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1、(10)授权公告号 CN 102220245 B (45)授权公告日 2012.08.22 CN 102220245 B *CN102220245B* (21)申请号 201110122361.X (22)申请日 2011.05.12 CGMCC No. 4538 2011.01.13 C12N 1/14(2006.01) C12R 1/66(2006.01) A62D 101/28(2007.01) C02F 101/34(2006.01) (73)专利权人 哈尔滨师范大学 地址 150025 黑龙江省哈尔滨市利民开发区 师大南路 1 号 (72)发明人 郭长虹 于典司 宋鸽 董蕊 宋丽莉 。
2、林海龙 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 CN CN101250486A A,2008.08.27, 全文 . CN CN102021121A A,2011.04.20, 全文 . Tetsuya K et al.Purification and characterization of formate oxidase.FEMS Microbiology Letters .2002, 第 214 卷 ( 第 1 期 ),137-142. (54) 发明名称 红绶曲霉 SGFA1 及其在降解甲醛中的应用 (57) 摘要 本发明公开了红绶曲霉 S。
3、GFA1 及其在降 解甲醛中的应用。本发明所提供的红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1， 其保藏号为 CGMCC No.4538。 本发明所提供的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1 可在好氧条件下将甲醛做为唯一 碳源进行生长， 同时将其降解。在纯培养条件下， 能将浓度为 80mmol/L 的甲醛在 7 天内降解完全。 该菌株有望在工业废水的生物处理中发挥重要作 用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙薇 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 。
4、(12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种红绶曲霉菌株， 其特征在于 ： 该菌株是红绶曲霉 (Aspergillus nomius) 菌株 SGFA1， 其保藏号为 CGMCC No.4538。 2. 权利要求 1 所述的红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 在降解甲醛中的应用。 3. 一种降解甲醛的菌剂， 其活性成分为权利要求 1 所述的红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1。 4. 权利要求 3 所述的菌剂在降解甲醛中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102220245 B 。
5、2 1/5 页 3 红绶曲霉 SGFA1 及其在降解甲醛中的应用 技术领域 0001 本发明涉及红绶曲霉 SGFA1 及其在降解甲醛中的应用。 背景技术 0002 甲醛在常温下是一种无色， 有强烈刺激性气味的气体， 易溶于水、 醇和醚， 通常以 水溶液的形式出现。甲醛易发生加成、 氧化、 还原、 聚合等化学反应， 具有高度的水溶性， 能 够与生物大分子高度反应， 甲醛在接触部位吸收或降解， 进入人体后， 主要与人体的蛋白质 和核酸反应 ： 引起细胞核基因突变、 DNA 单链内交连、 DNA 与蛋白质交连、 抑制 DNA 损伤的修 复， 与氨基结合， 改变蛋白质的内部结构并凝固， 扰乱人体细胞的。
6、正常代谢， 从而产生杀伤 力。 长时间吸入甲醛气体， 可损伤肝脏、 肾脏、 血液系统、 消化系统、 呼吸系统、 中枢神经系统 和免疫系统， 妇女、 孕妇长时间接触低浓度甲醛气体， 能导致月经紊乱、 胎儿畸形、 新生儿免 疫力降低、 体质下降， 智力发育产生障碍。甲醛有毒， 致畸， 同时甲醛也具有强烈的致癌作 用， 在我国有毒化学品优先控制的名单上居第 2 位。甲醛是一种重要的化工原料和有机溶 剂。 常用于制造树脂、 塑料、 药品、 油漆、 合成纤维和各种黏合剂等工业品， 也可用作消毒、 防 腐等 (Hesham R.Lotfy， Rashed I.G.A method for treating。
