结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌 的方法 本申请是中国专利申请 200580013120.4 的分案申请， 原申请的申请日是 2005 年 4 月 22 日， 发明名称是 “结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌的方法” 。
技术领域 本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系， 在临床检查中检测人型结核菌 ： 结核分 枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 以下称为人型结核菌 ) 的检测方法。
背景技术 人 型 结 核 菌 是 导 致 人 产 生 结 核 病 的 病 原 体， 是被分类在分枝杆菌属 (Mycobacterium) 并具有抗酸性质的革兰氏阳性杆菌。结核病虽然近年显著减少， 但是， 最 近产生了老年人的发病率上升、 在没有经历过结核感染的年轻人中引起集体感染等重大问 题。
另一方面， 除了人型结核菌以外， 已知鸟分枝杆菌 (Mycobacteriumavium)、 胞内分 枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii) 等非结核性抗酸菌对人表现病原性。另外， 在感染 AIDS 病毒的免疫缺陷者当中， 非结核性 抗酸菌引起疾病成了主要问题。由于这些非结核性抗酸菌病多数对抗结核药具有抗药性， 所以在决定治疗方案时， 鉴别诊断结核病和非结核性抗酸菌病是很重要的。但是， 从临床 症状、 病理组织学的观点来看， 鉴别结核病是非常困难的， 因此诊断必须通过菌的鉴定来进 行。
在鉴别诊断结核病或非结核性抗酸菌病时， 一般通过小川培养基分离培养样品， 为了鉴定种而进一步采用进行生化试验的方法。 然而， 通常由于分枝杆菌属生长慢， 培养时 需要相当长的时间。 因此， 进行历来的基本方法的涂片试验或培养试验时， 为了得到结核病 与否的诊断结果， 光是菌的分离培养就需要 3 ～ 4 周时间， 然后在鉴定种的各种试验中还需 要 2 ～ 3 周时间。
另外也有使用针对分枝杆菌属的抗原的抗体的结核菌检测法， 但是， 由于分枝杆 菌属种之间的交叉反应， 欠缺相对于结核菌的特异性， 灵敏度也不够。
近年， 利用聚合酶链反应 (PCR) 等的核酸扩增技术的诊断技术作为有用的方法被 研究， 也研究了可以被利用到结核菌的诊断中， 研究了结核菌 DNA 基因组的各区域是否在 用 PCR 进行的结核菌检测中可以用作靶标。
例如报道了检测编码分枝杆菌属的 65 千道尔顿抗原的基因区域的方法 ( 例如参 照非专利文献 1、 非专利文献 2、 非专利文献 3、 非专利文献 4、 非专利文献 5)。然而， 已知 65 千道尔顿抗原基因除了在人型结核菌中具有以外， 在鸟分枝杆菌 (M.avium)( 鸟型结核 菌 )、 偶发分枝杆菌 (M.fortuitum)、 副结核分枝杆菌 (M.paratuberculosis)、 堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii)、 BCG 和海分枝杆菌 (M.marinum) 等同属菌中也具有。尤其是， 由于与 非结核性抗酸菌病的典型的病原菌鸟分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌的交叉性高， 因此检测 65
千道尔顿抗原基因的方法作为特异地检测人型结核菌的方法还存在问题。
另外， 研究了使用自牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)DNA 鉴定的序列 - 编码 MPB70 蛋白质的基因序列进行结核分枝杆菌的鉴定的试验方法 ( 例如， 参照非专利文献 6)。 然而， Kulski 等人在 FEMS MicrobiolLett.1997 年 3 月 1 日 ； 148(1) ： 43-48( 非专利文献 7) 报道了其结果， 已知其中进行的 PCR 检验结果在以 MPB70 蛋白质作为靶标时， 与堪萨斯分 枝杆菌的 DNA 中存在的类似序列产生交叉反应， 该方法在特异地检测人型结核菌检测中也 存在问题。
此外， 报道了编码蛋白质抗原 b(Pab) 的基因序列作为标记的结核分枝杆菌 / 牛分 枝杆菌的检测方法 ( 例如参照非专利文献 8)， 证实了以结核分枝杆菌 / 牛分枝杆菌检测目 的使用该标记的有效性。但是， 由于考虑到 Pab 基因在结核基因组中仅存在一个拷贝， 因此 不太优选作为核酸扩增的靶标材料 ( 相对地， 后述的 IS6110 序列在核酸基因组中存在 10 个拷贝。)。
此外， 报道了 IS6110 作为探针的 RFLP( 限制性片段长度多态性 ) 可以在结核菌的 诊断中使用 ( 例如参照非专利文献 9)， 并且可以作为结核的流行病学调查的重要工具在世 界各国中被使用。IS6110 是结核菌特有的插入序列， 在染色体 DNA 中存在多个 IS6110， 其 在每种菌株中的数目、 位置不同， 其特性在一定程度上稳定地遗传下去。其结果是根据菌 株的不同而显示不同的 RFLP 型， 也可以分为衍生的组。直至目前为止， 很多报道涉及使用 IS6110 的结核检测方法， 报道了具有超过 75％的灵敏度和接近 100％的特异性。 但是， 另一 方面， 研究结果也报道了在使用 IS6110 的检测方法中， 存在产生假阳性的问题 ( 非专利文 献 10)。另外， 也有对 IS6110 设计特异的引物而进行 PCR 的检测方法 ( 例如参照专利文献 1、 专利文献 2、 专利文献 3、 专利文献 4)， 但存在涉及结核分枝杆菌以外的来自分枝杆菌属 的与 IS6110 相关的序列也扩增的问题。 另外， IS6110 样序列也存在于结核菌以外的其他微 生物中， 在以 IS6110 作为靶标的检测方法中， 暗示了这些微生物也被检测出来的问题。因 此， 历来检测 IS6110 的方法在特异地检测各种人型结核菌方面是不充分的， 并存在问题。
由以上看出 ： 目前的情况是期望确立一种新的特异地检测人型结核菌的方法。
专利文献 1 ： 特表平 5-507617 号公报
专利文献 2 ： 特表平 11-514522 号公报
专利文献 3 ： 日本专利第 2814422 号公报
专利文献 4 ： 美国专利第 5370998 号说明书
专利文献 5 ： 特开昭 60-500717 号公报
专利文献 6 ： 特开昭 60-281 号公报
专利文献 7 ： 美国专利第 5210015 号说明书
专利文献 8 ： 美国专利第 5538848 号说明书
专利文献 9 ： 美国专利第 5,801,155 号说明书
专利文献 10 ： 美国专利第 5925517 号说明书
专利文献 11 ： 美国专利第 6,492,121 号说明书
专利文献 12 ： 日本专利第 2650159 号公报
专利文献 13 ： 特公平 7-114718 号公报
专利文献 14 ： 特开昭 58-40099 号公报专利文献 15 ： 特开昭 62-265999 号公报
非 专 利 文 献 1： Chia 等 人， J.Clin.Microbiol.， 1990 年，第 28 卷，第 9 期， 1877-1880 页 ；
非专利文献 2 ： Brisson-Noel 等人， Lancet， 1989 年， 第 334 卷， p.1069-1071
非专利文献 3 ： Hackel 等人， Molecular and cellular Probes， 1990 年， 第 4 卷， p.205-210
非专利文献 4： Woods， Cole， FEMS Mycrobiology Letters， 1989 年， 第 65 卷， p.305-310
非专利文献 5 ： Hance 等人， Molecular Microbiology， 1989 年， 第 3 卷， 第 7 期， p.843-849
非专利文献 6 ： Kulski 等人， J.Clin Microbiol.， 1995 年， 第 33 期， p.668-674
非专利文献 7 ： Kulski 等人， FEMS Microbiol Lett.1997 年 3 月 1 日， 第 148 卷， 第 1 期， p.43-48
非专利文献 8 ： Sjobring 等人， J.Clin.Microbiol.， 1990 年， 第 28 卷， 第 10 期， p.2200-2204 非 专 利 文 献 9： Hermans PWM 等 人， J.Clin.Microbiol.， 1990 年，第 28 卷， p.2051-2058
非专利文献 10 ： Lee 等人， Neurological Sciences， 1994 年， 第 123 卷， p.173-179
非专利文献 11 ： Thierry 等人， Nucleic Acid Res.， 1990 年， 第 18 卷， 第 1 期， p.188
非专利文献 12 ： Nucleic Acids Res.， 1986 年， 第 14 卷， p.6115-6128
非专利文献 13 ： Kent PT， Kubica GP， Pubric HealthMycobacteriology， A Guild for the Level III laboratory， U.S.Department ofHealth and Human Services， Public Health Service， Center for DiseaseControl， Atlanta， U.S.A.， 1985 年， p.31-55
发明内容
发明欲解决的课题
鉴于上述情况， 本发明的目的是提供一种排除诊断上的假阳性的新颖的结核菌检 测用引物， 和使用该引物简便、 迅速且准确度高地检测人型结核菌的检测方法。
用于解决课题的手段
本发明以解决上述课题为目的并已完成了发明， 包括以下内容。
(1) 含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序 列号 8 中所述的核酸序列 ( 其中， A 表示腺嘌呤、 C 表示胞嘧啶、 G 表示鸟嘌呤、 T 表示胸腺 嘧啶。另外， 任意位置的 T 可以被尿嘧啶 (U) 替换。下同 ) 的部分或全部， 或其互补序列的 部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。
(2) 一种人型结核菌检测用引物， 含有寡核苷酸， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列 号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分 或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交。
(3) 一种人型结核菌检测用探针， 含有寡核苷酸， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核酸序列的部分 或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交。
(4) 一种人型结核菌的检测方法， 其特征在于 ： 使用寡核苷酸作为引物和 / 或探 针， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的 部分或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂 交。
(5) 一种人型结核菌检测用试剂盒， 包括含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结 核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物和 / 或探针。
本发明人对直至目前所确定的人型结核菌和其他生物的各种基因， 反复进行各属 种之间的各基因序列的同源性的理论验证和实验验证， 结果发现存在这样的碱基序列， 所 述碱基序列特异地与人型结核菌的插入重复序列 -IS6110 序列的特定区域杂交， 是对人型 结核菌的检测有用的碱基序列。
对这些发现作进一步深入的研究， 结果研发了对人型结核菌具有特异性、 并用于 其检测的寡核苷酸 ( 序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 和序列号 8 中所述的核酸序列 ) 和利用它们的人型结核菌检测用核酸引物和标识探针， 并 确立使用它们的人型结核菌的检测方法。 发明效果
根据本发明的人型结核菌的检测方法， 与历来使用的 IS6110 作为靶标的结核菌 的检测方法相比， 可能排除诊断上的假阳性， 并且可能以更高的特异性和精确度检测人型 结核菌。
附图简述
[ 图 1] 是实施例 1 中所得的电泳结果。另外， 各泳道的数字分别表示分别使 用 以 下 的 试 样 时 的 结 果。M4 ： 分 子 量 标 记 ( 标 记 4)、 a： 大 肠 菌 (Escherichia coil)、 b、 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人 型 结 核 菌 )、 c、 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)、 d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)、 e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)、 f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)、 g： 戈氏分枝 杆菌 (Mycobacterium gordonae)、 h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)、 i： 鸟分枝 杆菌 (Mycobacterium avium)、 j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacteriumintracellulare)k ： 胃分 枝杆菌 (Mycobacterium gastri)、 l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)、 m： 无色分枝杆 菌 (Mycobacteriumnonchromogenicum)、 n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)、 o： 次要 分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)、 p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacteriumfortuitum)、 q： 龟 分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)、 r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)、 s： Mybacterium peregrinum。
[ 图 2] 是实施例 2 中所得的电泳结果。另外， 各泳道的数字分别表示分别使用 以下试样时的结果。M1 ： 分子量标记 ( 标记 1)、 M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)、 a： 大肠杆菌 (Escherichia coil)、 b、 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )、 c、 堪 萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)、 d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)、 e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)、 f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacteriumscrofulaceum)、
g： 戈 氏 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium gordonae)、 h： 斯 氏 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium szulgai)、 i： 鸟 分 枝 杆 菌 (Mycobacteriumavium)、 j： 胞 内 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium intracellulare)k ： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)、 l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)、 m： 无 色 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)、 n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)、 o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)、 p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)、 q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)、 r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)、 s： Mybacterium peregrinum。
[ 图 3-1] 是比较例 1 中所得电泳图。另外， 各泳道的数字分别表示分别使用 以下试样时的结果。另外， 当使用无色分枝杆菌 (Mycobacteriumnonchromogenicum) 作 为试样时 (m) 的条带用虚线圆圈起来表示。另外， 当使用次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 作为试样时 (o) 的条带用箭头指向的虚线圆圈起来表示。MI ： 分子量标记 ( 标 记 1)、 M4 ： 分 子 量 标 记 ( 标 记 4)、 a： 大 肠 杆 菌 (Escherichia coil)、 b、 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)、 c、 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacteriumkansasii)、 d： 海分枝 杆菌 (Mycobacterium marinum)、 e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)、 f： 瘰疬分枝杆 菌 (Mycobacteriumscrofulaceum)、 g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)、 h： 斯氏 分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)、 i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacteriumavium)、 j： 胞内分枝 杆菌 (Mycobacterium intracellulare)k ： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)、 l： 蟾分 枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)、 m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)、 n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)、 o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)、 p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)、 q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)、 r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)、 s： Mybacterium peregrinum(peregrinum 分枝 杆菌 )。
[ 图 3-2] 表示对次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 试样进行上述电泳 所得的部分 (o) 中， 对扩增片段的大小判断为与人型结核菌的阳性条带非常相似的部分的 PCR 产物进行纯化、 分析得到的核酸序列列表。其中， 源自部分 (b) 的人型结核菌的 PCR 产 物的序列作为第一核苷酸序列， 为了比较， 表示在序列表的上段。另外， 自部分 (o) 所得的 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 来源的 PCR 产物的序列作为第二核苷酸序列， 表 示在序列表的下段。
[ 图 4] 表示在实施例 3 中进行的实时 PCR 检测结果， 绘制相对各 PCR 用 DNA 试样 的基因组的拷贝数 (x 轴、 对数值 ) 的 Ct 值 (y 轴 ) 的校正曲线。
[ 图 5] 是实施例 4 所得的电泳的结果。另外， 各泳道的数字分别表示分别使 用以下的试样时的结果。M ： 分子量标记、 (1) 没有试样、 (2) 人型结核菌 + 鸟分枝杆菌 (M.avium)+ 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)、 (3) 人 型结核菌、 (4) 鸟分枝杆菌 (M.avium)+ 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii)、 (5) 人型结核菌 (10 个拷贝 )+ 鸟分枝杆菌 (M.avium)+ 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)、 (6) 鸟分枝杆菌 (M.avium)、 (7) 人 型结核菌 + 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)。另外， 在 电泳模式的左边用箭头表示电泳方向， 表示各扩增产物的部分的出现顺序。 “TB” 表示结核 分枝杆菌 (M.tuberculosis)、 “avium” 表示鸟分枝杆菌 (M.avium)、 “intra” 表示胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 “kansasii” 表示堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)。
[ 图 6] 表示在实施例 5 中进行的实时 PCR 检测结果， 绘制相对各 PCR 用 DNA 试样 的基因组的拷贝数 (x 轴、 对数值 ) 的 Ct 值 (y 轴 ) 的校正曲线。
实施发明的最佳方式
本发明涉及的人型结核菌的 IS6110 基因是由全长 885 个碱基对的碱基序列组成， 例如在根据巴斯德研究所的报告 “Nucleic Acid Res1990， No.18(1)， p.188” ( 非专利文献 11) 中记载了该全碱基序列。
作为本发明涉及的寡核苷酸， 可以列举含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的 部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸 ( 以下， 简称为 本发明的寡核苷酸。)。
作为本发明涉及的含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸， 例如可以列举含有与序 列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸 序列具有约 70％或以上、 优选约 80％或以上、 更优选约 90％或以上、 最优选约 95％或以上 的同源性的碱基序列的寡核苷酸， 或特征在于含有序列表的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部， 并且由连 续 10 个碱基或以上、 优选 20 个碱基或以上组成的寡核苷酸。
作为本发明涉及的含有相对序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列 号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部为互补序列的部分或全部的寡核苷 酸， 例如可以列举具有与含有本发明的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序 列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂交的碱基序列的部 分或全部的寡核苷酸。
所谓上述的本发明涉及的具有与含有本发明的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列 号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂 交的碱基序列的部分或全部的寡核苷酸， 具体地， 可以列举具有在高严格的条件或严格的 条件下， 与含有本发明的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂交的碱基序列的部分或全部的寡 核苷酸等。
