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一种新的镰孢菌及其在降解植物细胞壁中的应用
    【技术领域】
     本发明涉及一种新的 Fusarium 真菌及其在降解植物细胞壁中的应用。背景技术 生物能源是地球上取之不尽、 用之不竭且对环境不造成污染的能源， 因为它来 源 于 吸 收 CO2 进 行 光 合 作 用 的 生 物 质 (Schlamadinger andMarland， 1996 ； Cowie and 9 Gardner， 2007)。地球上每年产生的 170-200×10 吨生物质之中 70％为细胞壁成份， 其中 人类利用的总量只有 2％ (Markus P.et al 2008)。目前， 两大生物能源 - 生物乙醇和生物 柴油分别是汽油和柴油的可选择的燃料。它们对减少废气排放、 减轻全球变暖有着重要作 用， 因此， 生物能源可以很好地应用在现有的机动设施上。
     近年来， 全世界每年的生物乙醇的产量超过 100 亿加仑， 大多数通过我们目前生 产的淀粉和糖类得到 (Yuan et al.， 2008)。由于人们对这些碳水化合物的需求不断增长， 导致粮食竞争激烈， 相应的， 生物乙醇的造价也越来越高。因此， 目前研究的热点集中在自 然界中碳源最丰富的植物细胞壁多糖上。然而， 低成本高效生产生物乙醇的主要难题之 一是先通过作用有效的降解聚合物成可发酵的单糖， 然后再用酵母发酵 (Szczodrak and Fiedurek， 1996 ； Mielenz， 2001 ； Anderson and Akin， 2008)。 在传统的初始阶段多是利用各 种理化作用进行预处理， 例如高温、 高压， 酸、 碱、 有机溶剂或者联合作用来破坏多糖和芳香 族化合物的交联键如木质素和低分子量的酚类化合物 (Petersson et al.， 2007 ； Lindeet al.， 2008)。这些预处理作用不仅费用高、 污染环境， 而且可能对后来的酶水解和发酵有抑 制作用。 因此尽量减少或不使用这些预处理对提 高生物乙醇生产效率、 降低成本方面具有 重要的作用。
     要达到这个目标， 可以通过几种方法共同作用来实现， 例如改进细胞壁组分使之 容易被降解和找到一种能够产生具有广泛酶活和强水解作用的酶的微生物。一般来说， 真 菌进化形成通过降解植物细胞壁多糖来维持其生长 (Warzywoda et al.， 1992 ； De Vries and Visser， 2001)。据报道， 现在已经有大量的降解植物细胞壁的真菌酶被应用于工业生 产中。然而， 由于在自然界中存在大量没被发现和认知的真菌。真菌作为最大的分解者在 自然界的物质循环中起着重要的作用， 然而， 在大约 25 万种真菌中， 人们认识的真菌不到 40％， 仅有数百种被用于工业发酵、 药物开发等 (Peiji G..et al 2004)。 所以， 极有可能分 离到数量更多、 具有酶活性更高、 更稳定更好、 降解作用更宽泛的细胞壁降解酶的真菌。为 了筛选优良菌株， 我们从 18 株菌中选到 Fusarium sp.Q7-31 并进一步研究其特性。
     发明内容
     此发明的开始阶段， 对能降解植物细胞壁菌株的筛选是在中国， 青海西宁， 青海大 学谢占玲教授的实验室中进行的。 菌株包括我们在青藏高原分离纯化的 Aspergillus sp.， Fusarium spp.F-1， F-2， F-3， Q7-21， 和 Q7-31 ； Geotrichum sp. ； Morchella spp.M-1， M-2， M-3， M-4， 和 M-5 ； Mucor sp.U-1， U-2， U-3， 和 U-4 ； Penicillium sp. ； Pestalotiopsissp. ；和 Trichoderma sp. 共 18 株菌。为了诱导细胞壁降解酶的产生， 每一株菌都在以 0.3％的 水稻秸秆粉末作为唯一碳源的液体培养基上生长 3 天。然后通过离心从培养基中除去真菌 的菌丝体和剩余的水稻秸秆粉末， 上清液即为粗酶液， 立即用该粗酶液来检测其对植物细 胞壁的降解能力。测定方法是粗酶和 1％的水稻秸秆粉末 40℃反应 10 分钟， 然后加 DNS 测 定还原糖的含量。
