒性的潜力。hBS 衍生的肝细胞可以需要时潜在提供来自相同的遗 传供体的功能人肝细胞的无限来源， 并且因此改善体外测试例如毒性测试的预测性， 且减 少关于动物实验的需要。然而， 异生物质的毒性通常依赖于其生物转化成毒性和反应性代 谢物， 并且因此需要生物转化系统的存在和分布。 目前， 原代人肝细胞构成用于体外药物代 谢和毒性测试的模型。 然而， 当培养原代肝细胞时， 药物代谢酶的活性和许多转运蛋白功能 快速丧失和 / 或改变。此外， 用于体外研究的许多肝细胞瘤细胞系例如 HepG2， 缺乏许多重 要药物代谢酶的表达。 细胞色素 P450s(CYPs) 是混合功能单加氧酶和异生物质 I 期代谢中的主要酶。依 赖于异生物质的性质， 这种氧化代谢导致药物前体的失活和促进的消除、 激活或代谢激活。 CYP 表达的主要部位是肝脏， 并且 CYP3A4 是人成年肝脏中最丰富的 CYP 同工酶。对于药物 代谢具有最大重要性的酶属于家族 1-3， 负责临床使用药物的 70-80％的所有 I 期依赖性代 谢。由于多态现象， CYP 表达和活性呈现很大的个体间变异。此外， CYPs 可以由特定药物诱 导几倍或抑制， 导致另外， 尽管暂时的代谢活性的变异性。 特别地， 在肝细胞内 3 个主要 CYP 家族 (1-3) 基本 CYP 活性的组成对于药物代谢具有极大重要性。在本文例子中描述了 hBS 细胞衍生的 DE-Hep 细胞， 其中检测出来自所有测试 CYP 酶的 mRNA， 包括 CYP1A2( 成年肝脏 特异性酶 )、 CYP2C9 和 CYP3A4。检测出主要 CYP 家族更精确地 CYP1A2、 CYP2C9 和 CYP3A4 的基本 CYP 活性， 并且另外这 3 种提及的 CYPs 活性的个体间组成类似于人原代肝细胞的那 种。 此外， CYP1A2 也是另一种成年肝脏特异性酶， 即 CYP7A1( 胆固醇 7α 羟化酶 )， 在 DE-Hep 细胞中表达， 证实它们的成年肝表型。 因此， 本发明提供了用于制备表达功能药物代谢酶的 DE-Hep 细胞的方法。
除 I 期酶如 CYPs 外， 肝细胞还表达 II 期酶如 UGTs。因此， 本发明提供了用于制备 表达 II 期酶的 DE-Hep 细胞的方法。在本发明的一个进一步方面， DE-hep 细胞表达 I 期酶 和 II 期酶， 特别是 CYP2C9、 CYP2C19、 CYP2D6 连同 UGT1A6 和 / 或 UGT1A。
此外， 肝细胞表达细胞色素 P 还原酶， 这是对于 CYPs 重要的氧化还原配偶体， 并 且因此对于 CYP 功能性是必需的。因此， 本发明提供了用于制备表达细胞色素 P 还原酶的 DE-Hep 细胞的方法。
当分析肝脏的药物代谢和毒性时， 在肝细胞的功能药物转运蛋白例如 BSEP、 MRP2、 OATPs( 例如 OATP-2)、 MDR1 和 3、 NTCP 和 OCT-1 是必需的。因此， 本发明提供了用于制备表 达功能转运蛋白的 DE-Hep 细胞的方法。
因 此， 在 一 个 实 施 方 案 中， DE-hep 可 以 表 达 选 自 CYP2C9、 CYP2C19、 CYP2D6、 UGT1A6、 UGT1A、 OATP-2、 MRD3 和 / 或 BSEP 的 I 期酶， II 期酶和药物转运， 连同其他肝脏标 记， 例如醇脱氢酶 Ia(ADH1A) 和 / 或白蛋白。
肝脏相关转录因子如 HNF1α、 3α、 3β、 4α 和 6、 PXR、 CAR、 FXR、 RXR、 C/EBP A 和 B 的 表达是获得成年肝表型必需的。因此， 本发明提供了用于制备表达此种转录因子的 DE-Hep 细胞的方法。
因此， 本发明涉及经由定型内胚层用于从人胚泡衍生干 (hBS) 细胞制备 DE-Hep 祖 细胞的方法。本发明还涉及像这样的 DE-Hep 祖细胞和像这样的 DE-Hep 细胞。
根据本发明的 DE-Hep 祖细胞显示 EpCAM、 HNF1、 HNF3b、 HNF4a、 AFP、 结蛋白、 CD133、 c-kit、 Notch2、 ICAM1( ＝ CD54)、 CK7、 CK8、 CK18 和 CK19 中的一种或多种的基因表达 ( 参 见实施例 8、 表 2 和实施例 9)。
发明详述
定义和缩写
如本文所使用的， 术语 “胚泡衍生干细胞” 指 BS 细胞， 并且人形式称为 “hBS 细胞” 。 在文献中， 该细胞通常称为胚胎干细胞， 并且更具体而言人胚胎干细胞。
如本文所使用的 ；
阶段 I 产物 ： 定型内胚层 (DE) 细胞，
阶段 II 产物 ： 经由定型内胚层衍生的 DE-Hep 祖细胞， 例如成肝细胞样细胞。
阶段 III 产物 ： 经由定型内胚层衍生的 DE-Hep 细胞， 例如功能肝细胞样细胞。
术语 “至少 xx％的细胞或相关的细胞核显示 yy 的蛋白质和 / 或基因表达” 意指 “至少 xx％的细胞显示 yy 的蛋白质和 / 或基因表达” 或 “至少 xx％的细胞核显示 yy 的基 因表达”
术语 “固有分化” 意指衍生自 hBS 细胞的肝细胞样细胞， 所述 hBS 细胞已在 MEFs 上 TM 在无特定补充剂 ( 例如， 活化素 A) 的 VitroHES 中进行培养， 但将 bFGF 加入培养基中并且 培养基更换很少 ( 参考专利申请 WO2007/140968A1)。
术语 “功能肝细胞” 意指表达成熟肝细胞标记尤其例如白蛋白、 CYP3A4、 UGT2B7、 OATP-2、 ADH1A、 UGT1A6、 CYP2C9、 CYP2C19 和 CYP2D6 的细胞类型。
在肝脏中的异生物质代谢通常分成 3 个时期 ： 修饰 (I 期 )、 缀合 (II 期 ) 和排泄 (III 期 )。这些反应协同作用以使异生物质解毒且从细胞中去除它们。
在 I 期中， 各种酶作用于将反应性和极性基团引入其底物内。最常见的修饰之一 是由细胞色素 P-450 依赖性混合功能氧化酶系统催化的羟化。
如本文所使用的， “CYP” 意指细胞色素 P， 且更具体而言细胞色素 P450， 由许多不 同同工酶构成的肝脏主要 I 期代谢酶， 例如 CYP1A1、 CYP1A2、 CYP1B1、 CYP2A6/2A7/2A13、 CYP2B6、 CYP2C8、 CYP2C9、 CYP2C19、 CYP2D6、 CYP2E1、 CYP3A4、 CYP3A5、 CYP3A7 和 CYP7A1。
在肝脏中的 II 期反应由一大群广泛特异性的转移酶催化， 所述转移酶组合可以 代谢包含亲核或亲电子基团的几乎所有疏水化合物。 这些基团中最重要的一种是谷胱甘肽 S- 转移酶 (GSTs) 和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 (UGTs)。
如本文所使用的， 术语 “GST”意指谷胱甘肽转移酶， 并且其亚型的例子是 GST A1-1、 GST M1-1 和 GST P1-1。如本文所使用的， 术语 “UGT” 意指尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶， 这是催化葡萄 苷酸化活性的一群肝脏酶。
II 期反应后， 肝脏可能进一步代谢来自 II 期反应的产物。缀合物及其代谢产物 可以在其代谢 III 期中从细胞中排泄， 其中阴离子基团充当亲和标记用于多药抗性蛋白质 (MRP) 家族的各种膜转运蛋白。这些蛋白质是 ATP 结合盒转运蛋白家族的成员， 并且可以 催化大量的各种疏水阴离子的 ATP 依赖性转运， 并且因此作用于去除 II 期产物至细胞外介 质， 在其中它们可以进一步代谢或排泄。
如本文所使用的， 术语 “OATP” 意指有机阴离子转运多肽， 其在肝脏中介导有机阴 离子的钠 (Na+) 不依赖性转运， 例如磺溴酞 (BSP) 以及缀合 ( 牛磺胆酸盐 ) 和未缀合 ( 胆 酸盐 ) 胆酸 ( 通过相似性 )。OATP 家族的 3 个重要成员是 OATP-2( 有时称为 OATP-C 或 OATP1B1)、 OATP-8( 有时称为 OATP1B3) 和 OATP-A( 有时称为 OATP1A2)。
如本文所使用的， 术语 “细胞色素 P450 还原酶” ( 也称为 CPR) 意指这样的蛋白质， 它的生理功能是通过电子转移还原细胞色素 P450 酶并且因此是细胞色素 P450 酶介导的反 应所需的。
术语 “功能药物代谢酶” 意指属于 I 期和 II 期酶的功能酶， 其执行异生物质和药 物的化学修饰， 所谓的药物或异生物质代谢。
如本文所使用的， 术语 “功能活性” 指通常在原代人肝细胞中检测出的有效可测量 的肝细胞功能， 例如对于药物转运蛋白可测量的药物转运和对于细胞色素 P450s(CYPs) 可 测量的酶代谢。
如本文所使用的， 术语 “胚外内胚层 (ExE)” 意指分化的内胚层细胞， 与定型内胚层 相反， 它将构成人发育中的胚胎外区室， 例如卵黄囊。
如本文所使用的， 术语 “AAT” 意指肝脏标记 α- 抗胰蛋白酶。
如本文所使用的， 术语 “载脂蛋白 E” 意指这样的一类脂蛋白， 其携带胆固醇和其他 脂肪作为小囊泡通过血流， 并且是这些分子的正常分解所需的。载脂蛋白 E 是称为极低密 度脂蛋白的特定脂蛋白的主要组分， 其具有从血液中去除过量胆固醇并且将其携带至肝脏 用于处理的主要功能。
如本文所使用的， 术语 “醇脱氢酶 1” 意指这样的一类脱氢酶， 其促进醇和醛或酮之 + 间的互换， 伴随 NAD 还原成 NADH。醇脱氢酶 1 作用于分解否则可以是毒性的醇。
如本文所使用的， 术语 “AFP” 意指肝脏标记甲胎蛋白。
如本文所使用的， 术语 “BSEP” 意指胆汁转运蛋白胆汁盐输出泵。
如本文所使用的， 术语 “CK” 意指肝脏标记细胞角蛋白 ( 可互换使用 )， 具有不同 亚型例如细胞角蛋白 18(CK18)、 细胞角蛋白 19(CK19)、 细胞角蛋白 8(CK8) 和细胞角蛋白 7(CK7)。
如本文所使用的， 术语 “c-Met” 意指肝细胞生长因子和 / 或散射因子受体。
如本文所使用的， 术语 “葡萄糖 6 磷酸酶” 意指在糖质新生途径中使葡萄糖 6- 磷 酸脱磷酸的酶， 从而使得游离葡萄糖可以经由葡萄糖转运蛋白膜蛋白质从细胞中输出。葡 萄糖 -6- 磷酸酶在肝脏和肾脏中发现， 并且涉及器官的葡萄糖动态平衡作用。
如本文所使用的， 术语 “ICAM-1” 意指细胞间粘附分子 1( 有时称为 CD54)。
如本文所使用的， 术语 “LFABP” 意指肝脏脂肪酸结合蛋白 ( 可互换使用 )。如本文所使用的， 术语 “EpCAM” 意指上皮细胞粘附分子 ( 可互换使用 )。
如本文所使用的， 术语 “FGF” 指成纤维细胞生长因子， 优选具有人和 / 或重组起 源， 和属于其的亚型是例如 “bFGF” ( 指碱性成纤维细胞生长因子， 有时也称为 FGF2) 和 FGF4。 “aFGF” 指酸性纤维细胞生长因子 ( 有时也称为 FGF1)。
如本文所使用的， 术语 “BMP” 指成骨蛋白， 优选具有人和 / 或重组起源， 并且属于 其的亚型是例如 BMP4 和 BMP2。
如本文所使用的， 术语 “HGF” 指肝细胞生长因子， 优选具有人和 / 或重组起源。
如本文所使用的， 术语 “Dex” 指地塞米松。
如本文所使用的， 术语 “OSM” 指制癌素 M。
如本文所使用的， 术语 “ITS 混合物” 指胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒混合物， 例如来自 Invitrogen 的胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 -A 补充剂 (100X)( 目录号 -51300-044)。
如本文所使用的， 术语 “DMSO” 指二甲基亚砜。
如本文所使用的， 可互换使用的 “HNF3β” 和/或 “HNF3b” 意指肝细胞核因子 3， 调 节内胚层衍生组织例如肝脏、 胰岛和脂肪细胞中的基因表达的转录因子。HNF3β 有时也可 以称为 HNF3b 或 Fox2A， 后面一个名称源于转录因子是叉头框 (Forkhead box) 转录因子家 族成员。 如本文所使用的， 可互换使用的 “HNF4α” 和/或 “HNF4a” 意指肝细胞核因子 4α， 对于肝脏发育、 肝细胞特异性基因表达和胰脏 β 细胞基因表达调节关键的转录因子。
如本文所使用的， 术语 “NTCP” 意指牛磺胆酸钠共转运多肽， 并且是将胆酸从门静 脉循环吸收到肝细胞内的转运蛋白。因此， 胆酸的这种摄取是胆酸的肠 - 肝再循环的重要 组分， 并且因此对于足够的胆汁流动和正常肝脏功能是关键的。
如本文所使用的， 术语 “OCT-1” 意指有机阳离子转运蛋白 1。OCT-1 是主要肝转运 蛋白， 其介导许多有机阳离子从血液摄取到肝脏内， 在其中化合物可以代谢或分泌到胆汁 内。
如本文所使用的， 术语 “MDR” 意指多药抗性转运蛋白。MDR 1 和 3 是转运蛋白 ATP 结合盒 (ABC) 家族成员， 并且两者都是药物流出转运蛋白。MDR 1 在调节药物、 肽和异生物 质进入体内的运输中以及在保护机体不受异生物质损伤和药物毒性中是重要的， 而 MDR 3 是磷脂分泌到胆汁内必需的。
如本文所使用的， 术语 “Wnt3a” 意指 wingless 相关的 MMTV 整合位点 3A。
如本文所使用的， 术语 “活化素” 意指 TGF-β 家族成员， 其显示广泛范围的生物 活性， 包括细胞增殖和分化调节， 例如 “活化素 A” 或 “活化素 B” 。活化素属于配体的常见 TGF-β 超家族。
如本文所使用的， 术语 “无异物” 意指直接或间接暴露于非人动物组分的完全避 免。
如本文所使用的， 术语 “分化诱导剂” 意指诱导细胞分化的任何类型的因子， 包括 但不限于在围绕细胞的物理微环境中的化学制品、 生物制品和组分 ； 特别地， 该术语用于外 源性因子， 即供应给培养物的因子。
如本文所使用的， 术语 “固有因子方案” 指示分化通过暴露于分泌至培养基的固有 因子诱导。可以采用下述方案 ： hBS 细胞在 IVF 培养皿 (Falcon) 中的 mEF 细胞层上生长，
并且在 37℃、 5％ CO2 和 95％湿度下实施分化直至 40 天， 以获得肝细胞样细胞。使用的培 养基 ( 具有加入的 4ng/ml 人重组 bFGF[Invitrogen] 的 VitroHESTM[Vitrolife AB]) 每 7 至 21 天进行更换， 通常每 14 天， 通过弃去约 1 至 2ml 旧培养基并且加入 1 至 2ml 新鲜培养 基。
饲养细胞
如本文所使用的， 饲养细胞意指单独或组合使用的支持性细胞类型。细胞类型可 以进一步具有人或其他物种起源。饲养细胞可以衍生自其的组织包括胚胎、 胎儿、 新生儿、 青少年或成人组织， 并且它进一步包括衍生自皮肤的组织， 包括包皮、 脐带、 肌肉、 肺、 上皮、 胎盘、 输卵管、 腺、 基质或乳腺。饲养细胞可以衍生自属于由人成纤维细胞、 纤维细胞、 肌细 胞、 角化细胞、 内皮细胞和上皮细胞组成的群体的细胞类型。 可以用于衍生饲养细胞的特定 细胞类型例子包括胚胎成纤维细胞、 胚外内胚层细胞、 胚外中胚层细胞、 胎儿成纤维细胞和 / 或纤维细胞、 胎儿肌细胞、 胎儿皮肤细胞、 胎儿肺细胞、 胎儿内皮细胞、 胎儿上皮细胞、 脐 带间充质细胞、 胎盘成纤维细胞和 / 或纤维细胞、 胎盘内皮细胞、 出生后包皮成纤维细胞和 / 或纤维细胞、 出生后肌细胞、 出生后皮肤细胞、 出生后内皮细胞、 成人皮肤成纤维细胞和 / 或纤维细胞、 成人肌细胞、 成人输卵管内皮细胞、 成人腺子宫内膜细胞、 成人基质子宫内膜 细胞、 成人乳腺癌实质细胞、 成人内皮细胞、 成人上皮细胞或成人角化细胞。当饲养细胞衍 生自 hBS 细胞时， 细胞可以是成纤维细胞。 在根据本发明的方法中 ( 即， 阶段 I-III 中的任何 )， 可以使用饲养细胞例如人或 小鼠饲养细胞， 或该方法可以没有任何饲养细胞的任何使用。 在一个具体实施方案中， 培养 是无异物的。 在另一个具体实施方案中 ( 例如， 当 DE-Hep 细胞用于治疗用途时 )， 细胞可以 是自体细胞， 即衍生自治疗的受试者。
如本文所使用的， 术语 “MEF 细胞” 意指小鼠胚胎成纤维细胞。
在本发明中， 在本发明中使用特别考虑支持肝细胞生长的细胞培养基， 例如 HCM( 肝细胞培养基 ) 培养基、 Williams E 培养基和 RPMIAdvanced 培养基。
如由本文例子显而易见的， 本发明涉及用于制备 i)DE-Hep 祖先 ( 阶段 II 的结果 ) 和 ii)DE-Hep 细胞 ( 成熟 DE-Hep 祖细胞和阶段 III 的结果， 还参见图 1A 和 B) 的分阶段方 法。
DE-Hep 祖细胞
根据本发明的 DE-Hep 祖先和 DE-Hep 细胞可以有利地用于治疗和 / 或预防几种肝 疾病和病症。因此， 根据本发明 DE-Hep 祖先和 DE-Hep 细胞可以在药剂中使用。
DE-Hep 祖细胞是 DE-Hep 细胞的祖细胞， 并且因此， 它们适当地用于例如获得衍生 自定型内胚层的代谢感受态肝细胞样细胞， 或用于研究针对肝细胞样细胞的成熟。
如由下文描述显而易见的， 本发明还涉及用于制备 i)DE-Hep 祖先和 ii)DE-Hep 细 胞 ( 其为成熟 DE-Hep 细胞 ) 的分阶段方法。如图 1 中举例说明的， 这种方法涉及 DE 细胞 的形成， 通过培养 hBS 细胞 ( 阶段 I)， 其后从 DE 细胞获得 DE-Hep 祖细胞 ( 阶段 II)， 和最 终从祖先 DE-hep 形成成熟 DE-Hep 细胞 ( 阶段 III)。
阶段 I
DE 细胞通常通过在培养基中培养 hBS 细胞来获得， 所述培养基包括活化素 A 和任 选地一种或多种生长因子例如 FGF2 和血清尤其是 FCS。还可以包括其他合适物质， 例如
Wnt3a。 该方法包括对 hBS 细胞实施培养条件， 其中 hBS 细胞进行诱导以发育成定型内胚 层细胞。阶段 I 包括在包括活化素的第一种阶段 I 培养基中培养 hBS 细胞 2-6 天， 其中在 培养 1-2 天后培养基由第二种阶段 I 培养基替换， 所述第二种阶段 I 培养基包括活化素、 一 种或多种生长因子和在一个优选实施方案中血清。活化素 A 在某些情况下可以由类似物质 例如活化素 B 或卵泡抑素替换。
第一种和 / 或第二种阶段 I 培养基都可以是 RPMI 高级培养基 (RPMIadvanced medium) 或 DMEM 培养基。这种第一种和 / 或第二种阶段 I 培养基可以进一步补充有一种或 多种生长因子尤其是 FGF2 和 / 或 Wnt3a， 和血清尤其是胎牛血清 ( 缩写为在本文中可互换 使用的 FBS 或 FCS)， 如本发明的方案 1、 实施例 2 中显示的。
如实施例 2( 方案 1-4) 中显示的， hBS 细胞可以根据下述方案之一进行培养 ：
第1天： 第一种阶段 I 培养基包含活化素 ( 例如， 方案 1)，
第1天： 第一种阶段 I 培养基包含活化素和生长因子尤其是 FGF2( 例如， 方案 2 和 3)，
第1天： 第一种阶段 I 培养基包含活化素 ( 例如， 方案 4)。
第2天： 第二种培养基包含活化素和血清 ( 例如， 方案 1)， 和任选地 FGF2。
第2天： 第二种培养基包含活化素、 血清和生长因子尤其是 FGF2( 例如， 方案 2、 3 和 4)。
第3和4天： 第二种培养基包含活化素、 FGF2 和血清 ( 例如， 方案 1)。
第3和4天： 第二种培养基包含活化素、 血清和生长因子尤其是 FGF2( 例如， 方案 2、 3 和 4)。
在任何给定的上述培养基时供应给 hBS 细胞的活化素浓度可以在约 80-120ng/ml 范围中， 例如 90-110ng/ml、 95-105ng/ml 或 100ng/ml。Wnt3A 浓度将优选是约 20ng/ml， 例 如 25ng/ml、 30ng/ml。最优选的是 25ng/ml 的浓度。
血清例如 FBS 的浓度可以在约 0％至 10％的范围中， 例如 0.1-5％或 0.2-3％。如 图 1B 中显示的， 血清浓度在阶段 I 过程中可变， 例如第一种阶段 I 培养基具有 0％血清， 例 如随后为在第二种阶段 I 培养基中 0.2％血清浓度， 和在某些情况下甚至进一步增至例如 1％ FBS， 如图 1B 中的方案 4 显示的。
阶段 II-DE-Hep 祖先
本发明涉及用于制备经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干 (hBS) 细胞的 DE-Hep 祖细胞的方法。
在阶段 II 时， 繁殖得自阶段 I 的细胞， 并且阶段 II 包括在阶段 II 培养基中培养 来自阶段 I 的细胞， 所述阶段 II 培养基包括一种或多种生长因子和任选地成骨蛋白， 和任 选地收获因此获得的 DE-hep 祖细胞。
通 常， 培 养 在 培 养 基 例 如 RPMI 高 级 培 养 基 或 DMEM 培 养 基、 HCM 培 养 基、 基于 William E 的培养基或 VitroHES 等中进行。培养基通常补充有各种因子例如生长因子。 FGF2、 PEST 和 / 或 GlutaMAX 是适当地包括在培养基中的物质例子。
培养基适当地例如每天或每隔一天进行更换。
此外， 培养基可以包括一种或多种生长因子尤其是 aFGF， 和成骨蛋白尤其是
BMP2。 在一个具体实施方案中， 培养基进一步包括血清替代品或血清例如 FBS， 和在另一 个具体实施方案中， 培养基可以进一步包括 HGF。
