一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 【技术领域】
本发明涉及一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术是一种20世纪八十年代处发展起来的分子生物学技术，用于富集特定的DNA片段。它运用从温泉细菌中分离出的DNA聚合酶(DNA Polymerase)，通过变性、复性(退火)和延伸等三步反应，模拟体内DNA复制。能够将极微量的核酸在短时间内迅速扩增复制，获得大量的目的DNA片段。
PCR扩增完成后需要通过鉴定，才能确定是否真正准确可靠获得了预期扩增产物，琼脂糖凝胶电泳是实验室最常用的，简便易行。核酸分子带负电，在电场下向正极运动，不同分子大小的核酸带电量不同，在凝胶介质的分子筛作用下，使分子大小不同的核酸分子出现不同的迁移率，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入染料，在凝胶分析系统中进行分析。
琼脂糖凝胶电泳的浓度通常在0.5-2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来分离小片段的电泳。比如实验室常用的1％的琼脂糖凝胶电泳可以分辨的核酸大小为0.5kb-7kb，2％的胶可以分辨0.1kb-3kb的核酸。由此可见，其分辨率不高，当核酸片段大小相近(或相同时)就无法区分，在电泳中这几条分子大小相近的条带就可能只显现出一条带。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。
本发明提供的检测待测生物样本中是否含有DNA片段甲和/或DNA片段乙的双色荧光多重PCR(DFM-PCR，Dual Fluorescence Multiplex-PCR)方法，包括如下步骤：将待测生物样本的总DNA作为模板，用引物对甲和引物对乙进行多重PCR；将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有荧光条带，待测生物样本中含有DNA片段乙，如果532nm下具有荧光条带，待测生物样本中含有DNA片段甲；引物对甲的5’端用Tamra标记，引物对乙的5’端用Cy5标记；所述引物对甲用于扩增DNA片段甲；所述引物对乙用于扩增DNA片段乙。
所述琼脂糖凝胶电泳具体可为0.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，如0.5-1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1-1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳等。当所述琼脂糖凝胶电泳为1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳时，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差7000bp以下，具体可相差500bp以下。当所述琼脂糖凝胶电泳为2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳时，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差3000bp以下，具体可相差100bp以下。本发明的方法的灵敏度远远高于常规DNA检测所用的的琼脂糖凝胶电泳-SYBGreenI染色法。
所述双色荧光多重PCR方法可应用于检测待测生物样本中是否含有H3亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒。
本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有H3亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒的方法，包括如下步骤：将待测生物样本的cDNA为模板，用引物对A和引物对B进行多重PCR，将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有荧光条带，待测生物样本含有H3亚型禽流感病毒；如果532nm下具有荧光条带，待测生物样本含有H6亚型禽流感病毒；所述引物对A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra(TAMRA)标记；所述引物对B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记。所述琼脂糖凝胶电泳具体可为0.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，如0.5-1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1-1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳等，具体可为2％琼脂糖凝胶电泳。
所述多重PCR的反应条件具体可为：95℃、5min；94℃、30s，52℃、60s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。所述多重PCR的反应体系中，反应初始时，每个所述引物对的上游引物和下游引物的浓度具体均可为0.1mmol/L。
本发明同时保护一种检测待测生物样本中是否含有H3亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒的试剂盒，包括引物对A和引物对B；所述引物对A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表地序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记。