     在 18 株菌中， 根据 Fusarium sp.Q7-31 粗酶的高稳定性和高活力， 我们进一步研 究其特征。通过对其形态学特征的分析 ( 例如菌丝体的宽度和生长习性 ) 及它的 ITS 序列 ( 序列号 ： FJ646593) 鉴定菌株 Fusarium sp.Q7-31 属于 Fusarium 属。Q7-31 在以 0.3 ％ 水稻秸秆粉末作为唯一碳源的琼脂糖培养基培养 7 天， 其菌丝体生长十分茂盛， 菌落直径 达到 6cm。它的 这种生长活力和降解能力在转接到液体培养基上培养 3 天同样如此。通 过 3 天的培养这种粗酶的细胞壁降解能力达到最大， 再经过 4 天维持在较高水平。然而， 培 养基中蛋白质含量累积增长发生在前四天。为了比较酶的稳定性， 将 Fusarium sp.Q7-21 和 Q7-31 的粗酶保存在 25℃和 40℃中测细胞壁降解酶活力变化。在 25℃和 40℃条件下， Q7-31 的粗酶仍然保持其初始 75％的酶活性， 而 Q7-21 的酶活性在一天内就消失了。此外， Fusariumsp.Q7-31 产生的酶对于其他的谷类植物秸秆如当地的大麦， 小麦， 玉米， 燕麦， 黑 麦的降解作用要比水稻的强。这些结果显示 Fusarium sp.Q7-31 是一种新型的能够产生高 稳定降解植物细胞壁多糖的酶的菌株。因此， 在成本效率上， 这种菌株具有利用谷类植物 为原料生产生物乙醇的潜能。生物材料样品保藏相关信息 ： 生物材料样品为存活的镰孢， Fusarium sp. 保藏编号为 CGMCC NO.2710。保藏发出日期为 2008 年 10 月 14 日。保藏单 位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)。 附图说明
     图 1. 具有不同水稻秸秆粉末降解度的真菌的液体培养物。菌株在以 0.3％的水 稻植物秸秆粉末作为唯一碳源的培养基 25 ℃下 100rpm 摇床中培养 3 天。A， Morchella sp.M-1 ； B， Fusarium sp.Q7-31 ； C， Pestalotiopsis sp. ； D， Fusarium sp.Q7-21 ； E， Trichoderma sp. ； F， Penicillium sp. ； G， Mucor sp.U-1 ； H， Fusarium sp.F-2 ； I， Geotrichum sp. ； J， Morchella sp.M-2 ； K， Morchella sp.M-3.
     图 2. 在不同真菌菌株培养基中总还原糖产量。 每株菌株都生长在 5ml 含有 0.3％ 水稻茎秆粉末的液体培养基中。生长到第 3 和第 6 天时用 DNS 法测酶活。
     图 3.Fusarium sp.Q7-31 的生长习性和菌丝体 .(A) 菌丝体接种在含有 0.3％水稻 茎秆粉末作为唯一碳源的固体培养基的中央。这张图片是在 25℃培养 5 天后拍的。(B) 这 幅图片说明菌丝体有隔膜。在 (A) 和 (B) 中刻度分别为 1cm 和 5um。
     图 4.Fusarium sp.Q7-31 在以 0.3％水稻秸秆粉末作碳源的固体培养基上的生长 曲线。平均数和标准误差来自于对 3 个平行的测量结果。
     图 5.ITS 序列对比。显示物种间的差异， Fusarium sp.Q7-31( 序列号 ： FJ646593) 有 159 个碱基和他的邻近物种一致。所有已报道的物种都包括在括号内。箭头指示出 ITS2 和 28S 核糖体 RNA 基因的分界线。