在一个具体实施方案中， DE-Hep 祖先通过下述方法获得， 其中 DE 细胞通过如上所 述的方法获得， 根据下述方案进行培养， 如实施例 2( 方案 1-4) 中显示的 ：
阶段 II 的第 1 天至第 4 天 ： 阶段 II 培养基包含 FGF2、 BMP4、 一种或多种进一步的 成骨蛋白尤其是 BMP2、 血清尤其是 FBS、 PEST 和 GlutaMAX、 和任选地一种或多种进一步的生 长因子尤其是 aFGF( 例如， 方案 1)，
阶段 II 的第 1 至 8 天 ： 阶段 II 培养基包含 HGF( 例如， 方案 2)，
阶段 II 的第 1 至 5 天 ： 阶段 II 培养基包含 FGF4、 BMP2( 例如， 方案 3)，
阶段 II 的第 1 至 3 天 ： 阶段 II 培养基包含 FGF2、 BMP4、 血清尤其是 FBS( 例如， 方 案 4)，
阶段 II 的第 4 至 10 天 ： 阶段 II 培养基包含 FGF2、 BMP4、 血清尤其是 FBS、 和 HGF( 例 如， 方案 1)，
阶段 II 的第 6 至 10 天 ： HGF( 例如， 方案 3)，
阶段 II 的第 4 至 8 天 ： 阶段 II 培养基包含 HGF、 FGF2、 EGF 和血清例如 FBS( 方案 4)
阶段 II 中的细胞优选培养 8 天， 血清例如 FBS 的浓度在第 6 天时增加， 并且生长 因子尤其是 EGF 的补充剂在第 6 天时给予， 并且从第 6 天到第 8 天培养基每天进行更换。
如实施例中显示的， 浓度和优选实施方案可以包括 ：
方案 1
补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax 且另外具有下述的 RPMI 高级培养基或 DMEM 培养 基；
第 5 天： aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4( 分 别 为 100ng/ml、 5ng/ml、 50ng/ml、 200ng/ ml)0.2％ FCS。
第 6 天： aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4( 分 别 为 100ng/ml、 5ng/ml、 50ng/ml、 200ng/ ml)0.2％ FCS。
第7天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS。
第8天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS。
第9天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS。
相对高的 HGF 浓度 (100-200ng/ml) 可以用于第一天。
任选地第 6-13 天可以是 ；
第6天： BMP4(50ng/ml)、 FGF2(4ng/ml)、 0.2％ FCS，
第7天： BMP4(50ng/ml)、 FGF2(4ng/ml)、 0.2％ FCS
第 8-9 天 ： FGF1(50ng/ml)、 FGF2(4ng/ml)、 1％ FCS
第 10 天 ： HGF、 FGF2( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml)、 1％ FCS
第 11-13 天 ： HGF、 FGF2、 EGF( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml、 10ng/ml)、 1％ FCS
其中在第 11 至 13 天时可以给予更高的 FCS 浓度和 EGF(10ng/ml) 的补充剂。
备选地， BMP4、 FGF2( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml)0.2％ FCS 可以用于第 6-7 天， 随后
为在第 8-9 天时的 aFGF、 FGF2( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml)1％ FCS， 和在第 9-10 天时的 HGF、 FGF2、 EGF( 分别为 50ng/ml、 2ng/ml、 10ng/ml)1％ FCS。
在 另 一 个 实 施 方 案 中， 可 以 使 用 补 充 有 1 ％ PEST、 1 ％ Glutamax 且 另 外 具 有 HGF(20ng/ml) 和 0％ FCS 的 HCM 培养基或基于 Williams E 的培养基， 其中 HGF 的浓度在第 6-12 天时是约 20ng/ml。备选地， 第 6-15 天可以通过 ( 方案 3) 在第 6-9 天时使用 FGF4、 BMP2( 分别为 30ng/ml、 20ng/ml)0％ FCS， 和在第 10-15 天时使用 HGF(20ng/ml)0％ FCS 加 以改变。
根据上文， 当存在时， 可见 aFGF 的浓度在约 50 至约 200ng/ml 的范围中， bFGF 是 约 2-50ng/ml)， BMP2 是约 25-100ng/ml， BMP4 是 25-300ng/ml( 一般而言， 在阶段开始时采 用比以后更高的浓度 )， HGF 是约 25-300ng/ml)， FGF2 是约 1 至约 10ng/ml， FGF1 是约 25 至 约 100ng/ml， EGF 是约 5-50ng/ml)， FCS 是约 0.1％ -5％。
方案 1 的另一个实施方案可以包括
第1天： 活化素 A、 bFGF(100ng/ml、 5ng/ml)。
第 2-5 天 ： 活化素 A、 bFGF(100ng/ml、 5ng/ml)、 0.2％ FCS。
第 5-7 天 ： 无培养基更换。
第 8-14 天 ： aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4(100ng/ml、 5ng/ml、 50ng/ml、 200ng/ml)、 0.2％ FCS。
第 15-21 天 ： 补充有 bFGF、 HGF(2ng/ml、 20ng/ml) 的 WME+SQ。
其中 WME+SQ， 补充有 Dex、 OSM bFGF、 HGF(100nM、 10ng/ml、 2ng/ml、 2ng/ml)。
其中 Williams 培养基 E 和 SQ 是包含谷氨酸、 抗坏血酸、 牛血清白蛋白、 氢化可的 松、 转铁蛋白、 胰岛素的 SingleQuots。
DE-Hep 祖先的表征
如本文例子中显示的， 获得的 DE-Hep 祖细胞显示 EpCAM、 HNF1、 HNF3b、 HNF4a、 结蛋 白、 CD133、 c-kit、 CAM1( ＝ CD54)、 CK8、 CK18 和 CK19 中的一种或多种， 例如 2 种或更多、 4 种或更多、 6 种或更多、 8 种或更多、 10 种或更多、 12 种或更多或全部的基因表达 ( 参见实施 例 7、 表 2 和实施例 8)。
就 DE-Hep 祖先的表征而言的更多细节由段落 “发明概述” 、 本文实施例和附图可 见。
阶段 III
如本文前文描述的， 本发明的方法还提供经由 hBS 细胞衍生自 DE 细胞的 DE-Hep 细胞， 即肝细胞样细胞。为了获得此种细胞， 在上文描述的方法中包括进一步的阶段， 即阶 段 III。阶段 III 涉及在培养基中培养如阶段 II( 和任选地阶段 I) 中所述获得的 DE-Hep 祖细胞， 所述培养基例如基于 Williams E 的培养基、 Leibovitz L-15 培养基或 HCM Cambrex 培养基或可比较培养基， 任选补充有单独或组合的分化和 / 或 CYP 诱导剂， 例如 DMSO、 地塞 米松、 奥美拉唑、 利福平、 脱氧苯巴比妥、 乙醇、 异烟肼 ；
ITS 混合物 ；
BMP 和 / 或 TGFP、 OSM 和 / 或 EGF， 尤其是 BMP4 和 / 或 HGF。
在阶段 III 中， 培养通常执行 10-25 天或更多天。
培养基通常每天更换直至第 15 天时， 并且相关时， 对于其余培养期每隔一天更换。 用于制备 DE-hep 祖细胞和 DE-hep 细胞的方法包括上文描述的合适阶段。
对于所有实施方案， 如本文实施例 1 中所述的原材料可以适当地是以在下述专利 申请中详细描述的下述 4 种不同方法获得的未分化的人胚泡衍生干细胞 ；
1.hBS 细胞系建立和 LOT 制备 (WO03055992)
2.hBS 细胞转移至无饲养者的培养系统 (WO2004099394)
3. 无异物制备 (WO2007042225)
4. 酶促传代的 hBS 细胞 (WO07107303)
当 DE-hep 细胞用于治疗用途时， 无异物制备是特别重要的。
特别地， 推荐作为原材料的 hBS 细胞或细胞系具有下述特征 ： 对于碱性磷酸酶、 SSEA-3、 SSEA-4、 TRA 1-60、 TRA 1-81、 Oct-4 阳性对于 SSEA-1 阴性、 端粒酶活性、 以及在体 外和体内的多能性 ( 后者通过在免疫缺陷小鼠中的畸胎瘤形成显示 )。
如上所述， 未分化的 hBS 细胞因此可以在本发明提及实施方案的任何中使用， 这 进一步包括下述具体 5 个实施方案 ：
实施方案 1
0％ FCS 的基于 William E 的培养基或 HCM 或 HBM 培养基 任选地， 在 阶段 II 后第 6-11 天 III 补充有丁酸钠、 HGF( 分别为 1-3mM、 1-3ng/ml ； 优选分 别为 2.5mM、 2.5ng/ml) 和 0％ FBS、 HGF 浓度 (100-200ng/ml) 和地塞米松 (Dex)(100μM) 的基于 William E 的培养基
实施方案 2
实施方案 3
实施方案 4
实施方案 5
ng/ml)、 0％ FCS 的基于 William E 的培养基或 HCM 或 HBM 培养基。 每 1-3 天更换 50-100％培养基 其中省去 EGF 和抗坏血酸添加。 15-30， 优 选 15-26 补充有 OSM、 ITS 混合物、 HGF、 Dex( 分别为 5-15ng/ml、 0.5-2x、 40-60ng/ml、 0.5-2x10-7M ； 优选分别为 10ng/ml、 1x、 50ng/ml、 10-7M)、 0％ FCS 的基于 William E 的培 养基或 HCM 或 HBM 培养基。 每 1-3 天更换 50-100％培养基 上文提及的具体实施方案是本发明的举例说明。 预期个别成分可以由具有相同功 能性的物质替换， 并且与所述浓度范围的偏离是可能的并且仍获得所需结果。
得自阶段 III 的 DE-Hep 细胞的表征
本发明还涉及通过上述阶段 III 获得的 DE-Hep 细胞， 与使用相同种类的细胞但对 细胞实施固有分化制备的细胞比较， 其可能显示白蛋白、 UGT2B7、 CYP3A4、 ADH1A、 OATP-2、 UGT1A6、 CYP2C9、 CYP2C19 和 CYP2D6 增加的蛋白质和 / 或基因表达， 此处需要用于对照实验 的方案的详述。
本发明进一步涉及这样的 DE-hep 细胞， 其中与固有分化的细胞比较， 白蛋白和 / 或 UGT2B7 和 / 或 CYP3A4 的蛋白质和 / 或基因表达中的增加是至少 2 倍， 例如至少 5 倍、 至 少 10 倍、 至少 20 倍、 至少 30 倍、 至少 40 倍或更多倍。
本发明进一步涉及这样的 DE-hep 细胞， 其中与固有分化的细胞比较， ADH1A 和 / 或 OATP-2 和 / 或 UGT1A6 和 / 或 CYP2C9 和 / 或 CYP2C19 和 / 或 CYP2D6 的蛋白质和 / 或基因 表达中的增加是至少 2 倍， 例如至少 5 倍、 至少 10 倍、 至少 20 倍、 至少 30 倍、 至少 40 倍或 更多倍。
在一个具体实施方案中， 本发明涉及这样的 DE-hep 细胞， 其中与固有分化的细胞 比较， 白蛋白的蛋白质和 / 或基因表达中的增加是至少 5 倍， 例如至少 10 倍、 至少 15 倍、 至 少 20 倍或更多倍， 并且 UGT2B7 的蛋白质和 / 或基因表达中的增加是至少 3 倍， 例如至少 5 倍、 至少 10 倍、 至少 15 倍或更多倍。
就 DE-hep 细胞的表征而言的更多细节由段落 “发明概述” 、 本文实施例和附图可 见。
在一个具体实施方案中， 本发明涉及这样的 DE-hep 细胞， 其中获得的细胞群体中 至少 20％的细胞或细胞核显示下述特征中的至少一种， 例如至少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种或全部 ： 葡萄糖 6 磷酸酶、 载脂蛋白 E、 CYP7A1( 胆固醇 7α 羟化酶 )、 醇脱氢酶 1、 细胞色素 P450 还原酶、 HNF4a、 α-1- 抗胰蛋白酶、 CK18、 HNF3b、 白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋 白和下述 11 种特征中的至少 2 种， 例如至少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种或全部
A. 药物转运蛋白
i) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 BSEP 的蛋白质和 / 或基因表达，
ii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MRP2 的蛋白质和 / 或基因表达，
iii) 至少 1 ％的细胞或相关的细胞核显示 OATP-2( ＝ OATP-C、 OATP1B1) 和 / 或 OATP-8(OATP1B3) 的蛋白质和 / 或基因表达，
iv) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 OATP-A( ＝ OATP1A2) 的蛋白质和 / 或基 因表达，
v) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 NTCP 的蛋白质和 / 或基因表达，
vi) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MDR1 的蛋白质和 / 或基因表达，
vii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MDR3 的蛋白质和 / 或基因表达，
viii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 OCT-1 的蛋白质和 / 或基因表达
B. 药物代谢酶
ix) 至少 20％的细胞或相关的细胞核显示 GST A1-1 和 GSTM1-1 的蛋白质和 / 或 基因表达，
x) 至少 5％的细胞或相关的细胞核显示下述 CYPs-1A1、 -1A2、 -1B1、 -2A6、 -2B6、 -2 C8、 -2C9、 -2C19、 -2D6、 -2E1、 -3A4、 -3A7 和 -7A1 中的至少 2 种的蛋白质和 / 或基因表达，
xi) 至少 5％的细胞或相关的细胞核显示 UGT1A6 和 / 或 UGT2B7 的蛋白质和 / 或 基因表达。
在本发明的一个实施方案中， DE-Hep 细胞可以经由 I 期细胞色素 P450 酶代谢药 物。特别地， CYP1A2、 CYP2C9 和 CYP3A4 可以在不存在诱导剂的情况下代谢药物。可以在研 究 DE-hep 细胞代谢药物物质的能力的测定法中使用的物质是例如非那西丁、 双氯芬酸和 咪达唑仑， 并且代谢产物可以通过 LC-MS 进行分析。必须指出 DE-Hep 细胞组成性表达药物 代谢酶， 并且因此能够代谢药物而无需诱导剂的影响。
在一个进一步的实施方案中， DE-Hep 细胞具有与人原代肝细胞培养中的 CYP 活性 组成相似的 CYP 活性组成。具体而言， 在肝细胞样细胞中的 CYP1A2、 CYP3A4 和 CYP2C9 组 成与人原代肝细胞培养中的组成可比较。与在人原代肝细胞培养中的组成比较， CYP1A2、 CYP3A4 和 CYP2C9 之间的 CYP 活性组成可以相差 30％、 50％、 75％和 100％。
在本发明的一个实施方案中， DE-Hep 细胞表达功能药物转运蛋白。特别地， 通过 ICG 染料的摄取和释放测量 OATP-2 的表达， 所述 ICG 染料指示细胞内功能药物转运蛋白 的存在。此外， 可以在 DE-Hep 细胞中发现其他药物转运蛋白例如 OATP-8、 OATP-A、 MRP2、 OCT-1、 MDR1、 MDR3 和 NTCP 的蛋白质和 / 或基因表达。
此外， 一部分 DE-Hep 细胞和 DE-Hep 祖先对于 Notch-2 可以是阳性的。Notch 信 号途径广泛用于胚胎发育以及成人和动态平衡维持中。它也是构成干细胞信号网络的关 键途径之一。在哺乳动物中， 迄今为止已鉴定了 4 种 Notch 受体 (Notch1-Notch4) 和 5 种 结构上相似的 Notch 配体 (Delta 样 1[ 也称为 Deltal]、 Delta 样 3、 Delta 样 4、 Jagged1 和 Jagged2)。Notch 配体是单通道跨膜蛋白质。通过与在邻近细胞上表达的配体结合， 激 活 Notch 受体， 这导致 Notch 细胞内结构域的蛋白酶解释放和核转位， 这反过来调节分化。 Notch-2 在胚胎发育过程中广泛表达， 并且在许多器官中具有关键作用。 在肝脏中， Notch-2 涉及肝内导管的形成和分化 (Ader 等人， 2005， Kodama 等人， 2006)。因为肝脏样细胞通过 干细胞产生， 所以了解 notch 信号在这些细胞类型中的作用是重要的。
此外， DE-Hep 细胞可以表达除 UGTs 和 GSTs 外的进一步 II 期酶， 例如磺基转移酶。
DE-Hep 细胞显示对于肝细胞的一般形态， 即它们具有多边形细胞形状、 大细胞直径 ( 约 25-50μM)， 并且通常是具双核的。DE-Hep 在培养中也以岛样簇亚组构。
葡萄糖 6 磷酸酶、 载脂蛋白 E、 CYP7A1( 胆固醇 7α 羟化酶 )、 醇脱氢酶 1、 细胞色素 P450 还原酶、 HNF4a、 α-1- 抗胰蛋白酶、 CK18、 HNF3b(HNF3B)、 白蛋白和肝脏脂肪酸结合蛋 白都是肝脏相关标记， 并且像这样它们的表达指示肝细胞。 然而， 并非所有这些肝脏相关标 记都必须在根据本发明的细胞群体的所有细胞中表达。 即使仅表达这些标记之一的细胞也 可以类似于肝脏细胞表现， 并且因此可以用于上述目的， 依赖于它们期望的用途。 为了研究 例如通过细胞的代谢， 需要 CYPs、 GSTs 和 UGTs。为了研究摄取， OATPs 是重要的， 并且此外， 对于排泄研究， 例如 BSEP 或 MRP-2 可能是需要的。待执行的体内样研究越多， 需要的这些 特征越多。甚至更好的是潜在具有肝细胞样细胞连同其他肝脏细胞类型， 例如巨噬细胞和 枯否细胞， 提供肝脏环境以及细胞间相互作用。这个类型的培养系统可以是一种或多种细 胞类型包埋在其内的三明治 (sandwich) 形状。这个 3D 样和更体内的模拟情况可以潜在地 进一步使得肝细胞样细胞显示极性， 即显示一个细胞侧面朝向血液和一个细胞侧面朝向胆 汁。对于毒性研究， 由于其相互作用， I 和 II 期代谢酶都是需要的。此外， 希望细胞群体对 已知药物诱导剂反应， 由此可诱导例如 I 期和 / 或 II 期代谢酶。
在本发明的一个实施方案中， 细胞群体中的至少约 30％， 例如至少约 40％、 至少 约 50％、 至少约 60％、 至少约 70％、 至少约 80％、 至少约 90％或至少约 95％细胞具有上述 特征 i)-xi) 中的至少 3 个。在一个具体实施方案中， 至少一种， 例如 2 种、 4 种、 6 种或全部 特征属于药物转运蛋白组 ( 即， 特征 i)-viii)) 和 / 或至少一种， 例如 2 种、 3 种或 4 种特征 属于药物代谢酶组 ( 即 ix)-xi))。 特征 i) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示药物转运蛋白 BSEP 的蛋白质和 / 或基因表达。 BSEP 代表胆汁盐输出泵， 并 且是 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白， 其使用 ATP 水解的能量催化分子转运经过细胞外膜和细 胞内膜， 并且因此例如可以将药物输出到胆汁内 ( 通常在体内位于称为肝细胞顶侧的侧面 上 )。在本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至少 15％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 或至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 BSEP 的蛋白质和 / 或基因表达。