本发明还保护一种检测待测生物样本中含有中的哪一种亚型禽流感病毒的方法，包括如下步骤：将待测生物样本的总DNA作为模板，用引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI和引物对VII进行多重PCR，将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有641bp的荧光条带，待测生物样本含有H1亚型禽流感病毒；如果635nm下具有708bp的荧光条带，待测生物样本含有H3亚型禽流感病毒；如果635nm下具有419bp的荧光条带，待测生物样本含有H5亚型禽流感病毒；如果532nm下具有367bp的荧光条带，待测生物样本含有N1亚型禽流感病毒；如果532nm下具有338bp的荧光条带，待测生物样本含有N2亚型禽流感病毒；如果532nm下具有724bp的荧光条带，待测生物样本含有H6亚型禽流感病毒；如果532nm下具有532bp的荧光条带，待测生物样本含有H9亚型禽流感病毒；所述引物对I是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对，序列2所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对，序列6所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸组成的引物对，序列8所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列10所示核苷酸组成的引物对，序列10所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸组成的引物对，序列14所示核苷酸的5’端用Tamra标记。所述琼脂糖凝胶电泳具体可为0.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，如0.5-1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1-1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳等，具体可为2％琼脂糖凝胶电泳。
所述多重PCR的反应条件具体可为：95℃、5min；94℃、30s，52℃、60s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。所述多重PCR的反应体系中，反应初始时，每个所述引物对的上游引物和下游引物的浓度具体均可为0.1mmol/L。
本发明同时保护一种检测待测生物样本中含有如下哪种亚型禽流感病毒的试剂盒：H1亚型禽流感病毒、H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、N1亚型禽流感病毒、N2亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒；所述试剂盒包括引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI和引物对VII；所述引物对I是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对，序列2所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对，序列6所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸组成的引物对，序列8所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列10所示核苷酸组成的引物对，序列10所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸组成的引物对，序列14所示核苷酸的5’端用Tamra标记。
DFM-PCR技术不仅可以区分琼脂糖凝胶电泳中分子大小相同的条带，而且检测过程中无需核酸染料，因此还具有环保安全的优点。为检测病原物提供了简便、安全和高通量的技术方法。
本发明的方法基于荧光染料标记技术和多重PCR技术。多重PCR(Mutiplex PCR)就是在同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，从而在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。荧光物质在特定波长激发条件下，电子吸收能量跃迁到高能激发态。激发态的电子不稳定，跃迁回基态，能量转化成相应的波长，发出荧光。通过给引物加上不同的荧光标记(这里称之为“探针引物”)，可以获得不同荧光的PCR产物，由于分子大小相同(或相近的)的PCR片段是用带不同荧光标记的探针引物扩增所得，所以只要通过检测不同的荧光便可以区分检测出这些分子大小相同(或相近)的PCR产物。从而使该具有方便、快捷的特点。
本发明提供的核酸检测方法具有以下优点：
1)高通量性：运用合适的不同荧光探针引物，在不同的激发波长下，琼脂糖凝胶电泳上分辨不出的分子大小相近的条带将发射不同波长的荧光，根据条带的颜色可对琼脂糖上片段大小相近的条带做进一步区别判定。因此，DMF-PCR即可把普通PCR几次的结果在一次反应中分析出来，操作方便省时。
2)高分辨性：运用DFM-PCR分析时，由于分析仪器针对荧光探针的高灵敏性，因而荧光探针引物多重PCR可以达到较高的分辨率。因此，在扩增量小的情况下，一般的凝胶成像系统分辨有限，而在用DFM-PCR后，检测结果变得更灵敏，为实验提供更佳的分析依据。
3)可操作性强：在普通PCR仪上即可实现待测片段的扩增，荧光探针引物合成条件成熟，扩增结果采用琼脂糖凝胶电泳和荧光扫描仪即可分析。
4)适用范围广：可应用于检疫、科研等领域，尤其是对高通量和高灵敏性有要求的领域。
5)省时：可以同时进行多重PCR，减少单重普通PCR的耗时，节省时间。
6)节省试验耗材：由于集中一管反应，所以可以节省相应的试验试剂、用品等耗材，节省实验费用。
7)安全：由于操作检测过程中无需核酸染料，使得更加环保安全。
【附图说明】
图1为SYBGreenI染色检测结果。
图2为FLA-5100荧光成像分析仪532nm扫描图。
图3为FLA-5100荧光成像分析仪635nm扫描图。
【具体实施方式】
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
10×PCR buffer(大连宝生物公司)；dNTP(大连宝生物公司)；Taq酶(大连宝生物公司)；DL2000DNA Marker(大连宝生物公司)；QIAamp Viral RNA MiniKit(QIAGEN公司)；QIANGEN One Step试剂盒(QIAGEN公司)；DNA回收试剂盒(美国Omega公司)；T-载体(大连宝生物公司)。
荧光探针引物由上海Invitrogen公司合成，序列见表1：
表17种A型流感病毒阳性质粒构建所用引物
表2A型流感病毒7重PCR探针引物及扩增片段大小