     图 6.Fusarium sp.Q7-31 产生粗酶 ( 细胞壁降解酶 ) 的活力。开始还原糖的含量 利用 DNS 法， 在 575nm 波长下用分光光度计测量。光吸收率根据已知葡萄糖浓度的 DNS 标准曲线转变成 ug/mL， 从而得知产生葡萄糖的量。 酶活力的最终计算要除以 10min 的酶催化 反应时间。测量结果由三个平行得出平均数和标准误差。
     图 7.Fusarium sp.Q7-31 液体培养基中可溶蛋白的累积量。根据 Bradford 法， 在 波长 595nm 下用分光光度计测量光吸收值。光吸收值根据已知浓度的小牛血清蛋白作的标 准曲线得出蛋白含量。
     图 8.Fusarium sp.Q7-31 产生的粗酶的稳定性。液体培养三天后通过离心取上清 液 ( 粗酶 )。酶液置于 25℃和 40℃环境中， 在各个时间点测量酶活。
     图 9.Fusarium sp.Q7-31 产生的酶对各类谷类植物秸秆的降解效果。通过在含有 0.5％水稻秸秆粉末培养基中生长 3 天来诱导菌株粗酶产生。每种植物秸秆粉末作底物加 入等体积的粗酶 40 条件下反应 10min， 然后用 DNS 法测酶活。
     发明物的详细描述 ：
     植物细胞壁多糖是自然界中最丰富的碳水化合物。它的主要组成成分包括纤维 素， 半纤维素， 果胶和木质素。纤维素是植物细胞壁的主要组成成分， 通过 β-1， 4-D- 葡萄 糖残基结合呈晶体纤维状直线结构。 半纤维素包含多种异构体多糖， 包括木聚糖， 葡聚糖和 xyloglucans。这些聚合物的主链通常具有多分支的不同的侧链集团， 例如 L- 阿拉伯糖， D- 半乳糖， 乙酰基， feruloyl， p-coumaroyl 和葡糖醛酸残基。果胶的主链是 β-1， 4-D- 半 乳糖醛酸残基和 α-1， 2-L- 鼠李糖残基并连有相关的长 的 L- 阿拉伯糖和 D- 半乳糖残基 侧链基团 (De Vries and Visser， 2001). 除此之外， 半纤维素和果胶， 芳香族化合物例如木 质素和低分子量酚类化合物都通过共价键和氢键相互结合或与植物细胞壁上的主要多糖 相结合， 这种结合使细胞壁更加坚硬 (Anderson and Akin， 2008)。
     由于植物细胞壁结构的复杂性和组成的多样性， 不同的酶如葡聚糖内切酶， 细胞 壁水解酶， 糖苷酶， 外切葡聚糖酶， 木聚糖内切酶， β 木糖苷酶， β 甘露聚糖内切酶， β甘 露糖苷酶， 果胶水解酶和果胶裂合酶对于主链的水解作用都是相关的。还有大量的附属 酶如 α- 木糖苷酶， 阿拉伯呋喃糖酶， 阿拉伯木聚糖酶， 阿拉伯糖水解酶， 内切和外切阿拉 伯糖酶， α- 和 β- 半乳糖苷酶， 内切和外切葡聚糖酶， α- 葡萄糖醛酸苷酶， feruloyl， ρ-coumaroyl， 乙酰基和甲基酯酶也作用于植物细胞壁多糖的取代基或侧链基团 (Walton， 1994)。 这些细胞壁降解酶已经从许多微生物中纯化出来， 特别是在维持地球碳循环中起到 重要的作用的丝状真菌。更重要的是从特异的真菌菌株中产生的酶具有广泛的降解范围， 高酶活和高稳定性。另外已经报道细胞壁降解酶的底物特异性， 这些酶之间通过协同作用 以加强的酶活力 (de Vriesa et al.， 2000).。综合分析这些因素， 为了能最大量的降解细 胞壁多糖， 我们采用菌培养物的上清液作为粗酶而不是分离纯化的酶。
     试验过程 ：
     菌株的纯化 ：
     分离菌株 Q7-31 时样品来自于 Morchella sp. 子实体 ( 蘑菇 ) 组织分离物。是 通过在筛选培养基上一系列的次代培养而筛选出的纯化培养物。筛选培养基包含 0.6％蛋 白胨， 0.1％ K2HPO4， 0.05％ MgSO4·7H2O， 和 1％葡萄糖， pH 7.0. 在 28℃条件下培养 3-5 天。然后生长良好的菌落通过次代培养转接到新鲜培养基上。从均匀生长的菌落上， 用接 种环挑取一环转接到和选择培养基成分相同的基本液体培养基中 (BLM)28℃， 100rmp 摇床 培养。为了保藏， 菌株被接种到 PDA 培养基上 4℃条件下保存。筛选能降解植物细胞壁的菌株