特征 ii) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示药物转运蛋白 MRP2 的蛋白质和 / 或基因表达。MRP2 代表多药抗性蛋白质 2， 并且也是 ABC 转运家族成员且将药物代谢产物输出到胆汁内。在本发明的一个实施方案 中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至少 20％、 至少 30％、 至 少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 MRP2 的蛋白质和 / 或基因表达。
特征 iii) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明 的细胞群体中显示药物转运蛋白 OATP-2 和 / 或 OATP-8 的蛋白质和 / 或基因表达。OATP-2 和 OATP-8 代表有机阴离子转运蛋白 2 和 8。两者都是 OATP 家族成员， 已知例如吸收来自 血液的毒性内源代谢产物和非生物物质。OATPs 在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在 本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至 少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或 至少 95％细胞显示 OATP-2 和 / 或 OATP-8 的蛋白质和 / 或基因表达。
特征 iv) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示药物转运蛋白 OATP-A 的蛋白质和 / 或基因表达。OATP-A 代表有机阴离子 转运蛋白 A， 并且是 OATP 家族成员， 已知例如吸收来自血液的毒性内源代谢产物和非生物 物质。OATPs 在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至 少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 OATP-A 的蛋白 质和 / 或基因表达。
特征 v) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示药物转运蛋白 NTCP 的蛋白质和 / 或基因表达。 NTCP 代表牛磺胆酸钠共转运 多肽， 并且是将胆酸从门静脉循环吸收到肝细胞内的转运蛋白。胆酸的这种摄取是胆酸的 肠 - 肝再循环的重要组分， 并且因此对于足够的胆汁流动和正常肝脏功能是关键的。NTCP 在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的 细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 NTCP 的蛋白质和 / 或基因表 达。 特征 vi) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示药物转运蛋白 MDR1 的蛋白质和 / 或基因表达。MDR1 代表多药抗性转运蛋 白 1， 并且是转运蛋白 ATP 结合盒 (ABC) 家族成员。MDR1 在调节药物、 肽和异生物质进入体 内的运输中以及在保护机体不受异生物质损伤和药物毒性中是重要的。MDR1 在体内位于 肝细胞朝向胆小管的顶侧上。在本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体 中的至少 5％， 例如至少 10％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 MDR1 的蛋白质和 / 或基因表达。
特征 vii) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明 的细胞群体中显示药物转运蛋白 MDR3 的蛋白质和 / 或基因表达。 MDR3 代表多药抗性转运蛋 白 3， 并且是转运蛋白 ATP 结合盒 (ABC) 家族成员。 MDR 3 是磷脂分泌到胆汁内必需的。 MDR 3 在体内位于肝细胞朝向胆小管的顶侧上。在本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细 胞的细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至 少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 MDR 3 的蛋白质和 / 或基 因表达。
特征 viii) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明 的细胞群体中显示药物转运蛋白 OCT-1 的蛋白质和 / 或基因表达。OCT-1 代表有机阳离子 转运蛋白 1。OCT-1 是主要肝转运蛋白， 其介导许多有机阳离子从血液摄取到肝脏内， 在其 中化合物可以代谢或分泌到胆汁内。OCT-1 在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在本发 明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 OCT-1 的蛋白质和 / 或基因表达。
特征 ix) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示药物代谢酶 GST A1-1 和 / 或 GSTM1-1 的蛋白质和 / 或基因表达。谷胱甘 肽转移酶 (GSTs) 催化异生物质与谷胱甘肽的缀合， 并且是 II 期解毒系统的重要部分。此
外， 在 17 种不同的人细胞溶质 GST 亚单位中分成命名为例如 A、 M、 P 和 S 的七个类别。GST A1-1 是在体内成年人肝脏中最丰富的亚单位。GST M1-1 也在成年人肝脏中表达， 而 GST P1-1 在胎儿肝脏中表达至更高程度。在本发明的一个实施方案中， 在包括肝细胞样细胞的 细胞群体中的至少 20％， 例如至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至 少 80％、 至少 90％或至少 95％细胞显示 GST A1-1 和 / 或 GST M1-1 的蛋白质和 / 或基因 表达。此外， GST A1-1 和 / 或 GST M1-1 的表达在特定情况下也可以由诱导剂诱导， 因此， 本发明还涉及这样的细胞群体， 其中在添加诱导剂后， 获得的至少 20％， 例如 30％、 40％、 50％或更多细胞表达 GST A1-1 和 / 或 GST M1-1 蛋白质。
此外， 细胞群体可以显示为展示 GST 酶促活性， 这可以是在细胞群体的裂解物 中 0.01μmol/ 分钟 /mg， 例如至少 0.03μmol/ 分钟 /mg、 至少 0.05μmol/ 分钟 /mg、 至少 1.0μmol/ 分钟 /mg、 至少 0.07μmol/ 分钟 /mg、 至少 0.09μmol/ 分钟 /mg、 至少 0.11μmol/ 分钟 /mg、 至少 0.13μmol/ 分钟 /mg 或至少 0.15μmol/ 分钟 /mg 蛋白质。在另一个实 施方案中， 本发明涉及这样的细胞群体， 其中 GST 酶促活性是在细胞群体的裂解物中至 少 0.4μmol/ 分 钟 /mg， 例 如 至 少 0.6μmol/ 分 钟 /mg、 至 少 0.8μmol/ 分 钟 /mg、 至少 1.0μmol/ 分钟 /mg、 至少 1.2μmol/ 分钟 /mg、 至少 1.4μmol/ 分钟 /mg、 或至少 1.6μmol/ 分钟 /mg 蛋白质。
特征 x) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示选自 CYP450s-1A1、 -1A2、 -1B1、 -2A6、 -2B6、 -2C8、 -2C9、 -2C19、 -2D6、 -2E1、 3A4、 -3A7 和 -7A1 的药物代谢酶中的至少 2 种， 例如至少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种、 至少 12 种或全部的蛋白质和 / 或基因表达。在本发明中， 至少 5％， 例如至少 10％、 至 少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％或至 少 95％获得的细胞显示上文提及的一种或多种 CYP 蛋白质的活性。此外， 在一个具体实施 方案中， 获得的至少 20％， 例如至少 30％、 至少 40％或更多细胞在添加诱导剂后可诱导表 达至少一种上文提及的 CYP 蛋白质。
CYP 代表细胞色素 P450， 并且是位于肝脏内质网中的一群酶。它们的作用是内源 化合物和异生物质的代谢和解毒。高浓度的这些酶可以在肝脏和小肠中发现， 但许多 CYPs 也在其他组织中发现。CYPs 可以通过许多机制包括抑制和诱导加以改变， 并且可以从人到 人不同。CYP 系统对于了解药物代谢、 药物相互作用和药物诱导的肝毒性是重要的。
特征 xi) 涉及在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的细胞百分比， 其在根据本发明的 细胞群体中显示药物代谢酶 UGT1A6 和 UGT2B7 中的至少一种的蛋白质和 / 或基因表达。 UGT 代表尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶， 并且是催化葡萄苷酸化活性的一群 II 期肝脏酶。在 本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的至少 5％， 例如至少 10％、 至 少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％或 至少 95％细胞显示 UGT1A6 和 / 或 UGT2B7 的蛋白质和 / 或基因表达。UGT 也可以通过使细 胞与诱导剂接触而诱导， 并且因此， 本发明还涉及如上所述的细胞组成， 其中在添加诱导剂 后可诱导 UGT 蛋白质的表达。
在本发明的一个实施方案中， 在包括 DE-Hep 细胞的细胞群体中的至少 10％， 例如 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 或至少 80％、 至少 90％ 或至少 95％细胞显示下述 CYP450s-1A1、 -1A2、 -1B1、 -2A6、 -2B6、 -2C8、 -2C9、 -2C19、 -2D6、 2E1、 -3A4、 -3A7 和 -7A1 中的至少 2 种， 例如至少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种、 至少 12 种或全部的蛋白质和 / 或基因表达。
在一个具体实施方案中， 在获得的细胞群体中的至少 20％细胞具有所述药物转运 蛋白特征 i-viii) 中的至少一种， 和所述药物代谢特征 ix-xi) 中的至少一种， 或获得的细 胞群体的至少 20％细胞具有所述特征中的至少 4 种， 例如至少 5 种、 至少 6 种、 至少 7 种、 至 少 8 种或至少 9 种或全部。
在本发明的一个具体实施方案中， 细胞组成包括共表达 CK18 和上文提及的一种 或多种 CYP 药物代谢酶， CYP2C8、 CYP2C9 和 CYP2C19 组合， 或 CYP3A4 和 CYP3A7 和 / 或 CYP7A1 组合的细胞。在一个具体实施方案中， 获得的至少约 5％， 例如 10％、 15％、 20％或更多细胞 共表达 CK18 和 CYP3A4 和 / 或 CYP3A7。
如上文中提及的， 本发明提供了衍生自 hBS 细胞的改良 DE-Hep 细胞和 DE-Hep 祖 细胞。改良 DE-Hep 细胞表达药物转运蛋白和 / 或代谢酶， 确保与体内使用相同药物转运蛋 白和代谢酶的肝细胞相似的药物摄取、 分泌和代谢。 因此， 所有这些特征的表达是关于在药 物开发和毒性测试中使用的细胞的所需特征， 因为它们针对药物和化学制品的反应预期类 似于在体内的肝细胞。
因此， 本发明中公开的 DE-Hep 细胞和 DE-Hep 祖细胞有利地用于多种研究目的， 例 如， 在药物开发过程中， 在用于研究药物转运蛋白的体外模型中， 在用于研究药物代谢酶的 体外模型中， 在用于研究肝生成例如早期肝生成的体外模型中， 在用于研究人肝再生障碍 的体外模型中， 用于体外肝毒性测试。
其他方面
由于药物转运蛋白和药物代谢酶的表达， 本发明的 DE-Hep 细胞和 DE-Hep 祖细胞 良好地适合于在医学产品中使用。因此， 在本发明中描述的细胞群体可以用于制造医学产 品用于预防和 / 或治疗由组织退化引起的病理状态和 / 或疾病， 例如肝脏组织退化， 肝脏病 症， 例如选自下述的肝脏病症 ： 自身免疫病症， 包括原发性胆汁性肝硬化 ； 代谢病症， 包括 血脂异常 ； 由例如酒精滥用引起的肝脏病症 ； 由病毒引起的疾病， 例如乙型肝炎、 丙型肝炎 和甲型肝炎 ； 由针对例如药学药物的急性中毒反应引起的肝脏坏死 ； 和在患有例如肝细胞 癌的患者中的肿瘤摘除， 和代谢病理状态和 / 或疾病。
此外， 根据本发明的 DE-Hep 细胞和 DE-Hep 祖细胞适当地用于筛选目的。例如， 细 胞可以在用于筛选化合物肝细胞毒性的方法中使用， 所述方法包括使来自根据本发明的细 胞群体的细胞暴露于化合物， 并且测定化合物对细胞是否是毒性的。细胞还可以在用于筛 选化合物调节肝细胞功能的能力的方法中使用， 其包括使来自根据本发明的细胞群体的细 胞暴露于化合物， 测定细胞中起因于与化合物接触的任何表型或代谢变化， 并且使变化与 调节肝细胞功能的能力关联。
对于在再生医学中的用途， hBS 细胞必须已衍生自无异物 hBS 细胞 ( 参见实施例 1)， 并且此外， 在分化、 解离和潜在传代培养过程中从未直接或间接暴露于非人动物衍生的 组分。这可以通过使用专一地人衍生组分例如重组培养基和添加剂来达到。
本发明在下述非限制性实施例和图中进一步举例说明。
图例
方法概述图 1a)。成为 DE-Hep 细胞的分化操作的示意性概述。分化方案分成 3 个主要阶 段。关于基本方案的原材料由在小鼠胚胎饲养者 (mEFs) 上未分化的 hBS 细胞组成。在阶 段 I 中， 从第 0 天时的活化素 A 添加开始， hBS 细胞经由中内胚层 (MesEnd) 诱导成定型内胚 层 (DE)。在阶段 II 中， DE 经由原肠诱导成早期肝脏内胚层或肝脏祖细胞 (DE-Hep 祖先 )。 在阶段 III 过程中， DE-Hep 祖先成熟为衍生自定型内胚层 (DE-Hep 细胞 ) 的功能肝细胞样 细胞， b) 作为参考实施例 2( 即方案 1) 的本发明的一个具体实施方案， 成为功能 DE-Hep 细 胞的分化操作的示意性概述。方案 2 至 4 是参考实施例 2 在本发明中体现的备选方案。原 材料的变化和 / 或在成为 DE-Hep 细胞的培养操作过程中的变化在实施例 1 和 2 中描述。
定型内胚层 (DE)
图 2。定型内胚层 (DE) 的形态 ； 在培养第 5 天、 阶段 I 时， 用于衍生 DE 的活化素 A 处理 hBS 细胞的相衬图像。
图 3。 证实定型内胚层的免疫染色 ； 通过活化素 A 诱导至定型内胚层的 hBS 细胞培 养物的 Sox17 免疫荧光分析。在用活化素 A4 天后， 绝大多数细胞是 Sox17 阳性和 Sox7 阴 性的。
图 4。图解显示在第 5 天时根据阶段 I 在生长因子的存在下培养的 DE 培养物 ( 参 见实施例 2)、 和对照培养物 ( 不含活化素 A 的固有分化培养物 ) 通过 Q-PCR 分析的 HNF3b、 Sox17、 Cxcr4 相对基因表达水平的代表性图。补充有活化素 A 和 FGF2 的培养物 ( 灰色柱 ) 与含活化素 A 的培养物 ( 黑色柱 ) 和不用补充剂衍生的对照培养物 ( 白色柱 ) 比较。
图 5。图解显示在第 5 天时根据阶段 I 培养的 DE 培养物 ( 参见实施例 2)、 和对照 培养物 ( 不含活化素 A 的固有分化培养物 ) 通过 Q-PCR 分析的 HNF4a、 α-1- 抗胰蛋白酶和 AFP 相对基因表达水平的代表性图。补充有活化素 A 和 FGF2 的培养物 ( 灰色柱 ) 与含活化 素 A 的培养物 ( 白色柱 ) 和不用补充剂衍生的对照培养物 ( 黑色柱 ) 比较。
图 6。 如 实 施 例 2、 阶 段 I 中 所 述， 与 B) 活 化 素 A+bFGF 处 理 的 hESC 培 养 物 (SA002p70n ＝ 7) 比较， 在 A) 活化素 A 中的基因表达 QPCR 分析的代表性图。在活化素和 bFGF 的存在下培养 5 天的 DE 培养物通过 QPCR 分析 SOX17、 SOX7、 AFP、 A1AT、 CXCR4、 FOXA2 和 CDX2 的相对基因表达水平。补充有活化素 A 和 bFGF/FGF2 的培养物 ( 条纹柱 ) 与含活 化素 A 的培养物 ( 灰色柱 ) 比较。用 SA002 p29 n ＝ 5 也产生了可比较结果。
图 7。所有小块都在 log2 尺度下用于显现关于所有样品的表达值。关于 OCT4 和 Nanog 的基因表达小块代表在这个实验中使用的所有未分化标记。为了检查培养物中的 DE 诱导， 分析 LEFTY1、 LEFTY2、 GOOSECOID、 SOX17、 HNF 3B、 CXCR4， 并且与固有分化培养物 (EE) 比较， 在活化素 A 和 bFGF 处理的培养物中都是上调的。同时与固有分化培养物比较， AFP 和 CDX2 在活化素 A 和 bFGF 处理的培养物中都是降低表达的。这产生活化素 A 和 bFGF 条 件培养基诱导来自 hBS 细胞的 DE。黑色箭头指向相关柱。
DE-Hep 祖先
图 8。来自阶段 II 的 DE 衍生的肝祖先 (DE-Hep 祖先 ) 的形态。培养物强烈响应 BMP4 暴露， 并且在阶段 II 培养基中 2 天后， 获得相当异质的群体， 在其中有许多上皮样细胞 类型。在阶段 II 培养基中另外 6-9 天后， 如图 6 中显示的， 出现第一批多边形形状的细胞， 其中某些是具双核的。
图 9a-h)。hBS 细胞衍生的 DE-Hep 祖先的 EpCAM 染色。a) 根据阶段 II 在第 8 天时的 DE 培养物， 用 EpCAM 抗体标记， b) 相应区域的相衬图像。DE 培养物强烈响应在阶段 II 中施加的生长因子， 并且先前的同质上皮细胞使形态改变成多边形形状的细胞 ( 也比较 7c))。
c-h)DE-Hep 祖先的 EpCAM 和 CK19 的形态和表达。c) 在第 17 天时包含多边形形 状细胞的 DE 培养物的相衬图像 ( 白色箭头指向 )， d) 用 EpCAM 抗体和在 e) 中用 CK19 抗 体标记的相应区域， f)EpCAM 和 CK19 的重叠 ( 在 d、 e 和 f 中的白色箭头显示某些双阳性细 胞 )。g) 在第 14 天时的 DE-Hep 细胞对于 CD54 是阳性的和， h)CK7。
图 10a-b)。在阶段 II/III 中衍生自 hBS 细胞的晚期 DE-Hep 祖先 / 早期 DE-Hep 细胞。a， b) 在阶段 II 培养基中在第 8 天时 DE-Hep 祖先的相衬图像， 从传代当天计数总共 培养 20 天。
功能 DE-Hep 细胞
图 11a-b)。衍生自 hBS 细胞和 c) 衍生自 SCED 细胞的 DE-Hep 细胞。a， b) 在阶段 II 培养基中在第 12 天时 DE-Hep 细胞的相衬图像， 从传代当天计数总共培养 23 天。a) 显 示概观照片和在 b) 中相应更高倍的放大。应当指出细胞以簇排列， 是具双核的并且显示肝 细胞样形态。c) 在培养第 33 天时， 在阶段 III 时衍生自 SCED 细胞的 DE-Hep 细胞的相衬图 像。应当指出白色箭头显示具有一般肝细胞样细胞形态的具双核的 DE-Hep 细胞。
图 12a-b)。 在 MEFs 上的 hBS 细胞的固有分化产生的肝细胞样细胞， 例如无特定补 TM 充剂加入培养基和很少的 VitroHES 培养基更换 ( 比较专利申请 WO2007/140968A1) 用作 对照。a) 肝细胞样细胞位于 hBS 细胞集落周围。b) 在这些条件下衍生的肝细胞样细胞的 特写显示细胞高度富含甘油三酯。
图 13a-g)。 在阶段 III 过程中 DE-Hep 培养物的 CYP 表达。 在阶段 III 时的 DE-Hep 细胞的免疫荧光标记显示强 CYP1A2 免疫反应性 a)， 而在对照培养 ( 固有分化 ) 中的肝细胞 样细胞显示较低的 CYP1A2 免疫反应性 ( 未显示 )， b)CYP1A2 和用 DAPI 的核复染。DE-Hep 细胞还显示 c)CYP3A4 免疫反应性， d) 核 DAPI 和 CYP3A4 的重叠。用 e) 使 CYP3A4、 CK18 和 DAPI 的在阶段 III 免疫荧光标记的相应 DE-Hep 细胞培养物更高倍放大会并成一个图， f) CYP3A4， 和 g)CK18。
图 14a-c)。在显示细胞的功能活性的 DE-Hep 细胞中的有机阴离子转运蛋白 MRP2 基因的免疫荧光分析。MRP2 免疫反应性在 DE-Hep 细胞中发现， 并且显示一般的表达模式， a) 显示形态的相衬图像， 和 b) 在阶段 III、 21 天时在 DE-Hep 细胞中的 MRP2 免疫反应性。 c) 在 1 小时温育后在 DE-Hep 细胞中的吲哚花青绿 (ICG) 摄取 ( 环绕区域 ) 的相衬图像。 接着过夜后清除。