7、 waste water containing form aldehydeJ.Water Research， 2002， 36 ： 633-637)。 环境中甲醛的主要来源是甲醛生 产企业以及以甲醛为原料的有机合成、 木材加工、 染料、 制漆等行业排放的废水。 0003 目前对甲醛废水的处理方法主要有化学反应法 ( 软锰矿催化氧化、 次氯酸钠、 亚 氯酸钠、 二氧化氯、 高锰酸钾等的氧化作用 )、 电化学法、 电解氧化、 氧化吸附法、 物理吸附技 术、 臭氧负离子技术、 纳米光催化技术、 低温等离子技术和生物降解等方法。但是， 化学方 法的反复使用会造成二次污染 ； 物理方法普遍存在成本较高，。
8、 操作复杂和处理效果不理想 等问题。相对的， 微生物法则以生态环境中的有益菌为材料， 成本低， 效果好， 而且无二次 污染。微生物以污染物中的有机物、 富营养元素为食物， 大量生长繁殖， 加速消耗污染物中 有机物、 污染物、 营养成份， 从而彻底治理污染。特选的微生物能保持长久的活性， 它们以 各自针对分解的有毒物质为 “食物” ， 快速、 大量繁殖， 在污染物表面及浅表层形成菌群保护 膜， 随时截杀从污染源渗透或挥发出的污染物， 从而能长久地起作用由于它能渗入到污染 源中， 在不破坏原始材料的情况下， 有效分解有害物质从而治标治本， 杜绝后患。 无毒无害， 不会危害人体和造成环境二次污染。 。
9、0004 目前常用的生物方法多是应用筛选自各类不同生境的甲醛降解细菌和酵母， 这类 微生物对不良环境， 如紫外辐射、 低营养、 低 pH 值等适应性不佳， 繁殖传播能力较差， 且不 易保存。丝状真菌普遍存在于水体和土壤环境中， 其菌丝体能提供较大的表面积与污染物 接触， 有利于污染物的充分降解 ； 其孢子能够适应各类不良环境。因此， 亟待开发一种能够 有效降解废水中甲醛， 且安全、 环保、 高效的真菌菌种。 发明内容 0005 本发明的一个目的是提供红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1。 说 明 书 CN 102220245 B 3 2/5 页 4 0006 本发明所提。
10、供的红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1， 其保藏号为 CGMCC No.4538。 0007 本发明的另一个目的是提供所述红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在降解甲 醛中的应用。 0008 本发明的又一个目的是提供一种降解甲醛的菌剂。 0009 本发明所提供的降解甲醛的菌剂， 其活性成分为所述红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1。 0010 所述菌剂在降解甲醛中的应用也属于本发明的保护范围。 0011 本发明所提供的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1可在好氧条件下将甲醛作 为唯一碳源进行生长， 同。
11、时将其降解。在纯培养条件下， 能将浓度为 80mmol/L 的甲醛在 7 天内降解完全。该菌株有望在工业废水的生物处理中发挥重要作用。 附图说明 0012 图 1 为红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 在孟加拉红培养基上的生长状况。 0013 图 2 为红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 的分生孢子囊。 0014 图 3 为将红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 在含有 80mmol/l 甲醛的培养基 中培养时甲醛含量的变化。 0015 图4为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同浓度甲。
12、醛的培养基中 培养时菌丝体干重的的变化。 0016 图5为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同浓度甲醛的培养基中 培养时甲醛含量的变化。 0017 图6为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同碳源的培养基中培养 时菌丝体干重的的变化。 0018 图7为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同碳源的培养基中培养 时甲醛含量的变化。 0019 图 8 为不同浓度甲醛标准品对应 OD 值的标准曲线。 具体实施方式 0020 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0021 下述实施例中。