另外， 其中所谓的 “高严格的条件”具体地是指例如在 50 ％的甲酰胺中、 42 ～ 70℃、 优选 60 ～ 70℃的杂交， 然后在 0.2 ～ 2×SSC、 0.1％十二烷基硫酸钠 (SDS) 中、 25 ～ 70℃洗净的条件。
另外， 所谓的 “严格的条件” 具体地是指例如在 6×SSC 或与其等价的盐浓度的杂 交溶液中， 在 50 ～ 70℃的温度条件下进行 16 小时的杂交， 在 6×SSC 或与其等价的盐浓度 的溶液等中根据需要进行预洗净后， 在 1×SSC 或与其等价的盐浓度的溶液等中洗净的条 件。
所谓本发明涉及的与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸， 可 以列举前述的具有在高严格的条件或严格的条件下， 与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸 序列杂交的碱基序列的寡核苷酸等。该高严格的条件和严格的条件如前所述。另外， 本发明的寡核苷酸可以是脱氧核糖核酸 (DNA)， 也可以是核糖核酸 (RNA)。 当然核糖核酸时， 胸苷残基 (T) 与尿苷残基 (U) 可以相互替换。另外， 也可以在合成时将任 意位置的 T 变为 U 进行合成， 得到含有尿苷残基的 DNA。 同样地也可以得到含有将任意位置 的 U 变成 T 的胸苷残基的 RNA。另外， 也可以是 1 个或多个核苷酸的缺失、 插入或替换， 也可 以是如肌苷 (I) 这样的修饰核苷酸。
为了获得本发明的寡核苷酸， 也可以使用通过本身公知的化学合成法制备的寡核 苷酸。因此， 相比克隆化的寡核苷酸或多核苷酸， 更可以容易、 大量且便宜地获得一定质量 的寡核苷酸。
例如， 使用通常进行 DNA 合成的 DNA 合成仪， 根据通常的磷酰胺 ( ホスホアミダイ ト ) 法合成寡核苷酸， 根据使用阴离子交换柱色谱的常规方法进行纯化， 可以得到作为目 的的本发明的寡核苷酸。
作为本发明涉及的人型结核菌检测用引物， 可以列举具有含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或 全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的人型结核菌检测用 引物 ( 以下称为本发明的引物 )。 本发明的引物中使用的含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的具体例子， 可以是在前述的本发明的寡核苷酸的叙述中 所述的。
另外， 本发明的引物， 例如在符合作为目的的核酸杂交条件下， 从含有序列号 1 ～ 5 中所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互补序列的部分或全部的寡核苷酸 中， 考虑解链温度 (Tm 值 ) 等、 可以以适当区域的适当长度使用。考虑到维持作为引物序列 的特异性所需的碱基数， 优选具有 10 个碱基或以上、 更优选具有 20 个碱基或以上的长度。
将本发明的引物作为在 PCR 等中使用的引物时， 例如优选正向引物是含有序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部的寡核苷酸， 反向引物 是含有序列号 3 或 4 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部的寡核 苷酸。
其中， 正向引物优选序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的寡核苷酸， 反向引物优选序 列号 3 或 4 中所述的核酸序列的寡核苷酸。
作为特别优选的引物的组合， 可以列举 (a) 正向引物是序列号 1 中所述的核酸序 列的寡核苷酸， 反向引物是序列号 3 中所述的核酸序列的寡核苷酸的组合， 或 (b) 正向引物 是序列号 2 中所述的核酸序列的寡核苷酸、 反向引物是序列号 4 中所述的核酸序列的寡核 苷酸的组合。
获得本发明的引物的方法是如获得前述的本发明的核苷酸的方法中所述的方法。
本发明的引物也可以通过标识物质被标识。
作为用于通过标识物质标识本发明的引物的标识物质， 可以使用放射性同位素或 酶、 荧光物质、 发光物质、 生物素等公知的标识物质中的任一种。 33 35
例 如， 作 为 放 射 性 同 位 素， 可 以 列 举 32P、 P、 S等； 作 为 酶， 可以列举碱性磷 酸酶、 西洋辣根过氧化物酶等 ； 作为荧光物质， 可以列举花菁染料 (Cyanine Dye) 系的
Cy3、 Cy5(Amasham Bioscience 公司 )、 荧光素等 ； 作为发光物质， 可以列举含有吖啶嗡酯 (Acridinium Ester) 的化学发光试剂等。
通过放射性同位素标识本发明的引物时， 可以列举在合成引物时， 通过掺入使用 放射性同位素标识的核苷酸以标识引物的方法、 或合成引物后， 使用放射性同位素标识的 方法等。具体地， 可以列举通常使用较多的随机引物法、 切口移位法、 通过 T4 多核苷酸激酶 的 5′ - 末端标识法、 使用末端转脱氧核苷酰酶的 3′ - 末端标识法、 RNA 标记法等。
通过酶标识本发明的引物时， 可以使用使碱性磷酸酶、 西洋辣根过氧化物酶等酶 分子与标识的引物直接共价键合等该领域中常用的方法即直接标识法。
通过荧光物质标识时， 例如可以通过该领域中常用方法的标识技术掺入荧光素标 识的核苷酸到引物上。另外， 在具有连接臂的核苷酸作为序列的寡核苷酸的一员的替代方 法 ( 例如， 参照非专利文献 12) 中， 也可以通过荧光物质标识核苷酸。这时， 也有通过特开 昭 60-500717 号公报 ( 专利文献 5) 中公开的合成法由脱氧尿苷化学合成 5 位上具有连接 臂的尿苷， 在上述寡核苷酸链中引入荧光物质的方法。
通过发光物质标识的方法和通过生物素标识的方法， 通常可以根据该领域中采用 的发光标识或生物素标识核苷酸的常规方法进行。 作为本发明涉及的人型结核菌检测用探针， 可以列举含有寡核苷酸 ( 本发明的寡 核苷酸 ) 的探针 ( 以下称为本发明的探针 )， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补 序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交。
在本发明的探针中使用的本发明的寡核苷酸的具体例子如前述的本发明的寡核 苷酸的叙述中所述。
本发明的探针例如在符合作为目的的核酸杂交条件下， 由含有序列号 1 ～ 8 所述 的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互补序列的部分或全部的寡核苷酸， 计算解 链温度 (Tm 值 ) 等， 可以以合适的长度使用合适的区域。但是， 考虑到使探针具有充分的特 异性， 同时为了维持作为探针序列的特异性所需的碱基数， 优选具有 10 个碱基或以上， 更 优选 20 个碱基或以上的长度。
另外， 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核酸序列是通过使用本发明的引物 进行 PCR 而被扩增的核酸序列。例如， 序列号 6 中所述的核酸序列是通过以序列号 1 中所 述的核酸序列的寡核苷酸作为正向引物， 序列号 3 中所述的核酸序列的寡核苷酸作为反向 引物进行 PCR 而被扩增的序列 ； 序列号 7 中所述的核酸序列是通过以序列号 2 中所述的核 酸序列的寡核苷酸作为正向引物， 序列号 4 中所述的核酸序列的寡核苷酸作为反向引物进 行 PCR 而被扩增的序列 ； 序列号 8 中所述的核酸序列是通过以序列号 4 中所述的核酸序列 的互补链序列的寡核苷酸 ( 序列号 14) 作为正向引物， 序列号 5 中所述的核酸序列的寡核 苷酸作为反向引物通过 PCR 而被扩增的序列。
获得本发明的探针的方法如在获得前述的本发明的核苷酸的方法中所述。
本发明的探针可以通过标识物质被标识。
作为通过标识物质标识本发明的探针中所使用的标识物质， 可以使用放射性同位 素或酶、 荧光物质、 发光物质、 生物素等公知的标识物质的任一种。
标识本发明的探针的标识物质的具体例子和标识方法如在本发明的引物的标识
方法的叙述中所述。
另外， 作为后述的实时 PCR 检测法中使用的标识探针， 可以列举通过在实时检测 法中通常使用的标识物质对本发明的探针进行了标识的探针。 例如， 可以列举 5′末端使用 报告荧光物质 ( 羧基荧光素 (FAM)、 六氯荧光素 (HEX)、 四氯荧光素 (TET) 等 ) 标识的， 3′ 末端使用猝灭剂染料 ( 例如羧基四甲基若丹明 (TAMRA) 等荧光物质、 Black Hole Quencher 染料 BHQ， 4-((4- 二甲氨基 ) 苯基 ) 偶氮 ) 苯甲酸 (DABCYL) 等的非荧光物质 ) 标识的本发 明的寡核苷酸。
作为在本发明涉及的人型结核菌的检测中使用的试样， 可以列举人的痰、 血液、 经 支气管采样等的各种临床材料。 另外， 也可以是从样品中分离培养的培养菌、 自它们分离纯 化的核酸、 或通过核酸扩增检测体系等被扩增的核酸。
从上述试样提取、 纯化 DNA 可以依据从样品中提取抗酸菌 ( 结核菌 )DNA 中使用的 常规方法进行。
例如在以菌体作为试样时， 例如可以列举通过 SDS 等表面活性剂或硫氰酸胍 (GTC) 等蛋白变性剂处理菌体以破坏结核菌的膜结构的方法、 通过玻璃珠等物理压碎菌体 的方法等。 以痰作为试样时， 作为前处理， 可以通过美国疾病管理预防中心 (Centers for Disease Control and Prevention， 简称 CDC) 推荐的 NALC(N- 乙酰 -L- 半胱氨酸 )-NaOH 法 ( 非专利文献 13) 进行样品的均质化。
然后， 可以通过一般的 DNA 制备法 ( 酚 / 氯仿提取、 乙醇沉淀法等， Rapid and simple method for purification of nucleic acids， J.Clin.Microbiol.， 1990 年 3 月 ； 28(3)， 495-503， Boom R， Sol CJ， Salimans MM， Jansen CL， Wertheim-van Dillen PM， van der Noordaa J) 进行 DNA 的提取和纯化。
从样品中分离、 培养的培养菌用作检测人型结核菌的试样时的例子有例如收集小 川培养基上的菌落， 悬浮在灭菌蒸馏水中， 离心分离收集菌体后， 再悬浮在蒸馏水中， 高压 灭菌釜处理后， 经菌体的粉碎处理 ( 通过玻璃珠进行物理压碎等 )， 再离心分离回收上清 液。从所得的上清液中可以提取纯化 DNA。对于 DNA 的提取纯化， 由于市售有各种试剂盒， 因此可以使用这些试剂盒进行， 也可以根据该领域中的常规方法 ( 例如， 酚 / 氯仿提取法、 使用乙醇或异丙醇等使沉淀的方法等 ) 进行。例如， 可以使用 ( 株 ) キアゲソ制离子交换 树脂类型的 DNA 提取纯化试剂盒 Genomic-tip 等进行 DNA 的提取、 纯化。
作为本发明涉及的人型结核菌的检测方法， 可以列举将含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或含有其互补序列的部分 或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物和 / 或探针 的方法 ( 使用本发明的引物和 / 或探针的方法 )。
例如， 使用本发明的引物， 使其与试样中的核酸杂交， 通过 DNA 聚合酶等进行核酸 扩增 ( 例如 PCR ； 专利文献 6) 使引物延伸， 因为对于人型结核菌， 可以使 IS6110 核酸序列 的特异区域的序列扩增， 通过测定所得引物延伸物， 可以检测人型结核菌。
作为本发明涉及的使用本发明的引物检测人型结核菌的检测方法的具体例子， 可 以列举 “人型结核菌的检测方法， 其特征在于 ： 包括下述步骤 (i) 使用含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或含有其互补序列的部
分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物 ( 本发明 的引物 )， 以试样中的核酸作为模板进行 PCR， (ii) 对于上述 (i) 所得的引物延伸物进行电 泳， 由其结果判断有无人型结核菌” 。
在上述方法中使用的本发明的引物的具体例子如前所述。
优选地， 可以列举以含有序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补 序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为正 向引物， 以含有序列号 3 或 4 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全 部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为反向引物。
使用上述引物的 PCR、 及接下来进行电泳法的条件、 操作方法等可以参照该领域中 通常使用的常规方法。
作为进行电泳并由其结果判断有无人型结核菌的方法， 例如可以例举 (a) 通过确 认目标碱基对数的引物延伸物部分来判断的方法、 (b) 通过使用标识探针的杂交来判断的 方法等。
作为 (a) 通过确认目标碱基对数的引物延伸物部分来判断的方法， 例如可以列举 使用序列号 1 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 3 所述的寡核苷酸作为反向引物， 进行 PCR 后， 对所得的引物延伸物进行电泳， 对确认有 178 个碱基对部分的试样判断为阳性 的方法。
另外， 例如也可以是使用序列号 2 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 4 所 述的寡核苷酸作为反向引物， 进行 PCR 后， 对所得的引物延伸物进行电泳， 对确认有 182 个 碱基对部分的试样判断为阳性的方法。
另外， 例如也可以是使用序列号 14 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 5 所述的寡核苷酸作为反向引物， 进行 PCR 后， 对所得的引物延伸物进行电泳， 对确认有 324 个碱基对部分的试样判断为阳性的方法。
作为通过使用 (b) 的标识探针的杂交进行判断的方法， 例如， 可以列举在进行电 泳后， 对于所得的电泳部分， 进行使用标识物质标识的标识探针与本发明的核苷酸的杂交， 通过检测该标识探针的标识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
例如， 可以列举以使用序列号 1 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 3 所述 的寡核苷酸作为反向引物进行 PCR 的情况为例， PCR 后， 进行电泳， 对于所得的部分， 进行使 用标识物质标识的标识探针与含有序列号 6 中所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交， 通过检 测该标识探针的标识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
另外， 使用序列号 2 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 4 所述的寡核苷酸 作为反向引物进行 PCR 时， PCR 后， 进行电泳， 对于所得的部分， 进行使用标识物质标识的标 识探针与含有序列号 7 所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交， 通过检测该标识探针的标识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
另外， 使用序列号 14 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 5 所述的寡核苷 酸作为反向引物进行 PCR 时， PCR 后， 进行电泳， 对于所得的部分， 进行使用标识物质标识 的标识探针与含有序列号 8 所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交， 通过检测该标识探针的标 识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
可以列举下述例子来详细说明本发明涉及的人型结核菌的检测方法 ： 例如进行PCR 以及电泳后， 其中 PCR 使用序列号 2 所述的寡核苷酸作为正向引物， 序列号 4 所述的寡 核苷酸作为反向引物， 通过确认目标碱基对数的引物延伸物部分的方法进行检测， 如下所 述。
首先， 根据前述方法， 从应该检出人型结核菌的试样中得到纯化的 DNA 试样。另 外， 通过前述的方法， 从本发明涉及的核苷酸， 使用 DNA 合成仪， 根据磷酰胺法， 合成序列号 2 所示的序列 ( 以下称为 IS_F6) 和序列号 4 所示的序列 ( 以下称为 IS_R6) 的寡核苷酸。
制 备 含 有 各 0.2 ～ 2.0μm 的 IS_F6 和 IS_R6、 1.0 ～ 4.0mM MgCl2、 80mMKCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.005 ～ 0.2％ Triton X-100( トリトン X-100、 聚氧乙烯辛 苯基醚、 rohm-and-haas 公司商品名 )、 分别为 0.1 ～ 0.6mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 10 ～ 80 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用反应 液。
向 PCR 用反应液中添加 1ng 纯化的 DNA 试样使用作 PCR 用试样， 通过 DNA 热循环 仪， 进行 20-40 次 PCR。对 PCR 后所得的 5μL 反应液进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳。接着溴 化乙锭染色后， 用紫外线检测荧光。另外， 分子量标记也与反应液一起迁移， 通过比较相对 迁移程度， 计算出被检测的 DNA 片段的长度。在使用 IS_F6 作为正向引物和 IS_R6 作为反 向引物的 PCR 中， 预测 IS6110 的核酸序列中的 182 个碱基对的 DNA 片段 ( 序列号 7) 被复 制。其中， 182 个碱基对的荧光条带被确认的试样可以判断为阳性。
作为本发明涉及的使用寡核苷酸作为引物的人型结核菌的检测方法的其他实施 方式， 可以列举将本发明的引物使用前述方法标识的标识引物， 进行以试样中的核酸作为 模板的 PCR， 在通过测定所得引物延伸物的标识可以检测到标识的情况下， 判断人型结核菌 阳性的方法。
上述方法中， 在进行 PCR 后， 除去游离的标识引物， 测定引物延伸物的标识， 可以 检测到标识时， 判断为人型结核菌阳性。
作为除去游离的标识引物的方法， 可以列举通过使核酸沉淀的常规方法 ( 乙醇沉 淀法、 使用异丙醇的沉淀法等 ) 使进行 PCR 后所得的反应物中的引物延伸物沉淀， 然后除去 含有未沉淀的游离标识引物的上清液的方法。
另外， 也可以列举在适当的条件下， 通过凝胶层析法处理进行 PCR 反应所得的反 应物， 分离引物延伸物和游离的标识引物的方法， 通过电泳分离的方法等。
对于本发明的人型结核菌的检测方法， 也可以使用实时扩增检测体系 ( 例如参照 专利文献 7、 专利文献 8 的记载 )。
作为通过实时扩增检测体系的检测体系例子， 可以列举实时 PCR 检测体系。
例如， 可以在本发明的人型结核菌的检测方法中使用 TaqManTM 实时 PCR 法 ( 例 如参照专利文献 8 的记载 )、 MGB Eclipse Probe System 法 ( 例如参照专利文献 9 的记 载 )、 Molecular Beacons Probe Technology 法 ( 例如参照专利文献 10 的记载 )、 LUX Fluorogenic Primer 法 (InvitrogenCorporation)、 Quenching probe-PCR(QP) 法 ( 例如 参照专利文献 11 的记载 ) 等各种实时 PCR 检测法。
更加具体地， 通过使用以 FAM 标识 5′末端， TAMRA 标识 3′末端的探针的 TaqManTM 实时 PCR 法 ( 例如参照专利文献 8 的记载 )， 可以高灵敏度且定量地检测目标的微量的 DNA。
即， 使用含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸作为引物 ( 本发明的引物 )， 使用含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核酸序列的部分或全部或其互补序列 的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸 ( 本发明的寡 核苷酸 ) 的 5′末端通过报告荧光染料被标识， 3′末端通过猝灭染料被标识的寡核苷酸作 为标识探针， 试样中的核酸作为模板， 进行 PCR， 通过检测从该标识探针游离的标识物质而 进行的方法。
上述 TaqManTM 实时 PCR 法的原理如下所示。可以使用通过荧光染料 ( 报告分子 ) 标识 5′末端， 猝灭染料标识 3′末端的、 在目标基因的特定区域杂交的寡核苷酸探针。该 探针在通常的状态下， 通过猝灭染料抑制报告分子的荧光。在完全使该荧光标识探针与目 标基因杂交的状态下， 从其外侧使用 TaqDNA 聚合酶进行 PCR。 如果通过 TaqDNA 聚合酶进行 延伸反应， 则荧光标识探针由于该核酸外切酶活性而自 5′端水解， 报告染料游离， 发出荧 光。实时 PCR 法通过实时地监测该荧光强度， 可以正确地测定模板 DNA 的初期量。
作为本发明涉及的实时 PCR 检测体系中使用的、 通过荧光染料 ( 报告分子 ) 标识 5′末端、 猝灭染料标识 3′末端的探针中使用的探针， 可以是前述的本发明的探针， 或由所 述探针序列设计的探针。 例如， 可以列举由序列号 6 设计的序列号 11 所示的序列。 另外， 作 为标识 5′末端的报告荧光物质， 可以列举 FAM、 HEX、 TET 等， 其中优选 FAM。作为标识 3′ 末端的猝灭染料， 可以列举 TAMRA 等荧光物质、 BHQ、 DABCYL 等非荧光物质， 其中优选 TAMRA。 作为本发明涉及的实时 PCR 检测体系中使用的正向引物的优选例子， 可以列举含 有序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型 结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸， 作为反向引物的优选例子， 可以列举含 有序列号 3 或 4 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型 结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。
实时 PCR 检测体系中所使用的其他的脱氧核苷三磷酸 (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP)、 DNA 聚合酶等试剂， 可以使用在通常的实时 PCR 中所使用的试剂， 实时 PCR 技术除了使用本 发明的引物和探针以外， 也可以根据实时 PCR 的一般方法进行。
阐述本发明涉及的通过实时 PCR 检测体系 (TaqManTM 实时 PCR 法 ) 检测人型结核 菌的检测方法的例子如下所示。
首先， 根据前述方法， 从可以检测人型结核菌的试样中制得纯化的 DNA 试样。另 外， 使用 DNA 合成仪， 通过磷酰胺 ( ホスホアミダイト ) 法合成序列号 1 所示的序列 (IS_ F5)、 序列号 3 所示的序列 (IS_R5) 的寡核苷酸。
另外， 自通过使用 IS_F5 和 IS_R5 作为引物进行 PCR 而扩增的序列号 6 的寡核苷 酸设计用作探针的序列 ( 序列号 11)， 合成该序列的寡核苷酸。通过常规方法将报告染料 FAM 键合至该寡核苷酸的 5′末端， 将报告消光体 TAMRA 键合至该寡核苷酸的 3′末端， 制得 荧光标识探针。
使用上述制备的 IS_F5 作为正向引物， IS_R5 作为反向引物， 例如如下所示进行实 时 PCR。
即， 制备含有各 1μM 的引物 IS_F5 和引物 IS_R5、 100 ～ 1000nM 荧光标识探针、 1.0 ～ 4.0mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.005 ～ 0.2％ TritonX-100、
分 别 为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP、 10 ～ 80 单 位 /mL 的 Taq DNA 聚 合 酶 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH8.9)， 作为反应液。向 20μL 反应液中加入 1ng 纯化的 DNA 试样作为 PCR 用试样， 加入到 96 孔反应板的孔中， 使用 TaqManTMpCR 专用实时 PCR 检测装置进行实时 PCR。反应进行 30 ～ 50 个循环， 测定每次循环报告染料的发光量。
在人型结核菌的判断中， 测定报告染料的发光量时， 可以判断人型结核菌阳性。