图 15。在 DE-Hep 细胞中的糖原贮积显示细胞的功能性。在阶段 III 培养第 21 天 时， 在低 a) 和高放大率 b) 下 DE-Hep 细胞的相衬图像， 显示糖原贮积的暗区。应当指出 b) 中的某些细胞是具双核的且贮存糖原 ( 白色箭头 )。
图 16。在 DE-Hep 培养物中经由 CYP1A2、 CYP3A4 和 CYP2C9 的功能药物代谢和 CYP 表达的诱导性。
衍生自几个 hBS 细胞系的 DE-Hep 细胞、 从不同供体分离的人原代肝细胞和肝细胞 瘤细胞系 HepG2 就其代谢 CYP1A2 底物非那西丁、 CYP3A4 底物咪达唑仑和 CYP2C9 底物双氯 芬酸的能力进行分析。A) 在用不同 DE 方案衍生自不同 hBS 细胞系的 DE-Hep 培养物上的 CYP 活性测定 法的代表性结果。应当指出， 衍生自不同 hBS 细胞系的 DE-Hep 培养物在关于 CYP1A2、 3A4 和 CYP2C9 的代谢活性方面不同， 导致对于不同 hBS 细胞系一般的 CYP 活性谱。B) 此外， 来 自不同供体的人原代肝细胞显示 CYP 活性谱的高个体间变异， 类似于衍生自不同 hBS 细胞 系的 DE-Hep 培养物。肝细胞瘤细胞系 HepG2 主要显示 CYP1A2 活性。C， D) 在用 CYP 诱导 剂的混合物处理后， DE-Hep 培养物显示 CYP1A2 活性超过 3 倍的上调 (C)， 以及 CYP1A2mRNA 和 CYP3A4mRNA 水平的 3-4 倍增加 (D)。结果呈现为 nM 代谢产物 (B， C)、 log[nM 代谢产物 ] (A) 和 RNA 表达中的改变倍数 (D ； 未处理的 DE-Hep 培养物设为 1)。
图 17。 衍 生 自 DE 细 胞 的 DE-Hep 祖 先 的 形 态， 所 述 DE 细 胞 已 从 MEF 转 移 到 Matrigel 包被平板上。在阶段 II 培养基 ( 参见实施例 2) 的存在下， 细胞朝向肝祖细胞快 速分化以及增殖。在阶段 II 中第 16 天时， 许多细胞是 EpCAM、 CK7、 CK19 和 CD54 免疫阳性 的 ( 数据未显示， 关于在 DE-Hep 祖先中表达的标记比较表 2)。
图 18。在 DE-Hep 细胞中与人原代肝细胞和 HepG2 细胞的基因表达比较。关于进 一步细节参见实施例 13。
图 19。在 DE-Hep 培养物中的 II 期酶表达。hBS 细胞系 SA167、 SA002 和 SA461 就 II 期酶谷胱甘肽转移酶 GSTA1-1(A) 和磺基转移酶 SULT1E1(B) 的表达进行分析。 在未分化 的 hBS 培养物 ( 缩写为 UD) 中， 2 种 II 期酶的表达都很低， 并且随后在 DE-Hep 培养物 ( 缩 写为 DE) 和固有分化的 hBS 培养物 ( 缩写为 EE) 中， 在 hBS 细胞培养物的分化过程中上调。 hBS 细胞培养物在第 04、 10 和 20 天时进行分析。作为对照， 使用 HepG2 和培养的人原代肝 细胞 ( 铺平板且培养 48 小时 ； 缩写为 PPH)。
图 20。通过无饲养者的培养条件或通过延长培养期改善在 DE-hep 细胞中的 CYP2C9 mRNA 表达。在 SA002( 灰色柱 ) 和 SA348( 黑色柱 ) 中相对于看家基因 CREBBP 的 CYP2C9mRNA 表达。在 1 次实验中 3 次生物学重复， 除仅以一个重复完成的 42 天的 SA348 外。
图 21。 在衍生自 2 个不同方案的细胞中相对于看家基因 CREBBP 的白蛋白、 CYP1A2、 CYP2C9 和 CYP3A4 的 mRNA 表达水平 ： 我们的 DE-Hep 方案 ( 黑色柱 ) 和由 Cai 等人公开的 方案 ( 灰色柱 )。显示相对于 Cai 方案的表达水平。
图 22。 相应同种型用作对照用于单克隆抗体的非特异性结合 ( 图 22， A)。 约 33.5％ 的所有计数细胞 (DAPI) 在 DE-Hep 培养物对于是 CYP1A2 阳性的 ( 计数 4218 个细胞 )( 图 22， BI/II)。原代肝细胞由 52％ CYP1A2 阳性细胞组成 ( 计数 20000 个细胞 )( 图 22， CI/ II)。有趣的是， DAPI 谱描述了在 DE-Hep 和原代肝细胞中的单核、 双核和多核细胞 ( 图 22， B， C)。
图 23。在用活化素 A( 黑色柱 ) 或活化素 B( 灰色柱 ) 处理的 hESCs 中， 相对于看 家基因 CREBBP， 在定型内胚层中表达的基因 (Foxa2、 Sox17 和 CXCR4 ； DE) 或在胚外组织中 表达的基因 (Sox7、 CDX2 和 AAT ； ExE) 的 mRNA 表达。一次实验使用 5 次生物学重复。DE ＝ 定型内胚层， ExE ＝胚外组织。
材料与方法 方法 原材料合适的材料， 未分化的人胚泡衍生干细胞可以以在下述专利申请中详细描述的下 述 4 种不同方法获得 ；
1.hBS 细胞系建立和 LOT 制备 (WO03055992)
2.hBS 细胞转移至无饲养者的培养系统 (WO2004099394)
3. 无异物制备 (WO2007042225A3)
4. 酶促传代的 hBS 细胞 (WO07107303)
当 DE-hep 细胞用于治疗用途时， 无异物制备是特别重要的。
实施例
实施例 1
原材料
用于本发明的原材料适当地是多能未分化的 hBS 细胞， 例如未分化的 hBS 细胞 系。此种材料可以得自 Cellartis AB， www.cellartis.com。Cellartis AB 是全世界限定 hBS 细胞系的最大来源， 并且目前具有超过 30 种可用的 hBS 细胞系和亚克隆。2 种细胞系 在 National Institutes of Health(NIH)Human Embryonic StemCell Registry， http:// stemcells.nih.gov/research/registry/ 中列出， 并且 20 种在 UK Stem Cell Bank 中。 此外， Cellartis 可以提供由主要市场例如日本、 德国和法国批准用于研究用途的 hBS 细 胞系。对于本发明， 具体使用 hBS 细胞系 SA002、 SA002.5、 SA034、 SA167、 SA181、 SA348 和 SA461。推荐作为原材料的 hBS 细胞特征是下述 ： 对于碱性磷酸酶、 SSEA-3、 SSEA-4、 TRA 1-60、 TRA 1-81、 Oct-4 阳性、 对于 SSEA-1 阴性、 端粒酶活性、 以及在体外和体内的多能性 ( 后者通过在免疫缺陷小鼠中的畸胎瘤形成显示 )。( 方法和方案如先前显示的， Heins 等 人， WO03055992。)
LOT 制备和表征程序
hBS 细胞系的 LOT 制备构成 hBS 细胞在培养中的扩增和在单次传代中后续冷冻超 过 100 根吸管， 根据标准化方法 ( 未决专利， WO2004098285)。在冷冻前和后以及在细胞从 LOT 解冻后在后续培养中的连续传代中监控 hBS 细胞系的形态。通过检查解冻恢复率验证 LOT 冷冻的质量， 所述解冻恢复率应对于解冻的 10 根中的每一根吸管显示 100％的解冻率， 即细胞材料可以在解冻后从每个个别玻璃化的吸管传代培养。 随后对在冷冻传代中的细胞 和培养基执行关于微生物安全性的安全性测试， 以确保细胞不含污染。执行的表征程序包 括广泛范围的方法， 以验证 hBS 细胞系的分化状态。首先， 执行关于未分化细胞的通常公认 标记的标记表达分析 (SSEA-1、 SSEA-3、 SSEA-4、 TRA-1-60、 TRA-1-81、 Oct-4 和 ALP)。通过 核型分析和 FISH 检查细胞在传代和冻 - 融循环自始至终的遗传稳定性。使用 Telo TAGGG Telomerase PCRELISAPLUS 试剂盒测量端粒酶活性。通过体外分化经由胚状体步骤且通过体 内分化通过将 hBS 细胞移植在免疫缺陷 SCID 小鼠的肾囊下检查 hBS 细胞的多能性。
此外， 本文使用的原材料可以是完全无异物衍生的， 由此可以获得完全无异物的 肝细胞样细胞用于在再生医学中的潜在转移， 并且因此显著减少移植物排斥的风险和非人 病原体的潜在转移。对于 hBS 细胞的无异物衍生， 使用的所有培养基和基质组分、 饲养细胞 和其他材料可能不衍生自任何非人动物材料或与任何非人动物材料接触。用于 hBS 细胞和 进一步无异物肝细胞样细胞的无异物衍生的合适组分是无异物衍生的人成纤维细胞， 例如 人包皮成纤维细胞 (HFF)， 含人重组生长因子、 分化因子和 / 或潜在的其他添加剂的无血清或基于人血清的培养基， 和人重组酶或用于细胞解离和繁殖的无菌机械工具。
此外， 用于衍生 DE-Hep 细胞的原材料是在饲养细胞例如小鼠胚胎成纤维细胞或 人包皮成纤维细胞或在无饲养者的系统中在例如 Matrigel 或 Collagen 等表面上的 hBS 细 胞。在实验前和 / 或在实验过程中在相同种类的基质或不同基质和相同种类的培养基或不 同培养基上， hBS 细胞可以进行酶促和 / 或手工传代。
实施例 2
使未分化的 hBS 细胞诱导成 DE 且进一步成为功能肝细胞
在体外维持且繁殖未分化的 hBS 细胞。在传代后第 4-7 天时， 根据基本分化程序 处理未分化的 hBS 细胞集落。这个方案中的每个步骤的特征在于决定性的关键组分 ；
阶段 I， 定型内胚层 (DE) ： 低血清和活化素 A
阶段 II， DE-Hep 祖细胞 ： 蛋白质 TGFβ 超家族成员， 特别是 BMP4
阶段 III， 功能 DE-Hep 细胞 ： HGF
已测试了生长因子暴露时间、 浓度、 它的各种组合和处理长度中的变化
基本方法和变化的概述呈现于图 1a 中。通过在 RPMI Advanced 培养基或 DMEM 培 养基或可比较培养基 ( 阶段 I， 第 0 天 ) 中与活化素 A(100ng/ml) 一起温育 3-5 天， 使未分 化的 hBS 细胞诱导为 DE。培养基每天进行更换。活化素 A 诱导的第一天， 血清浓度是零， 并 且培养基补充有或没有 Wnt3A(25ug/ml) 和 / 或 FGF2。从阶段 I 的第二天开始， 培养基补 充 0.2％ FCS、 活化素 A 和 / 或 FGF2。在活化素诱导后， 使细胞在其条件培养基中温育另外 1-3 天， 而无培养基更换， 这之后阶段 II 开始 ( 基本方案的变化 )。在阶段 II 过程中， 细胞 在 RPMIAdvanced 培养基或 DMEM 培养基或可比较培养基中温育， 所述培养基在顺次步骤中 补充有 BMP4 和 FGF2 和 / 或不同浓度的 aFGF、 bFGF、 BMP2 和 HGF( 参见基本方案的变化， 图 1a)。培养基每天至每隔一天进行更换。在阶段 III 过程中， 使 DE 衍生的肝细胞 (DE-Hep 细胞 ) 成熟。
阶段 I ： 分化成定型内胚层
先前已显示在暴露于定义明确的生长因子 ( 活化素 A) 后， hBS 细胞可以分化成定 型内胚层细胞类型。 在本发明中， 几种细胞系 (SA001、 SA002、 SA002.5、 SA034、 SA167、 SA181、 SA348 和 SA461) 已通过生长因子 (GFs) 诱导， 以经由定型内胚层 (DE) 产生肝细胞， 这随后 称为 DE-Hep 细胞。我们的策略涉及模拟肝脏发育中的重要步骤的 3 个分化阶段， 如下所 述。在第一个分化阶段中 ( 阶段 I， 参见图 1a)， 活化素 A 诱导 hBS 细胞成为 DE， 这花费 1 至 5 天。在阶段 II 中， 通过 BMP4 和 / 或其他因子诱导早期肝脏细胞类型， 并且这些早期肝脏 细胞扩增且成熟。在最后一个阶段中， 阶段 III， 通过 HGF、 OSM、 DEX 达到终末成熟， 共高达 数天 ( 图 1a)。
使用活化素 A 以及活化素 A 与 Wnt3a 和 / 或 FGF2 组合以产生 DE。在阶段 1 中 4 至 5 天后， hBS 细胞集落分化， 并且使用定量实时实时 PCR(Q-PCR) 检查关于早期 DE 的遗传 标记。在第 3 至 5 天时， 活化素 A 诱导强早期内胚层波， 并且通过 Sox17、 HNF3β(HNF3b 或 HNF3b) 和 Cxcr4 表达的高表达水平突出 ( 图 4)， 并且随后减少至接近基线水平 ( 数据未显 示 )。 有趣的是， 与单独的活化素 A 比较， 活化素 A 和 FGF2 的组合产生 Sox17( 高超过 2 倍 )、 HNF3b( 高超过 1.5 倍 ) 和 Cxcr4( 高将近 1.5 倍 ) 的更高表达 ( 图 4)。未处理的 hBS 细胞 具有比生长因子处理的培养物明显更少的 Sox17、 HNF3b 和 Cxcr4。此外， 对照培养物具有明显更少的 Sox17、 HNF3b 和 Cxcr4 基因表达。此外， 它们上调早期肝脏标记如 AFP 或 AAT。 在分化和发育的这个早期阶段时， 这指示在固有分化集落中胚外内胚层 (ExE) 的存在 ( 图 5 和 10)。表达数据通过 Sox17/Sox7、 Sox17/Cxcr4、 Sox17/Oct4、 Sox7/HNF3b 的共染色加以 证实 ( 数据未显示 )。在活化素 A 中 4 天后， 超过 70％的其余细胞是 Sox17 阳性， 并且仅发 现少数是 Sox7 或对于 HNF3b 和 Oct4 是双阳性的。在活化素 A 处理后的基因表达改变与集 落的形态改变和不同的分化模式相关 ( 图 2)。在用含活化素 A 培养基诱导 4 至 5 天后， 细 胞集合在一起， 并且在集落周围形成上皮细胞环。 这些同质生长的细胞扩展跨过平板， 并且 可以传代给包含小鼠饲养细胞的平板和 / 或其他基质。这些发现一起显示在暴露于活化素 A 后， 本文使用的所有细胞系都能够分化成定型内胚层细胞类型。此外， 早期出现的高 AFP 表达水平指示未处理的固有分化的 hBS 细胞培养物主要产生胚外内胚层 (ExE)。参见图 4 和 5、 实施例 5。
阶段 II ： 肝诱导
在阶段 II 中 ( 图 1)， 使细胞暴露于生长因子组合以诱导肝脏发育。 培养物强烈响 应生长因子添加的培养基， 并且形成以小簇成群的同质上皮细胞。 在更多天后， 相当异质的 肝脏样细胞群体发展， 在其中许多细胞类型以簇集合在一起 ( 图 6)。此外， 在第二个阶段 中， 在 6-9 天后 ( 在通过活化素 A 诱导后 )， 出现具有少数具双核的细胞的第一批多边形形 状的细胞 ( 图 6)。
通过基因表达分析评估这些形态改变是否与在分子水平上的不同分化模式相关。 通过 Q-PCR 分析整个切断的集落， 显示在两者中， 对照与生长因子诱导的培养物一样， 可以 检测出早期肝脏标记 AFP、 HNF4a、 HNF3b、 白蛋白、 CK7、 CK8、 CK18、 CK19 和 HNF1a 的表达。在 暴露于肝脏特异性因子后 ( 阶段 II)， 与对照培养物比较， 肝脏标记的水平明显更高。
为了支持通过 Q-PCR 获得的发现， 执行免疫组织化学分析。对照以及阶段 II 培养 物都表达早期肝脏标记。
阶段 III ： 肝成熟
在阶段 III 中， 培养物随后更换成包含 HGF、 FGF2 和 FGF1 的培养基 2-3 天。在方 案 1， 本发明的一个具体实施方案中 ( 图 1b)， 培养基在阶段 II 过程中更换成包含不同浓 度的 aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4、 HGF 且含 0.2％血清的不同培养基。在这些阶段时， 出现许多 DE-Hep 细胞， 并且显示具有多边形形状、 包含具有核仁的特征性核的一般肝细胞形态。 有趣 的是， 在中至晚期阶段 II 时开始， 它们以小岛样簇排列 ( 图 6 和 9)。
在阶段 III 过程中， 细胞在 HCM 培养基中进一步培养用于成熟。在这个阶段时， 切 断整个集落且通过 Q-PCR 进行分析。结果显示与固有衍生的肝细胞样细胞比较， 肝细胞标 记 ( 白蛋白、 CYP3A4 和 UGT2B7) 的表达明显上调。在 2 个方案中在末期时的免疫染色显示 许多 DE-Hep 细胞对于是 CYP1A2、 CYP3A4/7、 CK18、 CK8、 CK19 和 HNF4α 阳性的 ( 表 2)。有 趣的是， 可以在 DE-Hep 培养物而不是未处理的对照培养物中检测出极化转运蛋白 MRP2 的 表达。对照培养物是固有分化的细胞， 参见定义。
本发明的一个具体实施方案， 方案 1 ：
下述具体条件在这个具体实施方案， 方案 1 中使用， 参见图 1b。
阶段 I ： DE 诱导
通过补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax 和 FGF2(4 或 5ng/ml) 且另外具有下述的 RPMI高级培养基或 DMEM 培养基或可比较培养基中培养在阶段 I 中诱导定型内胚层 ；
第1天： 活化素 A、 Wnt3A(100ng/ml、 25ng/ml)0％ FCS
第2天： 活化素 A(100ng/ml)0.2％ FCS
第3天： 活化素 A(100ng/ml)0.2％ FCS
第4天： 活化素 A(100ng/ml)0.2％ FCS
细胞无需培养基更换培养 2-3 天。该方案使培养基补充剂活化素 A 和 bFGF 组合。
阶段 II ： DE-Hep 祖先扩增
对于 DE-Hep 祖先的衍生和扩增， 使用补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax 且另外具有 下述的 RPMI 高级培养基或 DMEM 培养基或可比较培养基 ；
第 5 天： aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4( 分 别 为 100ng/ml、 5ng/ml、 50ng/ml、 200ng/ ml)0.2％ FCS。
第 6 天： aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4( 分 别 为 100ng/ml、 5ng/ml、 50ng/ml、 200ng/ ml)0.2％ FCS。
第7天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS。
第8天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS。
第9天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS。
DE-Hep 祖先在阶段 II 培养基中从第 9 天培养直到第 20 天， 伴随每隔一天的培养 基更换。相对高的 HGF 浓度 (100-200ng/ml) 用于第一天。
任选地 ；
第6天： BMP4(50ng/ml)、 FGF2(4ng/ml)、 0.2％ FCS，
第7天： BMP4(50ng/ml)、 FGF2(4ng/ml)、 0.2％ FCS
第 8-9 天 ： FGF1(50ng/ml)、 FGF2(4ng/ml)、 1％ FCS
第 10 天 ： HGF、 FGF2( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml)、 1％ FCS
第 11-13 天 ： HGF、 FGF2、 EGF( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml、 10ng/ml)、 1％ FCS
考虑到在第 11 至 13 天时较高的 FCS 浓度和 EGF(10ng/ml) 的补充， 每天更换 50％ 的培养基。
阶段 III ： DE-Hep 成熟
对于衍生自定型内胚层 (DE-Hep 细胞 ) 的肝细胞成熟， 使用基于 Williams E 的培 养基或 HCM 培养基或可比较培养基， 并且补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax， 并且在第 10 天时 -7 另外具有 ： OSM、 Dex、 ITS 混合物、 BMP4、 HGF( 分别为 10ng/ml、 10 M、 1x、 200ng/ml、 50ng/ml)、 0％ FCS。直至第 15 天时， 培养基每天进行更换。
高 HGF 浓度 (100-200ng/ml) 用于长于 6 天的温育。使用高浓度的地塞米松 (Dex) (100μm)。在第 15 天后， 使用补充有丁酸钠、 HGF( 分别为 2.5mM， 2.5ng/ml) 和 0％ FBS 的 基于 Williams E 的培养基 (1％ PEST， 1％ Glutamax)。从第 16 到 21 天每隔一天更换培养 基。
本发明的一个具体实施方案， 方案 2 ：
下述具体条件在这个具体实施方案， 方案 2 中使用， 参见图 1b。
阶段 I ： DE 诱导
通过补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax、 bFGF(4 或 5ng/ml) 且另外具有下述的 RPMI高级培养基或 DMEM 或可比较培养基中培养在阶段 I 中诱导定型内胚层 ；
第1天： 活化素 A(100ng/ml)0％ FCS
