一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用 技术领域 本发明涉及一种丙型肝炎病毒血清型检测技术， 具体地说涉及一种丙型肝炎特异 性抗原以及采用酶联免疫技术检测丙型肝炎病毒血清型特异性抗体的方法。
背景技术 丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus， HCV) 是引起输血后病毒性非甲非乙型肝炎的 主要病原， 主要通过输血、 静脉吸毒传播， 也可通过密切接触和母婴传播。目前全世界约有 1.7 亿 HCV 感染者。一般地， 15 ～ 20％左右的 HCV 感染者为自限性感染， 超过 80 ～ 85％的 感染者发展为慢性丙型肝炎， 其中又有 20％的可发展为肝纤维化， 最终有 4 ～ 5％的肝纤维 化患者发生肝细胞性肝癌， 危害十分严重。
HCV 基因组全长 9400nt， 共编码 C、 E1、 E2、 NS3、 NS4、 NS5 等蛋白。目前， 慢性丙型 肝炎主要治疗方案是干扰素加利巴韦林联合治疗。治疗前应进行 HCV RNA 基因分型 (1 型 和非 1 型 ) 和血中 HCV RNA 定量， 以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量。因此， HCV 基因型的检测在慢性丙型肝炎的治疗中具有重要作用。
由于 HCV 基因组具有极高的变异性， 根据选择的区段的不同， 不同学者采用不同 的 HCV 分型方法， 命名也不尽相同。一般说， 国际上通常采用的分型方法有两种， 一种是 Simmonds 基因分型法， 主要是采用测序法分析 NS5 区 222bp 的变异情况， 将 HCV 基因型分为 1a、 1b、 1c、 2a、 2b、 2c、 3a、 3b、 4a、 5a、 6a 等 6 个主要的基因型和 11 个亚型， 伴随大量新 HCV 基 因的克隆测序工作的进行， 目前， HCV 已经发现有 30 多个亚型 ； 另一种是 Okamoto 基因分型 法， 主要采用型特异性引物扩增 C 区基因， 根据扩增片断的长度， 将 HCV 分为 I-IV 四个主要 的基因型。 不同分型方法之间有一定的关联性， 象 Simmonds 确定的 1b 亚型相当于 Okamoto 分型的 II 型 ； 而 2a 亚型相当于 III 型。除此以外， 对 E1 区的测序分析可以正确的区分 I/1a、 II/1b、 III/2a、 IV/2b、 2c(V)、 3a、 4a、 4b、 4c、 4d、 5a、 6a 共 12 种不同的基因型或亚型。 临床研究显示 ： 1b 型 HCV 感染者 IFN 疗效较差， 而 2a 型感染者 IFN 敏感性较好。来自流行 病学的研究显示， 在我国， 1b、 2a 两种亚型感染率接近 97％， 因此， 如何区分 1b、 2a 感染在我 国临床 HCV 治疗中具有独特的重要作用。
目前， 对 HCV 基因分型的方法除了序列分析法外， 还增加了型特异性引物 PCR 扩增 法、 型特异性探针杂交法、 限制酶切多态性分析等方法， 尽管后续方法降低了测序费用及缩 短了检测时间， 但仍需要 HCV 基因提取等过程， 一般实验室难以开展。另外， 当 HCV-RNA 阴 性或由于保存不当及处理过程中 HCV-RNA 遭到破坏时， 则不能进行基因分型。
鉴于上述情况， 有些学者提出了血清学分型， 即筛选 HCV 各基因型特异性抗原表 位， 合成相应多肽， 采用间接酶联免疫技术， 根据患者体内型特异性抗体的存在情况， 进行 HCV 的血清学分型。目前， 日本学者根据不同 HCV 基因型中 C 区氨基酸序列的差异， 人工合 成 2 条多肽， 血清 1 型多肽代表 Okamoto 分型的 I 和 II 型 (Simmonds 分型的 1a、 1b)， 血清 2 号多肽代表 Okamoto 分型的 III 和 IV 型 (Simmonds 分型的 2a、 2b)， 基于 C 区的血清分型 与基因分型具有较高的符合率， 但分型率只有 45％， 但具有很高的特异性 ； 基于 NS4 血清分