另外， 在实时 PCR 法中， 由于可以制作校正曲线， 因此可以制得试样中的人型结核 菌的基因组 DNA 的数目 ( 拷贝数 )。另外， 由于该数目与人型结核菌的数目成比例， 因此也 可以得到试样中的人型结核菌的数目。校正曲线的制作方法可以参照实时 PCR 方法中通常 进行的常规方法进行。例如， 使用拷贝数已知的人型结核菌的基因组 DNA 试样作为标准， 制 备稀释系列的浓度 ( 拷贝数 ) 的 PCR 用 DNA 试样。接着， 使用各稀释系列的 PCR 用 DNA 试 样， 根据上述方法进行实时 PCR， 测定报告染料的发光量。在各个稀释系列的 PCR 用 DNA 试 样中， 绘制相对 PCR 的各个循环数 (x 轴 ) 测定的发光量的测定值 (Rn、 y 轴 )， 制作成扩增 曲线。接着， 选择发光量呈指数函数地扩增的 Rn 部， 引入临界线 (Threshold line)(Th)。 Th 和各个 PCR 用 DNA 试样的扩增曲线的交叉点为临界循环 (Thresholdcycle)(Ct) 值。接 着绘制相对使用的各个 PCR 用 DNA 试样的拷贝数的对数值 (x 轴 ) 的 Ct 值 (y 轴 )， 对应各 Ct 所得的近似曲线可以作为校正曲线。 对于定量试样中的人型结核菌的基因组 DNA 的数目 ( 拷贝数 )， 首先， 从可以检测 人型结核菌的试样中分离纯化 DNA， 然后， 对所得的 DNA 试样进行实时 PCR， 同样地制作扩增 曲线。得到在制作校正曲线时的 Th 和所得扩增曲线交叉的 Ct 值。通过将该 Ct 值应用于 校正曲线， 由此可以获得试样中的人型结核菌的基因组 DNA 量 ( 拷贝数 )。
另外本发明在核酸扩增步骤中， 可以应用利用 RNA 转录产物的检测法。例如， 可以 列举 NASBA( 基于核酸序列的扩增 ) 法 ( 专利文献 12)、 3SR( 自我维持的序列扩增 ) 法 ( 专 利文献 13) 等， 其中利用逆转录酶和 RNA 聚合酶的协同作用 ( 逆转录酶和 RNA 聚合酶在协 同地作用的条件下反应 ) 的特定温度核酸扩增法适用于测定系统的自动化。
另外， 作为本发明的人型结核菌的检测方法， 可以列举通过标识物质标识含有序 列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核 酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核 酸序列杂交的寡核苷酸 ( 本发明的寡核苷酸 ) 作为标识探针， 使该标识探针与试样中的核 酸杂交， 除去游离的标识探针后， 检测杂交复合体的标识的方法。
具体地， 可以列举例如 (a) 将本发明的寡核苷酸结合在固相载体上， 用作捕捉探 针， 使其与试样中的核酸杂交， 使试样中的人型结核菌衍生的核酸固定在固相上的检测法 ( 例如， 参照专利文献 15 的记载 )， (b) 使用 (a) 的捕捉探针和本发明的标识探针， 使其与 试样中的核酸杂交， 在固相载体上形成捕捉探针和人型结核菌衍生的核酸和标识探针的复 合体， 进行测定标识探针的夹心试验 ( 例如， 参照专利文献 14 的记载 ) 的方法等。或者也 可以使用 (c) 使用生物素标识的本发明的标识探针， 与试样中的核酸杂交后， 通过抗生物 素蛋白结合载体捕捉试样中的人型结核菌衍生的核酸的方法。
另外， 在本发明的人型结核菌的检测方法中所使用的试剂中， 可以使用通常在该 领域中所使用的试剂类， 例如缓冲剂等稳定剂、 防腐剂等不会妨碍共存试剂等的稳定性、 不 会妨碍 PCR 或杂交反应的试剂。另外， 其浓度也适宜选择通常在该领域中经常使用的浓度
范围。 如果列举缓冲液的具体例子， 完全可以列举例如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、 磷酸 缓冲液、 佛罗那缓冲液、 硼酸缓冲液、 良好缓冲液 ( グッド緩衝液 ) 等在实施通常的 PCR 或 杂交反应时所使用的缓冲液， 其 pH 也没有特别的限制， 通常优选 5 ～ 9。
另外， 根据需要， 可以使用核酸合成酶 (DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 逆转录酶等 )、 对 TM 应酶的基质 (dNTP、 rNTP 等 )、 或者双链嵌入剂 ( 溴化乙锭、 SYBR Green 等 ) 或者 FAM 或 TAMRA 等标识检测物质等。
作为本发明涉及的人型结核菌检测用试剂盒， 可以列举 “包含含有序列号 1、 序列 号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或 全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物 ( 本发明的引 物 ) 的人型结核菌检测用试剂盒。 ” 引物也可以为通过标识物质标识的引物。
上述试剂盒还可以包含使用标识物质标识的本发明寡核苷酸作为标识探针。
另外， 可以列举 “包含下述组成试剂的试剂盒， (1) 含有序列号 1 或 2 所述的核酸 序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸 序列杂交的寡核苷酸作为正向引物， (2) 含有序列号 3 或 4 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷 酸作为反向引物” 。
上述试剂盒还可以包含使用标识物质标识本发明的寡核苷酸作为标识探针。
另外， 可以列举 “包含本发明的寡核苷酸作为探针的人型结核菌检测用试剂盒” 。 所述探针也可以使用标识物质标识。
组成这些试剂盒的组成试剂的优选方式和具体例子如前所述。
另外， 在本发明的人型结核菌的检测用试剂盒中， 也可以含有例如缓冲剂等稳定 剂、 防腐剂等不会妨碍共存试剂等的稳定性、 不会妨碍 PCR 或杂交反应的试剂。另外， 其浓 度也可以适合选择通常在该领域中经常使用的浓度范围。
如果列举缓冲液的具体例子， 完全可以列举例如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、 磷酸 缓冲液、 佛罗那缓冲液、 硼酸缓冲液、 良好缓冲液等在实施常规 PCR 或杂交反应时所使用的 缓冲液， 其 pH 也没有特别的限制， 通常优选 5 ～ 9 的范围。
另外， 根据需要， 可以使用核酸合成酶 (DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 逆转录酶等 )、 对 TM 应酶的基质 (dNTP、 rNTP 等 )、 或者双链嵌入剂 ( 溴化乙锭、 SYBR Green 等 ) 或者 FAM 或 TAMRA 等标识检测物质等。
以下列举实施例， 更加具体地说明本发明， 但本发明不会因此而受到任何的限制。
实施例 实施例 1
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
使 用 ABI 公 司 DNA 合 成 仪 392 型，通 过 磷 酰 胺 法，合 成 序 列 号 2 所 示 的 序 列 (ACCTCACCTATGTGTCGACC，以 下 称 为 IS_F6) 和 序 列 号 4 所 示 的 序 列 (AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG， 以下称为 IS_R6) 的寡核苷酸。合成方法参照 ABI 公司手册， 通过在 55℃下对寡核苷酸的氨水溶液加热一晚实施各种寡核苷酸的脱保护。接着， 通过
Pharmacia 公司生产的使用 FPLC 的阴离子交换柱色谱， 对合成的寡核苷酸纯化。
(2) 制备试样
使用如下所示的细菌， 通过下述的方法提取、 纯化 DNA， 得到 DNA 试样。 细菌每一种 都有临床分离株， 培养后， 通过菌落的形状和历来的各种生化试验等就可以鉴别出菌种来。
首先， 对于分枝杆菌 (Mycobacterium) 属细菌， 使小川培养基上的菌落悬浮在纯 化水上， 高压灭菌釜处理 (120℃·2 个大气压、 20 分钟 ) 后， 经菌体的粉碎处理 ( 通过直径 2mm 玻璃珠进行物理压碎 )， 离心分离， 得到上清液。由所得的上清液， 使用 ( 株 ) キアゲソ 制的离子交换树脂型 DNA 提取纯化试剂盒 Genomic-tip 进行 DNA 的提取、 纯化。另外， 对于 大肠杆菌， 根据大肠杆菌的 DNA 提取方法的常规方法提取和纯化 DNA。
所得的纯化 DNA 最后配制成 1ng/μL(10mM Tris-HCl 缓冲液、 pH8.9)， 作为 DNA 试 样。
a： 大肠杆菌 (Escherichia coli)
b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )
c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)
d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)
e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)
f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)
g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)
h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)
i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)
j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)
k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)
l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)
m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)
n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)
o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)
p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Mycobacterium peregrinum)
(3)PCR
使用上述 (1) 制备的 IS_F6 作为正向引物， IS_R6 作为反向引物， 如下所述进行 PCR。
首 先， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F6 和 引 物 IS_R6、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1 ％胆酸钠、 0.1 ％ TritonX-100( トリトン X-100、 聚氧乙烯辛苯基醚、 rohm-and-haas 公司商品名 )、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用 反应液。
在 20μL 的 PCR 用反应液中添加 1ng DNA 试样用作 PCR 用试样， 通过 MJ Research公司的 DNA 热循环仪 (DNA Engine PCT200)， 在下述反应条件下进行 30 个循环的 PCR。
PCR 反应条件 ：
热变性 ： 94℃、 0.5 分钟
退火 ： 55℃、 1 分钟
聚合反应 ： 75℃、 0.5 分钟。
(4) 检测
5μL 上述 (3) 所得的 PCR 后的反应液进行 1.5 ％琼脂糖凝胶电泳。电泳的电 学条件为恒电压 100V， 进行 30 分钟。操作方法和其他条件参照生物实验说明的第 2 卷， p53-63( 秀润社、 中山广树著 ) 中所述的一般使用的方法。接着， 溴化乙锭染色后， 使用 UV 样本摄影装置 FAS-III 系统 ( 东洋纺织 ( 株 ) 制 ) 通过紫外线检测荧光。另外， 分子量标 记也与反应液一起迁移， 通过比较相对迁移程度， 计算出被检测的 DNA 片段的长度。另外， 分子量标记使用 X174/HaeIII 消化 ( 标记 4、 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 )。
(5) 结果
所得的电泳结果如图 1 所示。
在图 1 中， 各泳道的数字分别表示分别使用以下的试样时的结果。
M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)
a： 大肠杆菌 (Escherichia coli)
b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )
c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)
d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)
e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)
f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)
g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)
h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)
i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)
j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)
k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)
l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)
m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)
n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)
o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)
p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Myeobaeterium peregrinum)
通过使用正向引物 IS_F6 和反向引物 IS_R6 进行 PCR， 预计 IS6110 的核酸序列中 的 182 个碱基对的 DNA 片段 ( 序列号 7) 被复制。因此， 182 个碱基对的荧光条带被证实则 判断为阳性。
由图 1 的结果可以明白 ： 使用本发明的引物 IS_F6 和引物 IS_R6 进行 PCR， 结果仅使用结核分枝杆菌作为试样时 (b) 可确认 182 个碱基对的荧光条带， 可以判断为阳性。与 之相反， 使用其他的分枝杆菌属细菌或其他属的细菌即大肠杆菌试样作为试样时 (a 和 c ～ s)， 不能证实相应的荧光条带， 完全可以判断为阴性。
如上， 通过在 PCR 中使用本发明的寡核苷酸作为引物， 判断可以特异地检测人型 结核菌。另外， 可以预期通过 PCR 等的核酸扩增具有高灵敏度， 不必要分离细菌， 就可以直 接在检测中使用临床材料， 对人型结核菌的检测最长也就 1 日以内即可以结束， 而通过现 有的培养细菌的检测方法则需要花数周时间在培养上。
实施例 2
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
使 用 与 实 施 例 1(1) 相 同 的 仪 器， 在 相 同 的 操 作 下， 合成序列号1所 示 的 序 列 (TGGGTAGCAGACCTCACCTAT，以 下 称 为 IS_F5) 和 序 列 号 3 所 示 的 序 列 (CGAGTACGCTTTCTTGTTGG， 以下称为 IS_R5) 的寡核苷酸。
(2) 制备试样
使用实施例 1(2) 中所得的 DNA 试样。
(3)PCR
上述 (1) 制备的 IS_F5 用作正向引物、 IS_R5 用作反向引物， 如下所述进行 PCR。
首 先， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F5 和 引 物 IS_R5、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.1％ TritonX-100、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用反应液。
向 20μL 的 PCR 用反应液中添加 1ng DNA 试样用作 PCR 试样， 使用与实施例 1(3) 中使用的相同仪器， 在同样的反应条件下进行 PCR。
(4) 检测
在与实施例 1(4) 同样的方法下， 进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色后， 通 过紫外线检测荧光。
(5) 结果
所得的电泳结果如图 2 所示。
在图 2 中， 各泳道数字分别表示分别使用以下试样时的结果。
M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)
a： 大肠杆菌 (Escherichia coli)
b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )
c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)
d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)
e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)
f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)
g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)
h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)
i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)
j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)
l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi))
m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)
n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)
o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)
p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Mycobacterium peregrinum)
另外， 通过使用正向引物 IS_F5 和反向引物 IS_R5 的 PCR， 预计 IS6110 的核酸序列 中的 178 个碱基对的 DNA 片段 ( 序列号 6) 被复制。因此， 178 个碱基对的荧光条带被证实 则判断为阳性。
比较例 1
基 于 公 知 的 IS6110 序 列， 通过使用所制备的引物序列的检测法 ( 特表平 11-514522 号公报 ： 专利文献 11) 进行人型结核菌的检测。
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
特表平 11-514522 中公开的引物序列中， 合成 “TTCGGACCACCAGCACCTAACC” ( 序列 号 9、 以下称为 IS_F2) 和 “CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG” ( 序列号 10， 以下称为 IS_R2) 的寡核 苷酸。
合成使用与实施例 1(1) 同样的仪器， 在同样的操作下进行。
(2) 制备试样
使用实施例 1(2) 所得的 DNA 试样。
(3)PCR
上述 (1) 制备的 IS_F2 用作正向引物、 IS_R2 用作反向引物， 如下所述进行 PCR。
首 先， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F2 和 引 物 IS_R2、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.1％ TritonX-100、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用反应液。
向 20μL 的 PCR 用反应液中添加 1ng DNA 试样用作 PCR 用试样， 使用与实施例 1(3) 中使用的相同仪器， 在同样的反应条件下进行 PCR。
(4) 检测
在与实施例 1(4) 同样的方法下， 进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色， 通过 紫外线检测荧光。另外， 分子量标记使用 λ./Hind III 消化 ( 标记 1)(M1 泳道 ) 或 X174/ HaeIII 消化 ( 标记 4)( 都是 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 )。
(5) 结果
所得的电泳的结果如图 3-1 所示。
在图 3-1 中， 另外， 各泳道的数字分别表示使用各个以下试样时的结果。
M1 ： 分子量标记 ( 标记 1)
M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)a： 大肠杆菌 (Escherichia coli) b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 ) c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii) d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum) e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae) f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum) g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae) h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai) i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium) j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare) k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri) l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)) m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum) n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae) o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Mycobacterium peregrinum)
另外， 预计通过使用正向引物 IS_F2、 反向引物 IS_R2 进行 PCR 所复制的是 IS6110 的核酸序列中的 197 个碱基对的 DNA 片段。 因此， 197 个碱基对的荧光条带被证实则判断为 阳性。
如从实施例 2 中所得的图 2 的结果可以明白 ： 使用本发明的引物 IS_F5、 引物 IS_ R5 时， 仅仅使用人型结核菌 (b) 作为试样时可以证实 178 个碱基对的荧光条带， 可以判断 为阳性。对此， 在使用其他的分枝杆菌属细菌或其他属细菌大肠杆菌作为试样时 (a 和 c ～ s)， 没有观察到相应的荧光条带， 完全可以判断为阴性。
另一方面， 如从比较例 1 中所得的图 3-1 的结果可以明白， 使用公知的引物 IS_F2、 引物 IS_R2 进行 PCR 时， 可以判断人型结核菌作为试样时为阳性， 除此之外， 在使用无色分 枝杆菌作为试样 (m) 和次要分枝杆菌作为试样时 (o)， 也可以证实具有显著的条带， 这被判 断为假阳性。 在图 3-l 中将使用无色分枝杆菌作为试样时 (m) 的条带以虚线围成的圆表示。 另外， 将使用次要分枝杆菌作为试样时 (o) 的条带以箭头指向的虚线圆圈表示。
即， 在比较例 1 的方法中， 判定为 ： 难以特异地检测人型结核菌。
因此， 从比较例 1 的电泳结果尤其注意到了被判断为与人型结核菌的阳性条带和 扩增片段大小非常相似的次要分枝杆菌试样 (o)。图 3-1 中箭头处， 尤其显示了该条带。为 了进一步分析该 PCR 产物， 在切下迁移部分的 PCR 产物、 进行 DNA 纯化后， 使用 ABI 公司的 序列试剂盒根据 PCR- 直接序列法进行序列分析。
所得的序列如图 3-2 所示。图 3-2 所示的序列中， 部分 (b) 的人型结核菌衍生的 PCR 产物的序列作为第一核苷酸序列 (1st NucleotideSequence)， 序列表的上段所示 ( 序 列号 12)。另外， 由部分 (o) 所得的次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 衍生的 PCR产物的序列作为第二核苷酸序列 (2nd Nucleotide Sequence)， 序列表的下段所示 ( 序列号 13)。