     每种菌株接种一环的菌丝体到 50ml 含有 1％葡萄糖作为的基本液体培养基 (BML) 生长成饱和状态。大约 50uL 的饱和培养物转接到 5ml 的含有 0.5％水稻茎秆粉末的 BLM 中 28℃条件下培养。在第 3 和第 6 天， 通过 DNS 法测量 1ml 的每种培养基中还原糖的含量， 将 18 株菌进行对比。
     DNS 法测总还原糖含量
     根据 Miller(1959) 所描述的 DNS 法过程， 稍微改变， 测定溶液中还原糖的含量以 及酶活。DNS 试剂包含 0.5％的 DNS， 0.025％的亚硫酸钠， 0.5％ NaOH， 0.1％苯酚和 2.5N 的 KOH。0.5mL 的真菌培养物或粗酶反应溶液和的 0.1mL 的 DNS 试剂 100℃下反应 10min。然 后加 0.4mL 的蒸馏水是总体积达到 1mL， 在 575nm 波长下读出分光光度计的光吸收值， 确定 溶液中还原糖的含量。
     Q7-31 形态学和分子学上的鉴定
     菌丝体在 PDA 上持续培养 5 天， 用来测量形态学特征， 如菌丝宽度， 孢子的形成和 孢子的形状。用 CTAB 法 (van Burik et al.， 1998) 从生长在 PDA 培养基上 5 天的菌丝体 中提取基因组 DNA， 利用具有正向 ITS5 引物， 5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 和 ITS4 反相 引物 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ PCR 用 Yahg et al.(2007) 方法， ITS DNA 被扩增。测 序后通过 NCBI BLAST 数据库对 PCR 产生的序列分析。 真菌生长在琼脂糖及液体培养基中生长
     为了确定生长率， 用接种环挑取菌丝体接种到含有 0.3％水稻茎秆粉末的琼脂糖 基本培养基中。真菌生长率的表现通过每天对三个培养皿中真菌菌丝菌落直径进行测量， 其直径不断扩大。 每株菌的一接种环菌丝体接种到 5mL 的含有 0.6％蛋白胨， 0.1％ K2HPO4， 0.05％ MgSO4·7H2O， 和 1％葡萄糖或水稻茎秆粉末作为唯一碳源， pH 为 7 的培养基上。液 体培养基在摇床中 100rpm， 28℃恒温培养。
     植物粉末的制备 ：
     来源于 Dong-Jin 水稻， Ho-Pyum 大麦， Geum-Kang 小麦， Chum-Ye 黑麦， 当地的玉米 品种， 和 Ok-Chun 的燕麦， 他们的种子在一半浓度的家用漂白 剂中灭菌 30min， 然后种植在 水饱和的土壤中。种子培养 20 天后， 收获长出的芽， 在液氮中研磨成粉末。其中叶绿素和 可溶性物质在含有 95％乙醇， 65℃过夜培养初步去除。 3000rmp 下离心 5min， 然后把液相丢 弃。然后在 65℃温箱中完全干燥， 这些干的块状粉末利用研钵和研棒被进一步粉末化成均 一的松软的粉末。
     酶活和稳定性测定 ：
     为了测定细胞壁降解的活力， 反应溶液由 0.2mL 的 Q7-31 上层培养液 ( 定义为粗 酶 )， 0.4mL 的含 1.0 ％ (w/v) 水稻植物粉末溶解于 pH5.5， 50mM 的磷酸缓冲液， 酶反应在 40℃下发生 10min. 通过二硝基水杨酸试剂法 (DNS 法 ) 测定酶反应溶液中还原糖的产量 (Miller， 1959 ； Sengupta etal.， 2000)。在 575nm 波长下， 利用分光光度计测定光吸收值， 然后根据标准曲线转换成还原糖的含量 .