型试剂可以检测 1-6 型， 分型率为 83％ ； 与基因分型的符合率为 87％， 目前， Murex 已经推 出 NS4 血清分型的商品化试剂， 但价格昂贵， 且结果判断复杂。
造成血清分型率低的原因主要在于单独使用 C 区、 NS4 抗原进行血清学分型， 其抗 体检出率偏低。事实上， HCV 感染者体内针对 HCV 病毒产生的抗体情况十分复杂， 存在针对 多个不同区的抗体， 因此， HCV 诊断通常通过采用多抗体联合诊断的手段提高 HCV 抗体的检 出率。而近些年对膜区 E1、 E2 抗原的研究进展， 超过 90％以上的 HCV 慢性感染者体内都存 在针对膜区的抗体， 但由于 E1、 E2 抗原难以大量纯化， 直接影响膜区抗体在 HCV 检测中的应 用， 也影响其在 HCV 血清分型中的进一步应用。
C 区型别特异性抗原表位的位置主要位于 65-81aa 区间， 但不同研究中选择的序 列并不相同， 缺少进一步核实 ； NS4 型别特异性抗原表位的位置并不固定， 其大体范围位于 1690-1711 范围类， 有 15-21 个氨基酸组成， 尚需要对其型别特异性表位进行精确分析。而 关于膜区型别特性抗原的鉴定至今未见报道。
为了提高 HCV 血清分型的分型率， 本研究在对 C、 NS4、 E1 型别特异性抗原表位进行 分析鉴定的基础上， 利用基因序列拼接技术， 克隆表达含有 C、 NS4、 E1 三个区段的融合型别 特异性抗原， 并再此基础上采用双孔测试酶联法对 HCV 血清进行分型。 发明内容 为了解决 HCV 基因分型技术难以用于临床的目的， 本发明提供一种建立在免疫酶 联检测技术基础之上的 HCV 血清分型技术。为了提高 HCV 血清分型的分型率， 本发明公开 了一种基于嵌合多区段型别特异性抗原进行多表位 HCV 血清分型的方法， 克服了原有技术 中单独使用 C 区、 NS4 抗原造成的检出率偏低的问题。本发明除了对现有 HCV 血清分型通 常采用的 C、 NS4 型别特异性抗原表位进行分析鉴定外， 还增加了对 E1 型别特异性抗原表位 筛选， 利用基因序列拼接技术， 克隆表达含有 C、 NS4、 E1 三个区段的嵌合型别特异性抗原， 并在此基础上建立多表位 HCV 血清分型技术， 提高 HCV 血清分型的分型率。
本发明提供一种丙型肝炎病毒 (HCV) 的 1b、 2a 型别特异性的多表位嵌合抗原， 其 特征在于， 所述 1b 型别抗原 E1 区段包含氨基酸序列 1、 3、 5， 同时所述 2a 型别抗原 E1 区段 包含氨基酸序列 2、 4、 6， 即，
1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS
2VEVRNISSSYYATNDCSNN
3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA
4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT
5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT
6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH
所述 1b 型别抗原 NS4 区段包含氨基酸序列 7， 同时所述 2a 型别抗原 NS4 区段包含 序列 8， 即，
7VVAPDKEVLYEAFDEM
8AIIPDREVLYQEFDEM
所述 1b 型别抗原 C 区段包含氨基酸序列 9， 同时所述 2a 型别抗原序列 10， 即，
9KARRPEGRTWAQPGY
10KDRRSTGKSWGKPGY。
本发明还提供一种一种利用如上所述抗原进行丙型肝炎病毒 (HVC) 血清分型检 测的方法， 利用所述 1b 型别抗原和 2a 型别抗原分别形成抗原包被酶联板， 并进一步分别形 成 HCV-1b 孔板条和 2a 孔板条， 将待测 HCV 血清分别加入两孔内， 利用间接 ELISA 法检测 HCV 血清于上述两种抗原的反应性， 根据每份血清与 HCV-1b 和 2a 抗原孔反应的 OD 比值判 断 HCV 的血清型， 当 OD-1b/OD-2a 之间的比值大于等于 1 肝炎病毒血清型为 1b 型， 否则为 2a 型。