13、所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0022 实施例 1、 红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 的分离和鉴定 0023 一、 红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 的分离 0024 红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 的分离分为取样和富集培养， 筛选和纯化 两个步骤， 具体方法如下 ： 0025 1、 取样和富集培养 0026 取黑龙江省某家具厂未处理的出水口处淤泥样后立即富集培养。在超净工作台 上， 取 10g 淤泥样置于 90mL 无菌水中， 180rmin-1， 置于 30的条件下震荡培。
14、养 5 天。 0027 2、 筛选和纯化 0028 筛选用的是含甲醛的 PDA 培养基， 该培养基的配制方法如下 ： 说 明 书 CN 102220245 B 4 3/5 页 5 0029 取 200g 马铃薯， 洗净去皮切成小块， 加水煮沸 30 分钟， 纱布过滤， 再加 20g 葡萄糖 和 2的琼脂， 定容至 1000mL， 121灭菌 20 分钟， 冷却后加入 10mmol/L 甲醛贮存备用。 0030 将上述步骤1震荡培养5天后生长起来的霉菌经多次用含有10mmol/L甲醛的PDA 培养基平板划线， 直至分离得到单菌落为止。将菌丝顶端移接到 PDA 培养基上连续重复纯 化 3 次， 既。
15、获得纯培养菌株。 0031 二、 红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 的鉴定 0032 对上述实验一得到的纯培养菌株进行一系列形态特征鉴定， 并进行 DNA 提取， ITS 保守区序列的扩增和测序。 该菌株在孟加拉红培养基上呈环状生长， 菌落黄绿色， 反面蛋壳 黄色， 菌体平薄， 粗糙， 内部为黄色， 最外缘为白色， 后期稍呈绿色。 干燥无渗出液， 表面无辐 射状纹， 基质有不规则的辐射皱折沟纹 ( 图 1)。分生孢子穗圆筒状， 淡黄色。分生孢子梗平 滑带黄色。分生孢子囊为球形， 孢子呈葡萄状 ( 图 2)。 0033 孟加拉红培养基的配制方法如下 ： 将蛋白胨5g、。
16、 葡萄糖10g、 KH2PO4 1g、 MgSO4 7H2O 0.5g和琼脂20g加入蒸馏水中溶解后， 加1/3000孟加拉红溶液(取孟加拉红30克， 加蒸馏 水1000毫升， 加热至全部溶解， 即得到1/3000孟加拉红溶液)100mL和氯霉素0.1g， 定容至 1000mL， 分装， 121灭菌 20min， 用于分离霉菌及酵母。 0034 利用通用引物 ITS1 和 ITS4 进行 ITS 保守区序列的扩增， 引物序列如下 ： 0035 ITS1 ： 5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3， 0036 ITS4 ： 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。 0037。
17、 PCR 扩 增 条 件 为 ： 94 3min ； 94 30s， 50 30s， 72 1.5min， 25 个 循 环 ； 72 10min。 0038 对 PCR 扩增产物进行测序， 测序结果如序列表中序列 1 所示。 0039 将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为红绶曲霉 (Aspergillus nomius) SGFA1。 0040 该红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 已于 2011 年 01 月 13 日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号 院 3 号， 中国科学院微生物研。