     蛋白含量的测定 ：
     根据 Bradford 法 (Bradford， 1976)， 0.4mL 靠马斯亮蓝溶液与 1.6mL 培养上清液， 混合， 5 分钟内测定 595nm 波长的光吸收值， 利用牛血清蛋白绘制标准曲线来测定蛋白含
     量。 结果 ：
     Q7-31 产植物细胞壁降解酶活性筛选 ：
     在含有水稻植物粉末的培养基上生长的 18 株菌呈现出不同的浑浊度， 表现了其 对植物粉末不同降解力 ( 图 1)。包括 Q7-31， 图 1(A) 到 (E) 的菌株活跃的崩解细胞壁粉末 成胶态 ； 然而， 在图 1(I)(J)(K) 中的菌株培养基中仍保留没被分解的细胞壁小颗粒 ； 部分 菌株培养物， 如图 1(F)(G) 和 (H) 形成较大的白色的菌丝体聚合物， 能够部分的降解植物 粉末 ； 此外， Morchella sp.M-1 崩解细胞壁粉末成胶态也可以产生较高的还原糖外 ； 同样， Geotrichum sp.， Morchella spp.M-2 和 M-3 不能改变细胞壁而产生少量还原糖 ( 图 1 和 2； 表 1)。 除了它们的培养物降解细胞壁的外观形态， 在这些菌株之中， Q7-31 产生的还原糖 从第 3 到第 6 天都最高， 并且第 3 天培养基就变的浑浊 ( 图 1 和 2 ； 表 1)。和其他 菌株对 比还原糖的含量， 通过 6 天的培养， 尤其是 Q7-31 培养基中还原糖的含量最高。因此， 我们 选择 Q7-31 在细胞壁降解方面对其进一步研究。
     Q7-31 形态学和分子学鉴定 ：
     从图 1A 中可见， Q7-31 的菌丝体呈现典型的白色的干的羽绒状， 遍及菌落各处 (Fig.3A)。菌丝体由许多间隔组成 ((Fig.3B).). 为了鉴定 Q7-31 的生长率， 它的菌丝体被 接种到含有 0.3％水稻粉末的基本培养基固体上， 在 28℃培养 7 天， 菌落的直径达到约 6cm， 在 1 到 3 天的生长曲线图中呈现陡坡状， 表明在这一时期的生长呈对数生长 (Fig.4)。
     在和 18S 核糖体基因部分序列相关的基因组鉴定， 提取菌株 Q7-31 中的基因组 DNA 作为 PCR 扩增的模板， 通过 PCR 技术， 扩增内部转录间隔区 1， 5.8S 核糖体 RNA 基因， 内部转 录间隔区 2 和 28S 核糖体 RNA 基因部分序列。PCR 扩增出的序列信息在 NCBI 数据库中被 用来做 BLAST 研究。BLAST 结果显示 Q7-31 分析区段， 其中 99％和 Fusarium， Gibberella， Cordyceps((Fig.5)) 的一些菌株相应区段相一致。结合形态学和分子学的分析， 我们将 Q7-31 归入到 Fusarium 中， 并根据布达佩斯公约于 2008 年 10 月 14 日保藏在中国微生物菌 种保藏中心 (Deposition No ： CGMCC2710) 北京市朝阳区大屯路甲 3 号， 中国科学院微生物 研究所 邮编 ： 100101。
     产于 Fusarium sp.Q7-31 的细胞壁降解酶 ：
     Q7-31 菌株在 28℃条件下生长在含有 0.3％的水稻粉末的 BLM 培养基中。 在每天相 同时间测量每分钟每 mL 菌株产生的总还原糖的量， 用 μg 量来表示细胞壁降解酶酶活性。 在培养到第 3 天酶活有显著的提高， 然而从第 4 天开始酶活有很大的波动。酶活持续到第 7 天， 到第 8 天酶活出现下降 ( 图 6， 表 2)。测定酶活的同时对菌株 Q7-31 培养基中可溶性 蛋白含量进行测定。在培养的第 1 天， 中蛋白含量积累最快。总蛋白量在培养的 2-5 天稳 定提高， 第 6 天开始降低 ( 图 7)。酶活变化图中， Q7-31 培养基中总蛋白含量稳定的升高活 到第 5 天达到顶峰。
     Fusarium sp.Q7-31 酶的稳定性 ：