本发明是建立在对 HCV 膜区抗原表位和分子进化分析的基础上
目前， HCV 血清分型试剂中主要采用的是 C 区和 NS4 区型别特异性抗原， 在至今未 见对 HCV-E1 区型别特异性抗原的报道。本发明在对 HCV 膜区抗原表位进行生物信息学分 析的基础上， 筛选主要的抗原表位区间 ； 进一步采用分子进化的方法对上述抗原序列进行 同源比较， 筛选其中的主序列， 并通过血清学检测验证筛选表位的抗原性。
同时， 本发明发明是建立在含有 HCV 联合多区段型别特异性嵌合抗原基础之上。
目前国际上广泛采用的 HCV 分型检测试剂均是建立在单抗原检测的基础上， 其试 剂盒包被抗原只有 C 区或 NS4 区中的一种， 由于感染者对 HCV 不同区段的抗体的产生情况 并不相同， 因此， 采用单一抗原对 HCV 型别特异性抗体进行检测存在检出率低的问题。故本 发明采用基因融合的方法， 将 C、 NS4、 E1 区进行多表位嵌合表达， 在此基础上建立 HCV 血清 分型技术， 获得较单一抗原检测更高的血清分型率。
本发明首先利用生物信息学软件分析丙型肝炎病毒 E1、 NS4 区型别特异性抗原表 位， 并利用多序列比较分析其中的共同序列， 作为型别特异性抗原表位 ； 由于 C 区型别特异 性表位明确， 可直接采用多序列比较分析获得其型别特异性抗原即可。HCV-C、 NS4、 E1 三个 区段的 1b、 2a 型别特异性抗原其氨基酸序列如序列 1- 序列 10 所示。
采用合成肽技术合成上述 E1 抗原表位， 分别包被酶联板， 采用 30 分阳性血清对其 抗原表位的抗原性进行分析， 选择其中高抗原活性的 E1 多肽。
将 1b 及 2a 型别特异性抗原按 C、 E1、 NS4 区的顺序进行串联后， 采用大肠杆菌优势 密码子获得嵌合 1b、 2a 型别特异性抗原基因序列， 采用退火延伸 PCR 法获得嵌合 1b、 2a 型 别特异性抗原基因， 插入 pGEX-4T-2 载体。 测序法鉴定阳性克隆， 并保存菌种。 大量培养后， IPTG 诱导后， 采用亲和层析法和葡聚糖凝胶法纯化相应的嵌合抗原。嵌合抗原的氨基酸序 列分别如序列表中序列 11、 12 所示， 即
11 ： AIIPDREVLYQEFDEMYEVRNVSGVYHVTNDCSNSKARRPEGRTWAQPGY
12 ： VVAPDKEVLYEAFDEMVEVRNISSSYYATNDCSNNKDRRSTGKSWGKPGY
以上述嵌合抗原包被酶联板， 检测每份 HCV 血清与 1b 及 2a 型别特异性抗原， 根据 OD-1b 与 OD-2a 的双孔测试的比值判断 HCV 的血清型。
实验结果证明， 本发明所提供的 HCV 的血清分型检测试剂能正确检测 34 份 1b 血 清中 29 份， 16 份 2a 血清中的 9 份， 仅有 2 份 1b 血清和 3 份 2a 血清未进行分型， 总体分型 率达到 90％， 正确率为 85％， 均高于活接近国外报道。显示 HCV 的血清分型检测试剂具有 较高的正确率和分型率， 在我国 HCV 临床治疗评价具有一定的应用价值。附图说明
图 1 是 HCV-E1 区序列的抗原表位的生物信息学分析 图 2HCV-NS4 区序列的抗原表位的生物信息学分析 图 3HCV 纯化重组表位抗原 SDS-PAGE 鉴定结果具体实施方式
以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式。
本发明是通过以下技术方案得以实现的 ：
用生物信息学软件对 HCV 抗原 E1、 NS4 区表位进行预测， 确定 E1、 NS4 区主要的抗 原表位的氨基酸位置 ； 采用分子进化软件对比抗原序列， 获得相应的 1b、 2a 型别特异性序 列； 由于 C 区抗原表位明确， 直接采用分子进化软件分析其型别特异性抗原即可。 利用合成 多肽和 30 份 HCV 内质控血清对上述多肽的抗原性进行鉴定， 选择其中高抗原活性的 E1 多 肽， 并按 C、 E1、 NS4 区的顺序串联 1b、 2a 型别特异性嵌合抗原。