第 2-3 天 ： 活化素 A(100ng/ml)0.2％ FCS
细胞无需培养基更换培养 2 天。该方案使培养基补充剂活化素 A 和 bFGF 组合。
阶段 II ： DH-Hep 祖先扩增
对于 DE-Hep 祖先的衍生和扩增， 使用 HCM 培养基 ( 在某些情况下， 省去 HCM- 抗生 素混合物 GA1000) 或基于 Williams E 的培养基或可比较培养基， 并且补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax 且另外具有 HGF(20ng/ml) 和 0％ FCS。
第 6-12 天 ： HGF(20ng/ml)0％ FCS
DE-Hep 祖先在阶段 II 培养基中从第 6 天培养直到第 12 天， 伴随每 2-3 天的培养 基更换。
阶段 III ： DE-Hep 成熟
对于衍生自定型内胚层 (DE-Hep 细胞 ) 的肝细胞成熟， 使用 HCM 培养基 ( 在某些情 况下， 省去 HCM- 抗生素混合物 GA1000) 或基于 Williams E 的培养基或可比较培养基， 并且 -7 补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax， 并且在第 13 天时另外具有 ： OSM、 Dex(10ng/ml、 10 M)、 0％ FCS。每 2-3 天更换培养基。DE-Hep 细胞在这种培养基中培养最少 22 天且直至 35 天。 在某些情况下， 在分析 DE-Hep 培养物的最后数天或最后一周过程中省去 EGF 或抗 坏血酸， 并且观察到对细胞成熟和功能性的正面作用。不含 EGF 和抗坏血酸， 增殖不再受刺 激， 相反这导致增加的成熟。
本发明的一个具体实施方案， 方案 3 ：
下述具体条件在这个具体实施方案， 方案 3 中使用， 参见图 1b。
阶段 I ： DE 诱导
通过补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax、 bFGF(4 或 5ng/ml) 且另外具有下述的 RPMI 高级培养基或 DMEM 或可比较培养基中培养在阶段 I 中诱导定型内胚层 ；
第1天： 活化素 A(100ng/ml)0％ FCS
第 2-3 天 ： 活化素 A(100ng/ml)0.2％ FCS
细胞无需培养基更换培养 2 天。该方案使培养基补充剂活化素 A 和 bFGF 组合。
阶段 II ： DE-Hep 祖先扩增
对于 DE-Hep 祖先的衍生和扩增， 使用 HCM 培养基 ( 在某些情况下， 省去 HCM- 抗生 素混合物 GA1000) 或基于 Williams E 的培养基或可比较培养基， 并且补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax 且另外具有下述。
第 6-9 天 ： FGF4、 BMP2( 分别为 30ng/ml、 20ng/ml)0％ FCS
第 10-15 天 ： HGF(20ng/ml)0％ FCS。
DE-Hep 祖先在阶段 II 培养基中从第 6 天培养直到第 15 天， 伴随每 2-3 天的培养 基更换。
阶段 III ： DE-Hep 成熟
对于衍生自定型内胚层 (DE-Hep 细胞 ) 的肝细胞成熟， 使用 HCM 培养基 ( 在某些情 况下， 省去 HCM- 抗生素混合物 GA1000) 或基于 Williams E 的培养基或可比较培养基， 并且 -7 补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax， 并且在第 16 天时另外具有 ： OSM、 Dex(10ng/ml、 10 M)、 0％FCS。每 2-3 天更换培养基。DE-Hep 细胞在这种培养基中培养最少 22 天且直至 35-40 天。
在某些实验中， 在分析 DE-Hep 培养物的最后数天或最后一周过程中省去 EGF 或抗 坏血酸， 并且观察到对细胞成熟和功能性的正面作用。不含 EGF 和抗坏血酸， 增殖不再受刺 激， 相反这导致增加的成熟。
本发明的一个具体实施方案， 方案 4 ：
下述具体条件在这个具体实施方案， 方案 4 中使用， 参见图 1b。
阶段 I ： DE 诱导
通过补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax 且另外具有下述的 RPMI 高级培养基或 DMEM 或可比较培养基中培养在阶段 I 中诱导定型内胚层 ；
第1天： 活化素 A(100ng/ml)0％ FCS
第 2-3 天 ： 活化素 A、 FGF2( 分别为 100ng/ml， 4ng/ml)0.2％ FCS
第 4-5 天 ： 活化素 A、 FGF2( 分别为 100ng/ml， 4ng/ml)1％ FCS
每天更换 50 或 100％培养基。该方案使培养基补充剂活化素 A 和 bFGF 组合。
阶段 II ： DE-Hep 祖先扩增
对于 DE-Hep 祖先的衍生和扩增， 使用 RPMI 高级培养基或 DMEM 或或可比较培养 基， 并且补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax 且另外具有下述 ；
第 6-7 天 ： BMP4、 FGF2( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml)0.2％ FCS。
第 8-9 天 ： aFGF、 FGF2( 分别为 50ng/ml、 4ng/ml)1％ FCS。
第 10-12 天 ： HGF、 FGF2、 EGF( 分别为 50ng/ml、 2ng/ml、 10ng/ml)1％ FCS。
DE-Hep 祖先在阶段 II 培养基中从第 6 天培养直到第 12 天， 伴随每 1-3 天 50 或 100％的培养基更换。
阶段 III ： DH-Hep 成熟
对于衍生自定型内胚层 (DE-Hep 细胞 ) 的肝细胞成熟， 使用 HCM 培养基 ( 在某些 情况下， 省去 HCM- 抗生素混合物 GA1000) 或基于 Williams E 的培养基或可比较培养基， 并 且补充有 1％ PEST、 1％ Glutamax， 且另外具有下述 ；
第 13-14 天 ： OSM、 ITS 混合物、 HGF( 分别为 10ng/ml、 1x、 50ng/ml)、 0％ FCS
第 15-26 天 ： OSM、 ITS 混合物、 HGF、 Dex( 分别为 10ng/ml、 1x、 50ng/ml、 10-7M)、 0％ FCS
每 1-3 天更换 50 或 100％培养基。
在某些实验中， 在分析 DE-Hep 培养物的最后数天或最后一周过程中省去 EGF 或抗 坏血酸， 并且观察到对细胞成熟和功能性的正面作用。不含 EGF 和抗坏血酸， 增殖不再受刺 激， 相反这导致增加的成熟。
实施例 3
定型内胚层的形态， 阶段 I
活化素 A 处理与集落的形态改变和不同的分化模式相关。在通过含活化素 A 培养 基处理 3-5 天后， 细胞集合在一起， 并且在集落周围形成上皮细胞环 ( 图 2)。 这些同质生长 的细胞扩展跨过平板， 并且可以传代给包含小鼠饲养层的平板。
实施例 4
用免疫细胞化学和定量分析表征定型内胚层在早期分化阶段时， Sox7 可以视为关于胚外内胚层 (ExE) 的标记， 并且在定型内 胚层 (DE) 中不表达 (D′ Amour 等人， 2006)。Sox17 阳性细胞存在于 ExE 和 DE 中。这暗示 Sox17+/Sox7- 细胞具有 DE 起源。执行用 Sox7 和 Sox17 的免疫染色， 以证实 DE-Hep 细胞 已由定型内胚层产生。用活化素 A4 天后， 绝大多数细胞是 Sox17 阳性和 Sox7 阴性的 ( 图 3)。
活化素 A 诱导通过 Sox17+/Sox7- 组合检测出的定型内胚层， 活化素 A 或活化素 A/ FGF2 处理的培养基中 80-90％的总细胞估计是 Sox17 阳性且对于 Sox7 阴性的 ( 显微镜中 的人工计数 )。对照培养物主要诱导其为 Sox17/Sox7 阳性的胚外内胚层。
实施例 5
通过定量实时 PCR 的定型内胚层的基因表达
为了研究在不同细胞类型中的基因表达水平， 使用 TaqMan 低密度阵列 (384- 孔 Micro Fluidic Cards， Applied Biosystems)。对于比较， 平行分析来自胎儿肝脏、 人成年 肝脏、 铺平板的人原代肝细胞、 新鲜分离的人原代肝细胞和 HepG2 的商购可得的总 RNA。使 用 Superscript 3( 目录号 18080-051 Invitrogen) 执行 cDNA 分析。相对基因表达水平针 对 CREBBP 的表达进行标准化。
在补充有活化素 A 的培养基中诱导 5 天的 hBS 细胞的 Q-PCR 分析显示 8 种基因的 表达水平。 活化素 A 诱导强早期内胚层波， 并且通过 Sox17、 HNF3b 和 Cxcr4 的高表达水平突 出。 有趣的是， 与单独的活化素 A 比较， 活化素 A 和 bFGF 产生 Sox17、 HNF3b 和 Cxcr4 的更高 表达。 未处理的 hBS 细胞具有比生长因子处理的培养物明显更少的 Sox17、 HNF3b 和 Cxcr4。 此外， 对照培养物 ( 固有分化 ) 具有明显更少的 Sox17、 HNF3b 和 Cxcr4 基因表达， 加上早 期肝脏标记如 AFP 和 A1AT 的上调。在分化和发育的这个早期阶段时， 这指示在固有分化集 落中胚外内胚层的存在。CXCR4 在中胚层和定型但不在原始内胚层中表达 [McGath KE. 等 人 Embryonic expression and function of the chemokine SDF-1 and its receptor， CXCR4.Dev.Biol.213 ： 442-45(1999)]， 并且因此与 Sox17 和 / 或 HNF3b 组合是关于 DE 的 极佳标记。Sox17 和 HNF3b 是关于早期定型和原始内胚层的 2 种标记。TGFβ 超家族成员 Noda1 是在小鼠中的原肠胚形成过程中内胚层指定所需的。高水平的 Noda1 信号指定定 型内胚层， 并且较低水平的 Noda1 信号指定中胚层 [Lowe， LA.， Yamada， S.， Kuehn， N.R.， Genetic dissection of noda1 functionin patterning the mouse embryo.Development 128， 1831-1843(2001) ； Brennan， J. 等人 Nodal signalong in the epiblastpatterns the early mouse embryo.Nature 411， 965-969(2001)]。活化素也是 TGFβ 家族成员， 并且与 和 Noda 1 相同的受体结合 ( 除共受体 cripto 外 )， 触发与 LEFTY1 和 LEFTY2 诱导相似的 细胞内信号事件 [de Caestecker， M.The transforming growth factor-betasuperfamily of receptors.Cytocine Growth Factor Rev.15， 1-11(2004)]， 并且因此可以用于在体外 模拟 Noda1 活性。关于基因表达数据， 参见图 4 和 5。
通过 QPCR 在几个实验中更广泛显示进一步证据， 与单独的活化素 A 比较， 活化素 A 和 bFGF 的组合产生 DE 标记的更高表达和胚外内胚层标记的更低表达 (SA002 p70n ＝ 7， SA002p29n ＝ 5)( 图 6)。与单独的活化素 A 比较， Sox17、 HNF3B/HNF3b 和 CXCR4 在活化素 A 和 bFGF 处理的培养物中全都明显更高。与单独的活化素 A 比较， DE 细胞数目在活化素 A 和 bFGF 处理的培养物中更高 ( 图 6)。与活化素 A 和 bFGF 处理的培养物比较， 活化素 A 处理的培养物具有胚外内胚层标记 AFP、 A1AT 和 CDX2 的更高表达， 显示与单独的活化素 A 比 较， 活化素 A 与 bFGF 组合产生更定型的内胚层。关于基因表达数据， 参见图 6。
实施例 6。
总体基因表达 ： DE 与 EE 诱导的肝细胞比较
用于一种基因的几种探针
一种探针代表特定 mRNA 转录物 ( 剪接变体 )， 并且这些转录物可以显示完全不同 的表达谱。因为这是关于转录水平的数据， 所以当对蛋白质表达作图时， 它有时引起混乱。 为了了解何种剪接变体编码目的蛋白质， 可以使用不同策略 ： 1) 可以选择具有最高表达的 变体 ； 2) 可以计算平均值 ； 3) 可以选择预期表达谱的 “生物学” 解释。如果基因是众所周知 的， 那么已使用第三种备选方案。关于了解较少的基因， 已使用第一种策略。每个探针具有 指示探针如何特异的标记。探针名称包括在图表中的左侧上。关于缺乏非常特异的探针的 基因， 已显示最特异的可用探针。小于 1 的值在 log2 范围中是负值， 参见下表。
Log2 值 -3 -2 -1 0 2 3 4 8 10 13 15 20
正常值 0.125 0.25 0.5 1 4 8 16 256 1024 8192 32768 1,048,576使用使光刻法和固相化学组合的技术制造 GeneChip 探针阵列。以这种方式， 产生包含以极高密度包装的成百上千种寡核苷酸探针的阵列。目前， Affymetrix 提供GeneChips 用于监控基因在酵母、 拟南芥属、 果蝇、 小鼠、 大鼠和人中的总体活性。为了补充 总体能力， 可以使用 QPCR， 因为这种方法更加灵敏。相对基因表达水平针对 CREBBP 的表达 进行标准化。 分析下述基因以表征未分化的细胞 ： POU5F1(Oct-4)、 NANOG、 GDF3、 GAL、 LECT1、 FOXH1、 CER1、 DNMT3B、 DPPA5、 FOXD3、 TERT、 TERF1、 TDGF1///TDGF3、 SOX2、 PODXL 和 LIN28。 所有这些基因在暴露于活化素 A 和 bFGF 共 5 天的培养物中急剧减少。图 7 显示关于 OCT4 和 Nanog 的表达但所有其他标记都具有相同谱。分析下述基因以表征 DE 细胞 ： LEFTY1、 LEFTY2、 BRA、 AFP、 SOX7、 SOX17、 SERPINA1(A1AT)、 HNF4α、 GOOSECOID、 HNF3B、 CXCR4、 CDX2， 其中某些在图 7 中标绘。可以清楚看出 LEFTY1、 LEFTY2、 GOOSECOID、 SOX17、 HNF3B、 CXCR4 全部在用活化素 A 和 bFGF 处理 5 天后的培养物中上调。 这不如对照培养物中一样清楚 ( 固 有分化， EE)。参见图 7。来自这个实验的结果概括在图 7 中。选择基因实验对象组以区分 定型和胚外内胚层。
阵列实验和数据分析的描述
使用 3 种细胞系 SA167、 SA002 和 SA461。实验设置如下 ： 未分化的 hBS 细胞 (UD)、 在第 5 天时的定型内胚层 (DE5)、 在第 5 天时的固有分化的 hBS 细胞 (EE5)、 在第 10 天时的 DE 诱导的肝细胞祖先 (DE10)、 在第 10 天时的固有分化的 hBS 细胞 (EE10)、 在第 20 天时的 DE 诱导的肝细胞 (DE20)、 在第 20 天时的固有分化的 hBS 细胞 (EE20)。作为对照， 使用胎儿 肝脏 (FL)、 成年肝脏 (AL)、 铺平板的原代肝细胞 (PH) 和新鲜的原代肝细胞 (FPH) 和 HepG2。
使用 Agilent Bioana lyzer 测试通过体外转录标记的 RNA 和 cDNA 的质量。断裂 的 cDNA 在 45℃下与 GeneChip Human， HGU 133 Plus 2.0(Affymetrix， Santa Clara， CA) 杂交 16 小时。每种样品以生物学一式两份与阵列杂交 ( 对于每种样品 2 个阵列 )。关于数 据提取， 使用 MAS5 软件 (Affymetrix， Santa Clara， CA)， 并且数据进行中值标准化和 log2 转化用于后续数据分析。所有图表在 log2 尺度中。
通过用于分析 DE 细胞的良好质量的多种标记分析在活化素 A 和 bFGF 的存在下 hBS 细胞衍生的 DE 富集培养物的产生。因此， 我们显示已从 hBS 细胞制备 DE 而不是原始内 胚层。我们的数据还显示与仅给予活化素 A 的培养物比较， 与活化素 A 连同 bFGF 一起培养 的 hBS 细胞产生更多 DE 细胞。
实施例 7
DE-Hep 祖细胞的形态
培养物强烈响应在阶段 II 中的因子 ( 关键组分 BMP4)， 并且先前的同质上皮细胞 以小簇成群。在再多 2 天后， 获得相当异质的群体， 在其中有许多上皮样细胞类型。此外， 在第二阶段中， 在 6-9 天后， 出现含有少数具双核的细胞的第一批多边形形状细胞 ( 图 8)。 这些细胞通常定位接近于成纤维细胞样细胞的三维脊 ( 图 8)。
实施例 8
用免疫细胞化学表征 DE-Hep 祖细胞
通过免疫荧光标记证实 DE-Hep 祖先群体。参见概括来自阶段 II 的早期 DE-Hep 祖细胞通过免疫细胞化学标记的分析的表 2， 也描述于图 8 和实施例 7 中。DE-Hep 祖细胞 通常在具有表达 EpCAM 的细胞的区域中发现， 图 9。
表2： 对 DE-Hep 祖先的免疫细胞化学分析 ( 阶段 II)。
47102083967 A CN 102083975说抗体 EpCAM HNF4a HNF3b HNF1 CK8 CK18 CK19 结蛋白 ICAM-1(CD54) c-kit CD133明书DE-Hep 祖细胞 ( 阶段 II) +(subpop.) + + + + + + +(subpop.) +(subpop.) +(subpop.) +(subpop.)41/67 页实施例 9
DE-Hep 祖先的基因表达
使用 NanoDrop ND-1100 测定样品的 RNA 浓度。在逆转录中使用来自不同样品的 相同量 RNA， 所述逆转录一式两份地进行以产生 cDNA。作为关于基因组 DNA 量的对照， 执行 在其中不添加逆转录酶 (RT) 的 NoRT 对照。NoRT 对照中的信号反映基因组 DNA 的量。对 来自一式两份样品和 NoRT 对照的 cDNA 执行基因的 qPCR。使用的测试法是 ： HNF3b、 HNF4a、 EpCAM、 AFP、 AAT、 结蛋白、 CD133、 Notch2、 ICAM-1、 CK7、 CK18 和 CK19。
分析 ： 计算相对量， 假定 90％ PCR 功效和使具有最低表达水平的样品设为值 1。随 后可以直接比较且标绘其他样品。
实施例 10
DE-Hep 祖先的扩增和培养
对于 DE-Hep 祖细胞的扩增和纯化， 在阶段 II 第 5 天时 ( 方案 1 和 4) 用 0.2％胰 蛋白酶 -EDTA 酶促处理或人工切断培养物， 并且转移至 Matrigel 包被的组织培养平板用于 根据下文描述的方案重新铺平板。 对于 DE-Hep 祖先的 Matrigel 培养， 使用 RPMI Advanced 培养基或 DMEM， 并且补充有 1％ PEST， 1％ Glutamax 且另外具有 ；
第5天 ： aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4( 分别为 100ng/ml、 5ng/ml、 50ng/ml、 200ng/ml)5％ FCS ；
第 6 天： aFGF、 bFGF、 BMP2、 BMP4( 分 别 为 100ng/ml、 5ng/ml、 50ng/ml、 200ng/ ml)0.2％ FCS ；
第7天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS ；
第8天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS ；
第9天： bFGF、 BMP4、 HGF( 分别为 50ng/ml、 200ng/ml、 50ng/ml)0.2％ FCS ；
进一步成熟为 DE-Hep 细胞如实施例 2 中执行。DE-Hep 祖细胞也可以通过胶原酶 IV 切断， 并且在 MEF 包被平板上重新铺平板。
实施例 11
在新方案 1 的阶段 III 中 DE-Hep 细胞的形态
在阶段 III 中， 培养物更换成 HCM 培养基 ( 参见图 1a 和实施例 2)。在这个阶段 时， 出现许多 DE-Hep 细胞， 并且显示具有多边形形状、 包含具有核仁的特征性核的一般肝 细胞形态 ( 图 11)。有趣的是， 它们以由成纤维细胞样细胞包围的小岛样簇排列 ( 图 12)。 这种形态不同于由固有分化衍生的肝细胞样细胞的形态 ( 图 12 ； 还比较 等 人， 2007)。
实施例 12
用免疫细胞化学和定量分析表征 DE-Hep 细胞
整个集落通过免疫细胞化学进行固定且分析。表 1 中的数据显示在 DE-Hep 培养 物中， 许多细胞对于 CYP1A2、 CYP3A4/7、 CK18、 CK8、 CK19 和 HNF4α 是阳性的。有趣的是， 可 以在 DE-Hep 培养物而不是未处理的对照培养物 ( 固有分化 ) 中检测出极化转运蛋白 MRP2 的表达。表 3A 概括了迄今为止已对在阶段 III 时的 DE-Hep 细胞、 对照培养物、 从 Vitro Technologies 商购可得的 HepG2 和原代人肝细胞执行的免疫细胞化学分析。 空框未进行染 色或分析。