DNA 片段的序列分析结果证实了这是次要分枝杆菌 (Mycobacteriumtriviale) 衍 生的核酸序列， 对于人型结核菌特有的 IS6110 的核酸序列而言， 其仅与比较例 1 使用的引 物 IS_F2 和引物 IS_R2 的序列部位一致。因此， 使用该公知的引物 IS_F2、 引物 IS_R2 进行 PCR 时， 发现人型结核菌以外的核酸序列也扩增， 证实了在引物的设计上存在明显的缺点。
由上可知 ： 使用本发明的寡核苷酸作为引物， 通过 PCR 进行人型结核菌的检测， 与 使用现有技术的引物进行结核菌的检测法相比， 可以排除假阳性的判断， 在特异地且高精 度地检测人型结核菌方面， 与现有技术的引物和使用它们的人型结核菌的检测法相比， 非 常优异。
实施例 3
通过实时 PCR 扩增体系检测结核菌
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
使用与实施例 1(1) 相同的仪器， 在同样的操作下， 合成 IS_F5 和 IS_R5 的寡核苷 酸。
(2) 制作结核菌检测用探针
由通过使用 IS_F5 和 IS_R5 作为引物进行 PCR 扩增所得的序列号 6 的寡核苷酸序 列， 设计用作探针的序列 “ACCGACGCCTACGCTCGCAG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 IS_ F5R5_FAMTAM。 序列号 11)。 在该寡核苷酸的 5′末端结合报告染料 FAM， 3′末端结合报告消 TM 光体 TAMRA， 得到标识的寡核苷酸探针 (TaqMan fluorescent probe、 applied biosystems japan 公司制 )。
(3) 制备 PCR 用 DNA 试样
对于实施例 1(2) 中制备的结核分枝杆菌试样所得的 DNA 试样， 通过测定其吸光度 测定试样中的 DNA 量。所得的 DNA 量通过与已知的结核分枝杆菌的基因组 DNA 量比较， 确 8 定试样中的基因组 DNA 量 ( 基因组拷贝数 )。得到 10 个拷贝 /μL 的基因组 DNA。
接着使用 10mM pH8.9 的 Tris-HCl 缓冲液， 制备稀释成 105， 104， 103， 102， 10， 5， 2个 拷贝 /μL 的稀释系列的 DNA 试样作为 PCR 用 DNA 试样。
(4) 实时 PCR
上述 (1) 制备的 IS_F5 用作正向引物， IS_R5 用作反向引物， 如下所述进行实时 PCR。
即， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F5 和 引 物 IS_R5、 195nM 上 述 (1) 制 备 的 荧 光 标识探针 IS_F5R5_FAMTAM、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1 ％胆酸钠、 0.1 ％ TritonX-100、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9) 作为反应液。
向 20μL 反应液中添加 1μL 各稀释系列的 DNA 试样作为 PCR 用试样， 将其加入到 96 孔反应板 ( 微扩增光学 96 孔反应板、 アプライドバイオシステムズジヤパソ社制 ) 的孔 TM 中， 使用 TaqMan PCR 专用热循环检测器 (ABI7000、 アプライドバイオシステムズジヤパソ 社制 ) 进行实时 PCR。反应在 95℃保温 10 分钟后， 在 95℃反应 15 秒钟和 60℃反应 1 分钟 并循环进行 50 个循环， 测定每次循环的报告染料的发光量。另外， 通过使用测定时所用热循环仪将供测定的 96 孔反应板每一板的相对荧光强度比数值化的功能求得发光量。
(5) 结果和分析
按照实时 PCR 法进行的常规方法制成校正曲线。
即， 对各 PCR 用 DNA 试样， 相对 PCR 循环数 (x 轴 ) 绘制报告染料的发光量 (Rn、 y 轴 ) 而制作扩增曲线。接着， 选择发光量随指数函数扩增的 Rn 部， 引出临界线 (Th)。Th 和 各 PCR 用 DNA 试样的发光量交叉的点为临界循环 (Ct) 值。接着， 相对使用的各 PCR 用 DNA 试样的基因组拷贝数 (x 轴、 对数值 ) 绘制 Ct 值 (y 轴 )， 对各个 Ct 值， 所得的近似曲线为校 正曲线。所得的校正曲线如图 4 所示。
y ＝ -3.555x+39.13
R2 ＝ 0.996
由以上可知 ： 由于通过实时 PCP 可以检测发光， 那么在 PCR 中使用本发明的寡核苷 酸作为引物， 由该扩增区域的序列设计标识引物， 通过进行实时 PCR， 可以检测人型结核菌。
另外， 从可以制作校正曲线看出 ： 通过使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法， 可 以进行人型结核菌的定量。另外， 从图 4 可以看出 ： 在使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法中， 在人型结核菌基因组 DNA 的初期量为 2 个拷贝的情况下， 也可以进行人型结核菌的检 测。
另外， 在利用实时 PCR 法时， 由于实时地监视该荧光强度， 可以正确地测定模板 DNA 的初期量， 有效地进行人型结核菌的检测。
实施例 4
利用使用多个引物对在一支管中同时地扩增多个片段的多重 PCR(multiplex PCR) 反 应，尝 试 进 行 以 人 型 结 核 菌、鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium))、胞 内 分 枝 杆 菌 (M.intracellulare)) 和堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)) 为对象的结核病与非结核性抗酸 菌病 (non-tuberculosis Mycobacteriosis， NTM 症 ) 的同时诊断 ( 识别诊断 )。
(1) 引物的合成
(i) 合成结核菌检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备 IS_F5( 序列号 1) 和 IS_R6( 序列号 4)， 分别 作为正向引物、 反向引物。
(ii) 合成鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备特开平 11-69999 号公报权利要求 5 所述的 “鸟 19 千道尔顿蛋白质基因区域中特异的寡核苷酸引物” MAV19KF1(CGGCTGTTCGAGTGGCAACA AGTC， 本发明说明书中序列号 15 所示。 以下称为 “鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 -Fw” )， 和 MAV19K R1(CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC， 本发明说明书中序列号 16 所示。以下称为 “鸟 分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 -Rv” )， 分别作为正向引物和反向引物。
(iii) 合成胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备特开平 11-69999 号公报权利要求 6 所述的 “胞内核糖体蛋白质 s1 基因区域中特异的寡核苷酸引物” rps1F1(CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCA AGA， 本发明说明书中序列号 17 所示。以下称为 “胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测 用引物 -Fw)” ， 和 rps1R1(GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC， 本发明说明书中序列号 18 所示。以 下称为 “胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 -Rv” ， 分别作为正向引物和反向引物。 (iv) 合成堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备特开平 11-155589 号中所述的由堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii) 的 KATS2 序列所设计的引物即图 1 所示引物 15 的、 沿 5′方向移动 1 碱 基的序列 (GTCCCTGGCTGCTCTTGA， 本发明说明书中序列号 19 所示。以下称为 “堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 -Fw)” ， 和引物 (Primer)E3(GCTGGTGGAGATGGAGATGTT， 本发 明说明书中序列号 20 所示。以下称为 “堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 -Rv” ， 分别作为正向引物和反向引物。
(2) 制备试样
使用实施例 1(2) 中所得的人型结核菌、 鸟分枝杆菌 (M.avium)、 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样。
(3)PCR
制 备 含 有 最 终 浓 度 为 各 1μM 的 上 述 (1) 合 成 的 正 向 引 物 和 反 向 引 物、 10mM Tris-HCl(pH8.9)、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1 ％ 胆 酸 钠、 0.1 ％ TritonX-100， 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( ニッポソジ一ソ制 ) 的溶液， 作为 PCR 反应用溶液。
向 20μL 的 PCR 用反应液中， 如下面表 1 所述分别添加 1μL(0 ～ 1000 个拷贝 )DNA 试样， 制备 PCR 用试样 (1) ～ (7)， 对于各个试样， 使用与实施例 1(3) 中使用的仪器相同的 仪器， 在同样的反应条件下进行 PCR。另外， 在表 1 中， avium 表示鸟分枝杆菌 (M.avium)、 intracellulare 表示胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 kansasii 表示堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)。另外， × 分别表示不加 DNA 试样的情况， O 分别表示加入 DNA 试样的情况， O 下 () 内的数字表示加入的 DNA 试样的浓度 ( 拷贝数 )。
[ 表 1]
(4) 检测
在与实施例 1(4) 同样的方法下， 进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色后， 通 过紫外线检测荧光。
(5) 结果
图 5 表示所得的电泳结果。
在图 5 中， 各泳道的数字分别表示分别使用前述表 1 中的 7 种 DNA 试样 (1) ～ (7) 时的结果。
另外， 在 DNA 试样中存在人型结核菌的 DNA 试样时， 通过使用 IS_F5 引物和 IS_R6 引物进行 PCR， 预期可得到 193bp 的扩增产物。存在鸟分枝杆菌 (M.avium) 的 DNA 试样时， 通过使用鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 Fw 和鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 Rv 进行 PCR， 预期可得到 106bp 的扩增产物。另外， 存在胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 的 DNA 试样时， 通过使用胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Fw 和胞内分枝杆 菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Rv 进行 PCR， 预期可得到 160bp 的扩增产物。存在堪 萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样时， 通过使用堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测 用引物 Fw 和堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 Rv 进行 PCR， 预期可得到 235bp 的 扩增产物。其中， 在图 5 的电泳模式旁， 结合电泳方向， 表示各扩增产物部分出现的顺序。 “kansasii” 表示堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)， “TB” 表示人型结核菌， “intra” 表示胞内 分枝杆菌 (M.intracellulare)， “avium” 表示鸟分枝杆菌 (M.avium)。
如从图 5 可以看出： 人 型 结 核 菌、 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium)、 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样全部加入到同一管中， 一
次进行 PCR 时， 完全可以证实各细菌存在时被扩增和预测的各扩增产物的 4 条荧光条带 ( 泳道 (2)、 (5))。另外， 通过可以证实泳道 (5) 中的人型结核菌的条带， 因此即使 DNA 试样 的浓度为行 (2) 时的 1/100， 也可以高灵敏性地进行结核菌的检测。
仅仅使用人型结核菌的 DNA 试样进行 PCR 时， 即使鸟分枝杆菌 (M.avium)、 胞内分 枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用的引物存在时， 也可以 只观察到使用本发明涉及的人型结核菌检测用引物 IS_F5 和 IS_R6 进行 PCR 反应获得的 193bp 的荧光条带 ( 泳道 (3))。
另一方面， 在使用不含有人型结核菌 DNA 试样的试样进行 PCR 时 ( 泳道 (4)、 (6))， 分别使用各个 DNA 试样进行 PCR 可以证实， 使用鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 Fw/Rv 进行 PCR 反应获得的 106bp 的荧光条带， 使用胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引 物 Fw/Rv 进行 PCR 反应获得的 160bp 的荧光条带和使用堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检 测用引物 Fw/Rv 进行 PCR 反应获得的 235bp 的荧光条带， 但是没有检测到在存在人型结核 菌时应该可以证实的 193bp 荧光条带。
由以上可以看出 ： 如果使用本发明的引物， 即使多种 DNA 试样存在于同一管内， 也 可以特异地检测人型结核菌。 另外， 通过使用一管反应进行 PCR， 可以一次进行人型结核菌、 非结核性抗酸菌病的病原菌 MAC 群 ( 鸟分枝杆菌、 胞内分枝杆菌 ) 还有堪萨斯分枝杆菌的 分别 4 种病原体衍生的基因组 DNA 的检测。 实施例 5
在 实 时 PCR 扩 增 体 系 中 使 用 荧 光 标 识 探 针 进 行 多 重 PCR， 尝试同时诊断人 型 结 核 菌 和 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium)、 胞 内 分 枝 杆 菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分 枝 杆 菌 (M.kansasii) 为 对 象 的 结 核 病 和 非 结 核 性 抗 酸 菌 病 (non-tuberculosis Mycobacteriosis， NTM 症 )。
(1)PCR 用引物
(i) 结核菌检测用 PCR 引物
与实施例 1(1) 同样的操作， 制备 IS_F5( 序列号 1) 和 IS_R5( 序列号 3)， 分别作为 正向引物、 反向引物。
(ii) 鸟分枝杆菌检测用 PCR 引物使用与实施例 4(1)(ii) 相同的引物。
(iii) 胞内分枝杆菌检测用 PCR 引物使用与实施例 4(1)(iii) 相同的引物。
(iv) 堪萨斯分枝杆菌检测用 PCR 引物使用与实施例 4(1)(iv) 相同的引物。
(2) 探针的制备
(i) 制备结核菌检测用探针
由通过使用 IS_F5 和 IS_R5 作为引物进行 PCR 而扩增的序列号 6 的寡核苷酸序 列， 设计用作探针的序列 “ACCGACGCCTACGCTCGCAG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 IS_ F5R5_FAMTAM。序列号 11)。在该寡核苷酸的 5′末端结合报告染料 FAM， 3′末端结合报告 TM 消光体 TAMRA， 得到标识的寡核苷酸探针 (TaqMan fluorescent probe、 アプライドバイオ システムズジヤパソ社制 )。
(ii) 制作鸟分枝杆菌检测用探针
由 通 过 用 作 PCR 引 物 的 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium) 检 测 用 引 物 Fw 和 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium) 检 测 用 引 物 Rv 而 扩 增 的 寡 核 苷 酸 序 列， 设计用作探针的序列
“CAGCTCGAGCACCAGTGCGTCGG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 Mab_F1R1m2_Cy5BHQ。序 列号 21)。在该寡核苷酸的 5′末端结合报告染料 Cy5， 3′末端结合报告消光体 BHQ2， 得到 标识的寡核苷酸探针 ( 实时 PCR 用两端修饰的探针， SIGMA GENOSYS 公司制 )。
(iii) 制作胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用探针
由通过用作 PCR 引物的胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Fw 和胞内 分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Rv 而扩增的寡核苷酸序列， 设计用作探针的序 列 “CTGGCTCGTCAGCTTCACGCG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 Int_F1R1m_VICMGB。序 列号 22) 在该核苷酸的 5′末端结合报告染料 VIC， 3′末端结合报告消光体 MGB， 得到标识 TM 的寡核苷酸 (TaqMan fluorescent probe、 アプライドバイオシステムズジヤパソ社制 )。
(iv) 制作堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用探针
由通过用作 PCR 引物的堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 Fw 和堪萨 斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 Rv 而扩增的寡核苷酸序列， 设计用作探针的序列 “ATCGTATCCACCATCCTCGACAGCGT” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 KATS2_TAMBHQ2。 序列 号 23)。在该核苷酸的 5′末端结合报告染料 TAMRA， 3′末端结合报告消光体 BHQ2， 得到标 识的寡核苷酸 ( 实时 PCR 用两端修饰的探针， SIGMA GENOSYS 社制 )。
(3) 制备试样
对 实 施 例 1(2) 所 得 的 人 型 结 核 菌、 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium)、 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样， 通过测定吸光度以测定 试样中的 DNA 量。所得的 DNA 量通过与已知的结核分枝杆菌的基因组 DNA 量比较， 确定试 8 样中的基因组 DNA 量 ( 基因组拷贝数 )。得到 10 个拷贝 /μL 的基因组 DNA。
接着， 使用 10mM pH8.9 的 Tris-HCl 缓冲液， 制备稀释成 105， 104， 103， 102， 10， 5， 2 个拷贝 /μL 的稀释系列的试样作为 PCR 用 DNA 试样。
(4) 实时 PCR 检测
制备含有最终浓度分别为 1μM 的上述 (1) 合成的各个正向引物和反向引物、 最 终浓度分别为 195nM 的各个荧光标识探针、 10mMTris-HCl(pH8.9)、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.1％ TritonX-100， 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL Taq DNA 聚合酶 ( ニッポソジ一ソ制 ) 的溶液， 作为反应液。
向 20μL 反应液中加入各稀释系列的 1μLDNA 试样作为 PCR 用试样， 将其加入到 96 孔反应板 ( 微扩增光学 96 孔反应板、 アプライドバイオシステムズジヤパソ社制 ) 的孔 TM 中， 使用 TaqMan PCR 专用热循环·检测仪 (ABI7500、 アプライドバイオシステムズジヤパ ソ社制 ) 进行实时 PCR。反应在 95℃保温 10 分钟后， 在 95℃反应 15 秒钟和 60℃反应 1 分 钟并循环进行 50 次， 测定每次循环的报告染料的发光量。
另外， 通过使用测定时所用热循环仪将供测定的 96 孔反应板每一板的相对荧光 强度比数值化的功能求得发光量。
(5) 结果与分析
由于各菌体检测用引物的报告染料各不相同， 因此如果监测来自各个循环的每种 报告染料的不同荧光 4 波长的发光量， 可以证实以人型结核菌衍生的基因组序列作为靶标 的 DNA 片段的扩增、 以及非结核性抗酸菌病的病原体 MAC 群 ( 鸟分枝杆菌、 胞内分枝杆菌 ) 还有堪萨斯分枝杆菌的 4 种病原体衍生的基因组 DNA 的扩增。因此， 测定各个报告染料的发光量， 通过与实施例 3(5) 同样的方法， 可以制作成 表示来自各菌的基因组 DNA 的稀释系列和各报告染料的发光量的关系的扩增曲线。由所得 的扩增曲线， 通过与实施例 3(5) 同样的方法， 绘制相对基因组的拷贝数 (x 轴、 对数表示 ) 的 Ct 值 (y 轴 )， 相对各个 Ct 值所得的近似曲线作为校正曲线。
结果如图 6 所示。
从图 6 的结核菌 (M.tuberculosis)DNA 的结果 ( 校正曲线 ) 可以看出 ： 由于可以 检测人型结核菌检测用引物的报告染料的发光， 那么本发明涉及的寡核苷酸作为引物用于 PCR 时， 通过由形成该扩增区域的序列设计标识引物， 进行实时 PCR， 即使在同一管中存在 来自于人型结核菌以外的多种细菌的 DNA， 也可以检测人型结核菌。
另外， 由于可以制作成校正曲线， 通过使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法， 可 以定量人型结核菌。另外， 由图 6 可以看出 ： 在使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法中， 即使人型结核菌的基因组 DNA 初期量以 2 个拷贝存在的条件下 (2 个拷贝 / 反应 )， 也可以 检测人型结核菌。
另外， 利用实时 PCR 法时， 通过实时地监测其荧光强度， 可以正确地定量模板 DNA 的初期量， 有效地检测人型结核菌。
此外， 即使混合 ( 并发感染 ) 有分别来自非结核性抗酸菌病的病原菌 MAC 群 ( 鸟 分枝杆菌、 胞内分枝杆菌 ) 和堪萨斯分枝杆菌的基因组 DNA 时， 也可以相互不干涉彼此的扩 增反应， 维持各校正曲线的线性， 通过 1 管反应监测分别来自 4 种病原体的基因组 DNA。这 时的检测灵敏度对于任一种菌种都可以显示 2 个拷贝 / 反应。即， 对于多种细菌混合的样 品， 通过进行实时 PCR， 也可以一次地进行人型结核菌的检测和非结核性抗酸菌的鉴定。
工业实用性
根据本发明涉及的人型结核菌的检测方法， 与现有技术中的以 IS6110 作为靶标 的结核菌检测法相比， 可以排除诊断上的假阳性， 更特异地和高灵敏度地检测人型结核菌。
技术领域 本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系， 在临床检查中检测人型结核菌 ： 结核分 枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 以下称为人型结核菌 ) 的检测方法。
背景技术 人 型 结 核 菌 是 导 致 人 产 生 结 核 病 的 病 原 体， 是被分类在分枝杆菌属 (Mycobacterium) 并具有抗酸性质的革兰氏阳性杆菌。结核病虽然近年显著减少， 但是， 最 近产生了老年人的发病率上升、 在没有经历过结核感染的年轻人中引起集体感染等重大问 题。
