用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒及其制备方法 【技术领域】
本发明属于动物卫生检验技术领域，特别是一种快速检测猪伪狂犬病毒gE基因的新型方法，通过观察反应管浊度和颜色变化，或紫外灯下观察琼脂糖凝胶电泳图像来判断扩增情况，来判断结果。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又名奇痒症、奥叶基氏病，病原为疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)。临床上多以发热和神经症状为特征。至2007年世界上有44个国家和地区有本病的报道，该病已成为危害全球养猪业最严重的疫病之一。种猪感染伪狂犬病毒后引起不育；妊娠母猪发生流产、产死胎和木乃伊胎；伪狂犬病病毒先天感染或早期感染引起哺乳仔猪的神经症状和高死亡率；对于育肥猪，伪狂犬病毒是呼吸系统疫病综合征(PRDC)的重要病原，引起生长育肥猪的呼吸系统症状和生长迟缓；对于种猪场来说，伪狂犬病呈阳性对于种猪的销售和品牌效应造成不利影响；而对于出口企业，猪场伪狂犬病呈阳性面临着经济和贸易的双重损失。
近年来，我国养猪业朝着集约化、规模化方向迅速发展，饲养的密度越来越大而且种猪交流越来越频繁，这为该病的发生、传播与蔓延创造了条件。刘有昌等于2006年-2007年对来自天津、河北、山东等省市猪场的1502份血清样品的检测结果，最高感染率为100％，平均感染率为49％。据不完全统计，我国每年因猪伪狂犬病毒等疾病引起的猪呼吸道疾病综合征造成的经济损失高达数十亿人民币。世界猪伪狂犬病防制经验表明，敏感、快速、准确的检测技术则是猪伪狂犬病防制中的关键环节。由于猪伪狂犬病与其它许多引起猪繁殖障碍综合征的疾病存在非常类似的临床症状，加上各猪场间的临床症状差异极大，尤其是有细菌性或病毒性的继发感染或混合感染，更增加了临床诊断工作的难度，因此仅根据临床症状及流行病学特点很难作出诊断。目前国内外所报道的实验室诊断方法很多，分为血清学和病原学诊断方法。
(一)血清学方法：
血清学方法包括中和法、乳胶凝集等，其中最为著名的是gE-ELISA。该方法也是我国目前应用较多的确定野毒感染的血清学诊断方法，但是与其他的血清学方法一样，该方法同样无法排除母源抗体干扰，因为对于10周龄以内的仔猪很难判断gE抗体是来自母源抗体，还是由于感染。而且血清学的方法不能检测到伪狂犬病毒的潜伏感染。伪狂犬病毒在初次感染康复后可以潜伏在神经结中，这时抗体检测为阴性，但是当机体受到内外因素刺激时，病毒被活化并引起疾病的发生和传播。
(二)病原学方法：
1.细胞培养法
在病原学诊断方法中最经典、准确的方法是从发病猪体采取病料组织，用细胞来进行病毒分离，但此方法耗时长(7-10天)，很难满足临床诊断所要求的时效性，主要应用于科学研究。
2.基因诊断技术
各国学者对该病毒的分子生物学特性、实验室诊断基因进行了大量的研究，目前伪狂犬病毒已有75％的基因定位，一些重要的糖蛋白的结构和功能都已清楚。这些都推进着伪狂犬病的基因诊断技术的发展。
人们已经建成了多种方法，例如核酸探针杂交技术、PCR技术，荧光定量PCR技术等等，伴随着基因缺失疫苗在伪狂犬病防治上的应用，与其相应的鉴别PCR应运而生，陈陆一等根据已发表的伪狂犬病病毒gB、gE基因的序列，设计并合成了两对引物，分别建立了一种通用和一种鉴别PCR诊断方法，可以用于鉴别疫苗株与野毒株感染。万超等以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针，建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。
目前对于PCR技术已经有了相当多的研究，但是在应用过程中人们发现它存在很多不足之处：(1)靶基因易被污染。(2)常引起非特异性扩增。(3)反应所需taq DNA酶经常受到组织、血液和IgG等成分的影响，而降低活性，从而抑制扩增反应。(4)需要比较昂贵的PCR仪。(5)扩增反应时间较长，一般需要几个小时，不利于在基层实验室推广应用等等。鉴于目前诊断方法的不足，建立更为简便、快速、特异、适于现地应用的诊断方法，对猪伪狂犬病的及时监测、鉴别自然感染猪只及实施控制和扑灭计划均具有重要意义。
随着科学技术的迅猛发展，一些先进的分子生物学技术和免疫学技术已经在实验室研究中得到普及应用，为兽医诊断技术的研究提供了新的手段。
LAMP(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)。该方法是2000年由Notomi等首先报道的一种新地核酸扩增技术，该方法是利用一套四种(FIP、F3、BIP、B3)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件(65℃左右)保温30-60分钟，即可完成核酸扩增反应，其终产物是一种混和物，由多个不同茎长的茎-环状结构的DNA和在相同链中通过退火目的序列不断翻转复制而成的多样的环状结构所构成的花椰菜样结构所组成。
LAMP法的原理虽然复杂，但研究人员或检测人员实际操作却是很简便。另外，其检测产物的方法简单易行选择性高，无需经过电泳，可直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或加入EB/SYBR Green I通过观察有无荧光进行判断是否发生反应。该方法灵敏度高、特异性强，极适于病原检测用。故本法一经面世，即受到多学者的关注。