表 3A ： 与对照培养物 ( 固有分化的 hBS 培养物 )、 HepG2 和原代人肝细胞比较， 对 在阶段 III 时的 DE-Hep 细胞的免疫细胞化学分析。
在阶段 III 中通过免疫组织化学和 ELISA 表征 DE-Hep 培养物。关于肝细胞的良 好特异性标记是尿素的合成， 所述尿素仅由肝细胞而不由卵黄囊制备， 并且因此可以用于 区分真正的肝细胞和卵黄囊细胞。
ICCDE-Hep对照HepG2人原代肝细 胞 +α1- 抗胰蛋白 酶 αFP 白蛋白++++ ++ ++ ++49102083967 A CN 102083975说+ + + + + + + + + + + -明书+ + + 仅少数 + + + + + 仅少数 + + 约 15％ + -43/67 页CK7 CK8 CK18 CK19 CYP1A2 CYP3A4 糖原HNF3β ICG+ ++ + 仅少数+LFABP MRP2 ELISA 尿素 (mmol/L)
+ ++ -1.2＜ 0.81.51.7* 固有分化的 hBS 培养物
该表涵盖了阶段 III DE-Hep 培养物的表征数据， 这与固有分化的 hBS 细胞培养 物、 HepG2 细胞系和人原代肝细胞培养物进行比较。 “+” 和 “-” 是半定量测量， 并且描述分 析标记的近似水平。
表 3B ： 在 DE-Hep 培养物中人白蛋白阳性核的计算
方案人核数目人白蛋白阳性核 数目人白蛋白阳性核％50102083967 A CN 102083975说39655明书9821 24,844/67 页DE-Hep 细胞， 方 案2
* 因为发现特定百分比的 DE-Hep 细胞是具双核的 ( 如人肝细胞 )， 所以核数目与 细胞数目不相等。
实施例 13
DE-Hep 细胞的生物活性
为了评估这些 DE-Hep 细胞是否是功能的， 就吲哚花青绿摄取和分泌进行测试 ( 实 施例 17)、 糖原贮积 ( 实施例 18)、 白蛋白分泌 ( 实施例 15)、 LDL- 摄取、 不同药物的代谢能 力 ( 实施例 16) 和氨代谢 ( 实施例 20) 测试它们。
发现 DE-Hep 培养物能够摄取且分泌吲哚花青绿 ( 参见实施例 17)。
因为人肝细胞可以贮存且制造糖原， 所以经由阶段 III 细胞和未处理培养物的过 碘酸 -Schiff 染色分析糖原水平。 在 2 种培养物都发现阳性染色 ( 参见实施例 18 和图 15)。
为了进一步测定 DE-Hep 细胞的分化状态和功能感受态， 就白蛋白基因表达和白 蛋白分泌评估细胞 ( 参见实施例 15)。
为 了 测 定 阶 段 III 的 DE-Hep 细 胞 是 否 摄 取 LDL， 这 在 肝 细 胞 中 观 察 到， 通过 使 培 养 物 与 DilAc-LDL(1， 1γ- 双 十 八 基 -3， 3， 3δ， 3γ- 四 甲 基 吲 哚 羰 花 青 高 氯 酸 盐 (C59H97CIN2O4) 乙酰化人低密度脂蛋白 ) 温育评估 LDL 摄取。在阶段 III 中的培养物吸收 LDL， 而在未处理的对照培养物中仅某些细胞显示 LDL 摄取。
对于非那西丁、 双氯芬酸和咪达唑仑通过 DE-Hep 细胞的药物代谢参见实施例 16， 并且关于氨代谢参见实施例 20。
实施例 14
DE-Hep 细胞通过 Q-PCR 和 LDA 卡的基因表达分析
通过 QPCR 就肝相关基因的表达分析 hBS 细胞衍生的 DE-Hep 培养物和适当对照 ( 伴随很少的 VitroHESTM 培养基在 MEFs 上更换的固有分化的 hBS 细胞或 HepG2 细胞 ) 样 品。如表 4 中指定的分析白蛋白、 HNF4a、 CYP3A4、 CYP3A7、 CYP7A1 和 UGT2B7 的表达。
此外， 如表 5A 和 B 中列出的， 在 LDA 微流动性卡上表征 DE-Hep 细胞的基因表达。 衍生自样品总 RNA 的 cDNA 与 LDA 卡杂交， 并且在 PCR 设置中运行实验， 并且使用合适软件 进行进一步分析。所有样品在重复实验中在 LDA 卡上用适当对照平行运行， 根据指导手册 (Applied Biosystems 7900HT Micro Fluidic Card Getting StartedGuide) 且根据下述 缩短方案 ： 从总 RNA 制备 cDNA， 并且在无 RNA 酶 /DNA 酶的水中稀释它， 以接受合适浓度 ( 参 见下文 )。使下述组分混合 ： cDNA(1-100ng)， 5
1， 无 RNA 酶 /DNA 酶的水， TaqMan Universal PCR， 45μl， Master 混合物 (2X)， 50μL， 总共 ： 100μl。其后将样品装载到 LDA 卡上 ( 每个样品混合物是 100ul 和 170ng cDNA/ 样品 ) 且离心， 随后使 LDA 卡密封。最后， 根据手册中的指导， 使卡在 ABI 7900HT 实 时 PCR 系统上运行， 并且通过使用 SDS 2.2.1 软件和相对定量方法分析结果。
通过 QPCR 或 LDA 分析对 DE-Hep 细胞的基因表达分析概括呈现于表 4(QPCR) 和 5(LDA)， 并且在下文中描述。
表4： 通过 QPCR 的基因表达分析。 方案 1( 无任何修改 )
方案 2( 无任何修改 )
方案 3( 无任何修改 )
样品 C 用 EGF 和抗坏血酸执行 样品 D 不用 EGF 和抗坏血酸执行 方案 4( 无任何修改 )
样品 E 修饰 ： 阶段 1 ： 无活化素 A、 bFGF 和 FCS ； 阶段 2 ： DMEM 代替 RPMI A 和一直 0.2％ FCS ； 阶段 3 ： 在第 17-30 天时无 ITS 和 HGF。
样品 F ： 无 EGF 和抗坏血酸。
来自 Cai 等人 2007 的方案 ( 无任何修饰 )
- ＝未测试 ； 0 ＝未检测出表达。 *DE-Hep 细胞 (DE-Hep) 中的表达对固有分化的对照 hBS 细胞中的表达进行标准化。 * 在培养 21-38 天后分析 DE-Hep 细胞和固有分化的对照 hBS 细胞。
与固有分化的对照 hBS 细胞比较， 用方案 1-4 衍生的 DE-Hep 细胞显示增加的成年 肝脏相关基因表达。重要的是， 通常发现功能基因如 CYP3A4 的表达在 DE-Hep 细胞中明显 更高。在所有测试样品中检测出成年肝脏相关基因如 CYP7A1 的表达， 并且通常在 DE-Hep 培养物中比固有分化的对照 hBS 细胞中更高。在许多样品中， 检测出 CYP1A2 表达 ( 数据未 显示 )。
当比较我们的方案 1-4 与由 Cai 等人 2007(G) 公开的方案时， HNF4a、 白蛋白和 UGT2B7 明显更高。
表5： 在 LDA 卡上 DE-Hep 细胞的基因表达分析
表 5A
* 针对 HPRT1 进行标准化。* 固有分化的 hBS 细胞是对照样品 ； dCT 值给出， 以防 在对照样品不表达测试基因的情况。执行方案 1 无任何修改。
在表 5A 中， 通过方案 1 衍生自 hESC 系 SA002 的在阶段 III 时 DE-Hep 细胞与来自 hESC 系 SA002 的固有分化的 hBS 细胞 ( 设为 1) 进行比较。DE-Hep 细胞显示与固有分化的 hBS 细胞比较几乎所有基因增加的表达。
表 5B
* 针对 HPRT1 进行标准化。
* 培养 48 小时的 HepG2 细胞和人原代肝细胞是对照样品。HepG2 设为 1， 并且所有 其他样品对其表达进行标准化。
； + ＝检测出的表达， 但并未标准化， 因为 HepG2 细胞是阴性
“Cai 07” ＝根据 Cai 等人 2007 的方案 ( 参见参考文献 )
在方案 1 和 2 中不执行修饰， 并且与 Cai 等人 2007 比较
在表 5B 中， 通过方案 1 衍生自 hESC 系 SA002.5、 通过方案 2 衍生自 hESC 系 SA348 和通过 Cai 等人 2007 的方案衍生自 hESC 系 SA348 在阶段 III 时的 DE-Hep 细胞与培养 24 小时的原代人肝细胞和 HepG2 细胞 ( 设为 1) 进行比较。
有趣的是， 发现与用 Cai- 方案衍生的 DE-Hep 细胞比较， UGT2B7、 CAR、 HNF4a 和白 蛋白在通过方案 1 和 2 衍生的 DE-Hep 细胞中在更高水平下表达。在用 Cai- 方案衍生的 DE-Hep 细胞中未检测出 CYP2C9、 CYP2C19、 CYP2D6、 UGT1A6、 OATP-2 和醇脱氢酶 1 的表达。
用人原代肝细胞和 HepG2 细胞在 DE-Hep 细胞中的基因表达比较 ( 参见图 18)
用方案 2(3 次独立实验 ) 衍生的 DE-Hep 细胞显示与培养 48 小时的人原代肝细胞 同样高的 CYP3A4 表达， 和比 HepG2 细胞高约 100 倍的表达。与 DE-Hep 培养物比较， 在固有 分化的 hBS 细胞培养物中的肝细胞样细胞 (3 次独立实验， 与方案 2 平行运行 ) 显示 CYP3A4 较低的表达水平。发现用方案 2 衍生的 DE-Hep 细胞表达成年肝脏相关基因 CYP7A1 和葡萄 糖 6 磷酸酶 ( 参见表 5A 和 B)。应当指出 DE-Hep 培养物不是同质细胞群体， 并且如果从混 合培养中富集 DE-Hep 细胞， 表达水平将更高。
实施例 15
在来自 DE-Hep 细胞的培养基上清液中的白蛋白分泌的 Elisa 分析
在 Klinisk Kemi， C-lab， Sahlgrenska University Hospital， Gothenburg 使用 Albumin Quantification 试剂盒 ( 目录号 03576108， Cobas) 分析白蛋白分泌。白蛋白在 肝脏实质细胞以 14g/ 天的速率合成， 并且在血浆中具有 2 种主要功能 ： 维持胶体渗透压 (80％由于血浆中的白蛋白 ) 和转运。它是用于具有低水溶性物质 ( 例如， 游离脂肪酸、 胆 红素、 金属离子、 激素和药物 ) 最重要的转运蛋白质。测试原理基于免疫比浊测定法， 使用 抗白蛋白抗体。这些抗体与样品中的抗原反应， 以形成抗原 / 抗体复合物， 这在凝集后用浊 度计进行测量。血清 / 血浆中的预期值是 35-52g/L(532-790μmol/L)。
在不同阶段时分析细胞， 阶段 II 培养基样品 A-E。在第一个分化期中 ( 阶段 I， 参 见图 1a)， 活化素 A 诱导 hBS 细胞成为 DE， 这花费 1 至 5 天。在阶段 II 中， 通过 BMP4 和 / 或其他因子诱导早期肝脏细胞类型， 并且这些早期肝脏细胞扩增且成熟。在最后一个阶段 中， 阶段 III， 通过 HGF、 OSM、 DEX 达到终末成熟， 共高达数天 ( 图 1a)。定型内胚层诱导的 DE-Hep 细胞分泌白蛋白。根据 等人 2007， 表 6， 在固有分化的 hBS 细胞的对照
中未检测出白蛋白。人原代肝细胞和 HepG2 细胞都不分泌白蛋白超过这个测定法的检测水 平。应当指出样品 A-D 已在其培养基中温育 2 天， 而样品 E 在其培养基中温育 1 天， 表 6。
表6： 来自 DE-Hep 细胞 (SA002) 的白蛋白分泌。
样品 1a DE-Hep 细胞， 第 22 天 1b 固有分化的 hBS 细胞， 第 22 天 2a DE-Hep 细胞， 第 24 天 2b 固有分化的 hBS 细胞， 第 24 天白蛋白 (mg/l) 149 152 -3a DE-Hep 细胞， 第 20 天 3b 固有分化的 hBS 细胞， 第 20 天 4a DE-Hep 细胞， 第 38 天 4 b 固有分化的 hBS 细胞， 第 34 天 5 DE-Hep 细胞， 第 31 天 6 HepG2 7 人原代肝细胞
142 142 75 -实施例 16
DE-Hep 细胞显示经由 CYP1A2、 CYP3A4 和 CYP2C9 的功能药物代谢
在阶段 III 时的 hBS 衍生的 DE-Hep 细胞就其代谢 3 种探测药物的能力就 I 期酶 CYP1A2、 CYP2C9 和 CYP3A4 进行测试。 26μM 非那西丁 ( 由 CYP1A2 代谢 ； 购自 Aldrich)、 9μM 双氯芬酸 ( 由 CYP2C9 代谢 ； 购自 SIGMA) 和 3μM 咪达唑仑 ( 由 CYP3A4 代谢 ； 购自 SIGMA) 作为混合物在 37℃和 5％ CO2 下在无酚红培养基中温育 12-17 小时。收集培养上清液的样 品， 并且以 500-4000g 的速度离 5-20 分钟， 以去除任何细胞碎片。将 100-120μl 澄清的上 清液样品转移至 96 孔平板， 并且将 15μl 乙腈加入每个孔中。需要时， 可以省略乙腈添加。 使样品冷冻在 -20℃下， 并且通过 LC-MS( 乙氨酚用于 CYP1A2， 1 羟基 - 咪达唑仑 (1OH- 咪达 唑仑 ) 用于 CYP3A4 和羟基 - 双氯芬酸 (OH- 双氯芬酸 ) 用于 CYP2C9) 测量在培养上清液中 的代谢产物浓度。
DE-Hep 细胞代谢测试的所有 3 种探测药物 ( 表 7 和图 14A)。有趣的是， 衍生自 不同 hBS 细胞系的 DE-Hep 培养物在关于 CYP1A2、 3A4 和 CYP2C9 的代谢活性方面不同， 导 致对于不同 hBS 系一般的 CYP 活性谱， 例如在衍生自 hBS 细胞系 SA001、 SA002 和 SA002.5 的 DE-Hep 细胞中高的 CYP1A2 和较低的 CYP3A4 活性， 并且在 hBS 细胞系 SA348 中反之亦然 ( 图 14A)。这与在文献中描述且在我们手中重现的众所周知的 CYP 表达在人中的个体间变 异相一致 ( 当在从不同供体中分离的人原代肝细胞中分析 CYP 活性时 ( 图 14B))。
除未处理的 DE-Hep 培养物中的组成性 CYP 表达外 ( 图 14A)， DE-Hep 细胞中的 CYP 表达可通过用 CYP 诱导剂混合物处理诱导， 所述 CYP 诱导剂混合物包含 25μM 利福平、 25μM 奥美拉唑、 100μM 异烟肼、 100μM 地塞米松、 10μM 扑米酮 ( 脱氧苯巴比妥 ) 和 88mM 乙醇 ； 在与 CYP 诱导剂混合物温育 24 小时后， CYP1A2 活性以及 CYP1A2 和 CYP3A4mRNA 水平 比未处理的对照培养物中高 3-4 倍 ( 图 4C， D)。
与 DE-Hep 细胞形成对比， 肝瘤细胞系 HepG2 主要显示 CYP1A2 活性， 而仅可以检 测出低 CYP3A4 活性且无 CYP2C9 活性 ( 表 7 和图 14B)。然而， 当比较在 DE-Hep 培养物 与 HepG2 和人原代肝细胞中的 CYP 活性时， 应当考虑 HepG2 和人原代肝细胞都是纯细胞群 体， 而 DE-Hep 培养物是混合细胞群体， 并且包含除 DE-Hep 细胞外的其他细胞类型。总之， DE-Hep 细胞显示组成性和诱导性 CYP 表达， 在不同 hBS 细胞系之间在 CYP 表达水平中很大 的个体间变异， 并且因此与人原代肝细胞的高相似性。
表7： DE-Hep 细胞的细胞色素 P450 活性
方案细胞系培养中的天 数 27 27nM 非那西丁 ( ＝ CYP1A2) 53 58nM OH- 咪达唑 仑 ( ＝ CYP3A4) 0 0方案 1(ECD) 方案 1( 诱导 的， ECD) 方案 1 方案 1 方案 1 方案 2 方案 2(ECD) 方案 2(ECD， 诱导的 )SA001 SA001SA002 SA002.5 SA167 SA001 SA001 SA00126 31 30 27 27 27886 133 149 273 59 1951 2 3 2 0 059102083967 A CN 102083975说SA002 SA002 SA167 28 37 30明书137 225 6 4 4 1253/67 页方案 2 方案 2(ECD) 方案 2( 在阶 段2和3中 +10％ FCS) 方案 3(ECD) 方案 3 方案 3 方案 3
SA001 SA002 SA002.5 SA34827 29 29 2937 38 138 02 4 12 127“ECD” ＝酶促簇解离。对照细胞类型 nM 非那西丁 ( ＝ CYP1A2) nM OH- 咪达唑仑 ( ＝ CYP3A4) 5 464HepG2 细胞 * 原代人肝细胞 ( 来自 4 个不同供体 )， 培养 48 小时 * 小鼠胚胎饲养细胞
427 402651* 对于 HepG2 细胞和人原代肝细胞， 计算 4 次独立实验的平均值。 在加入药物前使 人原代肝细胞培养 48 小时。
小鼠胚胎饲养细胞显示接近于检测水平的极低 CYP 活性水平， 因此不显著促成在 小鼠胚胎饲养细胞上的 DE-Hep 培养物中测量的 CYP 活性。
实施例 16
DE-Hep 细胞， 阶段 III 的转运蛋白分析
经过肝细胞质膜的转运是肝清除中的关键参数， 并且通常通过不同载体介导的系 统发生。
多药抗性蛋白质 2(MRP2)
阴离子化合物的胆汁消除由多药抗性蛋白质 2(MRP2) 介导。MRP2 免疫荧光在 DE-Hep 细胞培养物中在阶段 III 时发现 ( 参见图 14a 和 b)。MRP2 在 DE-Hep 细胞中的表达 在 LDA 卡上在 mRNA 水平上加以证实 ( 参见表 5A+B)。吲哚花青绿 (ICG)
吲哚花青绿 (ICG， 也称为靛氰绿， Sigma， I2633) 是有机阴离子， 其是无毒的， 并且通过肝细胞专一地消除， 并且因此通常在临床上用作测试物质以评估肝脏功能。 (Shinohara 等人 1996)。ICG 在 5ml 溶剂中在无菌小瓶中溶解， 并且随后加入包含 10％ FBS 的 20ml DMEM。所得到的吲哚花青绿 (ICG) 溶液的终浓度是 1mg/ml。将 ICG 溶液加入细胞 培养皿中， 并且在 37℃下温育 60 分钟。在皿用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 漂洗 3 次后， 用立体 显微镜检查 ICG 的细胞摄取。在检查后， 用包含 10％ FBS 的 DMEM 装满皿。ICG 从细胞中过 夜消除。
分析吲哚花青绿通过功能 DE-Hep 细胞的摄取， 并且显示事实上在与 ICG 温育接近 60 分钟后， DE-Hep 培养物的许多细胞是阳性的， 显示主动摄取 ICG 的能力 ( 参见图 14c)。 此外， 在 24 小时后， 大多数 ICG 已从细胞中排泄。 ICG 摄取和排泄仅在少数对照培养物中出 现， 显示固有分化的培养物也能够产生功能肝细胞样细胞。已知 ICG 的摄取和排泄经由药 物转运蛋白 OATP-2 发生， 所述 OATP-2 在 DE-Hep 细胞中的表达在 LDA 卡上在 mRNA 水平上 加以证实 ( 参见表 5A+B)。
实施例 17
功能 DE-Hep 细胞的糖原贮积
人肝细胞合成且贮存糖原。通过在阶段 III 中的 DE-Hep 细胞和固有分化细胞中 的过碘酸 -Schiff 染色分析糖原水平。在 2 种培养物都发现阳性染色 (DE-Hep 细胞的糖原 染色 ： 图 15 ； 固有分化细胞的糖原染色 ： 参见 等人 2007)。在 DE-Hep 细胞中 发现比在固有分化的细胞中明显更高的糖原贮积， 并且可以与具有肝细胞样形态的细胞相 关。应当指出在图 15B 中的某些糖原阳性细胞是具双核的。
通过 PAS- 染色 ( 过碘酸 -Schiff 染色系统， SIGMA-ALDRICH， 目录号 395-B) 检测 出在细胞中的糖原贮积检测。使细胞在甲醇中稀释的 4％多聚甲醛中在室温下固定 15 分 钟， 并且随后在 PBS 中洗涤 3 次。作为技术阴性对照， 培养物用人唾液在室温下处理 20 分 钟， 并且随后在 PBS 中洗涤。人唾液包含消化糖原的 α- 淀粉酶。将使二醇氧化成醛的过 碘酸加入处理和未处理的培养物中在室温下 5 分钟， 随后在 PBS 中反复洗涤。随后， 培养物 在 Schiff′ s 试剂中在室温下温育 15 分钟， 允许副蔷薇苯胺和焦亚硫酸钠之间的反应， 这 导致使含二醇细胞区室染成亮粉色的副蔷薇苯胺产物。在 PBS 中洗涤后， 细胞在苏木精中 在室温下复染 90 秒， 并且在固定培养基中固定前在 H2O 中漂洗。苏木精染色细胞的核 ( 蓝 色 )。
实施例 18
定型内胚层、 肝祖先和肝脏相关基因以及药物代谢酶和药物转运蛋白的免疫细胞 化学检测
使用的一抗 ：
白蛋白 ( 兔 )1 ∶ 500， DAKOCytomation， A0001
AAT( 兔 )1 ∶ 200， DAKOCytomation， A0012
CD133( 小鼠 )1 ∶ 50， Miltenyi， 克隆 AC141
c-kit( 山羊 )1 ∶ 100， R&D， AF332
CK7( 兔 )1 ∶ 200， Novocastra， NCL-CK7560CK8( 小鼠 IgG1)1 ∶ 200， Santa Cruz， sc-52324
CK18( 小鼠 )1 ∶ 200， DAKOCytomation， M7010
CK19( 小鼠 IgG1)1 ∶ 150， Novo Castra， NCL-CK19