另一方面， 除了人型结核菌以外， 已知鸟分枝杆菌 (Mycobacteriumavium)、 胞内分 枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii) 等非结核性抗酸菌对人表现病原性。另外， 在感染 AIDS 病毒的免疫缺陷者当中， 非结核性 抗酸菌引起疾病成了主要问题。由于这些非结核性抗酸菌病多数对抗结核药具有抗药性， 所以在决定治疗方案时， 鉴别诊断结核病和非结核性抗酸菌病是很重要的。但是， 从临床 症状、 病理组织学的观点来看， 鉴别结核病是非常困难的， 因此诊断必须通过菌的鉴定来进 行。
在鉴别诊断结核病或非结核性抗酸菌病时， 一般通过小川培养基分离培养样品， 为了鉴定种而进一步采用进行生化试验的方法。 然而， 通常由于分枝杆菌属生长慢， 培养时 需要相当长的时间。 因此， 进行历来的基本方法的涂片试验或培养试验时， 为了得到结核病 与否的诊断结果， 光是菌的分离培养就需要 3 ～ 4 周时间， 然后在鉴定种的各种试验中还需 要 2 ～ 3 周时间。
另外也有使用针对分枝杆菌属的抗原的抗体的结核菌检测法， 但是， 由于分枝杆 菌属种之间的交叉反应， 欠缺相对于结核菌的特异性， 灵敏度也不够。
近年， 利用聚合酶链反应 (PCR) 等的核酸扩增技术的诊断技术作为有用的方法被 研究， 也研究了可以被利用到结核菌的诊断中， 研究了结核菌 DNA 基因组的各区域是否在 用 PCR 进行的结核菌检测中可以用作靶标。
例如报道了检测编码分枝杆菌属的 65 千道尔顿抗原的基因区域的方法 ( 例如参 照非专利文献 1、 非专利文献 2、 非专利文献 3、 非专利文献 4、 非专利文献 5)。然而， 已知 65 千道尔顿抗原基因除了在人型结核菌中具有以外， 在鸟分枝杆菌 (M.avium)( 鸟型结核 菌 )、 偶发分枝杆菌 (M.fortuitum)、 副结核分枝杆菌 (M.paratuberculosis)、 堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii)、 BCG 和海分枝杆菌 (M.marinum) 等同属菌中也具有。尤其是， 由于与 非结核性抗酸菌病的典型的病原菌鸟分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌的交叉性高， 因此检测 65
在鉴别诊断结核病或非结核性抗酸菌病时， 一般通过小川培养基分离培养样品， 为了鉴定种而进一步采用进行生化试验的方法。 然而， 通常由于分枝杆菌属生长慢， 培养时 需要相当长的时间。 因此， 进行历来的基本方法的涂片试验或培养试验时， 为了得到结核病 与否的诊断结果， 光是菌的分离培养就需要 3 ～ 4 周时间， 然后在鉴定种的各种试验中还需 要 2 ～ 3 周时间。
另外也有使用针对分枝杆菌属的抗原的抗体的结核菌检测法， 但是， 由于分枝杆 菌属种之间的交叉反应， 欠缺相对于结核菌的特异性， 灵敏度也不够。
近年， 利用聚合酶链反应 (PCR) 等的核酸扩增技术的诊断技术作为有用的方法被 研究， 也研究了可以被利用到结核菌的诊断中， 研究了结核菌 DNA 基因组的各区域是否在 用 PCR 进行的结核菌检测中可以用作靶标。
例如报道了检测编码分枝杆菌属的 65 千道尔顿抗原的基因区域的方法 ( 例如参 照非专利文献 1、 非专利文献 2、 非专利文献 3、 非专利文献 4、 非专利文献 5)。然而， 已知 65 千道尔顿抗原基因除了在人型结核菌中具有以外， 在鸟分枝杆菌 (M.avium)( 鸟型结核 菌 )、 偶发分枝杆菌 (M.fortuitum)、 副结核分枝杆菌 (M.paratuberculosis)、 堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii)、 BCG 和海分枝杆菌 (M.marinum) 等同属菌中也具有。尤其是， 由于与 非结核性抗酸菌病的典型的病原菌鸟分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌的交叉性高， 因此检测 65
千道尔顿抗原基因的方法作为特异地检测人型结核菌的方法还存在问题。
另外， 研究了使用自牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)DNA 鉴定的序列 - 编码 MPB70 蛋白质的基因序列进行结核分枝杆菌的鉴定的试验方法 ( 例如， 参照非专利文献 6)。 然而， Kulski 等人在 FEMS MicrobiolLett.1997 年 3 月 1 日 ； 148(1) ： 43-48( 非专利文献 7) 报道了其结果， 已知其中进行的 PCR 检验结果在以 MPB70 蛋白质作为靶标时， 与堪萨斯分 枝杆菌的 DNA 中存在的类似序列产生交叉反应， 该方法在特异地检测人型结核菌检测中也 存在问题。
此外， 报道了编码蛋白质抗原 b(Pab) 的基因序列作为标记的结核分枝杆菌 / 牛分 枝杆菌的检测方法 ( 例如参照非专利文献 8)， 证实了以结核分枝杆菌 / 牛分枝杆菌检测目 的使用该标记的有效性。但是， 由于考虑到 Pab 基因在结核基因组中仅存在一个拷贝， 因此 不太优选作为核酸扩增的靶标材料 ( 相对地， 后述的 IS6110 序列在核酸基因组中存在 10 个拷贝。)。
此外， 报道了 IS6110 作为探针的 RFLP( 限制性片段长度多态性 ) 可以在结核菌的 诊断中使用 ( 例如参照非专利文献 9)， 并且可以作为结核的流行病学调查的重要工具在世 界各国中被使用。IS6110 是结核菌特有的插入序列， 在染色体 DNA 中存在多个 IS6110， 其 在每种菌株中的数目、 位置不同， 其特性在一定程度上稳定地遗传下去。其结果是根据菌 株的不同而显示不同的 RFLP 型， 也可以分为衍生的组。直至目前为止， 很多报道涉及使用 IS6110 的结核检测方法， 报道了具有超过 75％的灵敏度和接近 100％的特异性。 但是， 另一 方面， 研究结果也报道了在使用 IS6110 的检测方法中， 存在产生假阳性的问题 ( 非专利文 献 10)。另外， 也有对 IS6110 设计特异的引物而进行 PCR 的检测方法 ( 例如参照专利文献 1、 专利文献 2、 专利文献 3、 专利文献 4)， 但存在涉及结核分枝杆菌以外的来自分枝杆菌属 的与 IS6110 相关的序列也扩增的问题。 另外， IS6110 样序列也存在于结核菌以外的其他微 生物中， 在以 IS6110 作为靶标的检测方法中， 暗示了这些微生物也被检测出来的问题。因 此， 历来检测 IS6110 的方法在特异地检测各种人型结核菌方面是不充分的， 并存在问题。
由以上看出 ： 目前的情况是期望确立一种新的特异地检测人型结核菌的方法。
专利文献 1 ： 特表平 5-507617 号公报
专利文献 2 ： 特表平 11-514522 号公报
专利文献 3 ： 日本专利第 2814422 号公报
专利文献 4 ： 美国专利第 5370998 号说明书
专利文献 5 ： 特开昭 60-500717 号公报
专利文献 6 ： 特开昭 60-281 号公报
专利文献 7 ： 美国专利第 5210015 号说明书
专利文献 8 ： 美国专利第 5538848 号说明书
专利文献 9 ： 美国专利第 5,801,155 号说明书
专利文献 10 ： 美国专利第 5925517 号说明书
专利文献 11 ： 美国专利第 6,492,121 号说明书
专利文献 12 ： 日本专利第 2650159 号公报
专利文献 13 ： 特公平 7-114718 号公报
专利文献 14 ： 特开昭 58-40099 号公报专利文献 15 ： 特开昭 62-265999 号公报
非 专 利 文 献 1： Chia 等 人， J.Clin.Microbiol.， 1990 年，第 28 卷，第 9 期， 1877-1880 页 ；
非专利文献 2 ： Brisson-Noel 等人， Lancet， 1989 年， 第 334 卷， p.1069-1071
非专利文献 3 ： Hackel 等人， Molecular and cellular Probes， 1990 年， 第 4 卷， p.205-210
非专利文献 4： Woods， Cole， FEMS Mycrobiology Letters， 1989 年， 第 65 卷， p.305-310
非专利文献 5 ： Hance 等人， Molecular Microbiology， 1989 年， 第 3 卷， 第 7 期， p.843-849
非专利文献 6 ： Kulski 等人， J.Clin Microbiol.， 1995 年， 第 33 期， p.668-674
非专利文献 7 ： Kulski 等人， FEMS Microbiol Lett.1997 年 3 月 1 日， 第 148 卷， 第 1 期， p.43-48
非专利文献 8 ： Sjobring 等人， J.Clin.Microbiol.， 1990 年， 第 28 卷， 第 10 期， p.2200-2204 非 专 利 文 献 9： Hermans PWM 等 人， J.Clin.Microbiol.， 1990 年，第 28 卷， p.2051-2058
非专利文献 10 ： Lee 等人， Neurological Sciences， 1994 年， 第 123 卷， p.173-179
非专利文献 11 ： Thierry 等人， Nucleic Acid Res.， 1990 年， 第 18 卷， 第 1 期， p.188
非专利文献 12 ： Nucleic Acids Res.， 1986 年， 第 14 卷， p.6115-6128
非专利文献 13 ： Kent PT， Kubica GP， Pubric HealthMycobacteriology， A Guild for the Level III laboratory， U.S.Department ofHealth and Human Services， Public Health Service， Center for DiseaseControl， Atlanta， U.S.A.， 1985 年， p.31-55
发明内容
发明欲解决的课题
鉴于上述情况， 本发明的目的是提供一种排除诊断上的假阳性的新颖的结核菌检 测用引物， 和使用该引物简便、 迅速且准确度高地检测人型结核菌的检测方法。
用于解决课题的手段
本发明以解决上述课题为目的并已完成了发明， 包括以下内容。
(1) 含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序 列号 8 中所述的核酸序列 ( 其中， A 表示腺嘌呤、 C 表示胞嘧啶、 G 表示鸟嘌呤、 T 表示胸腺 嘧啶。另外， 任意位置的 T 可以被尿嘧啶 (U) 替换。下同 ) 的部分或全部， 或其互补序列的 部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。
(2) 一种人型结核菌检测用引物， 含有寡核苷酸， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列 号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分 或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交。
(3) 一种人型结核菌检测用探针， 含有寡核苷酸， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核酸序列的部分 或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交。
(4) 一种人型结核菌的检测方法， 其特征在于 ： 使用寡核苷酸作为引物和 / 或探 针， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的 部分或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂 交。
(5) 一种人型结核菌检测用试剂盒， 包括含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结 核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物和 / 或探针。
本发明人对直至目前所确定的人型结核菌和其他生物的各种基因， 反复进行各属 种之间的各基因序列的同源性的理论验证和实验验证， 结果发现存在这样的碱基序列， 所 述碱基序列特异地与人型结核菌的插入重复序列 -IS6110 序列的特定区域杂交， 是对人型 结核菌的检测有用的碱基序列。
对这些发现作进一步深入的研究， 结果研发了对人型结核菌具有特异性、 并用于 其检测的寡核苷酸 ( 序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 和序列号 8 中所述的核酸序列 ) 和利用它们的人型结核菌检测用核酸引物和标识探针， 并 确立使用它们的人型结核菌的检测方法。 发明效果
根据本发明的人型结核菌的检测方法， 与历来使用的 IS6110 作为靶标的结核菌 的检测方法相比， 可能排除诊断上的假阳性， 并且可能以更高的特异性和精确度检测人型 结核菌。
附图简述
[ 图 1] 是实施例 1 中所得的电泳结果。另外， 各泳道的数字分别表示分别使 用 以 下 的 试 样 时 的 结 果。M4 ： 分 子 量 标 记 ( 标 记 4)、 a： 大 肠 菌 (Escherichia coil)、 b、 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人 型 结 核 菌 )、 c、 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)、 d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)、 e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)、 f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)、 g： 戈氏分枝 杆菌 (Mycobacterium gordonae)、 h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)、 i： 鸟分枝 杆菌 (Mycobacterium avium)、 j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacteriumintracellulare)k ： 胃分 枝杆菌 (Mycobacterium gastri)、 l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)、 m： 无色分枝杆 菌 (Mycobacteriumnonchromogenicum)、 n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)、 o： 次要 分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)、 p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacteriumfortuitum)、 q： 龟 分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)、 r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)、 s： Mybacterium peregrinum。
[ 图 2] 是实施例 2 中所得的电泳结果。另外， 各泳道的数字分别表示分别使用 以下试样时的结果。M1 ： 分子量标记 ( 标记 1)、 M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)、 a： 大肠杆菌 (Escherichia coil)、 b、 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )、 c、 堪 萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)、 d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)、 e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)、 f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacteriumscrofulaceum)、
g： 戈 氏 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium gordonae)、 h： 斯 氏 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium szulgai)、 i： 鸟 分 枝 杆 菌 (Mycobacteriumavium)、 j： 胞 内 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium intracellulare)k ： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)、 l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)、 m： 无 色 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)、 n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)、 o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)、 p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)、 q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)、 r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)、 s： Mybacterium peregrinum。
[ 图 3-1] 是比较例 1 中所得电泳图。另外， 各泳道的数字分别表示分别使用 以下试样时的结果。另外， 当使用无色分枝杆菌 (Mycobacteriumnonchromogenicum) 作 为试样时 (m) 的条带用虚线圆圈起来表示。另外， 当使用次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 作为试样时 (o) 的条带用箭头指向的虚线圆圈起来表示。MI ： 分子量标记 ( 标 记 1)、 M4 ： 分 子 量 标 记 ( 标 记 4)、 a： 大 肠 杆 菌 (Escherichia coil)、 b、 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)、 c、 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacteriumkansasii)、 d： 海分枝 杆菌 (Mycobacterium marinum)、 e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)、 f： 瘰疬分枝杆 菌 (Mycobacteriumscrofulaceum)、 g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)、 h： 斯氏 分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)、 i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacteriumavium)、 j： 胞内分枝 杆菌 (Mycobacterium intracellulare)k ： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)、 l： 蟾分 枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)、 m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)、 n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)、 o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)、 p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)、 q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)、 r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)、 s： Mybacterium peregrinum(peregrinum 分枝 杆菌 )。
[ 图 3-2] 表示对次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 试样进行上述电泳 所得的部分 (o) 中， 对扩增片段的大小判断为与人型结核菌的阳性条带非常相似的部分的 PCR 产物进行纯化、 分析得到的核酸序列列表。其中， 源自部分 (b) 的人型结核菌的 PCR 产 物的序列作为第一核苷酸序列， 为了比较， 表示在序列表的上段。另外， 自部分 (o) 所得的 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 来源的 PCR 产物的序列作为第二核苷酸序列， 表 示在序列表的下段。
[ 图 4] 表示在实施例 3 中进行的实时 PCR 检测结果， 绘制相对各 PCR 用 DNA 试样 的基因组的拷贝数 (x 轴、 对数值 ) 的 Ct 值 (y 轴 ) 的校正曲线。
[ 图 5] 是实施例 4 所得的电泳的结果。另外， 各泳道的数字分别表示分别使 用以下的试样时的结果。M ： 分子量标记、 (1) 没有试样、 (2) 人型结核菌 + 鸟分枝杆菌 (M.avium)+ 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)、 (3) 人 型结核菌、 (4) 鸟分枝杆菌 (M.avium)+ 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii)、 (5) 人型结核菌 (10 个拷贝 )+ 鸟分枝杆菌 (M.avium)+ 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)、 (6) 鸟分枝杆菌 (M.avium)、 (7) 人 型结核菌 + 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)+ 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)。另外， 在 电泳模式的左边用箭头表示电泳方向， 表示各扩增产物的部分的出现顺序。 “TB” 表示结核 分枝杆菌 (M.tuberculosis)、 “avium” 表示鸟分枝杆菌 (M.avium)、 “intra” 表示胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 “kansasii” 表示堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)。
[ 图 6] 表示在实施例 5 中进行的实时 PCR 检测结果， 绘制相对各 PCR 用 DNA 试样 的基因组的拷贝数 (x 轴、 对数值 ) 的 Ct 值 (y 轴 ) 的校正曲线。
实施发明的最佳方式
本发明涉及的人型结核菌的 IS6110 基因是由全长 885 个碱基对的碱基序列组成， 例如在根据巴斯德研究所的报告 “Nucleic Acid Res1990， No.18(1)， p.188” ( 非专利文献 11) 中记载了该全碱基序列。
作为本发明涉及的寡核苷酸， 可以列举含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的 部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸 ( 以下， 简称为 本发明的寡核苷酸。)。
作为本发明涉及的含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸， 例如可以列举含有与序 列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸 序列具有约 70％或以上、 优选约 80％或以上、 更优选约 90％或以上、 最优选约 95％或以上 的同源性的碱基序列的寡核苷酸， 或特征在于含有序列表的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部， 并且由连 续 10 个碱基或以上、 优选 20 个碱基或以上组成的寡核苷酸。
作为本发明涉及的含有相对序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列 号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部为互补序列的部分或全部的寡核苷 酸， 例如可以列举具有与含有本发明的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序 列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂交的碱基序列的部 分或全部的寡核苷酸。