目前，该方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有相关论文报道。Enomoto及Kaneko等分别采用LAMP和聚合酶链反应(PCR)两种方法对与伪狂犬病毒同属的7型人类疱疹病毒进行DNA扩增，测得LAMP反应的灵敏性为每管250拷贝，较PCR的敏感性高10倍。wamodo等根据gyrB基因序列针对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的特异引物和16S核糖体RNA保守序列的分枝杆菌属公共引物Muniv，用LAMP方法从痰标本中鉴定结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，可检测到10个拷贝的细菌。他在反应试管中加入SYBR Green I进行检测。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。
伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科中的疱疹病毒a亚科，水痘病毒属的猪疱疹病毒I型，为双股DNA病毒。gE是至今发现的所有的野毒株都表达的一种糖蛋白，是PRV主要的毒力基因，能够介导病毒在细胞间的扩散，并有助于PRV向中枢神经系统扩散，它也是伪狂犬病基因缺失疫苗的标志基因，通过检测gE基因的有无可区分疫苗株和野毒株的感染。根据陆芹章等和邵伟娟等对PRV不同毒株gE基因核苷酸序列的比较，同源性在98％～99.5％之间，表明gE基因序列比较保守，在疫苗应用及分子诊断方面均有较大的价值。但尚没有应用LAMP方法(loop-mediatedisothermal amplification，环介导等温扩增)进行伪狂犬病毒检验的先例。
【发明内容】
本发明的一个目的是克服现有技术的缺点与不足，提供用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒及根据其gE基因设计的引物对其进行扩增，通过观察反应管浊度和颜色变化，或紫外灯下观察琼脂糖凝胶电泳图像来判断扩增情况，判断结果。
本发明的另一个目的是提供一种快速检测猪伪狂犬病毒的方法。
本发明的再一个目的是提供用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒的使用方法。为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：
一种用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒，其特征包含如下组分：
(1)LAMP反应液：每23μL LAMP反应液中含有：2×Buffer(含Mg2+)2.5μL；gE3-F30.5μL；gE3-B3 0.5μL；gE3-FIP 4μL；gE3-BIP 4μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶1μL；水7μL。
(2)排序序列的LAMP引物：
gE3-F3 TGCTCGGGGCGAAGGT gE3-B3 GGGTGGTAGATGCAGGGC gE3-FIP CATGTCCGAGACCACGCGCGTTTTTCCACTCGCAGCTCTTCT gE3-BIP GAGAACTTTACCGCCACGCTGGTTTTCGTACACGTAGTACAGCAGG
本发明所述用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤：
1、扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer(含Mg2+)2.5μL；gE3-F3 0.5μL；gE3-B3 0.5μL；gE3-FIP 4μL；gE3-BIP 4μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶1μL；水7μL；DNA样品2μL。其中2×Buffer表示的是2×缓冲液。
2、扩增反应过程：在DNA循环仪上95℃条件下变性5min，在60-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；
3、扩增反应结束，取体系液10-25μL用不同的检测方法判断扩增与否。
本发明所述用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒的使用方法，其特征是包括以下步骤：
(1)配制上述23μL LAMP反应液；
(2)提取待测样品中的核酸；
(3)取2μL所述(2)核酸的提取液加入步骤(1)配制的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000rpm瞬时离心30S以混匀反应液；
(4)置60℃至65℃恒温45min至60min进行LAMP扩增；
(5)取出扩增反应管，在反应液中添加1μL SYBR green I，通过观察反应管浊度和颜色变化，或紫外灯下观察琼脂糖凝胶电泳图像来判断扩增情况，判断结果。有三种观察方法，适合不同情况下进行：
1)通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象。由于EB是致癌剂，因此该方法应用不是很广范。结果见图3。
2)由于反应形成大量扩增产物，可以直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，紫外灯下观察，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图1。
3)检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。在反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。
