生成物为HSUB2/SUBOSUB2/SUB的氧化酶类活性检测方法.pdf

生成物为H2O2的氧化酶类活性检测方法
    技术领域：

    本发明涉及生物酶活性检测领域，具体涉及以生成物为H2O2的氧化酶类活性的检测，包括植物体内H2O2含量的检测。

    背景技术：

    氧化酶类是生物体氧化代谢过程中的重要物质，决定了生物体内的氧化代谢进程和次生代谢物质的产生与消除。使植物在不同的生长环境下具有不同的适应状态。如多胺(Polyamines，PAs)是生物体氮代谢过程中产生的一类次生代谢物质，植物体在受到生物的和非生物的胁迫时，体内的多胺浓度急剧地变化。多胺氧化酶(Polyamine oxidase，PAO)是催化生物体内PAs氧化的关键酶，通过调节细胞的PAs水平和生成物的浓度，参与各种植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。因而PAO是PAs代谢研究的一个重要环节；而多酚氧化酶是氧化酚类的关键酶，是研究酚类氧化代谢的关键酶。诸如此类氧化酶在植物体内还有很多。这类氧化酶的共同特点是氧化底物时有产物H2O2的生成。从而可以检测H2O2含量以达到对氧化酶活性的定量检测。传统检测方法是1972年Smith提出并应用地PAO活性的检测方法。但由于其灵敏性较低和检测产物稳定性较差等，在很多植物中都检测不到PAO的活性。影响了传统检测方法应用的广泛性。

    发明内容：

    本发明的目的就是提供一种生成物为H2O2的氧化酶类活性检测方法，该检测方法能提高氧化酶活性的检测率，H2O2浓度最低检测量可从1.25μmol·L-1提高到0.65μmol·L-1。

    其具体操作技术如下：

    (1)制作氧化酶提取液：称取0.5g试材加入1.6mL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1，pH 6.5)于冰浴中研磨后以10000×g离心20min(4℃)，上清液即为氧化酶提取液；

    (2)制作显色液：100mL显色液(用0.1mol，pH 6.5的磷酸缓冲液配)的成分中含25μL N，N-二甲基苯胺，10mg 4-氨基氨替吡啉；

    (3)制作反应混合液：该反应混合液含2.5mL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1，pH 6.5)，0.2mL显色液，0.2mL氧化酶提取液，0.1mL过氧化物酶溶液(250U·mL-1)；

    (4)将反应混合液加入20mmo l·L-1底物0.1mL起动反应后，混合反应液置于25℃中反应30min。所述底物依氧化酶的种类而定，如检测多胺氧化酶，其底物为多胺；检测多酚氧化酶，其底物为各种酚类；

    (5)用分光光度计测定波长550nm处光密度值，以0.001 ΔOD550·min-1为一个酶活单位(U)。

    (6)用加入5％高氯酸的提取液为对照。

    本发明的方法，H2O2浓度的最低检测量可从1.25μmol·L-1提高到0.65μmol·L-1，提高了氧化酶活性的检测率。并且其显色产物具有良好的稳定性与重现性，可以延长反应时间来提高检测效果。