结蛋白 ( 小鼠 IgG1)1 ∶ 200， Chemicon， MAB 1698
EpCAM( 小鼠 IgG1)， 1 ∶ 50， GeneTex， Inc.VU-ID9
EGFR-1( 小鼠 IgG2b)， 1 ∶ 100， abcam， ab30
e- 钙粘蛋白 ( 小鼠 IgG1)， 1 ∶ 500， ZYMED， 13-1700
LFABP( 山羊 )1 ∶ 500， Santa Cruz， sc-16064
HNF3b( 山羊 )1 ∶ 250， Santa Cruz， sc-6554
HNF4a( 兔 )1 ∶ 500， Santa Cruz， sc-8987
HNF1a( 兔 )， 1 ∶ 400， Santa Cruz， sc-22840
Nestin( 小鼠 IgG1)， 1 ∶ 250， BD Biosciences， 611658
Notch2( 兔 )1 ∶ 100， SantaCruz， 25-255
Oct-4( 小鼠 )1 ∶ 500， Santa Cruz， sc-5279
c-Met(HGF 受体， 小鼠 )1 ∶ 100， upstate， 05-237
α6- 整联蛋白 (CD49f， rat)1 ∶ 250， BD Biosciences， 555736
ICAM-1(CD54， 小鼠 )1 ∶ 500， BD Pharmingen， 559047
PDGFRa( 小鼠 )1 ∶ 500， Chemicon， CBL1366
Sox17( 兔 )1 ∶ 2000， ( 来自 E.Baetge 的友情赠予 )
波形蛋白 ( 小鼠 IgG1)1 ∶ 300， SIGMA， V-6630
使用的二抗 ：
- 驴抗 - 山羊 -Alexa 488， 1 ∶ 500， Molecular Probes， #A-11055
- 驴抗小鼠 -Cy3， 1 ∶ 1000， Jackson Immuno Research， #715-165-151
- 驴抗 - 小鼠 -Cy2， 1 ∶ 100， Jackson Immuno Research， #715-225-151
- 驴抗 - 兔 -Alexa488， 1 ∶ 1000， Molecular Probes， #A-21206
- 驴抗 - 兔 -Alexa594， 1 ∶ 1000， Molecular Probes， #A-21207
- 驴抗 - 大鼠 -Cy3， 1 ∶ 500， Jackson Immuno Research， #712-165-153
- 驴抗 - 大鼠 -Cy2， 1 ∶ 100， Jackson Immuno Research， #712-225-153
免疫染色方案 ：
对于细胞内蛋白质 ：
在 4％ PFA 中 15 分钟固定， 2xPBS 洗涤， 在 0， 1％ PBT 中的 5％ FBS 30 分钟， 一抗 在 PBS 中的 1％ FBS 中于 4℃温育过夜， 二抗在 PBS 中的 1％ FBS 中在 RT 下温育 1 小时， 全 都在 PBS、 以 0.05mg/ml 的 DAPI 中在 RT 下洗涤 5 分钟， 在 DAKOCytomation 固定培养基中固 定。
对于细胞外蛋白质 ：
在 4％ PFA 中 15 分钟固定， 2xPBS 洗涤， 在 PBS 中的 5％ FBS 30 分钟， 一抗在 PBS 中的 1％ FBS 中于 4℃温育过夜， 二抗在 PBS 中在 RT 下温育 1 小时， 全都在 PBS、 以 0.05mg/ ml 的 DAPI 中在 RT 下洗涤 5 分钟， 在 DAKOCytomation 固定培养基中固定。
I 期代谢酶 ：药物在人 / 哺乳动物中通过 2 种顺次途径进行代谢或分解。I 期酶由细胞色素 P450 家族组成。来自这类酶的蛋白质催化反应， 导致给其异生物质底物添加官能团和反应 中心， 例如 SH、 OH、 -NH2 和 -COOH 基团。 DE-Hep 细胞显示对于下述 CYPs 的免疫反应性 ： 1A2、 3A4/7( 在 2 个亚型之间的潜在抗体交叉反应 )。
使用的一抗 ：
-CYP1A2( 兔 )1 ∶ 100， Biomol， CR3130 ； 针对人 CYP1A2 的合成十三肽产生， 并且 因此可能不与 CYP1A1 交叉反应
-CYP1A2( 兔 )1 ∶ 200， Cypex， PAP021 ； 根据制造商的信息， 在蛋白质印迹中不与 CYP1A1 交叉反应
-CYP3A4( 绵羊 )1 ∶ 100， Biomol， CR3345 ； 根据制造商的信息， 可能与 CYP3A7 交 叉反应
-CYP3A4( 兔 )1 ∶ 200， Cypex， PAP011 ； 可能与 CYP3A7 交叉反应
使用的二抗 ：
- 驴抗 - 兔 -Alexa488， 1 ∶ 1000， Molecular Probes， #A-21206
- 驴抗 - 绵羊 -Alexa488， 1 ∶ 1000， #A-11015
免疫染色方案 ：
在 4％ PFA 中 15 分钟固定， 2xPBS 洗涤， 在 0， 1％ PBT 中的 5％ FBS 30 分钟， 一抗 在 PBS 中的 1％ FBS 中于 4℃温育过夜， 二抗在 PBS 中在 RT 下温育 3 小时， 全都在 PBS、 以 0.05mg/ml 的 DAPI 中在 RT 下洗涤 5 分钟， 在 DAKOCytomation 固定培养基中固定。
药物转运蛋白
DE-Hep 细胞显示对于转运蛋白 MRP2 的免疫反应性 ( 图 14B)。MRP2 在肝细胞样细 胞培养物和 DE-Hep 细胞培养物中都表达。
使用的一抗 ：
MRP2( 兔 )1 ∶ 50， Santa Cruz， sc-20766
使用的二抗 ：
- 驴抗 - 兔 -Alexa 488， 1 ∶ 1000， Molecular Probes， #A-21206
免疫染色方案 ：
在 4％ PFA 中 15 分钟固定， 2xPBS 洗涤， 在 0， 1％ PBT 中的 5％ FBS 30 分钟， 一抗 在 PBS 中的 1％ FBS 中于 4℃温育过夜， 二抗在 PBS 中在 RT 下温育 1 小时， 全都在 PBS、 以 0.05mg/ml 的 DAPI 中在 RT 下洗涤 5 分钟， 在 DAKOCytomation 固定培养基中固定。
实施例 19
在阶段 III 时在 DE-Hep 细胞中的尿素排泄
尿素的测定是用于评估肾脏功能的最广泛使用的测试。尿素是蛋白质和氨基酸 代谢的最终降解产物。在这个过程中形成的氨在肝脏中合成为尿素， 并且构成用于消除人 体中的过量氮的最重要的分解代谢途径。Roche UREA/BUN 测定法基于 Talke 和 Schubert 的方法， 使用总体酶促操作用于测定尿素， 使用偶联的尿素酶 / 谷氨酸脱氢酶 (GLDH) 酶 系统。简言之， 尿素通过尿素酶水解以形成 CO2 和氨。形成的氨随后在 GLDH 的存在下与 α- 酮戊二酸和 NADH 反应， 以产生谷氨酸盐和 NAD+。 动态测量由于 NADH 消耗在吸光度中的 减少。血清 / 血浆中的正常值是 10-50mg/dL(1.7-8.3mmol/L)。在 Klinisk Kemi， C-lab，Sahlgrenska University Hospital， Gothenburg， 使用用于尿素 / 尿素氮的动态 uV 测定法 试剂盒 (Roche/Hitachi) 分析尿素分泌。发现 DE-Hep 细胞、 对照肝细胞样细胞、 HepG2 和 人原代肝细胞产生尿素 ( 参见表 3)。
实施例 20
通过计算 CYP 免疫阳性细胞或细胞核数目 / 培养物定量特定 CYP 活性 / 细胞
因为 DE-Hep 培养物包含除 DE-Hep 细胞外的其他细胞类型， 所以希望确定表达 CYP 细胞的数目， 以便能够计算特定 CYP 活性 / 细胞 / 细胞核。一个可能性是计数对于特定 CYP 是免疫阳性的这些人核 ( 用核染剂如 DAPI 和抗人核抗体共标记 )， 使用自动细胞分析系统 ( 例如， 在 Cell 分析仪中 )。
使用此种系统， 已测定用方案 2 衍生的 DE-Hep 培养物包含约 19％ CYP3A4 免疫阳 性细胞核 ( 其中约 6％是高度免疫阳性的 ； 参见表 8)， 而具有肝细胞样细胞的对照培养物 包含约 2％ CYP3A4 免疫阳性细胞核 ( 其中约 0.3％是高度免疫阳性的 ； 参见表 8)。根据人 CYP3A4 阳性和高度阳性核的绝对数目， 可以计算代谢产物浓度 /1000 个 CYP3A4 阳性核或 /1000 个高度 CYP3A4 阳性核。 相同分析可以对于对照细胞类型如人原代肝细胞和 HepG2 细 胞执行， 并且随后在这些细胞类型之间的直接比较是可能的。在此种实验中， 来自 3 个不同 个体的人原代肝细胞 ( 培养 120 小时 ) 包含平均 8， 8％ CYP3A4 阳性核。与这比较， DE-Hep 培养物包含 19.4％超过 2 倍的 CYP3A4 阳性核。
表8： 在 DE-Hep 培养物中人 CYP3A4 阳性核的计算
方案 人核 数目 人 CYP3A4 阳性核 数目 DE-Hep 细胞， 方 案2 固有分 化的细 胞 40323 7830 人 CYP3A4 阳性核 数目％ 19.4 人高 CYP3A4 阳性核 数目 2309 人高 CYP3A4 阳性核 数目％ 5.8 nM 10H- 咪 达唑仑 (CYP3A4 代谢产物 ) 26 nM 10H- 咪达 唑仑 /1000 人 CYP3A4 阳 性核 3.3 nM 10H- 咪达 唑仑 /1000 人高 CYP3A4 阳性核 11.34867511112.31430.310.96.9* 计算来自 2 个等同处理孔的平均值 / 方案。
* 因为发现特定百分比的 DE-Hep 细胞和肝细胞样细胞都是具双核的 ( 如同人肝细 胞 )， 所以核数目与细胞数目不相等。
实施例 21
作为单细胞和细胞簇的 hBS 细胞的活化素处理
在起始分化方案前， 用胶原酶使 hBS 细胞解离成单细胞和细胞簇。其后， 使单细胞 和细胞簇在小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 或其他基质上铺平板， 并且根据 DE-Hep 分化策略 或根据固有分化策略进行培养。在下文中， 描述了此种实验的 4 个例子， 并且指定为方案 A-D。这些方案全都具有在培养中 5-7 天的长度。其后， 根据方案 1-4 继续细胞培养 ( 参见
图 1B)。 方案 A 涉及用胶原酶使 hBS 细胞解离， 以便获得单细胞和 / 或小细胞簇。它们随 后在阶段 I 培养基中在 MEFs 或其他基质上培养 3-7 天， 并且这之后根据方案 1-4 进行培养 ( 参见图 1B 和实施例 2)， 从阶段 II 培养基开始。
在方案 B， 前 3 天完全如对于方案 A 所述。其后将培养基更换成 VitroHESTM 培养 基， 补充有 4ng/ml FGF2 连同或不连同 10％ FBS， 并且培养另外 2 天。细胞随后根据方案 1-4 进行培养 ( 参见图 1B 和实施例 2)， 从阶段 II 培养基开始。
方案 C 涉及如方案 A 中所述用胶原酶使 hBS 细胞传代， 这之后使 hBS 细胞在补充 TM 有 4ng/ml FGF2 的 VitroHES 中铺平板， 并且在根据方案 1-4 培养细胞前允许生长至 70％ 汇合 ( 参见图 1B 和实施例 2)， 从阶段 I 培养基开始。
方案 D 涉及如上所述用胶原酶或 TrypleSelect 使 hBS 细胞在 MEF 上传代， 并且如 TM 上所述在 VitroHES 培养基中培养。它们固有分化成肝细胞样细胞 ( 参见图 11C)。
实施例 22
DE-Hep 细胞的分选和精制
因 为 DE-Hep 培 养 物 是 混 合 群 体， 所以可能必须使所需细胞群体纯化为例如 DE-Hep 祖先或 DE-Hep 细胞。可以用基于抗体的方法如磁活化细胞分选 (MACS) 或荧光活 化细胞分选 (FACS)， 或基于梯度离心的方法如 FICOLL 或 PERCOLL 来执行纯化。对于基于 抗体的方法 ( 如 FACS 和 MACS)， 需要针对细胞外表位的抗体， 例如无唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR1) 或药物转运蛋白。对于 FACS， 抗体的备选物是使用关于药物转运蛋白的荧光底 物， 例如关于 OATP-8 的 Fluo-3， 或关于 CYPs 例如 7- 苄氧基 -4- 三氟甲基 - 香豆素 (BTC)。 这些无毒的荧光底物暂时标记所需细胞群体， 并且因此允许细胞分选而无细胞的永久改变 或损害。
实施例 23
在活化素诱导后转移至胶原 /Matrigel
在阶段 I 中在第 5 天时， 用 TripleSelect 使在 MEF 上衍生自 hBS 细胞的 DE 细胞 解离， 并且转移至 Matrigel 和 / 或胶原包被平板。接种密度是 250000 个细胞 /cm2。在阶 段 II 培养基的存在下 ( 参见图 1B 和实施例 2)， 细胞快速朝向肝祖细胞分化以及增殖 ( 关 于形态参见图 17)。在第 16 天时， 在阶段 II 中， 许多细胞是 EpCAM、 CK7、 CK19 和 CD54 免疫 阳性的 ( 数据未显示， 关于在 DE-Hep 祖先中表达的标记比较表 2)。
实施例 24
其他内胚层细胞类型的衍生
除 DE-Hep 细胞外， 其他内胚层细胞类型如肠细胞或其他肠细胞也可以衍生自 hBS 细胞。 用于检测此种细胞类型的合适标记是 caudal 相关同源异形盒 2(Cdx2) 和肠脂肪酸结 合蛋白 (IFABP)。 Cdx2 在肠上皮和结肠癌细胞系 Caco-2 中高度表达 ( 数据未显示 )。 IFABP 在小肠肠细胞中表达 ( 数据未显示 )。通过免疫组织化学在肝脏切片上检测不出 Cdx2 和 IFABP( 数据未显示 )， 并且因此适合于区分在 DE-Hep 培养物中的肠细胞和肝细胞。
实施例 25
3D 系统改善 DH-Hep 细胞的功能性
当应用简单的 3D 系统例如所谓的三明治构型时， 这意指 Matrigel 或胶原覆盖放
置在细胞上， 已知原代人肝细胞在 2D 细胞培养中显示改善的功能性。因此， 也对 DE-Hep 细 胞测试此种三明治构象， 并且在最后 1-2 周过程中将 Matrigel 覆盖放置在培养物上。如表 9 中显示的， 这增加 CYP1A2 和 CYP3A4 活性， 并且因此对 DE-Hep 细胞的功能性具有正面作 用。还考虑了其他 3D 系统如珠、 凝胶或基质以改善功能性。
表9： 在三明治构型中的 DE-Hep 细胞改善的细胞色素 P450 活性。值是 nM 代谢产 物， 参见实施例 15。
2b具有 Matrigel 覆盖的 DE-Hep 细胞， SA002， 第 29 天287如表 10 中所示， 当存在 Matrigel 覆盖时， 相同细胞显示对于某些关键肝基因增加 的基因表达。
表 10 ： 在三明治构型中的 DE-Hep 细胞改善的基因表达。值是相对于固有分化细 胞的倍数变化。
实施例 26
在 DE-Hep 培养物中 II 期酶的表达
异生物质通过 2 个顺次系统代谢 ： I 期和 II 期酶系统。I 期系统由细胞色素 P450 酶 (CYPs) 组成， 并且 II 期系统由例如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 (UGTs)、 谷胱甘肽 S- 转移酶 (GSTs) 和磺基转移酶 (SULTs) 组成。
分析在 DE-Hep 培养物中某些选择的 II 期酶的表达。在 DE-Hep 培养物中， 可以检 测出 UGT1A6/4/3、 UGT1A8 和 UGT2B7 的表达 ( 表 5B ； 方案 1 和 2) 以及 GSTA1-1 和 SULT1E1 的表达 ( 图 19 ； 方案 4)。GSTA1-1 和 SULT1E1 在未分化的 hBS 细胞中都以极低水平表达， 并且在 DE-Hep 培养物中在分化过程期间强烈上调。
实施例 27
在 hBS 衍生的 DE-hep 细胞中改善 CYP2C9 表达
应用培养条件的不同变化， 以便改善 DE-hep 细胞中的 CYP2C9 表达。
使衍生自 2 种不同细胞系 SA002 和 SA348 的 DE-hep 细胞在阶段 III 中在培养中维 持延长时间段， 共另外 2 周， 直至第 42 天时， 并且在第 28 天时与 DE-heps 比较。延长在阶 段 III 中的培养期导致 CYP2C9mRNA 表达中的急剧增加 ( 对于 SA0026.6 倍和对于 SA3485.0 倍 )。
DE-heps 细胞在无饲养者系统中衍生自 2 种不同细胞系 SA002 和 SA348， 其中通过 将未分化的 hBS 细胞转移至滤器 (Millipore#PICMO1250， Lot R5PN16454)， 并且在不存在 饲养者的情况下在培养基中在空气 - 液体界面上培养， 如对于 DE-hep 方案描述的。这些细 胞与在饲养者上培养相同时间段—— 28 天的 DE-hep 细胞比较。与在饲养者上的通常生长 条件比较， 在不存在饲养者的情况下， CYP2C9mRNA 表达急剧增加 ( 对于 SA002 和 SA348 分 别 3.0 和 4.0 倍 )。
使用 ABI/TaqMan 方法通过实时 PCR 测量 CYP2C9 的 mRNA 表达。简言之， 通过使用 Qiagen′ s RNeasy 系统从细胞培养物中分离 RNA。通过使用 ABI 高能力 cDNA 合成试剂盒 合成 cDNA。通过使用 TaqMan 探针在 ABI 7500 中执行 RT-PCR。表达水平针对 CREBBP 表达 进行标准化。参见图 20。
实施例 28
与根据由 Cai 等人公开的方案分化的 hBS 细胞比较， DE-hep 细胞的基因表达
为了比较我们的方案与由 Cai 等人公开的方案， 对 hBS 细胞应用 2 种方案， 并且分 析几种重要肝基因的 mRNA 表达。通过我们的 DE-Hep 方案分化的细胞表达更高 mRNA 水平 的白蛋白、 CYP1A2、 CYP2C9 和 CYP3A4， 图 21。
方法 ：
通过用 TryLe Select 酶促解离成单细胞使来自细胞系 SA002 的 SCED( 酶促解离 的单细胞 ) 细胞与饲养细胞分开， 同时使大多数 HFFs 与平板附着。hBS 细胞转移至悬滴用 于在包含 30％纤维素的 VitroHes 培养基中重聚集 5 天， 并且在胶原包被细胞培养皿上铺平 板。随后使 hBS 细胞暴露于我们的 DE-hep 方案以及由 Cai 等人公开的方案。所得到的细 胞培养物通过实时 PCR 就几种肝标记的肝基因表达进行分析。
实施例 29
流式细胞术
使用 CYP1A2 抗体执行流式细胞术， 以定量在阶段 3 时在 DE-Hep 培养物 (SA002， d28) 和原代肝细胞中的 CYP1A2 阳性细胞百分比。DE-Hep 细胞用 TriPIS 在 37℃下解离 20 分钟。原代肝细胞是新鲜分离的。
使细胞在 0.5％ PFA 中固定 30 分钟。 使用 0.5％ Triton/PBS 在细胞渗透化后 5 分 钟完成细胞内染色。所有细胞已对于 DAPI 进行染色。所有离心步骤在 60g 下进行 3 分钟。 相应的同种型用作对照用于单克隆抗体的非特异性结合 ( 图 22， A)。约 33.5％的所有计 数细胞 (DAPI) 在 DE-Hep 培养物中对于 CYP1A2 是阳性的 ( 计数 4218 个细胞 )( 图 22， BI/ II)。原代肝细胞由 52％ CYP1A2 阳性细胞组成 ( 计数 20000 个细胞 )( 图 22， CI/II)。有 趣的是， DAPI 谱描述了在 DE-Hep 和原代肝细胞中的单核、 双核和多核细胞 ( 图 22， B， C)。
实施例 30用活化素 B 代替活化素 A 用于诱导内胚层
在 5ng/ml bFGF 的存在下使未分化的 hESC 系 SA002 暴露于活化素 A(100ng/ml) 或活化素 B(100ng/ml)5 天， 并且就基因表达进行分析。与活化素 A 比较， 在活化素 B 暴露 后， 内胚层标记 Foxa2、 Sox17 和 CXCR4 的 mRNA 表达相同或甚至更高。此外， 与活化素 A 比 较， 在用活化素 B 培养的细胞中， 胚外内胚层 (ExE) 标记 Sox7、 CDX2 和 AAT 相同或更低。这 显示对于内胚层的诱导， 活化素 B 与活化素 A 同样好或甚至更好。参见图 23。
方法 ：
使用 ABI/TaqMan 方法通过实时 PCR 测量 Foxa2、 Sox17、 CXCR4、 Sox7、 CDX2、 AAT 的 mRNA 表达。简言之， 通过使用 Qiagen′ s RNeasy 系统从细胞培养物中分离 RNA。通过使用 ABI 高能力 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。通过使用 TaqMan 探针在 ABI 7500 中执行 RT-PCR。 表达水平针对 CREBBP 表达进行标准化。
References
·Heins N， Englund MCO， Sjoblom C 等人 Derivation， characterization， and differentiation of human embryonic stemcells.STEM CELLS 2004 ； 22 ： 367-76.