本发明人研制的用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒具有以下特点：
(1)本发明在一定程度上提供了我国该病毒检测能力提高的技术支撑和理论依据。此外，基于LAMP方法的特异性和敏感性高，成本低廉，易于操作等诸多优势，为猪伪狂犬病的实时快速检测和出入境检疫提供新技术来源，对于及时监控该病的发生发展，制定行之有效的防制措施，对提高我国猪伪狂犬病免疫防制水平具有重要意义。
(2)由于猪伪狂犬病毒弱毒疫苗为gE基因缺失疫苗，而临床感染毒株为完整病毒，含有gE基因，因此，本发明的用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒可区分两种病毒，适用于临床病例、病料、细胞培养物和DNA样品的检测。
【附图说明】
图1为扩增产物加入SYBR Green I肉眼观察的结果图。自左向右依次为阴性水对照，伪狂犬病毒细胞培养物的扩增产物。
图2为扩增产物加入SYBR Green I紫外灯下观察的结果图。自左向右依次为阴性水对照，伪狂犬病毒细胞培养物的扩增产物。
图3为LAMP试验电泳图。自左向右，从左至右依次为M，DL2000DNA marker；1，临床样品1；2，样品2；3，样品3；4，样品4；5，样品5；6，样品6；7，样品7；8，样品8；9，伪狂犬病毒细胞培养物；10，阴性水对照；M，DL2000DNA marker。
图4为扩增产物加入EB紫外灯下观察的结果图。其中1，水对照；2，1TCID50；3，101TCID50；4，102TCID50；5，103TCID50；6，104TCID50；7，105TCID50；8，106TCID50；M，DL2000DNA Marker。其中TCID50(Tissue culture infective dose)，又称50％组织细胞感染量，即指能在半数细胞培养板孔或试管内病毒引起细胞病变(cytopathic effect，CPE)的病毒量，是一种计算病毒含量的单位。
图5为PCR试验电泳图：其中1，水对照；2，1TCID50；3，101TCI D50；4，102TCID50；5，103TCID50；6，104TCID50；7，105TCID50；8，106TCID50；M，DL2000DNA Marker。
【具体实施方式】
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用的原料均有市售。本发明所述的伪狂犬病毒gE基因LAMP引物序列见表1。
表1
gE3-F3 TGCTCGGGGCGAAGGT gE3-B3 GGGTGGTAGATGCAGGGC gE3-FIP CATGTCCGAGACCACGCGCGTTTTTCCACTCGCAGCTCTTCT gE3-BIP GAGAACTTTACCGCCACGCTGGTTTTCGTACACGTAGTACAGCAGG
实施例1
1、猪伪狂犬病毒PK-15细胞培养物DNA的提取：
收获出现典型病变的细胞，冻融1次，4000r/min离心取上清445μL，加入12.5μL蛋白酶K(20mg/mL)和25μL10％SDS。50℃水浴2h，酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次，吸取水相。2倍体积的无水乙醇在-20℃沉淀1h后，10000r/min离心10min，沉淀经70％乙醇洗涤，干燥后溶于20μL TE中，-20℃冻存备用。
2、扩增反应
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和2倍Buffer溶液；伪狂犬病毒gE基因LAMP引物；dNTPs
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer(含Mg2+)2.5μL；gE3-F3 0.5μL；gE3-B3 0.5μL；gE3-FIP 4μL；gE3-BIP4μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶1μL；水7μL；DNA样品2μL。。
(3)扩增反应过程：95℃条件下变性5min，在60℃进行45min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；
(4)扩增反应结束，直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green I，肉眼观察，无扩增反映的管子为桔黄色，有扩增的为绿色，结果见图1。在紫外灯下观察。无扩增反应的管子没有荧光，有扩增反应的管子将变为绿色荧光，结果见图2。
实施例2
1、猪伪狂犬病毒PK-15细胞培养物DNA的提取：
煮菌法。取病毒的细胞培养物200μL，100℃水浴10min，冰浴5min，1000rpm离心，上清用于检测。
2、扩增：
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和2倍Buffer溶液；伪狂犬病毒gE基因LAMP引物；dNTPs
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer(含Mg2+)2.5μL；gE3-F30.5μL；gE3-B30.5μL；gE3-FIP 4μL；gE3-BIP4μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶1μL；水7μL；DNA样品2μL。
(3)扩增反应过程：95℃条件下变性5min，在63℃进行45min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；