Fujifilm FLA-5100荧光/化学发光及同位素影像扫描分析仪；PCR仪(MJResearch)；电泳仪(Bio-Rad)。
实施例1、禽流感病毒阳性质粒的构建
一、H1阳性质粒的构建
用QIAamp Viral RNA MiniKit按照说明书提供的方法，从H1亚型禽流感病毒标准毒株中提取禽流感病毒基因组RNA。然后用QIANGEN One Step试剂盒操作说明以表1中的H1f’和H1r’组成的引物对进行RT-PCR反应(反应条件见表2)。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，连接于T-载体。对回收RT-PCR产物连接后的载体进行测序，测序结果表明，T-载体中插入了序列表的序列15(见序列表的序列15)所示的DNA。
二、H3阳性质粒的构建
用QIAamp Viral RNA MiniKit按照说明书提供的方法，从H3亚型禽流感病毒标准毒株中提取禽流感病毒基因组RNA。然后用QIANGEN One Step试剂盒操作说明以表1中的H3f’和H3r’组成的引物对进行RT-PCR反应(反应条件见表2)。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，连接于T-载体。对回收RT-PCR产物连接后的载体进行测序，测序结果表明，T-载体中插入了序列表的序列16(见序列表的序列16)所示的DNA。
三、H5阳性质粒的构建
用QIAamp Viral RNA MiniKit按照说明书提供的方法，从H5亚型禽流感病毒标准毒株中提取禽流感病毒基因组RNA。然后用QIANGEN One Step试剂盒操作说明以表1中的H5f’和H5r’组成的引物对进行RT-PCR反应(反应条件见表2)。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，连接于T-载体。对回收RT-PCR产物连接后的载体进行测序，测序结果表明，T-载体中插入了序列表的序列17(见序列表的序列17)所示的DNA。
四、H6阳性质粒的构建
用QIAamp Viral RNA MiniKit按照说明书提供的方法，从H6亚型禽流感病毒标准毒株中提取禽流感病毒基因组RNA。然后用QIANGEN One Step试剂盒操作说明以表1中的H6f’和H6r’组成的引物对进行RT-PCR反应(反应条件见表2)。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，连接于T-载体。对回收RT-PCR产物连接后的载体进行测序，测序结果表明，T-载体中插入了序列表的序列18(见序列表的序列18)所示的DNA。
五、H9阳性质粒的构建
用QIAamp Viral RNA MiniKit按照说明书提供的方法，从H9亚型禽流感病毒标准毒株中提取禽流感病毒基因组RNA。然后用QIANGEN One Step试剂盒操作说明以表1中的H9f’和H9r’组成的引物对进行RT-PCR反应(反应条件见表2)。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，连接于T-载体。对回收RT-PCR产物连接后的载体进行测序，测序结果表明，T-载体中插入了序列表的序列19(见序列表的序列19)所示的DNA。
六、N1阳性质粒的构建
用QIAamp Viral RNA MiniKit按照说明书提供的方法，从N1亚型禽流感病毒标准毒株中提取禽流感病毒基因组RNA。然后用QIANGEN One Step试剂盒操作说明以表1中的N1f’和N1r’组成的引物对进行RT-PCR反应(反应条件见表2)。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，连接于T-载体。对回收RT-PCR产物连接后的载体进行测序，测序结果表明，T-载体中插入了序列表的序列20(见序列表的序列20)所示的DNA。
七、N2阳性质粒的构建
用QIAamp Viral RNA MiniKit按照说明书提供的方法，从N2亚型禽流感病毒标准毒株中提取禽流感病毒基因组RNA。然后用QIANGEN One Step试剂盒操作说明以表1中的N2f’和N2r’组成的引物对进行RT-PCR反应(反应条件见表3)。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，连接于T-载体。对回收RT-PCR产物连接后的载体进行测序，测序结果表明，T-载体中插入了序列表的序列21(见序列表的序列21)所示的DNA。
表3步骤一至七中的RT-PCR反应条件
实施例2、应用双色荧光多重PCR检测不同亚型的禽流感病毒质粒
一、多重PCR
将七种亚型的阳性病毒质粒混合作为模板；混合物中，H1阳性质粒的浓度为1×106拷贝、H3阳性质粒的浓度为1.2×105拷贝、H5阳性质粒的浓度为8×106拷贝、H6阳性质粒的浓度为8×105拷贝、H9阳性质粒的浓度为1×107拷贝、N1阳性质粒的浓度为1.2×106拷贝、N2阳性质粒的浓度为6×106拷贝亚型病毒质粒。
采用表2的7对引物(H1f、H1r；H3f、H3r；H5f、H5r；H6f、H6r；H9f、H9r；N1f、N1r；N2f、N2r)进行多重PCR。多重PCR反应体系见表4，循环参数见表5。
分别采用表2的7对引物(H1f、H1r；H3f、H3r；H5f、H5r；H6F、H6R；H9f、H9r；N1f、N1r；N2f、N2r)进行单重PCR。单重PCR反应体系见表6，循环参数见表7。
表4多重PCR反应体系
10×PCR Buffer 5uL dNTP Mix(2.5mM each) 4uL H1f(10mM) 0.5uL H1r(10mM) 0.5uL H3f(10mM) 0.5uL H3r(10mM) 0.5uL H5f(10mM) 0.5uL H5r(10mM) 0.5uL H6f(10mM) 0.5uL
10×PCR Buffer 5uL H6r(10mM) 0.5uL H9f(10mM) 0.5uL H9r(10mM) 0.5uL N1f(10mM) 0.5uL N1r(10mM) 0.5uL N2f(10mM) 0.5uL N2r(10mM) 0.5uL DNA模板 3.5uL Taq酶 0.5uL ddH2O 30uL 总计 50uL
表5多重PCR循环参数
表6单重PCR反应体系
10×PCR Buffer 5uL dNTP Mix(2.5mM each) 4uL 上游引物(f) 0.5uL 下游引物(r) 0.5uL DNA模板 0.5uL
10×PCR Buffer 5uL Taq酶 0.5uL ddH2O 39uL 总计 50uL
