一种电化学式基因传感器探头及其制备方法.pdf

一种电化学式基因传感器探头及其制备方法，它涉及一种基因传感器探头及其制备方法。它解决了目前基因传感器存在的灵敏度低、探针结合力小、使用寿命短，探针在基质电极上取向性差等缺陷。本发明探头由玻碳电极、铂纳米颗粒、亲和素和生物素标记的ssDNA探针制成。制备方法：一、玻碳电极预处理；二、电沉积铂纳米颗粒；三、亲和素吸附于铂纳米颗粒上；四、将生物素标记的ssDNA探针滴加到吸附有亲和素的铂纳米沉积电极上，然后清洗，即得到电化学式基因传感器探头。本发明探头具有灵敏度高，探针结合力大、稳定，使用寿命长，探针在基质电极上取向性好的优点。

1、  一种电化学式基因传感器探头，其特征在于电化学式基因传感器探头由玻碳电极、铂纳米颗粒、亲和素和生物素标记的ssDNA探针制成；铂纳米颗粒沉积于玻碳电极表面、亲和素吸附于沉积的铂纳米颗粒之上，亲和素与生物素标记的ssDNA探针通过亲和作用相连。

2、  如权利要求1所述电化学式基因传感器探头的制备方法，其特征在于电化学式基因传感器探头按以下步骤制备：一、用直径为0.01μm的Al₂O₃粉末抛光玻碳电极至镜面，然后超声清洗，再放入浓度为0.5mol/L的H₂SO₄溶液中循环伏安扫描至得到稳定的伏安图，之后将玻碳电极放入混合溶液中扫描至循环伏安曲线峰电位差≤70mV；二、将步骤一处理过的玻碳电极浸入H₂SO₄浓度为0.5mol/L、K₂PtCl₆浓度为2.5mmol/L的电沉积液中，采用Step Functions法电沉积铂纳米颗粒；三、将亲和素吸附于铂纳米颗粒上；四、将浓度为1OD/mL的生物素标记的ssDNA探针滴加到吸附有亲和素的铂纳米沉积电极上，在室温条件下自然干燥，然后用TE液清洗，即得到电化学式基因传感器探头；其中步骤一将玻碳电极放入混合溶液中以电位为-0.1～0.6V、扫描速度为50mV/s的条件进行扫描；步骤一混合溶液中KNO₃的浓度为0.2mol/L、K₃Fe(CN)₆的浓度为1×10^-3mol/L；步骤二中先向电沉积液通入氮气1min，然后维持电沉积过程中电沉积液N₂气氛。

3、  根据权利要求2所述的电化学式基因传感器探头的制备方法，其特征在于步骤三将电沉积了铂纳米颗粒的电极浸入浓度为1mg/L的亲和素溶液，置于室温环境中放置50min，然后取出晾干，再浸入浓度为1mg/L的亲和素溶液在室温环境中放置50min，之后取出晾干，再用D-PBS溶液反复清洗5min。