(4)扩增反应结束，取体系液10μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象。结果见图3。
实施例3
1、提取感染猪伪狂犬病毒仔猪病料中的DNA：将采集的扁桃体与脑组织分别在灭菌的乳钵内剪碎，充分研磨后用含100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的Hank′s液稀释成5倍混悬液，4℃4000r/min离心30min，取上清液，按实例1的方法提取组织中的病毒DNA。
2、扩增反应：
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和2倍Buffer溶液；伪狂犬病毒gE基因LAMP引物；dNTPs
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer(含Mg2+)2.5μL；gE3-F3 0.5μL；gE3-B3 0.5μL；gE3-FIP 4μL；gE3-BIP4μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶1μL；水7μL；DNA样品2μL。
(3)扩增反应过程：95℃条件下变性5min，在65℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；
(4)扩增反应结束，取体系液10μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象。结果见图3。
实施例4
对比实验：
采用本发明的猪伪狂犬病毒LAMP试剂盒与PCR测定方法的对比：
(1)本发明方法试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和2倍Buffer溶液；伪狂犬病毒gE基因LAMP引物；dNTPs；DNA模板包括含有伪狂犬病毒的样品。
(2)本发明扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer(含Mg2+)；gE3-F3 0.5μL；gE3-B3 0.5μL；gE3-FIP 4μL；gE3-BIP 4μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶1μL；水7μL；DNA样品2μL。
(3)本发明扩增反应程序：95℃条件下变性5min，在65℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；
(4)扩增反应结束，取体系液10μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在紫外灯下观察。无扩增反应的反应管无明显条带，有扩增反应的反应管出现阶梯状条带。最低可以检测到101TCID50。结果见图4：其中1，水对照；2，1TCID50；3，101TCID50；4，102TCID50；5，103TCID50；6，104TCID50；7，105TCID50；8，106TCID50；M，DL2000DNA Marker。
(5)PCR方法：反应引物采用一对gE目标基因引物。
PCR反应为20μL体系，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.2μL，2×GC Buffer I 10μL，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)2μL，DNA模板2μL，25pM引物PRV(gE)U3和PRV(gE)L3各1μL，去离子水4.8μL。
扩增程序采用先预变性94℃5min之后，进入循环：94℃60s，65℃60s，72℃60s，30个循环后，72℃延伸10min。
PCR产物取10μL于2％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，
通过凝胶成像分析仪观察，PCR方法最低可以检测到102TCID50。结果见图5：其中1，水对照；2，1TCID50；3，101TCID50；4，102TCID50；5，103TCID50；6，104TCID50；7，105TCID50；8，106TCID50；M，DL2000DNA Marker。
由两种方法比较可以看出：本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出猪伪狂犬病毒含量更低的样品。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
【序列表】
<110>天津市畜牧兽医研究所
<120>用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒及其制备方法
<160>4
<210>1
<211>16bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tgctcggggc gaaggt 16
<220>
<211>18bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gggtggtaga tgcagggc 18
<220>
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
catgtccgag accacgcgcg tttttccact cgcagctctt ct 42
220>
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gagaacttta ccgccacgct ggttttcgta cacgtagtac agcagg 46