     在室温环境下酶活稳定性是非常重要的参数， 尤其在工业生产上的 应用方面， 跟 是如此。Q7-21 和 Q7-31 菌株在培养基中产生的粗酶被提取保持在 25℃或 40℃。存储的粗 酶的细胞壁降解的活力在培养 4 天的不同时间点测量。在 25℃条件下经 3 天 Q7-31 粗酶还 能保持初始状态 75％的酶活。然而， Q7-21 在相同温度下一天的时间酶活就消失了。而且
     Q7-31 在保持在 40℃条件下表现出和存储在 25℃下相似的稳定性 ( 图 8， 表 3)。从至少三 次重复试验， 每个试验做三个对照 Q7-21 和 Q7-31 酶稳定性表现出相同的模式。
     Q7-31 产生的粗酶对不同植物细胞壁粉末的降解活力 ：
     为了诱导细胞壁降解酶产生， Q7-31 培养在含有 0.3％水稻茎秆粉末的 BLM 培养基 上培养 3 天。在含有各种底物 ( 当地不同品种的大麦， 小麦， 玉米， 燕麦和黑麦 ) 的培养基 中测量粗酶的酶活。和对水稻茎秆相比， Q7-31 菌株对其他谷类植物细胞壁的降解活力表 现出更高酶活力 ( 图 9) 除了水稻， 其他已测的谷类植物， 在酶活方面表现出不同的敏锐性， 主要和高的变异性有关。
     讨论 ：
     为了提高生物酒精的生产效率。有效的降解植物细胞壁多糖已经引起人们的广 泛兴趣。因此发展大量研究以降低原料的抗降解性， 方法包括更有效的对原料预处理和 对具有更广泛更有效的产水解酶微生物的研究。为了评估被选择菌株的降解力， 我们选 择培养基上层悬浮液 ( 粗酶 ) 而没有对其进一步纯化原因如下 ： (1) 具有不同底物特异性 的水解酶活力对降解植物细胞壁是必需的。Berlin et al.(2007) 明确指出被 1.5L 纤维 素酶作用的木塑纤维素样品的降解作用通过补充 Novozym188(Novozymes)， 多聚木聚糖酶 (Genencor)， 和多聚果胶酶 (Genencor) 而被大量的加强。 (2) 另外多种不同酶， 在粗酶液中 单个酶之间的协同作用也可能存在。例如， 在和来自于 Sporotrichum thermophile 的木聚 糖酶和从 Fusarium oxysporum 中纯化的阿魏酸酯酶协同培育， 其活性被加强 5 倍 (Topakas et al.， 2003). 在初始筛选试验， 真菌被培养在含有 0.3％水稻植物细胞壁粉末作为 唯一碳源 的 BIM 培养基上。从可溶的植物粉末到胶态到完全降解态他们表现出广泛的细胞壁降解 活力 ( 典型代表在图 1 中显示 )。表现的对这些细胞壁降解作用程度的不同可能和培养基 中还原糖的含量不同有关。然而对于 Morchella sp. 菌株 M-1 虽然对水稻植物粉末有较 高的降解作用， 但是培养接中还原糖的含量相对较低 ( 图 1A 和 2 ； 表 1)。原因可能是真菌 生长过程中消耗了产生的还原糖， 相应的培养基中还原糖的量降低。根据菌丝体在含水稻 粉末的琼脂板培养基上的高生长活力和在含有水稻粉末液体培养基中高降解活力， 我们从 18 株真菌选择 Fusarium sp.Q7-31 对其分离纯化。在这选择的 Fusarium spp. 菌株中， 经 过 3 天和 6 天的培养， Q7-31 培养基中显示出最高的还原糖量 ( 图 2)。尤其是经过了六天 的培养， 培养基中高的还原糖含量表明菌株能够持续产生酶或产生的酶具有高稳定性。从 图 6 看出 Q7-31 的酶活在第三天开始出现较大的波动。可能是因为在不同的时间点产生 不同类型的细胞壁降解酶， 这影响整体酶产生还原糖的活力。例如， 有三种主要类型的纤 维素酶， 包括 β- 内切葡聚糖酶， β- 外切葡聚糖酶和 β- 糖苷酶。由于这些酶底物的特 异性， 这些纤维素酶在特定时间点上培养基中的含量和比例不同可能影响细胞壁中微晶纤 维素的降解效率 (Palmarola-Adrados et al.， 2005)。培养基中 Q7-31 粗酶的酶活在第三 天大约是 66μg/min/mL， 大约 0.37U/mL。Khan et al 曾经报道过与之相当的酶活， 他用水 稻秸秆诱导 Trichoderma spp. 和 Phanerochaetechrysosporium 产生纤维素降解酶。从 生长 6 天的 Trichoderma sp T-3 培养基中获得纤维素酶的浓度是 0.65U/mL 滤纸活力， 然 而， Phanerochaetechrysosporium 产生的纤维素酶的活性最高， 约 1.43U/mL 滤纸活力和 2.40U/mL 羧甲基纤维素活力。然而 Q7-31 粗酶活力和这些酶的线性对照无可比性， 由于特