一种电化学式基因传感器探头及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种基因传感器探头及其制备方法。
背景技术
转基因食品(Genetically Modified Food GMF)是指用转基因生物所制造或生产的食品、食品原料和食品添加剂等，其中主要指用作食品的转基因植物。自20世纪70年代转基因生物和转基因食品被开发以来一直以迅猛的速度发展。但是相对于传统的自然食品而言，转基因食品还是一个新生事物，存在着不确定的因素和未知效应，其安全性受到质疑。
为了评价转基因食品的安全性需要对转基因成分进行检测。采用PCR技术检测外源基因存在所用仪器设备价格昂贵、操作条件要求高、需要与电泳技术结合等缺陷，导致难以推广应用；而采用外源蛋白技术检测外源基因存在以下缺点：①食品中的蛋白质容易失活或分解，因而使检测结果出现假阴性；②有些外源基因不产生蛋白质表达；③而有些外源蛋白如NovertisBT176玉米外源蛋白质只存在于叶片中而不存在于玉米果实中，容易导致检测结果出现假阴性。因此，目前采用可以克服以上缺陷的基因传感器检测转基因食品的转基因成分；可是现有的基因传感器存在探针覆盖率低和探针活性低(导致灵敏性差)，以及探针结合力小、不稳定，使用寿命短，探针在基质电极上取向性差等缺陷。
发明内容
本发明要解决目前基因传感器存在探针覆盖率低和探针活性低(导致灵敏性差)，以及探针结合力小、不稳定，不能定量分析，使用寿命短，探针基质电极上取向性差等缺陷；而提供的一种电化学式基因传感器探头及其制备方法。
电化学式基因传感器探头由玻碳电极、铂纳米颗粒、亲和素和生物素标记的ssDNA探针制成；铂纳米颗粒沉积于玻碳电极表面、亲和素吸附于沉积的铂纳米颗粒之上，亲和素与生物素标记的ssDNA探针通过亲和作用相连。
上述电化学式基因传感器探头按以下步骤制备：一、用直径为0.01μm的Al₂O₃粉末抛光玻碳电极至镜面，然后超声清洗，再放入浓度为0.5mol/L的H₂SO₄溶液中循环伏安扫描至得到稳定的伏安图，之后将玻碳电极放入混合溶液中扫描至循环伏安曲线峰电位差≤70mV；二、将步骤一处理过的玻碳电极浸入H₂SO₄浓度为0.5mol/L、K₂PtCl₆浓度为2.5mmol/L的电沉积液中，采用Step Functions法电沉积铂纳米颗粒；三、将亲和素吸附于铂纳米颗粒上；四、将浓度为1OD/mL的生物素标记的ssDNA探针滴加到吸附有亲和素的铂纳米沉积电极上，在室温条件下自然干燥，然后用TE液清洗，即得到电化学式基因传感器探头；其中步骤一将玻碳电极放入混合溶液中以电位为-0.1～0.6V、扫描速度为50mV/s的条件进行扫描；步骤一混合溶液中KNO₃的浓度为0.2mol/L、K₃Fe(CN)₆的浓度为1×10^-3mol/L；步骤二中先向电沉积液通入氮气1min，然后维持电沉积过程中电沉积液N₂气氛。
本发明电化学式基因传感器探头在玻碳电极表面沉积了铂纳米颗粒，由于铂纳米颗粒比表面积大、表面活性中心多、吸附能力强，具有独特的电子特性，在电化学反应中可以作为优越的电子传递媒介；铂纳米颗粒可提高电极的有效表面，增大DNA探针的修饰量，大幅提高了检测靶基因的灵敏度。
本发明电化学式基因传感器探头在铂纳米颗粒上吸附亲和素，利用亲和素与生物素之间极强的生物亲和力(结合常数达10¹⁵)，使ssDNA探针能更稳定地结合于电极表面，延长了基因传感器的使用寿命。将本发明电化学式基因传感器探头分别浸入浓度为1mol/L盐酸溶液中15min和浓度为1mol/L氢氧化钠溶液中10分钟，电化学信号基本没有改变，能继续进行杂交检测——稳定性强。而且，本发明电化学式基因传感器探头测定后可再生重复使用，重复使用8次后测定响应值仍为初次测定的90％。
本发明电化学式基因传感器探头上的ssDNA探针不是平铺在电极表面，而是直立于玻碳电极，ssDNA探针的活动自由度增大，有利于与靶基因进行杂交反应，提高传感器的选择性和灵敏度。本发明电化学式基因传感器探头具有高选择性，选择与ssDNA探针互补链有1个错配碱基的靶基因，检测杂交前后的电化学信号基本没有变化，而现有的基因传感器一般需检测2～3个错配碱基的靶基因无明显信号。
采用了本发明电化学式基因传感器探头的电化学式基因传感器的线性范围为1.0×10^-10～3.2×10^-7mol/L、回归系数为0.999、检出限为2.0×10^-11mol/L。用本发明电化学式基因传感器探头连续5次测定含量相同的靶基因，测量信号的相对标准偏差(RSD)小于4％。使用本发明电化学式基因传感器探头进行检测，探头与靶基因杂交时间为30min，电化学检测时间为10min，比现有PCR技术检测技术节省2小时20分钟。
附图说明
图1是具体实施方式四中被检测基因浓度在1.0×10^-10～3.2×10^-7mol/L范围，杂交前后的峰电流差值与浓度线的性关系图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式电化学式基因传感器探头由玻碳电极、铂纳米颗粒、亲和素和生物素标记的ssDNA探针制成；铂纳米颗粒沉积于玻碳电极表面、亲和素吸附于沉积的铂纳米颗粒之上，亲和素与生物素标记的ssDNA探针通过亲和作用相连。
本实施方式可根据不同的靶基因(检测目的基因)序列设计互补DNA链作为ssDNA探针。
本实施方式中纳米颗粒与亲和素相结合，在修饰电极的技术路线上开辟了先河。