所谓上述的本发明涉及的具有与含有本发明的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列 号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂 交的碱基序列的部分或全部的寡核苷酸， 具体地， 可以列举具有在高严格的条件或严格的 条件下， 与含有本发明的序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂交的碱基序列的部分或全部的寡 核苷酸等。
另外， 其中所谓的 “高严格的条件”具体地是指例如在 50 ％的甲酰胺中、 42 ～ 70℃、 优选 60 ～ 70℃的杂交， 然后在 0.2 ～ 2×SSC、 0.1％十二烷基硫酸钠 (SDS) 中、 25 ～ 70℃洗净的条件。
另外， 所谓的 “严格的条件” 具体地是指例如在 6×SSC 或与其等价的盐浓度的杂 交溶液中， 在 50 ～ 70℃的温度条件下进行 16 小时的杂交， 在 6×SSC 或与其等价的盐浓度 的溶液等中根据需要进行预洗净后， 在 1×SSC 或与其等价的盐浓度的溶液等中洗净的条 件。
所谓本发明涉及的与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸， 可 以列举前述的具有在高严格的条件或严格的条件下， 与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸 序列杂交的碱基序列的寡核苷酸等。该高严格的条件和严格的条件如前所述。另外， 本发明的寡核苷酸可以是脱氧核糖核酸 (DNA)， 也可以是核糖核酸 (RNA)。 当然核糖核酸时， 胸苷残基 (T) 与尿苷残基 (U) 可以相互替换。另外， 也可以在合成时将任 意位置的 T 变为 U 进行合成， 得到含有尿苷残基的 DNA。 同样地也可以得到含有将任意位置 的 U 变成 T 的胸苷残基的 RNA。另外， 也可以是 1 个或多个核苷酸的缺失、 插入或替换， 也可 以是如肌苷 (I) 这样的修饰核苷酸。
为了获得本发明的寡核苷酸， 也可以使用通过本身公知的化学合成法制备的寡核 苷酸。因此， 相比克隆化的寡核苷酸或多核苷酸， 更可以容易、 大量且便宜地获得一定质量 的寡核苷酸。
例如， 使用通常进行 DNA 合成的 DNA 合成仪， 根据通常的磷酰胺 ( ホスホアミダイ ト ) 法合成寡核苷酸， 根据使用阴离子交换柱色谱的常规方法进行纯化， 可以得到作为目 的的本发明的寡核苷酸。
作为本发明涉及的人型结核菌检测用引物， 可以列举具有含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或 全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的人型结核菌检测用 引物 ( 以下称为本发明的引物 )。 本发明的引物中使用的含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的具体例子， 可以是在前述的本发明的寡核苷酸的叙述中 所述的。
另外， 本发明的引物， 例如在符合作为目的的核酸杂交条件下， 从含有序列号 1 ～ 5 中所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互补序列的部分或全部的寡核苷酸 中， 考虑解链温度 (Tm 值 ) 等、 可以以适当区域的适当长度使用。考虑到维持作为引物序列 的特异性所需的碱基数， 优选具有 10 个碱基或以上、 更优选具有 20 个碱基或以上的长度。
将本发明的引物作为在 PCR 等中使用的引物时， 例如优选正向引物是含有序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部的寡核苷酸， 反向引物 是含有序列号 3 或 4 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部的寡核 苷酸。
其中， 正向引物优选序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的寡核苷酸， 反向引物优选序 列号 3 或 4 中所述的核酸序列的寡核苷酸。
作为特别优选的引物的组合， 可以列举 (a) 正向引物是序列号 1 中所述的核酸序 列的寡核苷酸， 反向引物是序列号 3 中所述的核酸序列的寡核苷酸的组合， 或 (b) 正向引物 是序列号 2 中所述的核酸序列的寡核苷酸、 反向引物是序列号 4 中所述的核酸序列的寡核 苷酸的组合。
获得本发明的引物的方法是如获得前述的本发明的核苷酸的方法中所述的方法。
本发明的引物也可以通过标识物质被标识。
作为用于通过标识物质标识本发明的引物的标识物质， 可以使用放射性同位素或 酶、 荧光物质、 发光物质、 生物素等公知的标识物质中的任一种。 33 35
例 如， 作 为 放 射 性 同 位 素， 可 以 列 举 32P、 P、 S等； 作 为 酶， 可以列举碱性磷 酸酶、 西洋辣根过氧化物酶等 ； 作为荧光物质， 可以列举花菁染料 (Cyanine Dye) 系的
Cy3、 Cy5(Amasham Bioscience 公司 )、 荧光素等 ； 作为发光物质， 可以列举含有吖啶嗡酯 (Acridinium Ester) 的化学发光试剂等。
通过放射性同位素标识本发明的引物时， 可以列举在合成引物时， 通过掺入使用 放射性同位素标识的核苷酸以标识引物的方法、 或合成引物后， 使用放射性同位素标识的 方法等。具体地， 可以列举通常使用较多的随机引物法、 切口移位法、 通过 T4 多核苷酸激酶 的 5′ - 末端标识法、 使用末端转脱氧核苷酰酶的 3′ - 末端标识法、 RNA 标记法等。
通过酶标识本发明的引物时， 可以使用使碱性磷酸酶、 西洋辣根过氧化物酶等酶 分子与标识的引物直接共价键合等该领域中常用的方法即直接标识法。
通过荧光物质标识时， 例如可以通过该领域中常用方法的标识技术掺入荧光素标 识的核苷酸到引物上。另外， 在具有连接臂的核苷酸作为序列的寡核苷酸的一员的替代方 法 ( 例如， 参照非专利文献 12) 中， 也可以通过荧光物质标识核苷酸。这时， 也有通过特开 昭 60-500717 号公报 ( 专利文献 5) 中公开的合成法由脱氧尿苷化学合成 5 位上具有连接 臂的尿苷， 在上述寡核苷酸链中引入荧光物质的方法。
通过发光物质标识的方法和通过生物素标识的方法， 通常可以根据该领域中采用 的发光标识或生物素标识核苷酸的常规方法进行。 作为本发明涉及的人型结核菌检测用探针， 可以列举含有寡核苷酸 ( 本发明的寡 核苷酸 ) 的探针 ( 以下称为本发明的探针 )， 该寡核苷酸含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补 序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交。
在本发明的探针中使用的本发明的寡核苷酸的具体例子如前述的本发明的寡核 苷酸的叙述中所述。
本发明的探针例如在符合作为目的的核酸杂交条件下， 由含有序列号 1 ～ 8 所述 的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互补序列的部分或全部的寡核苷酸， 计算解 链温度 (Tm 值 ) 等， 可以以合适的长度使用合适的区域。但是， 考虑到使探针具有充分的特 异性， 同时为了维持作为探针序列的特异性所需的碱基数， 优选具有 10 个碱基或以上， 更 优选 20 个碱基或以上的长度。
另外， 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核酸序列是通过使用本发明的引物 进行 PCR 而被扩增的核酸序列。例如， 序列号 6 中所述的核酸序列是通过以序列号 1 中所 述的核酸序列的寡核苷酸作为正向引物， 序列号 3 中所述的核酸序列的寡核苷酸作为反向 引物进行 PCR 而被扩增的序列 ； 序列号 7 中所述的核酸序列是通过以序列号 2 中所述的核 酸序列的寡核苷酸作为正向引物， 序列号 4 中所述的核酸序列的寡核苷酸作为反向引物进 行 PCR 而被扩增的序列 ； 序列号 8 中所述的核酸序列是通过以序列号 4 中所述的核酸序列 的互补链序列的寡核苷酸 ( 序列号 14) 作为正向引物， 序列号 5 中所述的核酸序列的寡核 苷酸作为反向引物通过 PCR 而被扩增的序列。
获得本发明的探针的方法如在获得前述的本发明的核苷酸的方法中所述。
本发明的探针可以通过标识物质被标识。
作为通过标识物质标识本发明的探针中所使用的标识物质， 可以使用放射性同位 素或酶、 荧光物质、 发光物质、 生物素等公知的标识物质的任一种。
标识本发明的探针的标识物质的具体例子和标识方法如在本发明的引物的标识
方法的叙述中所述。
另外， 作为后述的实时 PCR 检测法中使用的标识探针， 可以列举通过在实时检测 法中通常使用的标识物质对本发明的探针进行了标识的探针。 例如， 可以列举 5′末端使用 报告荧光物质 ( 羧基荧光素 (FAM)、 六氯荧光素 (HEX)、 四氯荧光素 (TET) 等 ) 标识的， 3′ 末端使用猝灭剂染料 ( 例如羧基四甲基若丹明 (TAMRA) 等荧光物质、 Black Hole Quencher 染料 BHQ， 4-((4- 二甲氨基 ) 苯基 ) 偶氮 ) 苯甲酸 (DABCYL) 等的非荧光物质 ) 标识的本发 明的寡核苷酸。
作为在本发明涉及的人型结核菌的检测中使用的试样， 可以列举人的痰、 血液、 经 支气管采样等的各种临床材料。 另外， 也可以是从样品中分离培养的培养菌、 自它们分离纯 化的核酸、 或通过核酸扩增检测体系等被扩增的核酸。
从上述试样提取、 纯化 DNA 可以依据从样品中提取抗酸菌 ( 结核菌 )DNA 中使用的 常规方法进行。
例如在以菌体作为试样时， 例如可以列举通过 SDS 等表面活性剂或硫氰酸胍 (GTC) 等蛋白变性剂处理菌体以破坏结核菌的膜结构的方法、 通过玻璃珠等物理压碎菌体 的方法等。 以痰作为试样时， 作为前处理， 可以通过美国疾病管理预防中心 (Centers for Disease Control and Prevention， 简称 CDC) 推荐的 NALC(N- 乙酰 -L- 半胱氨酸 )-NaOH 法 ( 非专利文献 13) 进行样品的均质化。
然后， 可以通过一般的 DNA 制备法 ( 酚 / 氯仿提取、 乙醇沉淀法等， Rapid and simple method for purification of nucleic acids， J.Clin.Microbiol.， 1990 年 3 月 ； 28(3)， 495-503， Boom R， Sol CJ， Salimans MM， Jansen CL， Wertheim-van Dillen PM， van der Noordaa J) 进行 DNA 的提取和纯化。
从样品中分离、 培养的培养菌用作检测人型结核菌的试样时的例子有例如收集小 川培养基上的菌落， 悬浮在灭菌蒸馏水中， 离心分离收集菌体后， 再悬浮在蒸馏水中， 高压 灭菌釜处理后， 经菌体的粉碎处理 ( 通过玻璃珠进行物理压碎等 )， 再离心分离回收上清 液。从所得的上清液中可以提取纯化 DNA。对于 DNA 的提取纯化， 由于市售有各种试剂盒， 因此可以使用这些试剂盒进行， 也可以根据该领域中的常规方法 ( 例如， 酚 / 氯仿提取法、 使用乙醇或异丙醇等使沉淀的方法等 ) 进行。例如， 可以使用 ( 株 ) キアゲソ制离子交换 树脂类型的 DNA 提取纯化试剂盒 Genomic-tip 等进行 DNA 的提取、 纯化。
作为本发明涉及的人型结核菌的检测方法， 可以列举将含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或含有其互补序列的部分 或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物和 / 或探针 的方法 ( 使用本发明的引物和 / 或探针的方法 )。
例如， 使用本发明的引物， 使其与试样中的核酸杂交， 通过 DNA 聚合酶等进行核酸 扩增 ( 例如 PCR ； 专利文献 6) 使引物延伸， 因为对于人型结核菌， 可以使 IS6110 核酸序列 的特异区域的序列扩增， 通过测定所得引物延伸物， 可以检测人型结核菌。
作为本发明涉及的使用本发明的引物检测人型结核菌的检测方法的具体例子， 可 以列举 “人型结核菌的检测方法， 其特征在于 ： 包括下述步骤 (i) 使用含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或含有其互补序列的部
分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物 ( 本发明 的引物 )， 以试样中的核酸作为模板进行 PCR， (ii) 对于上述 (i) 所得的引物延伸物进行电 泳， 由其结果判断有无人型结核菌” 。
在上述方法中使用的本发明的引物的具体例子如前所述。
优选地， 可以列举以含有序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的部分或全部、 或其互补 序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为正 向引物， 以含有序列号 3 或 4 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全 部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为反向引物。
使用上述引物的 PCR、 及接下来进行电泳法的条件、 操作方法等可以参照该领域中 通常使用的常规方法。
作为进行电泳并由其结果判断有无人型结核菌的方法， 例如可以例举 (a) 通过确 认目标碱基对数的引物延伸物部分来判断的方法、 (b) 通过使用标识探针的杂交来判断的 方法等。
作为 (a) 通过确认目标碱基对数的引物延伸物部分来判断的方法， 例如可以列举 使用序列号 1 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 3 所述的寡核苷酸作为反向引物， 进行 PCR 后， 对所得的引物延伸物进行电泳， 对确认有 178 个碱基对部分的试样判断为阳性 的方法。
另外， 例如也可以是使用序列号 2 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 4 所 述的寡核苷酸作为反向引物， 进行 PCR 后， 对所得的引物延伸物进行电泳， 对确认有 182 个 碱基对部分的试样判断为阳性的方法。
另外， 例如也可以是使用序列号 14 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 5 所述的寡核苷酸作为反向引物， 进行 PCR 后， 对所得的引物延伸物进行电泳， 对确认有 324 个碱基对部分的试样判断为阳性的方法。
作为通过使用 (b) 的标识探针的杂交进行判断的方法， 例如， 可以列举在进行电 泳后， 对于所得的电泳部分， 进行使用标识物质标识的标识探针与本发明的核苷酸的杂交， 通过检测该标识探针的标识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
例如， 可以列举以使用序列号 1 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 3 所述 的寡核苷酸作为反向引物进行 PCR 的情况为例， PCR 后， 进行电泳， 对于所得的部分， 进行使 用标识物质标识的标识探针与含有序列号 6 中所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交， 通过检 测该标识探针的标识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
另外， 使用序列号 2 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 4 所述的寡核苷酸 作为反向引物进行 PCR 时， PCR 后， 进行电泳， 对于所得的部分， 进行使用标识物质标识的标 识探针与含有序列号 7 所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交， 通过检测该标识探针的标识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
另外， 使用序列号 14 所述的寡核苷酸作为正向引物， 使用序列号 5 所述的寡核苷 酸作为反向引物进行 PCR 时， PCR 后， 进行电泳， 对于所得的部分， 进行使用标识物质标识 的标识探针与含有序列号 8 所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交， 通过检测该标识探针的标 识， 确认与该标识探针杂交的部分是否存在， 以判断阳性的方法。
可以列举下述例子来详细说明本发明涉及的人型结核菌的检测方法 ： 例如进行PCR 以及电泳后， 其中 PCR 使用序列号 2 所述的寡核苷酸作为正向引物， 序列号 4 所述的寡 核苷酸作为反向引物， 通过确认目标碱基对数的引物延伸物部分的方法进行检测， 如下所 述。
首先， 根据前述方法， 从应该检出人型结核菌的试样中得到纯化的 DNA 试样。另 外， 通过前述的方法， 从本发明涉及的核苷酸， 使用 DNA 合成仪， 根据磷酰胺法， 合成序列号 2 所示的序列 ( 以下称为 IS_F6) 和序列号 4 所示的序列 ( 以下称为 IS_R6) 的寡核苷酸。
制 备 含 有 各 0.2 ～ 2.0μm 的 IS_F6 和 IS_R6、 1.0 ～ 4.0mM MgCl2、 80mMKCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.005 ～ 0.2％ Triton X-100( トリトン X-100、 聚氧乙烯辛 苯基醚、 rohm-and-haas 公司商品名 )、 分别为 0.1 ～ 0.6mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 10 ～ 80 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用反应 液。
向 PCR 用反应液中添加 1ng 纯化的 DNA 试样使用作 PCR 用试样， 通过 DNA 热循环 仪， 进行 20-40 次 PCR。对 PCR 后所得的 5μL 反应液进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳。接着溴 化乙锭染色后， 用紫外线检测荧光。另外， 分子量标记也与反应液一起迁移， 通过比较相对 迁移程度， 计算出被检测的 DNA 片段的长度。在使用 IS_F6 作为正向引物和 IS_R6 作为反 向引物的 PCR 中， 预测 IS6110 的核酸序列中的 182 个碱基对的 DNA 片段 ( 序列号 7) 被复 制。其中， 182 个碱基对的荧光条带被确认的试样可以判断为阳性。
作为本发明涉及的使用寡核苷酸作为引物的人型结核菌的检测方法的其他实施 方式， 可以列举将本发明的引物使用前述方法标识的标识引物， 进行以试样中的核酸作为 模板的 PCR， 在通过测定所得引物延伸物的标识可以检测到标识的情况下， 判断人型结核菌 阳性的方法。
上述方法中， 在进行 PCR 后， 除去游离的标识引物， 测定引物延伸物的标识， 可以 检测到标识时， 判断为人型结核菌阳性。
作为除去游离的标识引物的方法， 可以列举通过使核酸沉淀的常规方法 ( 乙醇沉 淀法、 使用异丙醇的沉淀法等 ) 使进行 PCR 后所得的反应物中的引物延伸物沉淀， 然后除去 含有未沉淀的游离标识引物的上清液的方法。
另外， 也可以列举在适当的条件下， 通过凝胶层析法处理进行 PCR 反应所得的反 应物， 分离引物延伸物和游离的标识引物的方法， 通过电泳分离的方法等。
对于本发明的人型结核菌的检测方法， 也可以使用实时扩增检测体系 ( 例如参照 专利文献 7、 专利文献 8 的记载 )。
作为通过实时扩增检测体系的检测体系例子， 可以列举实时 PCR 检测体系。
例如， 可以在本发明的人型结核菌的检测方法中使用 TaqManTM 实时 PCR 法 ( 例 如参照专利文献 8 的记载 )、 MGB Eclipse Probe System 法 ( 例如参照专利文献 9 的记 载 )、 Molecular Beacons Probe Technology 法 ( 例如参照专利文献 10 的记载 )、 LUX Fluorogenic Primer 法 (InvitrogenCorporation)、 Quenching probe-PCR(QP) 法 ( 例如 参照专利文献 11 的记载 ) 等各种实时 PCR 检测法。
更加具体地， 通过使用以 FAM 标识 5′末端， TAMRA 标识 3′末端的探针的 TaqManTM 实时 PCR 法 ( 例如参照专利文献 8 的记载 )， 可以高灵敏度且定量地检测目标的微量的 DNA。
即， 使用含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸作为引物 ( 本发明的引物 )， 使用含有序列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核酸序列的部分或全部或其互补序列 的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸 ( 本发明的寡 核苷酸 ) 的 5′末端通过报告荧光染料被标识， 3′末端通过猝灭染料被标识的寡核苷酸作 为标识探针， 试样中的核酸作为模板， 进行 PCR， 通过检测从该标识探针游离的标识物质而 进行的方法。
上述 TaqManTM 实时 PCR 法的原理如下所示。可以使用通过荧光染料 ( 报告分子 ) 标识 5′末端， 猝灭染料标识 3′末端的、 在目标基因的特定区域杂交的寡核苷酸探针。该 探针在通常的状态下， 通过猝灭染料抑制报告分子的荧光。在完全使该荧光标识探针与目 标基因杂交的状态下， 从其外侧使用 TaqDNA 聚合酶进行 PCR。 如果通过 TaqDNA 聚合酶进行 延伸反应， 则荧光标识探针由于该核酸外切酶活性而自 5′端水解， 报告染料游离， 发出荧 光。实时 PCR 法通过实时地监测该荧光强度， 可以正确地测定模板 DNA 的初期量。
作为本发明涉及的实时 PCR 检测体系中使用的、 通过荧光染料 ( 报告分子 ) 标识 5′末端、 猝灭染料标识 3′末端的探针中使用的探针， 可以是前述的本发明的探针， 或由所 述探针序列设计的探针。 例如， 可以列举由序列号 6 设计的序列号 11 所示的序列。 另外， 作 为标识 5′末端的报告荧光物质， 可以列举 FAM、 HEX、 TET 等， 其中优选 FAM。作为标识 3′ 末端的猝灭染料， 可以列举 TAMRA 等荧光物质、 BHQ、 DABCYL 等非荧光物质， 其中优选 TAMRA。 作为本发明涉及的实时 PCR 检测体系中使用的正向引物的优选例子， 可以列举含 有序列号 1 或 2 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型 结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸， 作为反向引物的优选例子， 可以列举含 有序列号 3 或 4 中所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型 结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。
实时 PCR 检测体系中所使用的其他的脱氧核苷三磷酸 (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP)、 DNA 聚合酶等试剂， 可以使用在通常的实时 PCR 中所使用的试剂， 实时 PCR 技术除了使用本 发明的引物和探针以外， 也可以根据实时 PCR 的一般方法进行。
阐述本发明涉及的通过实时 PCR 检测体系 (TaqManTM 实时 PCR 法 ) 检测人型结核 菌的检测方法的例子如下所示。
首先， 根据前述方法， 从可以检测人型结核菌的试样中制得纯化的 DNA 试样。另 外， 使用 DNA 合成仪， 通过磷酰胺 ( ホスホアミダイト ) 法合成序列号 1 所示的序列 (IS_ F5)、 序列号 3 所示的序列 (IS_R5) 的寡核苷酸。
另外， 自通过使用 IS_F5 和 IS_R5 作为引物进行 PCR 而扩增的序列号 6 的寡核苷 酸设计用作探针的序列 ( 序列号 11)， 合成该序列的寡核苷酸。通过常规方法将报告染料 FAM 键合至该寡核苷酸的 5′末端， 将报告消光体 TAMRA 键合至该寡核苷酸的 3′末端， 制得 荧光标识探针。
使用上述制备的 IS_F5 作为正向引物， IS_R5 作为反向引物， 例如如下所示进行实 时 PCR。
即， 制备含有各 1μM 的引物 IS_F5 和引物 IS_R5、 100 ～ 1000nM 荧光标识探针、 1.0 ～ 4.0mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.005 ～ 0.2％ TritonX-100、
分 别 为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP、 10 ～ 80 单 位 /mL 的 Taq DNA 聚 合 酶 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH8.9)， 作为反应液。向 20μL 反应液中加入 1ng 纯化的 DNA 试样作为 PCR 用试样， 加入到 96 孔反应板的孔中， 使用 TaqManTMpCR 专用实时 PCR 检测装置进行实时 PCR。反应进行 30 ～ 50 个循环， 测定每次循环报告染料的发光量。