     定参数的不同， 例如底物的总类和数量， 底物的预处理， 和反应的 pH 和温度。
     培养基中蛋白的积累有两种不同的来源 ： 真菌释放到细胞外的蛋白以及与降解的 水稻植物细胞壁相平衡的蛋白质。 真菌在水稻粉末培养基中培养时间越长培养基中释放的 细胞壁蛋白越多。然而， 图 5 显示在培养 的第五天蛋白含量开始下降。可能是由于真菌分 泌的不仅是细胞壁降解酶还有其他种类的蛋白质例如蛋白酶和转糖苷酶， 这些酶在培养超 过 5 天后对培养基中的蛋白积累产生负影响 (Hrmováet al.， 1991)。
     除了很高的酶活性， Q7-31 菌株产生的粗酶与同样是 Fusarium sp 属的产生的粗 酶有类似的细胞壁降解活力的 Q7-21 菌株相比具有更高的稳定性。25℃经过 4 天的培养 Q7-31 保持至少 50％初始酶活。然而相同条件下， Q7-21 进过一天的培养酶活就完全消失 ( 图 8 和表 3)。Gerber et al.(1997) 从 Trichoderma sp. 中纯化出两种木聚糖酶， 一种是 分子量 20kD， 等电点值低， 另一种是分子量 30kD， 中等值等电点。虽然大分子量的木聚糖酶 具有较低的酶活， 但是它表现出比小分子量的具有更高的热稳定性。 Raquel et al.(1997) 的研究表明酶的稳定性受培养木聚糖酶的底物影响。Stephens et al.(2007) 指出在热 稳定性木聚糖酶的变异体， 它的基因来自于嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus 并通过 error-prone PCRs 扩增。在他们的研究中发现与那些野生型木聚糖酶相比， 这三种特化的 变异体木聚糖酶在氨基酸序列上 1 或 3 个氨基酸被置换结果显示出热稳定性 2 到 3 倍的提 高。与之相似， Damaso et al.(2003) 指出选择的重组体木聚糖酶 50℃经过 4h 培养能保持 100％的酶活。根据这些方面推断 Q7-31 粗酶的高稳定性可能是由于细胞壁降解酶分子遗 传学性质方面发生改变而引起。
     Q7-31 的酶学性质的检测， 不仅在水稻植物粉末上进行， 同时检测它对其他谷类植 物细胞壁粉末的降解能力。这些谷类植物粉末包括当地大麦， 小麦， 玉米， 燕麦和黑麦的变 种， 用这些粉末来诱导酶的产生结果发现这些植物粉末更容易被 Q7-31 粗酶降解， 同时相 对水稻粉末而言粗酶的酶活更高。 这些谷类植物由不同的细胞壁多聚体组成。 例如， 水稻秸 秆由 41.6％纤维素， 31.5％半纤维素， 和 12.5％木质素组成 (Pauly andKeegstra， 2008)。
     虽然在小麦秸秆中木质素的含量要比水稻秸秆中要高很多， 然而在小麦秸秆中低 含量的半纤维素可能是粗酶对小麦植物粉末的降解力高于水稻粉末的主要原因。 另外对于 不同的细胞壁的组成， 在谷类植物细胞 壁中纤维素纤维可能以不同水平的结晶态存在， 这 会影响可降解端的浓度以及水解酶的亲和度 (Jeoh et al.， 2007)。这些资料表明， 用水稻 植物粉末诱导 Q7-31 产生的粗酶具有相对广泛的底物特异性。
     总之， Fusarium sp.Q7-31 容易被植物水稻植物粉末诱导产生高稳定高活性的粗 酶。Q7-31 的优点还包括， 在液体培养基上经过几天的培养生长旺盛， 细胞壁降解酶产量相 对高。此外从 Q7-31 中产生的粗酶表现出对大多数种类植物细胞壁都有降解作用。通过对 酶学生产和细胞壁降解条件的进一步的优化表明该菌种在工业应用上特别是在生物酒精 生产成本效率上有较高的优势。
     参考文献 (REFERENCES)
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