具体实施方式二：本实施方式电化学式基因传感器探头按以下步骤制备：一、用直径为0.01μm的Al₂O₃粉末抛光玻碳电极至镜面，然后超声清洗，再放入浓度为0.5mol/L的H₂SO₄溶液中循环伏安扫描至得到稳定的伏安图，之后将玻碳电极放入混合溶液中扫描至循环伏安曲线峰电位差≤70mV；二、将步骤一处理过的玻碳电极浸入H₂SO₄浓度为0.5mol/L、K₂PtCl₆浓度为2.5mmol/L的电沉积液中，采用Step Functions法电沉积铂纳米颗粒；三、将亲和素吸附于铂纳米颗粒上；四、将浓度为1OD/mL的生物素标记的ssDNA探针滴加到吸附有亲和素的铂纳米沉积电极上，在室温条件下自然干燥，然后用TE液清洗，即得到电化学式基因传感器探头；其中步骤一将玻碳电极放入混合溶液中以电位为-0.1～0.6V、扫描速度为50mV/s的条件进行扫描；步骤一混合溶液中KNO₃的浓度为0.2mol/L、K₃Fe(CN)₆的浓度为1×10^-3mol/L；步骤二中先向电沉积液通入氮气1min，然后维持电沉积过程中电沉积液N₂气氛。
本实施方式步骤三将电沉积了铂纳米颗粒的电极浸入浓度为1mg/L的亲和素溶液，置于室温环境中放置50min，然后取出晾干，再浸入浓度为1mg/L的亲和素溶液在室温环境中放置50min，之后取出晾干，再用D-PBS溶液反复清洗5min。
本实施方式步骤二中先向电沉积液通入氮气1min除氧。本实施方式镜面表面粗糙度≤RA0.01μm。本实施方式制备得到的基因传感器探头放于4℃环境中保存。
经实验选择与ssDNA探针互补链有1个错配碱基的靶基因，检测杂交前后的电化学信号基本没有变化。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤一中超声清洗2次，每次超声清洗2min。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式利用具体实施方式二制备出的电化学式基因传感器探头检测转基因食品：
本实施方式中以目前较为常用的基因构件花椰菜花叶病毒的35S启动子(5’-TGATGGCATTTGTAGGAGC-3’)和农杆菌终止子(NOS)(5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’)分别作为目的基因；
分别获得生物素标记的ssDNA探针，花椰菜花叶病毒的35S启动子ssDNA探针序列为：5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’，农杆菌终止子(NOS)ssDNA探针序列为：5’-CAAGACCGGCAACAGGATTC-3’；
将电化学式基因传感器探头浸入含有被检测基因的2×SSC杂交液中，置于50±1℃环境中杂交反应30min，然后取出电化学式基因传感器探头用50±1℃的2×SSC-0.1％SDS和0.2×SSC-0.1％SDS洗液分别清洗探头各1min，再用双蒸水清洗1min，用于检测；
以杂交反应前后的电化学式基因传感器探头作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为辅助电极，将电极置于[Co(phen)₃]³⁺浓度为0.100mmol/L的5mmol/LTris-HCl+5mmol/LNaCl缓冲液(pH7.05)中浸泡2min，并加0.5V的电压，用双蒸水冲洗电极，除掉未结合的Co(phen)₃³⁺，然后将电极浸入5mmol/LTris-HCl+5mmol/L NaCl的缓冲液中进行方波伏安法(SWV)检测，记录杂交反应前后[Co(phen)₃]³⁺的还原峰电流值，依据电流值的变化测定DNA含量。
本实施方式中被检测基因的浓度在1.0×10^-10～3.2×10^-7mol/L，杂交前后的峰电流差值与浓度成线性关系(如图1所示)，线性回归方程是y＝0.160x-0.651，线性回归系数为0.999，据此，计算出转基因DNA的含量。
本实施方式将杂交后的电化学式基因传感器探头置于温度为100℃的热去离水中变性洗脱90s后，立即浸入冰水中120s，再用双蒸水冲洗2～5次，即可重复使用，重复使用8次后测定响应值仍为初次测定的90％。
本实施方式中花椰菜花叶病毒的35S启动子和农杆菌终止子(NOS)的检测线性范围均为1.0×10^-10～3.2×10^-7mol/L、回归系数均是0.999、检出限为2.0×10^-11mol/L；连续测定同一杂交液5次，测量信号的相对标准偏差(RSD)为3.7％。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：利用植物基因组提取试剂盒提取样品大豆中全部DNA序列，用特异核酸内切酶HindIII酶切提取待测的DNA片段，使之成为小的片段，加热使之解链，形成单链，以其中一条单链作为待测序列进行转基因检测。其它步骤及参数与实施方式二相同。
本实施方式举例说明了检测样品DNA的提取、酶切和变性方法。
序列表
<110>杜晓燕
<120>一种电化学式基因传感器探头及其制备方法
<160>4
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)
<220>
<223>花椰菜花叶病毒的35S启动子。
<400>1
tgatggcatt tgtaggagc       19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<220>
<223>农杆菌终止子(NOS)。
<400>2
gaatcctgtt gccggtcttg      20
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>花椰菜花叶病毒的35S启动子ssDNA探针。
<400>3
gctcctacaa atgccatca      19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>农杆菌终止子(NOS)ssDNA探针。
<400>4
caagaccggc aacaggattc       20