在人型结核菌的判断中， 测定报告染料的发光量时， 可以判断人型结核菌阳性。
另外， 在实时 PCR 法中， 由于可以制作校正曲线， 因此可以制得试样中的人型结核 菌的基因组 DNA 的数目 ( 拷贝数 )。另外， 由于该数目与人型结核菌的数目成比例， 因此也 可以得到试样中的人型结核菌的数目。校正曲线的制作方法可以参照实时 PCR 方法中通常 进行的常规方法进行。例如， 使用拷贝数已知的人型结核菌的基因组 DNA 试样作为标准， 制 备稀释系列的浓度 ( 拷贝数 ) 的 PCR 用 DNA 试样。接着， 使用各稀释系列的 PCR 用 DNA 试 样， 根据上述方法进行实时 PCR， 测定报告染料的发光量。在各个稀释系列的 PCR 用 DNA 试 样中， 绘制相对 PCR 的各个循环数 (x 轴 ) 测定的发光量的测定值 (Rn、 y 轴 )， 制作成扩增 曲线。接着， 选择发光量呈指数函数地扩增的 Rn 部， 引入临界线 (Threshold line)(Th)。 Th 和各个 PCR 用 DNA 试样的扩增曲线的交叉点为临界循环 (Thresholdcycle)(Ct) 值。接 着绘制相对使用的各个 PCR 用 DNA 试样的拷贝数的对数值 (x 轴 ) 的 Ct 值 (y 轴 )， 对应各 Ct 所得的近似曲线可以作为校正曲线。 对于定量试样中的人型结核菌的基因组 DNA 的数目 ( 拷贝数 )， 首先， 从可以检测 人型结核菌的试样中分离纯化 DNA， 然后， 对所得的 DNA 试样进行实时 PCR， 同样地制作扩增 曲线。得到在制作校正曲线时的 Th 和所得扩增曲线交叉的 Ct 值。通过将该 Ct 值应用于 校正曲线， 由此可以获得试样中的人型结核菌的基因组 DNA 量 ( 拷贝数 )。
另外本发明在核酸扩增步骤中， 可以应用利用 RNA 转录产物的检测法。例如， 可以 列举 NASBA( 基于核酸序列的扩增 ) 法 ( 专利文献 12)、 3SR( 自我维持的序列扩增 ) 法 ( 专 利文献 13) 等， 其中利用逆转录酶和 RNA 聚合酶的协同作用 ( 逆转录酶和 RNA 聚合酶在协 同地作用的条件下反应 ) 的特定温度核酸扩增法适用于测定系统的自动化。
另外， 作为本发明的人型结核菌的检测方法， 可以列举通过标识物质标识含有序 列号 1、 序列号 2、 序列号 3、 序列号 4、 序列号 5、 序列号 6、 序列号 7 或序列号 8 中所述的核 酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核 酸序列杂交的寡核苷酸 ( 本发明的寡核苷酸 ) 作为标识探针， 使该标识探针与试样中的核 酸杂交， 除去游离的标识探针后， 检测杂交复合体的标识的方法。
具体地， 可以列举例如 (a) 将本发明的寡核苷酸结合在固相载体上， 用作捕捉探 针， 使其与试样中的核酸杂交， 使试样中的人型结核菌衍生的核酸固定在固相上的检测法 ( 例如， 参照专利文献 15 的记载 )， (b) 使用 (a) 的捕捉探针和本发明的标识探针， 使其与 试样中的核酸杂交， 在固相载体上形成捕捉探针和人型结核菌衍生的核酸和标识探针的复 合体， 进行测定标识探针的夹心试验 ( 例如， 参照专利文献 14 的记载 ) 的方法等。或者也 可以使用 (c) 使用生物素标识的本发明的标识探针， 与试样中的核酸杂交后， 通过抗生物 素蛋白结合载体捕捉试样中的人型结核菌衍生的核酸的方法。
另外， 在本发明的人型结核菌的检测方法中所使用的试剂中， 可以使用通常在该 领域中所使用的试剂类， 例如缓冲剂等稳定剂、 防腐剂等不会妨碍共存试剂等的稳定性、 不 会妨碍 PCR 或杂交反应的试剂。另外， 其浓度也适宜选择通常在该领域中经常使用的浓度
范围。 如果列举缓冲液的具体例子， 完全可以列举例如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、 磷酸 缓冲液、 佛罗那缓冲液、 硼酸缓冲液、 良好缓冲液 ( グッド緩衝液 ) 等在实施通常的 PCR 或 杂交反应时所使用的缓冲液， 其 pH 也没有特别的限制， 通常优选 5 ～ 9。
另外， 根据需要， 可以使用核酸合成酶 (DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 逆转录酶等 )、 对 TM 应酶的基质 (dNTP、 rNTP 等 )、 或者双链嵌入剂 ( 溴化乙锭、 SYBR Green 等 ) 或者 FAM 或 TAMRA 等标识检测物质等。
作为本发明涉及的人型结核菌检测用试剂盒， 可以列举 “包含含有序列号 1、 序列 号 2、 序列号 3、 序列号 4 或序列号 5 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或 全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物 ( 本发明的引 物 ) 的人型结核菌检测用试剂盒。 ” 引物也可以为通过标识物质标识的引物。
上述试剂盒还可以包含使用标识物质标识的本发明寡核苷酸作为标识探针。
另外， 可以列举 “包含下述组成试剂的试剂盒， (1) 含有序列号 1 或 2 所述的核酸 序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸 序列杂交的寡核苷酸作为正向引物， (2) 含有序列号 3 或 4 所述的核酸序列的部分或全部， 或其互补序列的部分或全部， 并且与人型结核菌的 IS6110 基因的核酸序列杂交的寡核苷 酸作为反向引物” 。
上述试剂盒还可以包含使用标识物质标识本发明的寡核苷酸作为标识探针。
另外， 可以列举 “包含本发明的寡核苷酸作为探针的人型结核菌检测用试剂盒” 。 所述探针也可以使用标识物质标识。
组成这些试剂盒的组成试剂的优选方式和具体例子如前所述。
另外， 在本发明的人型结核菌的检测用试剂盒中， 也可以含有例如缓冲剂等稳定 剂、 防腐剂等不会妨碍共存试剂等的稳定性、 不会妨碍 PCR 或杂交反应的试剂。另外， 其浓 度也可以适合选择通常在该领域中经常使用的浓度范围。
如果列举缓冲液的具体例子， 完全可以列举例如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、 磷酸 缓冲液、 佛罗那缓冲液、 硼酸缓冲液、 良好缓冲液等在实施常规 PCR 或杂交反应时所使用的 缓冲液， 其 pH 也没有特别的限制， 通常优选 5 ～ 9 的范围。
另外， 根据需要， 可以使用核酸合成酶 (DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 逆转录酶等 )、 对 TM 应酶的基质 (dNTP、 rNTP 等 )、 或者双链嵌入剂 ( 溴化乙锭、 SYBR Green 等 ) 或者 FAM 或 TAMRA 等标识检测物质等。
以下列举实施例， 更加具体地说明本发明， 但本发明不会因此而受到任何的限制。
实施例 实施例 1
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
使 用 ABI 公 司 DNA 合 成 仪 392 型，通 过 磷 酰 胺 法，合 成 序 列 号 2 所 示 的 序 列 (ACCTCACCTATGTGTCGACC，以 下 称 为 IS_F6) 和 序 列 号 4 所 示 的 序 列 (AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG， 以下称为 IS_R6) 的寡核苷酸。合成方法参照 ABI 公司手册， 通过在 55℃下对寡核苷酸的氨水溶液加热一晚实施各种寡核苷酸的脱保护。接着， 通过
Pharmacia 公司生产的使用 FPLC 的阴离子交换柱色谱， 对合成的寡核苷酸纯化。
(2) 制备试样
使用如下所示的细菌， 通过下述的方法提取、 纯化 DNA， 得到 DNA 试样。 细菌每一种 都有临床分离株， 培养后， 通过菌落的形状和历来的各种生化试验等就可以鉴别出菌种来。
首先， 对于分枝杆菌 (Mycobacterium) 属细菌， 使小川培养基上的菌落悬浮在纯 化水上， 高压灭菌釜处理 (120℃·2 个大气压、 20 分钟 ) 后， 经菌体的粉碎处理 ( 通过直径 2mm 玻璃珠进行物理压碎 )， 离心分离， 得到上清液。由所得的上清液， 使用 ( 株 ) キアゲソ 制的离子交换树脂型 DNA 提取纯化试剂盒 Genomic-tip 进行 DNA 的提取、 纯化。另外， 对于 大肠杆菌， 根据大肠杆菌的 DNA 提取方法的常规方法提取和纯化 DNA。
所得的纯化 DNA 最后配制成 1ng/μL(10mM Tris-HCl 缓冲液、 pH8.9)， 作为 DNA 试 样。
a： 大肠杆菌 (Escherichia coli)
b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )
c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)
d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)
e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)
f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)
g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)
h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)
i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)
j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)
k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)
l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)
m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)
n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)
o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)
p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Mycobacterium peregrinum)
(3)PCR
使用上述 (1) 制备的 IS_F6 作为正向引物， IS_R6 作为反向引物， 如下所述进行 PCR。
首 先， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F6 和 引 物 IS_R6、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1 ％胆酸钠、 0.1 ％ TritonX-100( トリトン X-100、 聚氧乙烯辛苯基醚、 rohm-and-haas 公司商品名 )、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用 反应液。
在 20μL 的 PCR 用反应液中添加 1ng DNA 试样用作 PCR 用试样， 通过 MJ Research公司的 DNA 热循环仪 (DNA Engine PCT200)， 在下述反应条件下进行 30 个循环的 PCR。
PCR 反应条件 ：
热变性 ： 94℃、 0.5 分钟
退火 ： 55℃、 1 分钟
聚合反应 ： 75℃、 0.5 分钟。
(4) 检测
5μL 上述 (3) 所得的 PCR 后的反应液进行 1.5 ％琼脂糖凝胶电泳。电泳的电 学条件为恒电压 100V， 进行 30 分钟。操作方法和其他条件参照生物实验说明的第 2 卷， p53-63( 秀润社、 中山广树著 ) 中所述的一般使用的方法。接着， 溴化乙锭染色后， 使用 UV 样本摄影装置 FAS-III 系统 ( 东洋纺织 ( 株 ) 制 ) 通过紫外线检测荧光。另外， 分子量标 记也与反应液一起迁移， 通过比较相对迁移程度， 计算出被检测的 DNA 片段的长度。另外， 分子量标记使用 X174/HaeIII 消化 ( 标记 4、 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 )。
(5) 结果
所得的电泳结果如图 1 所示。
在图 1 中， 各泳道的数字分别表示分别使用以下的试样时的结果。
M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)
a： 大肠杆菌 (Escherichia coli)
b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )
c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)
d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)
e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)
f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)
g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)
h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)
i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)
j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)
k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)
l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)
m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)
n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)
o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)
p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Myeobaeterium peregrinum)
通过使用正向引物 IS_F6 和反向引物 IS_R6 进行 PCR， 预计 IS6110 的核酸序列中 的 182 个碱基对的 DNA 片段 ( 序列号 7) 被复制。因此， 182 个碱基对的荧光条带被证实则 判断为阳性。
由图 1 的结果可以明白 ： 使用本发明的引物 IS_F6 和引物 IS_R6 进行 PCR， 结果仅使用结核分枝杆菌作为试样时 (b) 可确认 182 个碱基对的荧光条带， 可以判断为阳性。与 之相反， 使用其他的分枝杆菌属细菌或其他属的细菌即大肠杆菌试样作为试样时 (a 和 c ～ s)， 不能证实相应的荧光条带， 完全可以判断为阴性。
如上， 通过在 PCR 中使用本发明的寡核苷酸作为引物， 判断可以特异地检测人型 结核菌。另外， 可以预期通过 PCR 等的核酸扩增具有高灵敏度， 不必要分离细菌， 就可以直 接在检测中使用临床材料， 对人型结核菌的检测最长也就 1 日以内即可以结束， 而通过现 有的培养细菌的检测方法则需要花数周时间在培养上。
实施例 2
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
使 用 与 实 施 例 1(1) 相 同 的 仪 器， 在 相 同 的 操 作 下， 合成序列号1所 示 的 序 列 (TGGGTAGCAGACCTCACCTAT，以 下 称 为 IS_F5) 和 序 列 号 3 所 示 的 序 列 (CGAGTACGCTTTCTTGTTGG， 以下称为 IS_R5) 的寡核苷酸。
(2) 制备试样
使用实施例 1(2) 中所得的 DNA 试样。
(3)PCR
上述 (1) 制备的 IS_F5 用作正向引物、 IS_R5 用作反向引物， 如下所述进行 PCR。
首 先， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F5 和 引 物 IS_R5、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.1％ TritonX-100、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用反应液。
向 20μL 的 PCR 用反应液中添加 1ng DNA 试样用作 PCR 试样， 使用与实施例 1(3) 中使用的相同仪器， 在同样的反应条件下进行 PCR。
(4) 检测
在与实施例 1(4) 同样的方法下， 进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色后， 通 过紫外线检测荧光。
(5) 结果
所得的电泳结果如图 2 所示。
在图 2 中， 各泳道数字分别表示分别使用以下试样时的结果。
M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)
a： 大肠杆菌 (Escherichia coli)
b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 )
c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii)
d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)
e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae)
f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum)
g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)
h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai)
i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)
j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri)
l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi))
m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum)
n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae)
o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)
p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Mycobacterium peregrinum)
另外， 通过使用正向引物 IS_F5 和反向引物 IS_R5 的 PCR， 预计 IS6110 的核酸序列 中的 178 个碱基对的 DNA 片段 ( 序列号 6) 被复制。因此， 178 个碱基对的荧光条带被证实 则判断为阳性。
比较例 1
基 于 公 知 的 IS6110 序 列， 通过使用所制备的引物序列的检测法 ( 特表平 11-514522 号公报 ： 专利文献 11) 进行人型结核菌的检测。
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
特表平 11-514522 中公开的引物序列中， 合成 “TTCGGACCACCAGCACCTAACC” ( 序列 号 9、 以下称为 IS_F2) 和 “CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG” ( 序列号 10， 以下称为 IS_R2) 的寡核 苷酸。
合成使用与实施例 1(1) 同样的仪器， 在同样的操作下进行。
(2) 制备试样
使用实施例 1(2) 所得的 DNA 试样。
(3)PCR
上述 (1) 制备的 IS_F2 用作正向引物、 IS_R2 用作反向引物， 如下所述进行 PCR。
首 先， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F2 和 引 物 IS_R2、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.1％ TritonX-100、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9)， 作为 PCR 用反应液。
向 20μL 的 PCR 用反应液中添加 1ng DNA 试样用作 PCR 用试样， 使用与实施例 1(3) 中使用的相同仪器， 在同样的反应条件下进行 PCR。
(4) 检测
在与实施例 1(4) 同样的方法下， 进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色， 通过 紫外线检测荧光。另外， 分子量标记使用 λ./Hind III 消化 ( 标记 1)(M1 泳道 ) 或 X174/ HaeIII 消化 ( 标记 4)( 都是 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 )。
(5) 结果
所得的电泳的结果如图 3-1 所示。
在图 3-1 中， 另外， 各泳道的数字分别表示使用各个以下试样时的结果。
M1 ： 分子量标记 ( 标记 1)
M4 ： 分子量标记 ( 标记 4)a： 大肠杆菌 (Escherichia coli) b： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 人型结核菌 ) c： 堪萨斯分枝杆菌 (Mycobacterium kansasii) d： 海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum) e： 猿分枝杆菌 (Mycobacterium simiae) f： 瘰疬分枝杆菌 (Mycobacterium scrofulaceum) g： 戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae) h： 斯氏分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai) i： 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium) j： 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare) k： 胃分枝杆菌 (Mycobacterium gastri) l： 蟾分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)) m： 无色分枝杆菌 (Mycobacterium nonchromogenicum) n： 地分枝杆菌 (Mycobacterium terrae) o： 次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale)p： 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)
q： 龟分枝杆菌 (Mycobacterium chelonei)
r： 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)
s： peregrinum 分枝杆菌 (Mycobacterium peregrinum)
另外， 预计通过使用正向引物 IS_F2、 反向引物 IS_R2 进行 PCR 所复制的是 IS6110 的核酸序列中的 197 个碱基对的 DNA 片段。 因此， 197 个碱基对的荧光条带被证实则判断为 阳性。
如从实施例 2 中所得的图 2 的结果可以明白 ： 使用本发明的引物 IS_F5、 引物 IS_ R5 时， 仅仅使用人型结核菌 (b) 作为试样时可以证实 178 个碱基对的荧光条带， 可以判断 为阳性。对此， 在使用其他的分枝杆菌属细菌或其他属细菌大肠杆菌作为试样时 (a 和 c ～ s)， 没有观察到相应的荧光条带， 完全可以判断为阴性。
另一方面， 如从比较例 1 中所得的图 3-1 的结果可以明白， 使用公知的引物 IS_F2、 引物 IS_R2 进行 PCR 时， 可以判断人型结核菌作为试样时为阳性， 除此之外， 在使用无色分 枝杆菌作为试样 (m) 和次要分枝杆菌作为试样时 (o)， 也可以证实具有显著的条带， 这被判 断为假阳性。 在图 3-l 中将使用无色分枝杆菌作为试样时 (m) 的条带以虚线围成的圆表示。 另外， 将使用次要分枝杆菌作为试样时 (o) 的条带以箭头指向的虚线圆圈表示。
即， 在比较例 1 的方法中， 判定为 ： 难以特异地检测人型结核菌。
因此， 从比较例 1 的电泳结果尤其注意到了被判断为与人型结核菌的阳性条带和 扩增片段大小非常相似的次要分枝杆菌试样 (o)。图 3-1 中箭头处， 尤其显示了该条带。为 了进一步分析该 PCR 产物， 在切下迁移部分的 PCR 产物、 进行 DNA 纯化后， 使用 ABI 公司的 序列试剂盒根据 PCR- 直接序列法进行序列分析。