·WO03055992， A method for the establishment of apluripotent human blastocyst-derived stem cell line， CellartisAB
· WO2004098285， Cryopreservation of human blastocyst stemcells by use of a closed straws vitrification method
· W O 2 0 0 4 0 9 9 3 9 4 ，A m e t h o d f o r t h e e f f i c i e n t t r a n s f e r o f humanblastocyst-derived stem cells from a feeder-supported to afeeder-free culture system
·Noaksson K， Zoric N， Zeng X， Rao MS， Hyllner J， Semb H， Kubista M， Sartipy P， Monitoring differentiation of humanembryonic stem cells using real-time PCR. Stem Cells.2005Nov-Dec ； 23(10) ： 1460-7.Epub 2005 Aug 4.
·Sjogren-Jansson E， Zetterstrom M， Moya K， Lindqvist J， Strehl R， Eriksson PS.Large-scale propagation of fourundifferentiated human embryonic stem cell lines in afeeder-free culture system， Dev Dyn.2005Aug ； 233(4) ： 1304-14.
·D′ Amour KA， Bang AG， Eliazer S， Kelly OG， Agulnick AD， Smart NG， Moorman MA， Kroon E， Carpenter MK， Baetge EE.， Productionof pancreatic hormone-expressing endocrine cells from humanembryonic stem cells.， Nat Biotechnol.2006Nov ； 24(11) ： 1392-401
·D ′ Amour KA， Agulnick AD， Eliazer S， Kelly OG， Kroon E， Baetge EE.， Efficient differentiation of human embryonic stemcells to definitive endoderm.， Nat Biotechnol.2005 Dec ； 23
(12) ： 1534-41.
·Cai J， Zhao Y， Liu Y， Ye F， Song Z， Qin H， Meng S， ChenY， Zhou R， Song X， Guo Y， Ding M， Deng H.， Directed differentiationof human embryonic stem cells into functional hepatic cells.， Hepatology.2007May ； 45(5) ： 1229-39.
·Soderdahl T ， Kuppers-Munther B， Heins N， Edsbagge J， Bjorquist P，Cotgreave I， Jernstrom B. ″ Glutathione transferasesin hepatocyte-like cells derived from human embryonic stemcells. ″ Toxicol In Vitro.2007Aug ； 21(5) ： 929-37.Epub 2007Feb 2.
本发明的具体实施方案是 ：
阶段 II-DH-Hep 祖先
1. 用于制备经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干 (hBS) 细胞的 DE-Hep 祖细胞的 方法， 所述方法包括
i) 在培养基中培养衍生自 hBS 细胞的定型内胚层细胞， 共 5 天或更多天， 所述培养 基包括生长因子尤其是 FGF2 和成骨蛋白尤其是 BMP4，
ii) 任选地， 收获因此获得的成肝细胞样祖细胞。
2. 根据条款 1 的方法， 其中所述培养基是 RPMI 高级培养基或 DMEM 培养基。
3. 根据条款 1 和 2 的方法， 其中所述培养基补充有 FGF2、 PEST 和 / 或 GlutaMAX。
5. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述培养基每天或每隔一天进行更换。
6. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述培养基进一步包括一种或多种生长因 子尤其是 aFGF 和成骨蛋白尤其是 BMP2。
7. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述培养基进一步包括血清例如 FCS。
8. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述培养基进一步包括 HGF。
9. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述细胞根据下述方案进行培养 ：
第1和2天： 所述培养基包含 FGF2、 BMP4、 一种或多种进一步的成骨蛋白尤其是 BMP2、 血清尤其是 FCS、 PEST 和 GlutaMAX、 和任选地一种或多种进一步的生长因子尤其是 aFGF。
10. 根据前述条款中任一项的方法、 其中所述细胞根据下述方案进行培养 ：
第3天： 所述培养基包含 FGF2、 BMP4、 血清尤其是 FCS、 PEST、 GlutaMAX、 和任选地 肝细胞生长因子。
11. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述细胞根据下述方案进行培养 ：
第4天： 所述培养基包含 FGF2、 BMP4、 HGF、 血清尤其是 FCS、 PEST、 GlutaMAX 和肝 细胞生长因子， 或备选地所述培养基包含 FGF1、 FGF2 和血清尤其是 FCS。
12. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述细胞根据下述方案进行培养 ：
第5天： 所述培养基包含 FGF2、 BMP4、 HGF、 血清尤其是 FCS、 PEST、 GlutaMAX， 或备 选地所述培养基包含 HGF、 FGF2 和血清尤其是 FCS。
13. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述细胞根据下述方案进行培养 ：
第 6-8 天 ： 所述培养基包含 FGF2， HGF， 血清尤其是 FCS， PEST， GlutaMAX。
14. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述细胞培养 8 天， 所述 FCS 浓度在第 6 天时增加， 并且生长因子尤其是 EGF 的补充剂在第 6 天时给予， 并且从第 6 天到第 8 天所述 培养基每天进行更换。
DE-Hep 祖先的表征
15. 根据前述条款中任一项的方法， 其中获得的所述细胞显示 HNF3b、 HNF4a、 EpCAM、 AFP、 结蛋白、 CD133、 Notch2、 ICAM1、 CK7、 CK18 和 Ck19 中的一种或多种的基因表达。
16. 根 据 前 述 条 款 中 任 一 项 的 方 法， 其 中 获 得 的 所 述 细 胞 显 示 HNF1、 HNF3b、HNF4a、 EpCAM、 AFP、 结蛋白、 CD133、 、 ICAM1、 CK8、 CK18 和 Ck19 中的一种或多种的基因表达。
17. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述细胞群体包括显示条款 15-16 中限 定的标记的至少 25％例如至少 50％细胞。
阶段 I 的包括
18. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述定型内胚层细胞通过在培养基中培 养 hBS 细胞来获得， 所述培养基包括活化素 A 和任选地一种或多种生长因子 Wnt3a 和血清 尤其是 FCS。
19. 根据条款 18 的方法， 其中所述培养基是 RPMI 高级培养基或 DMEM 培养基。
20. 根据条款 18 或 19 的方法， 其中所述培养基补充有一种或多种生长因子尤其是 FGF2。
21. 根据条款 18-20 中任一项的方法， 其中所述 hBS 细胞根据下述方案进行培养 ：
第1天： 所述培养基包含活化素、 Wnt3A 和生长因子尤其是 FGF2。
22. 根据条款 18-21 中任一项的方法， 其中所述 hBS 细胞根据下述方案进行培养 ：
第2天： 所述培养基包含活化素、 血清和生长因子尤其是 FGF2。
23. 根据条款 18-22 中任一项的方法， 其中所述 hBS 细胞根据下述方案的培养物 ：
第3和4天： 所述培养基包含活化素、 血清和生长因子尤其是 FGF2。
24. 根据前述条款中任一项的方法， 其中所述定型内胚层细胞的培养在条款 18-23 中限定的条件下培养 hBS 细胞 4 天后开始， 用于获得定型内胚层细胞。
25. 根据条款 1-17 或 24 中任一项的方法， 其中从定型内胚层细胞开始的所述培养 继续 5 天或更多天。
阶段 III
26. 根据前述条款中任一项的方法， 其进一步包括在培养基中培养如条款 1-23 中 任一项中限定的获得的所述 DE-hep 祖细胞的步骤， 所述培养基例如基于 Williams E 的培 养基或 HCM Cambrex 培养基， 任选补充有单独或组合的分化诱导剂， 例如地塞米松、 奥美拉 唑、 利福平、 脱氧苯巴比妥、 乙醇、 异烟肼 ；
ITS 混合物 ；
BMP 和 / 或 TGFP， 尤其是 BMP4 和 / 或
HGF。
27. 根据条款 26 的方法， 其中所述培养执行 10-25 天或更多天。
28. 根据条款 27 的方法， 其中所述培养基每天更换直至第 15 天时， 并且相关时， 对 于其余培养期每隔一天更换。
得自方法 24-26 的 DE-Hep 细胞的表征
29. 根据条款 26-28 中任一项的方法， 其中在获得的细胞群体中的至少 20％细胞 或细胞核显示下述特征中的至少一种， 例如至少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种或全 部： 葡萄糖 6 磷酸酶、 载脂蛋白 E、 CYP7A1( 胆固醇 7α 羟化酶 )、 醇脱氢酶 1、 细胞色素 P450 还原酶、 HNF4a、 α-1- 抗胰蛋白酶、 CK18、 HNF3b、 白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白和下述 11 种 特征中的至少 2 种， 例如至少 4 种、 至少 6 种、 至少 8 种、 至少 10 种或全部
A. 药物转运蛋白
i) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 BSEP 的蛋白质和 / 或基因表达，ii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MRP2 的蛋白质和 / 或基因表达，
iii) 至少 1 ％的细胞或相关的细胞核显示 OATP-2( ＝ OATP-C、 OATP1B1) 和 / 或 OATP-8(OATP1B3) 的蛋白质和 / 或基因表达，
iv) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 OATP-A( ＝ OATP1A2) 的蛋白质和 / 或基 因表达，
v) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 NTCP 的蛋白质和 / 或基因表达，
vi) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MDR1 的蛋白质和 / 或基因表达，
vii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 MDR3 的蛋白质和 / 或基因表达，
viii) 至少 1％的细胞或相关的细胞核显示 OCT-1 的蛋白质和 / 或基因表达
B. 药物代谢酶
ix) 至少 20％的细胞或相关的细胞核显示 GST A1-1 和 GSTM1-1 的蛋白质和 / 或 基因表达，
x) 至少 5％的细胞或相关的细胞核显示下述 CYP s-1A1、 -1A2、 -1B1、 -2A6、 -2B6、 2C8、 -2C9、 -2C19、 -2D6、 -2E1、 -3A4、 -3A7 和 -7A1 中的至少 2 种的蛋白质和 / 或基因表达，
xi) 至少 5％的细胞或相关的细胞核显示 UGT1A6 和 / 或 UGT2B7 的蛋白质和 / 或 基因表达。
30. 根据条款 26-29 中任一项的方法， 其中在获得的细胞群体中的至少 20％细胞 显示下述特征中的至少一种 ： α-1- 抗胰蛋白酶、 CK18、 HNF3β、 白蛋白或肝脏脂肪酸结合 蛋白和下述 6 种特征中的至少 2 种
A. 药物转运蛋白
i) 至少 1％的细胞显示 BSEP 的蛋白质和 / 或基因表达，
ii) 至少 1％的细胞显示 MRP2 的蛋白质和 / 或基因表达，
iii) 至少 1％的细胞显示 OATP-2 和 / 或 OATP-8 的蛋白质和 / 或基因表达，
B. 药物代谢酶
iv) 至少 20％的细胞显示 GST A1-1 的蛋白质和 / 或基因表达，
v) 至少 20％的细胞显示下述 CYP450s-1A2、 -2A6、 -2B6、 -2C8、 -2C9、 -2C19、 -2D6、 2E1、 -3A4 和 -3A7 中的至少 2 种的蛋白质和 / 或基因表达，
vi) 至少 5％的细胞显示 GST M 1-1 的蛋白质和 / 或基因表达。
31. 根据条款 26-30 中任一项的方法， 其中在获得的细胞群体中的至少 20％细胞 具有至少一种所述药物转运蛋白特征和至少一种所述药物代谢特征。
32. 根据条款 29-31 中任一项的方法， 其中在获得的细胞群体中的至少 20％细胞 具有至少 4 种例如至少 5 种所述特征。
33. 根据条款 29-32 中任一项的方法， 其中在获得的细胞群体中的至少 20％细胞 具有所有 6 种所述特征。
34. 根据条款 29-33 中任一项的方法， 其中特征 i) 对于至少 5％， 例如至少 10％、 至少 15％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至 少 90％或至少 95％所述细胞有效。
35. 根据条款 29-34 中任一项的方法， 其中特征 ii) 对于至少 5％， 例如至少 10％、 至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％或至少 95％所述细胞有效。
36. 根据条款 29-35 中任一项的方法， 其中特征 iii) 对于至少 5 ％， 例如至少 10 ％、 至少 20 ％、 至少 30 ％、 至少 40 ％、 至少 50 ％、 至少 60 ％、 至少 70 ％、 至少 80 ％、 至少 90％或至少 95％所述细胞有效。
37. 根据条款 29-36 中任一项的方法， 其中特征 iv) 对于至少 30 ％， 例如至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％或至少 95％所述细胞有效。
38. 根据条款 29-37 中任一项的方法， 其中特征 v) 对于至少 30％， 例如至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％或至少 95％所述细胞有效。
39. 根据条款 29-38 中任一项的方法， 其中特征 vi) 对于至少 10 ％， 例如至少 20％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％或至少 95％所述细胞有效。
40. 根据条款 29-39 中任一项的方法， 其中在所述细胞群体中的至少约 30％， 例如 至少约 40％、 至少约 50％、 至少约 60％、 至少约 70％、 至少约 80％、 至少约 90％或至少约 95％所述细胞表达下述特征中的至少一种 ： α-1- 抗胰蛋白酶、 细胞角蛋白 18、 HNF-3β、 白 蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白。
41. 根据条款 29-40 中任一项的方法， 其中获得的至少约 5％所述细胞共表达细胞 角蛋白 18 和 CYP3A4 和 / 或 CYP3A7。
42. 根据条款 29-41 中任一项的方法， 其中获得的至少 20％所述细胞表达 CYP450 蛋白质中的至少一种， 可在添加诱导剂后诱导。
43. 根据条款 29-42 中任一项的方法， 其中获得的至少 20 ％所述细胞表达 GST A1-1 和 / 或 GST M1-1 蛋白质， 可在添加诱导剂后诱导。
44. 根据条款 29-43 中任一项的方法， 其中所述 UGT 蛋白质的表达可在添加诱导剂 后诱导。
45. 根据条款 29-44 中任一项的方法， 其中获得的至少 25％所述细胞显示特征 v) 的 CYP450 蛋白质中的至少一种的酶促活性。
46. 根据条款 29-45 中任一项的方法， 其中获得的至少 25％所述细胞显示 GST 酶 促活性。
47. 根据条款 46 的方法， 其中所述 GST 酶促活性是在所述细胞群体的裂解物 中 0.4μmol/ 分 钟 /mg， 例 如 至 少 0.6μmol/ 分 钟 /mg、 至 少 0.8μmol/ 分 钟 /mg、 至少 1.0μmol/ 分钟 /mg、 至少 1.2μmol/ 分钟 /mg、 至少 1.4μmol/ 分钟 /mg、 或至少 1.6μmol/ 分钟 /mg 蛋白质。
48. 根据条款 29-47 中任一项的方法， 其中所述细胞群体显示 UGT 酶促活性。
49. 根据条款 29-48 中任一项的方法， 其中获得的所述细胞在体外培养至少 24 小 时， 例如至少 72 小时并具有维持特征。
50. 根据条款 29-49 中任一项的方法， 其中获得的至少 25％所述细胞进一步表达 α-1- 抗胰蛋白酶、 L-FABP 和 CK-18。
51. 根据条款 29-50 中任一项的方法， 其进一步包括饲养细胞例如人或小鼠饲养 细胞的使用。
52. 根据条款 29-50 中任一项的方法， 其不包括饲养细胞的任何使用。53. 根据条款 29-50 中任一项的方法， 相关时， 其包括自体饲养细胞的使用。
54. 根据条款 29-53 中任一项的方法， 其中所述细胞的培养涉及塑料细胞培养瓶 的使用， 所述塑料细胞培养瓶在内部包被有单独或组合的一种或多种蛋白质。
55. 根据条款 54 的方法， 其中所述一种或多种蛋白质选自胶原、 层粘连蛋白及其 组合。
56. 根据条款 54 或 55 中任一项的方法， 其中所述细胞群体使用 3D 环境例如多孔 滤器获得。
57.DE-hep 祖细胞， 其可通过条款 1-15 中任一项中限定的方法获得。
58.DE-hep 祖细胞， 其如条款 15-17 中限定的表征。
59.DE-hep 细胞， 其可通过条款 26-56 中任一项中限定的方法获得。
60.DE-hep 细胞， 其具有条款 29-56 中任一项中限定的特征。
61. 如条款 58-68 中任一项中限定的细胞群体用于在药物开发过程中使用的用 途。
70. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体在用于研究药物转运蛋白的体外模 型中的用途。
71. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体在用于研究药物代谢酶的体外模型 中的用途。
72. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体在用于研究肝生成例如早期肝生成 的体外模型中的用途。
73. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体在用于研究人肝再生障碍的体外模 型中的用途。
74. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体用于体外肝毒性测试的用途。
75. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体在药剂中的用途。
76. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于预防和 / 或 治疗由组织退化 ( 例如肝脏组织退化 ) 引起的病理状态和 / 或疾病的用途。
77. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于治疗肝脏病 症的用途。
78. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于预防和 / 或 治疗选自下述的肝脏病症的用途 ： 自身免疫病症， 包括原发性胆汁性肝硬化 ； 代谢病症， 包 括血脂异常 ； 由例如酒精滥用引起的肝脏病症 ； 由病毒引起的疾病， 例如乙型肝炎、 丙型肝 炎和甲型肝炎 ； 由针对例如药学药物的急性中毒反应引起的肝脏坏死 ； 和在患有例如肝细 胞癌的患者中的肿瘤摘除。
79. 如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于治疗和 / 或 预防代谢病理状态和 / 或疾病的用途。
80. 来自如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体的一种或多种细胞用于获得代 谢改善的肝细胞样细胞的用途。
81. 来自如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体的一种或多种细胞用于研究朝 向肝细胞样细胞成熟的用途。
82. 用于就肝细胞毒性筛选化合物的方法， 其包括使来自如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体的细胞暴露于所述化合物， 并且测定所述化合物对所述细胞是否是毒性 的。
83. 用于就调节肝细胞功能的能力筛选化合物的方法， 其包括使来自如条款 57-61 中任一项中限定的细胞群体的细胞暴露于所述化合物， 测定所述细胞中起因于与所 述化合物接触的任何表型或代谢变化， 并且使所述变化与调节肝细胞功能的能力关联。