18、究所， 邮编 100101)， 保藏号为 CGMCC No.4538。 0041 实施例 2、 红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 对甲醛的生物降解效果检测红 绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 一级种子的制备方法如下 ： 0042 将从上述实施例 1 中 PDA 斜面上冲洗下的孢子悬液接入 PD 培养基中， 接种量为 2 ( 体积比 )， 在 30， 180rmin-1， 培养 4 天， 即得到一级种子液。 0043 PD 培养基 ： 除不加琼脂外， 其余成分均与上述 PDA 培养基相同。 0044 ( 一 ) 红绶曲霉 (Aspergill。
19、us nomius)SGFA1 对甲醛的生物降解效果检测 0045 将得到的一级种子液按体积比为 2的比例接种于含 80mmol/l 甲醛的 PD 培养基 中进行培养， 摇床转速 180rmin-1， 温度 30， 培养 7 天。同时， 设不接种一级种子液的对 照。 0046 在接种的第1、 第2、 第3、 第4、 第5、 第6和第7天分别取加菌处理和对照的培养液， 每天测量甲醛剩余量， 共测量7天。 实验设3次重复， 结果取平均值。 结果如图3所示， 加菌 处理的培养液中， 接种 7 天内甲醛浓度呈下降趋势， 且第 7 天甲醛全部降解 ； 而对照的培养 液中， 接种7天内甲醛浓度没有明显的变。
20、化。 此结果说明， 红绶曲霉(Aspergillus nomius) 说 明 书 CN 102220245 B 5 4/5 页 6 SGFA1 可降解甲醛。 0047 ( 二 ) 红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 对不同浓度甲醛的降解效果检测 0048 将得到的一级种子液按体积比为 2的比例分别接种于含有 30mmol/l、 50mmol/L 和 80mmol/L 甲醛的 PD 培养基中进行培养， 摇床转速 180rmin-1， 温度 30， 培养 7 天。 0049 在接种的第 1、 第 2、 第 3、 第 4、 第 5、 第 6 和第 7 天分别取不同甲醛浓度处。
21、理培养 液， 每天测量菌丝干重和甲醛剩余量， 共测量 7 天。实验设 3 次重复， 结果取平均值。结果 如图 4 所示， 即 SGFA1 在 30mmol/L、 50mmol/L 和 80mmol/L 甲醛处理下的生长状况和甲醛降 解状况。从图中可见， SGFA1 在 30mmol/L 甲醛处理下， 第 7 天菌丝体干重达到 0.748g， 在 50mmol/L 甲醛处理下， 第 7 天菌丝体干重达到 0.418g， 在 80mmol/L 甲醛处理下， 第 7 天菌 丝体干重达到0.346g。 此结果说明甲醛浓度越高， 同等质量的菌生长同样时间， 生长状况越 差。 0050 在接种的第1、 第。
22、2、 第3、 第4、 第5、 第6和第7天分别取不同甲醛浓度处理培养液， 每天测量甲醛剩余量， 共测量7天。 实验设3次重复， 结果取平均值。 结果如图5所示。 从图 中可见， 不同甲醛浓度处理的培养液中甲醛浓度均显著下降， 且 SGFA13 天内可将 30mmol/L 甲醛全部降解， 6 天内可将 50mmol/L 甲醛全部降解， 7 天内可将 80mmol/L 甲醛全部降解。 0051 ( 三 ) 不同碳源处理的培养基对红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 降解甲醛 的影响 0052 选取 4 种碳源 ： 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 可溶性淀粉， 按体积比 2的比例添。
23、加到 PD 培 养基中， 设置 5 种不同处理的碳源， 分别为 ： 甲醛 ( 处理 1)、 甲醛 +2葡萄糖 ( 处理 2)、 甲 醛 +2乳糖 ( 处理 3)、 甲醛 +2蔗糖 ( 处理 4) 和甲醛 +2可溶性淀粉 ( 处理 5)， 其余成 分相同。5 种不同处理的培养基的配制方法如下 ： 0053 (1) 以甲醛为碳源的培养基的配制方法如下 ： 200g 马铃薯， 洗净去皮切成小块， 加 水煮沸 30 分钟， 纱布过滤， 再加 2的琼脂， 定容至 1000mL。121灭菌 20 分钟， 冷却后加 入甲醛浓度为 80mmol/L 贮存备用。 0054 (2) 以甲醛 +2葡萄糖为碳源的培养。
24、基的配制方法如下 ： 200g 马铃薯， 洗净去 皮切成小块， 加水煮沸 30 分钟， 纱布过滤， 再加 20g 葡萄糖和 2的琼脂， 定容至 1000mL。 121灭菌 20 分钟， 冷却后加入甲醛浓度为 80mmol/L 贮存备用。 0055 (3) 以甲醛 +2乳糖为碳源的培养基的配制方法如下 ： 200g 马铃薯， 洗净去皮切 成小块， 加水煮沸 30 分钟， 纱布过滤， 再加 20g 乳糖和 2的琼脂， 定容至 1000mL。121灭 菌 20 分钟， 冷却后加入甲醛浓度为 80mmol/L 贮存备用。 0056 (4) 以甲醛 +2蔗糖为碳源的培养基的配制方法如下 ： 200g 马。