所得的序列如图 3-2 所示。图 3-2 所示的序列中， 部分 (b) 的人型结核菌衍生的 PCR 产物的序列作为第一核苷酸序列 (1st NucleotideSequence)， 序列表的上段所示 ( 序 列号 12)。另外， 由部分 (o) 所得的次要分枝杆菌 (Mycobacterium triviale) 衍生的 PCR产物的序列作为第二核苷酸序列 (2nd Nucleotide Sequence)， 序列表的下段所示 ( 序列号 13)。
DNA 片段的序列分析结果证实了这是次要分枝杆菌 (Mycobacteriumtriviale) 衍 生的核酸序列， 对于人型结核菌特有的 IS6110 的核酸序列而言， 其仅与比较例 1 使用的引 物 IS_F2 和引物 IS_R2 的序列部位一致。因此， 使用该公知的引物 IS_F2、 引物 IS_R2 进行 PCR 时， 发现人型结核菌以外的核酸序列也扩增， 证实了在引物的设计上存在明显的缺点。
由上可知 ： 使用本发明的寡核苷酸作为引物， 通过 PCR 进行人型结核菌的检测， 与 使用现有技术的引物进行结核菌的检测法相比， 可以排除假阳性的判断， 在特异地且高精 度地检测人型结核菌方面， 与现有技术的引物和使用它们的人型结核菌的检测法相比， 非 常优异。
实施例 3
通过实时 PCR 扩增体系检测结核菌
(1) 合成结核菌检测用 PCR 引物
使用与实施例 1(1) 相同的仪器， 在同样的操作下， 合成 IS_F5 和 IS_R5 的寡核苷 酸。
(2) 制作结核菌检测用探针
由通过使用 IS_F5 和 IS_R5 作为引物进行 PCR 扩增所得的序列号 6 的寡核苷酸序 列， 设计用作探针的序列 “ACCGACGCCTACGCTCGCAG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 IS_ F5R5_FAMTAM。 序列号 11)。 在该寡核苷酸的 5′末端结合报告染料 FAM， 3′末端结合报告消 TM 光体 TAMRA， 得到标识的寡核苷酸探针 (TaqMan fluorescent probe、 applied biosystems japan 公司制 )。
(3) 制备 PCR 用 DNA 试样
对于实施例 1(2) 中制备的结核分枝杆菌试样所得的 DNA 试样， 通过测定其吸光度 测定试样中的 DNA 量。所得的 DNA 量通过与已知的结核分枝杆菌的基因组 DNA 量比较， 确 8 定试样中的基因组 DNA 量 ( 基因组拷贝数 )。得到 10 个拷贝 /μL 的基因组 DNA。
接着使用 10mM pH8.9 的 Tris-HCl 缓冲液， 制备稀释成 105， 104， 103， 102， 10， 5， 2个 拷贝 /μL 的稀释系列的 DNA 试样作为 PCR 用 DNA 试样。
(4) 实时 PCR
上述 (1) 制备的 IS_F5 用作正向引物， IS_R5 用作反向引物， 如下所述进行实时 PCR。
即， 制 备 含 有 各 1μM 的 引 物 IS_F5 和 引 物 IS_R5、 195nM 上 述 (1) 制 备 的 荧 光 标识探针 IS_F5R5_FAMTAM、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1 ％胆酸钠、 0.1 ％ TritonX-100、 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( 株 ) ニッボソ·ジ一ソ制 ) 的 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.9) 作为反应液。
向 20μL 反应液中添加 1μL 各稀释系列的 DNA 试样作为 PCR 用试样， 将其加入到 96 孔反应板 ( 微扩增光学 96 孔反应板、 アプライドバイオシステムズジヤパソ社制 ) 的孔 TM 中， 使用 TaqMan PCR 专用热循环检测器 (ABI7000、 アプライドバイオシステムズジヤパソ 社制 ) 进行实时 PCR。反应在 95℃保温 10 分钟后， 在 95℃反应 15 秒钟和 60℃反应 1 分钟 并循环进行 50 个循环， 测定每次循环的报告染料的发光量。另外， 通过使用测定时所用热循环仪将供测定的 96 孔反应板每一板的相对荧光强度比数值化的功能求得发光量。
(5) 结果和分析
按照实时 PCR 法进行的常规方法制成校正曲线。
即， 对各 PCR 用 DNA 试样， 相对 PCR 循环数 (x 轴 ) 绘制报告染料的发光量 (Rn、 y 轴 ) 而制作扩增曲线。接着， 选择发光量随指数函数扩增的 Rn 部， 引出临界线 (Th)。Th 和 各 PCR 用 DNA 试样的发光量交叉的点为临界循环 (Ct) 值。接着， 相对使用的各 PCR 用 DNA 试样的基因组拷贝数 (x 轴、 对数值 ) 绘制 Ct 值 (y 轴 )， 对各个 Ct 值， 所得的近似曲线为校 正曲线。所得的校正曲线如图 4 所示。
y ＝ -3.555x+39.13
R2 ＝ 0.996
由以上可知 ： 由于通过实时 PCP 可以检测发光， 那么在 PCR 中使用本发明的寡核苷 酸作为引物， 由该扩增区域的序列设计标识引物， 通过进行实时 PCR， 可以检测人型结核菌。
另外， 从可以制作校正曲线看出 ： 通过使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法， 可 以进行人型结核菌的定量。另外， 从图 4 可以看出 ： 在使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法中， 在人型结核菌基因组 DNA 的初期量为 2 个拷贝的情况下， 也可以进行人型结核菌的检 测。
另外， 在利用实时 PCR 法时， 由于实时地监视该荧光强度， 可以正确地测定模板 DNA 的初期量， 有效地进行人型结核菌的检测。
实施例 4
利用使用多个引物对在一支管中同时地扩增多个片段的多重 PCR(multiplex PCR) 反 应，尝 试 进 行 以 人 型 结 核 菌、鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium))、胞 内 分 枝 杆 菌 (M.intracellulare)) 和堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)) 为对象的结核病与非结核性抗酸 菌病 (non-tuberculosis Mycobacteriosis， NTM 症 ) 的同时诊断 ( 识别诊断 )。
(1) 引物的合成
(i) 合成结核菌检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备 IS_F5( 序列号 1) 和 IS_R6( 序列号 4)， 分别 作为正向引物、 反向引物。
(ii) 合成鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备特开平 11-69999 号公报权利要求 5 所述的 “鸟 19 千道尔顿蛋白质基因区域中特异的寡核苷酸引物” MAV19KF1(CGGCTGTTCGAGTGGCAACA AGTC， 本发明说明书中序列号 15 所示。 以下称为 “鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 -Fw” )， 和 MAV19K R1(CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC， 本发明说明书中序列号 16 所示。以下称为 “鸟 分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 -Rv” )， 分别作为正向引物和反向引物。
(iii) 合成胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备特开平 11-69999 号公报权利要求 6 所述的 “胞内核糖体蛋白质 s1 基因区域中特异的寡核苷酸引物” rps1F1(CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCA AGA， 本发明说明书中序列号 17 所示。以下称为 “胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测 用引物 -Fw)” ， 和 rps1R1(GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC， 本发明说明书中序列号 18 所示。以 下称为 “胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 -Rv” ， 分别作为正向引物和反向引物。 (iv) 合成堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用 PCR 引物
在与实施例 1(1) 同样的操作下， 制备特开平 11-155589 号中所述的由堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii) 的 KATS2 序列所设计的引物即图 1 所示引物 15 的、 沿 5′方向移动 1 碱 基的序列 (GTCCCTGGCTGCTCTTGA， 本发明说明书中序列号 19 所示。以下称为 “堪萨斯分枝 杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 -Fw)” ， 和引物 (Primer)E3(GCTGGTGGAGATGGAGATGTT， 本发 明说明书中序列号 20 所示。以下称为 “堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 -Rv” ， 分别作为正向引物和反向引物。
(2) 制备试样
使用实施例 1(2) 中所得的人型结核菌、 鸟分枝杆菌 (M.avium)、 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样。
(3)PCR
制 备 含 有 最 终 浓 度 为 各 1μM 的 上 述 (1) 合 成 的 正 向 引 物 和 反 向 引 物、 10mM Tris-HCl(pH8.9)、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1 ％ 胆 酸 钠、 0.1 ％ TritonX-100， 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 ( ニッポソジ一ソ制 ) 的溶液， 作为 PCR 反应用溶液。
向 20μL 的 PCR 用反应液中， 如下面表 1 所述分别添加 1μL(0 ～ 1000 个拷贝 )DNA 试样， 制备 PCR 用试样 (1) ～ (7)， 对于各个试样， 使用与实施例 1(3) 中使用的仪器相同的 仪器， 在同样的反应条件下进行 PCR。另外， 在表 1 中， avium 表示鸟分枝杆菌 (M.avium)、 intracellulare 表示胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 kansasii 表示堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)。另外， × 分别表示不加 DNA 试样的情况， O 分别表示加入 DNA 试样的情况， O 下 () 内的数字表示加入的 DNA 试样的浓度 ( 拷贝数 )。
[ 表 1]
(4) 检测
在与实施例 1(4) 同样的方法下， 进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色后， 通 过紫外线检测荧光。
(5) 结果
图 5 表示所得的电泳结果。
在图 5 中， 各泳道的数字分别表示分别使用前述表 1 中的 7 种 DNA 试样 (1) ～ (7) 时的结果。
另外， 在 DNA 试样中存在人型结核菌的 DNA 试样时， 通过使用 IS_F5 引物和 IS_R6 引物进行 PCR， 预期可得到 193bp 的扩增产物。存在鸟分枝杆菌 (M.avium) 的 DNA 试样时， 通过使用鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 Fw 和鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 Rv 进行 PCR， 预期可得到 106bp 的扩增产物。另外， 存在胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 的 DNA 试样时， 通过使用胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Fw 和胞内分枝杆 菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Rv 进行 PCR， 预期可得到 160bp 的扩增产物。存在堪 萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样时， 通过使用堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测 用引物 Fw 和堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 Rv 进行 PCR， 预期可得到 235bp 的 扩增产物。其中， 在图 5 的电泳模式旁， 结合电泳方向， 表示各扩增产物部分出现的顺序。 “kansasii” 表示堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii)， “TB” 表示人型结核菌， “intra” 表示胞内 分枝杆菌 (M.intracellulare)， “avium” 表示鸟分枝杆菌 (M.avium)。
如从图 5 可以看出： 人 型 结 核 菌、 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium)、 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样全部加入到同一管中， 一
次进行 PCR 时， 完全可以证实各细菌存在时被扩增和预测的各扩增产物的 4 条荧光条带 ( 泳道 (2)、 (5))。另外， 通过可以证实泳道 (5) 中的人型结核菌的条带， 因此即使 DNA 试样 的浓度为行 (2) 时的 1/100， 也可以高灵敏性地进行结核菌的检测。
仅仅使用人型结核菌的 DNA 试样进行 PCR 时， 即使鸟分枝杆菌 (M.avium)、 胞内分 枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用的引物存在时， 也可以 只观察到使用本发明涉及的人型结核菌检测用引物 IS_F5 和 IS_R6 进行 PCR 反应获得的 193bp 的荧光条带 ( 泳道 (3))。
另一方面， 在使用不含有人型结核菌 DNA 试样的试样进行 PCR 时 ( 泳道 (4)、 (6))， 分别使用各个 DNA 试样进行 PCR 可以证实， 使用鸟分枝杆菌 (M.avium) 检测用引物 Fw/Rv 进行 PCR 反应获得的 106bp 的荧光条带， 使用胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引 物 Fw/Rv 进行 PCR 反应获得的 160bp 的荧光条带和使用堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检 测用引物 Fw/Rv 进行 PCR 反应获得的 235bp 的荧光条带， 但是没有检测到在存在人型结核 菌时应该可以证实的 193bp 荧光条带。
由以上可以看出 ： 如果使用本发明的引物， 即使多种 DNA 试样存在于同一管内， 也 可以特异地检测人型结核菌。 另外， 通过使用一管反应进行 PCR， 可以一次进行人型结核菌、 非结核性抗酸菌病的病原菌 MAC 群 ( 鸟分枝杆菌、 胞内分枝杆菌 ) 还有堪萨斯分枝杆菌的 分别 4 种病原体衍生的基因组 DNA 的检测。 实施例 5
在 实 时 PCR 扩 增 体 系 中 使 用 荧 光 标 识 探 针 进 行 多 重 PCR， 尝试同时诊断人 型 结 核 菌 和 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium)、 胞 内 分 枝 杆 菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分 枝 杆 菌 (M.kansasii) 为 对 象 的 结 核 病 和 非 结 核 性 抗 酸 菌 病 (non-tuberculosis Mycobacteriosis， NTM 症 )。
(1)PCR 用引物
(i) 结核菌检测用 PCR 引物
与实施例 1(1) 同样的操作， 制备 IS_F5( 序列号 1) 和 IS_R5( 序列号 3)， 分别作为 正向引物、 反向引物。
(ii) 鸟分枝杆菌检测用 PCR 引物使用与实施例 4(1)(ii) 相同的引物。
(iii) 胞内分枝杆菌检测用 PCR 引物使用与实施例 4(1)(iii) 相同的引物。
(iv) 堪萨斯分枝杆菌检测用 PCR 引物使用与实施例 4(1)(iv) 相同的引物。
(2) 探针的制备
(i) 制备结核菌检测用探针
由通过使用 IS_F5 和 IS_R5 作为引物进行 PCR 而扩增的序列号 6 的寡核苷酸序 列， 设计用作探针的序列 “ACCGACGCCTACGCTCGCAG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 IS_ F5R5_FAMTAM。序列号 11)。在该寡核苷酸的 5′末端结合报告染料 FAM， 3′末端结合报告 TM 消光体 TAMRA， 得到标识的寡核苷酸探针 (TaqMan fluorescent probe、 アプライドバイオ システムズジヤパソ社制 )。
(ii) 制作鸟分枝杆菌检测用探针
由 通 过 用 作 PCR 引 物 的 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium) 检 测 用 引 物 Fw 和 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium) 检 测 用 引 物 Rv 而 扩 增 的 寡 核 苷 酸 序 列， 设计用作探针的序列
“CAGCTCGAGCACCAGTGCGTCGG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 Mab_F1R1m2_Cy5BHQ。序 列号 21)。在该寡核苷酸的 5′末端结合报告染料 Cy5， 3′末端结合报告消光体 BHQ2， 得到 标识的寡核苷酸探针 ( 实时 PCR 用两端修饰的探针， SIGMA GENOSYS 公司制 )。
(iii) 制作胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用探针
由通过用作 PCR 引物的胞内分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Fw 和胞内 分枝杆菌 (M.intracellulare) 检测用引物 Rv 而扩增的寡核苷酸序列， 设计用作探针的序 列 “CTGGCTCGTCAGCTTCACGCG” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 Int_F1R1m_VICMGB。序 列号 22) 在该核苷酸的 5′末端结合报告染料 VIC， 3′末端结合报告消光体 MGB， 得到标识 TM 的寡核苷酸 (TaqMan fluorescent probe、 アプライドバイオシステムズジヤパソ社制 )。
(iv) 制作堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用探针
由通过用作 PCR 引物的堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 Fw 和堪萨 斯分枝杆菌 (M.kansasii) 检测用引物 Rv 而扩增的寡核苷酸序列， 设计用作探针的序列 “ATCGTATCCACCATCCTCGACAGCGT” ， 合成该序列的寡核苷酸 ( 以下称为 KATS2_TAMBHQ2。 序列 号 23)。在该核苷酸的 5′末端结合报告染料 TAMRA， 3′末端结合报告消光体 BHQ2， 得到标 识的寡核苷酸 ( 实时 PCR 用两端修饰的探针， SIGMA GENOSYS 社制 )。
(3) 制备试样
对 实 施 例 1(2) 所 得 的 人 型 结 核 菌、 鸟 分 枝 杆 菌 (M.avium)、 胞内分枝杆菌 (M.intracellulare)、 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) 的 DNA 试样， 通过测定吸光度以测定 试样中的 DNA 量。所得的 DNA 量通过与已知的结核分枝杆菌的基因组 DNA 量比较， 确定试 8 样中的基因组 DNA 量 ( 基因组拷贝数 )。得到 10 个拷贝 /μL 的基因组 DNA。
接着， 使用 10mM pH8.9 的 Tris-HCl 缓冲液， 制备稀释成 105， 104， 103， 102， 10， 5， 2 个拷贝 /μL 的稀释系列的试样作为 PCR 用 DNA 试样。
(4) 实时 PCR 检测
制备含有最终浓度分别为 1μM 的上述 (1) 合成的各个正向引物和反向引物、 最 终浓度分别为 195nM 的各个荧光标识探针、 10mMTris-HCl(pH8.9)、 1.5mM MgCl2、 80mM KCl、 500μg/mL BSA、 0.1％胆酸钠、 0.1％ TritonX-100， 分别为 0.2mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 和 40 单位 /mL Taq DNA 聚合酶 ( ニッポソジ一ソ制 ) 的溶液， 作为反应液。
向 20μL 反应液中加入各稀释系列的 1μLDNA 试样作为 PCR 用试样， 将其加入到 96 孔反应板 ( 微扩增光学 96 孔反应板、 アプライドバイオシステムズジヤパソ社制 ) 的孔 TM 中， 使用 TaqMan PCR 专用热循环·检测仪 (ABI7500、 アプライドバイオシステムズジヤパ ソ社制 ) 进行实时 PCR。反应在 95℃保温 10 分钟后， 在 95℃反应 15 秒钟和 60℃反应 1 分 钟并循环进行 50 次， 测定每次循环的报告染料的发光量。
另外， 通过使用测定时所用热循环仪将供测定的 96 孔反应板每一板的相对荧光 强度比数值化的功能求得发光量。
(5) 结果与分析
由于各菌体检测用引物的报告染料各不相同， 因此如果监测来自各个循环的每种 报告染料的不同荧光 4 波长的发光量， 可以证实以人型结核菌衍生的基因组序列作为靶标 的 DNA 片段的扩增、 以及非结核性抗酸菌病的病原体 MAC 群 ( 鸟分枝杆菌、 胞内分枝杆菌 ) 还有堪萨斯分枝杆菌的 4 种病原体衍生的基因组 DNA 的扩增。因此， 测定各个报告染料的发光量， 通过与实施例 3(5) 同样的方法， 可以制作成 表示来自各菌的基因组 DNA 的稀释系列和各报告染料的发光量的关系的扩增曲线。由所得 的扩增曲线， 通过与实施例 3(5) 同样的方法， 绘制相对基因组的拷贝数 (x 轴、 对数表示 ) 的 Ct 值 (y 轴 )， 相对各个 Ct 值所得的近似曲线作为校正曲线。
结果如图 6 所示。
从图 6 的结核菌 (M.tuberculosis)DNA 的结果 ( 校正曲线 ) 可以看出 ： 由于可以 检测人型结核菌检测用引物的报告染料的发光， 那么本发明涉及的寡核苷酸作为引物用于 PCR 时， 通过由形成该扩增区域的序列设计标识引物， 进行实时 PCR， 即使在同一管中存在 来自于人型结核菌以外的多种细菌的 DNA， 也可以检测人型结核菌。
另外， 由于可以制作成校正曲线， 通过使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法， 可 以定量人型结核菌。另外， 由图 6 可以看出 ： 在使用本发明的引物和探针的实时 PCR 法中， 即使人型结核菌的基因组 DNA 初期量以 2 个拷贝存在的条件下 (2 个拷贝 / 反应 )， 也可以 检测人型结核菌。
另外， 利用实时 PCR 法时， 通过实时地监测其荧光强度， 可以正确地定量模板 DNA 的初期量， 有效地检测人型结核菌。
此外， 即使混合 ( 并发感染 ) 有分别来自非结核性抗酸菌病的病原菌 MAC 群 ( 鸟 分枝杆菌、 胞内分枝杆菌 ) 和堪萨斯分枝杆菌的基因组 DNA 时， 也可以相互不干涉彼此的扩 增反应， 维持各校正曲线的线性， 通过 1 管反应监测分别来自 4 种病原体的基因组 DNA。这 时的检测灵敏度对于任一种菌种都可以显示 2 个拷贝 / 反应。即， 对于多种细菌混合的样 品， 通过进行实时 PCR， 也可以一次地进行人型结核菌的检测和非结核性抗酸菌的鉴定。
工业实用性
根据本发明涉及的人型结核菌的检测方法， 与现有技术中的以 IS6110 作为靶标 的结核菌检测法相比， 可以排除诊断上的假阳性， 更特异地和高灵敏度地检测人型结核菌。
另外， 使用本发明涉及的引物和探针， 通过实时 PCR， 进行人型结核菌的检测时， 由 于该检测方法对人型结核菌是特异的， 因此对于一种试样， 可以进行人型结核菌的检测和 非结核性抗酸菌的同时诊断 ( 识别诊断 )。29CN 101935709 A
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