表7单重PCR循环参数
取5μL多重PCR产物进行2％的琼脂糖电泳(5V/cm)(无核酸染料)，电泳完成后用FLA-5100荧光成像分析仪进行扫描分析。将7个单重PCR产物每管取5μL，进行2％的琼脂糖电泳(5V/cm)(无核酸染料)，电泳完成后用FLA-5100荧光成像分析仪进行扫描分析。取5μL多重PCR产物进行2％的琼脂糖电泳(5V/cm)(有核酸染料)，电泳完成后进行SYBGreenI染色检测。将7个单重PCR产物每管取5μL，进行2％的琼脂糖电泳(5V/cm)(有核酸染料)，电泳完成后进行SYBGreenI染色检测。
三、单重PCR和多重PCR扩增结果比较
SYBGreenI染色检测结果见图1。FLA-5100荧光成像分析仪532nm扫描图见图2。FLA-5100荧光成像分析仪635nm扫描图见图3。
多重PCR产物的SYBGreenI染色图中显示6条电泳条带。通过与单重PCR条带对比分析，可以判断由于H3、H6亚型PCR产物条带分子量相接近(分别为708bp和724bp)，多重PCR产物中，H3亚型和H6亚型PCR产物条带重合，因而无法通过普通PCR以及琼脂糖凝胶电泳得以区分。
在532nm下，多重PCR产物检测出4条带(图2)。与单重PCR产物对照，可知检测出的四条条带分别为5’Tamra标记的H6、H9、N1和N2四种亚型。
在635nm下，多重PCR产物检测出三条带(图3)。与单重PCR产物对照，可知检测出的三条条带分别为CY5标记的H1、H3和H5亚型。
【序列表】
<110>中国检验检疫科学研究院
<120>一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒
<130>CGGNARY92749
<160>21
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
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<210>2
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
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ggtttcggat gttacagcgt gacactctcc tattgtgact g 41
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<212>DNA
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<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>5
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
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<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
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<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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<212>DNA
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<220>
<223>
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<213>人工序列
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ggtttcggat gttacagcgt acatgctgag cacttcctg 39
<210>11
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<212>DNA
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tcacttgctt ccgttgagga aggcacttat tggatcagg 39
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggtttcggat gttacagcgt gtcctctagt ttcaatctgt gg 42
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<213>人工序列
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<223>
<400>13
tcacttgctt ccgttgagga agagaatggt cctatatcgt 40
<210>14
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
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<210>15
<211>602
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
ggagcaattg agttcagtat cttcatttga gaggttcgaa atattcccca aagagagctc 60
atggcccaat cacaccgtaa ccggagtatc agcatcatgc tcccataacg ggaaaagcag 120
tttttacaga aatttgctat ggctgacggg gaagaatggt ttgtacccaa acctgagcaa 180
gtcctatgca aacaacaaag agaaagaagt ccttgtacta tggggtgttc atcacccgcc 240
taacataggg gaccaaaggg ccctctatca tacagaaaat gcttatgtct ctgtagtgtc 300
ttcacattat agcagaagat tcaccccaga aatagccaaa agacccaagg tgagagatca 360
ggaaggaaga atcaactact actggactct gctggaaccc ggggatacaa taatatttga 420