25、铃薯， 洗净去皮切 成小块， 加水煮沸 30 分钟， 纱布过滤， 再加 20g 蔗糖和 2的琼脂， 定容至 1000mL。121灭 菌 20 分钟， 冷却后加入甲醛浓度为 80mmol/L 贮存备用。 0057 (5) 以甲醛 +2可溶性淀粉为碳源的培养基的配制方法如下 ： 200g 马铃薯， 洗 净去皮切成小块， 加水煮沸 30 分钟， 纱布过滤， 再加 20g 可溶性淀粉和 2的琼脂， 定容至 1000mL。121灭菌 20 分钟， 冷却后加入甲醛浓度为 80mmol/L 贮存备用。 0058 将红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 一级种子液按体积比为 2的比例接。
26、种 到上述五种培养基中进行培养。摇床转速 180rmin-1， 温度 30， 培养 7 天。 0059 在接种的第 1、 第 2、 第 3、 第 4、 第 5、 第 6 和第 7 天分别取不同处理培养液， 每天取 说 明 书 CN 102220245 B 6 5/5 页 7 2 瓶测量菌丝干重和甲醛剩余量， 共测量 7 天， 实验设 3 次重复， 结果取平均值。结果如图 6 和图 7。 0060 图 6 和图 7 的结果显示 ： 红绶曲霉 (Aspergillus nomius)SGFA1 能利用甲醛作为 唯一碳源生长繁殖， 7天能够将80mmol/L甲醛全部降解。 同时， 该菌能够在不同碳源。
27、的条件 下代谢甲醛。 0061 甲醛含量测量方法为乙酰丙酮法， 具体方法为 ： 根据不同浓度的甲醛水溶液， 在乙 酸铵溶液介质中， 与乙酰丙酮加热反应生成黄色化合物 (3， 5 一二乙酰基 -1， 4 氢卢剔啶 )。 该化合物对可见光有选择性吸收， 并且对波长 414nm 的可见光吸收最多， 其对可见光的吸 收值与甲醛溶液成正比。依据这一原理， 分别对几种已知浓度的甲醛溶液进行吸光度的测 量， 绘出不同甲醛浓度对应 OD 值标准曲线， 得出标线方程。 0062 具体步骤如下 ： 取 6 支 10ml 容量瓶编号， 分别加入 0， 2， 4， 6， 8， 10ml 浓度为 100mmol/l 的。
28、甲醛标准品溶液 ( 甲醛分析纯溶液购自国药集团化学试剂有限公司， 产品目 录号为CAS RN 50-00-0浓度为37-40(体积百分比浓度)， 取9.959ml该溶液加水定 容到 1L)， 加水至 10ml 摇匀 ( 不同编号的容量瓶中甲醛浓度见表 1 所示 )。将 1mL 乙酰丙 酮溶液加入 4mL 水中， 然后加入不同浓度的甲醛标准品溶液 1l， 65反应 10min。当溶液 冷却到室温时， 测量其 OD 值。采用 10mm 比色皿， 在波长 414nm 处， 以 0 号为参比测量吸光 度， OD 值测定结果见表 2。绘制不同甲醛浓度对应 OD 值标准曲线 ( 如图 8 所示 )， 得出。
29、标 准曲线方程为 ： y 0.0065x+0.0034(R2 0.9998)。 0063 表 1 配制不同浓度的甲醛标准品溶液 0064 0065 表 2 标准曲线中不同浓度的甲醛标准品浓度所对应的 OD 值 0066 0067 将 1mL 乙酰丙酮溶液加入 4mL 水中， 然后加入菌株培养液 1l， 65反应 10min。 当溶液冷却到室温时， 测量其 OD 值。采用 10mm 比色皿， 在波长 414nm 处， 以水为参比测量 吸光度。根据上述得出的标准曲线方程计算菌株培养液中的甲醛浓度。 0068 乙酰丙酮溶液的配制方法如下 ： 将 50g 乙酸铵、 6mL 冰乙酸及 0.5mL 乙酰丙。
30、酮溶于 100mL 水中， 即得到乙酰丙酮溶液。此溶液在 4保存至少可稳定一个月。 0069 菌丝干重的测量方法如下 ： 取培养液用两层纱布过滤， 收集菌体， 将菌体放在定量 分析滤纸 ( 滤纸事先称重 ) 上， 60烘干至恒重， 称重。菌丝干重总质量 - 定量分析滤纸 重量。 说 明 书 CN 102220245 B 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 102220245 B 8 1/3 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102220245 B 9 2/3 页 10 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102220245 B 10 3/3 页 11 图 8 说 明 书 附 图 CN 102220245 B 11 。