ggcaaatgga aatctaatag cgccaaggta tgctttcgca ctgagtagag gctttggatc 480
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gggagctata aacagcagtc ttcctttcca gaatgtacac ccagtcacaa taggagagtg 600
tc 602
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<220>
<223>
<400>16
tgttaccctt atgatgtgcc agattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatcaggc 60
accctggagt ttatcaatga agactttaat tggactggag tcgctcagaa tggggacagc 120
tatgcttgca aaaggggatc tgttaaaagt ttctttagta gattgaattg gttgcacaaa 180
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ttgtacattt ggggggttca ccacccgagc acggacagag aacaaaccag cctatatatt 300
cgagcatcag ggaaagtcac agtctctacc aaaagaagcc aacaaactgt aatcccgaat 360
atcgggtcca gaccctgggt aaggggtctg tccagtagaa taagcatcta ttggacaata 420
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaat agcaccggga atctaattgc tcctcggggt 480
tacttcaaaa tacggactgg gaaaagctcg ataatgaggt cagatgcacc cattggcacc 540
tgcagttctg aatgcatcac tccaaatgga agcatcccca atgacaaacc ttttcaaaat 600
gtaaacagga tcacatatgg ggcatgtccc agatatgtta agcaaaacac tctgaaattg 660
gcaacaggg 669
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<212>DNA
<213>人工序列
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agtgaattgg aatatggtaa ctgcaacacc aagtgtcaaa ctccaatggg ggcgataaac 60
tctagtatgc cattccacaa catacaccct ctcaccatcg gggaatgccc caaatatgtg 120
aaatcaaaca gattagtcct tgcgactggg ctcagaaata gccctcaaag agagagaaga 180
agaaaaaaga gaggactatt tggagctata gcaggtttta tagagggagg atggcaggga 240
atggtagatg gttggtatgg gtaccaccat agcaatgagc aggggagtgg atacgctgca 300
gacaaagaat ccactcaaaa ggcaatagat ggagtcacca ataaggtcaa ctcgatcatt 360
gacaaaatga acactcagtt 380
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<212>DNA
<213>人工序列
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aaggcactta ttggatcagg ggaaagggta gagaggtttg agatgtttcc caagagtaca 60
tgggcaggag tggacaccag cagtggagta acaagctctt gttcctttgg tagtggttca 120
tctttctaca ggaatctcct atggataata aaacacaggt catcaggata tccagtaatt 180
aagggaactt tcagaaacac tggagacaag tcagttctct atttttgggg tgtgcaccat 240
cctactgaca caactgagca aaacattctg tatggttctg gtaatcgata cgttagaatg 300
ggaactgaaa gcatgaattt tgccaggagc ccagaaattg cggcaaggcc tgctgtgaat 360
ggtcagagag gcagaattga ttatttctgg tccgttttaa aaccagggga aaccttgaat 420
gtagaatcta atgggaattt agtagcccct tggtatgcat acagatttgt cagcaaagat 480
agtaaaggag ccgtgttcag gtctaattta ccaatcgaga actgtgatgc cacatgccag 540
actattgaag gagtgataag aaccaacaaa acatttcaga atgtgagccc tctgtggata 600
ggagaatgcc caaaatatgt aaaaagtgag agtctaaggc ttgcaacagg actaaggaat 660
gttccacaaa ttgaaactag aggac 685
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aagagaatgg tcctatatcg tcgaaagacc atcggctgtt aatggattgt gttaccccgg 60
aaatgtagaa aacctagaag aactaaggtc actttttagt tctgctagtt cttaccaaag 120
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