本发明为了有利于 1b、 2a 型别特异性嵌合抗原基因在 E.coli 中获得高效的表达， 选择大肠杆菌的偏性密码子设计并合成嵌合抗原基因 ； 为了便于基因克隆到表达载体， 在 连接臂的两端引入 BamHI 和 EcoRI 两个酶切位点， 以适合表达载体 pGEX-4T-2( 参见中国专 利 ZL00100695.9 ： 表达载体 pBVIL1 及其构建方法和用途 )。双酶切后插入载体 pGEX-4T-2 中， 构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合抗原表达质粒， 转化 E.coli HB101 后， 通过热诱导培 养， 取全菌液进行 SDS-PAGE 鉴定， 证明各表达质粒均已获得了高效的表达， 再经采用亲和 层析及凝胶过滤纯化， 均可获得电泳纯的 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合抗原纯品。用 ELISA 检测 HCV 感染者血清与上述 2 种抗原与之间的反应性， 并根据每份血清与 HCV1b、 2a 型别特 异性抗原之间双孔测试的比值判断 HCV 的血清型。
步骤 1、 HCV 型别特异性抗原表位的选择
我们通过生物信息学软件对 HCV-E1 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 1 所 示， 含有 192-207aa、 292-312aa 和 310-331aa 共 3 个主要的抗原区段， 采用 CLUSTAL W(1.8) multiple sequence alignment 对比获得其型别特异性序列分别如如下序列 1- 序列 6 所 示。
通过生物信息学软件对 HCV-NS4 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 2 所示， 其 抗原表位主要位于 1693-1708aa， 采用 CLUSTAL W(1.8)multiple sequencealignment 对比 获得其型别特异性序列分别如序列 7 和序列 8 所示 ； C 区抗原表位主明确位于 65-81aa， 直 接采用 CLUSTAL W 分析其型别特异性抗原序列如序列 9 和序列 10 所示。
序列 1-10 如下所示 ：
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7： VVAPDKEVLYEAFDFM
8： AIIPDREVLYQEFDEM
9： KARRPEGRTWAQPGY
10 ： KDRRSTGKSWGKPGY
采用合成肽技术合成上述 HCV-E1 区 6 条型别特异性多肽， 包被酶联板，
步骤 2、 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的克隆与表达
1.HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.1HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原基因的合成
根据上述 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的氨基酸序列， 采用大肠杆菌优 势密码子委托上海英骏生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。
1.2HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.2.1PCR 产物及表达载体 pGEX-4T-2 双酶切
取以上合成基因产物及 pGEX-4T-2 表达载体各 30μl 分别放于 Eeppendorf 离心 管中， 各加入 10×buffer(H)4μl、 BamH I(10u/μl) 和 EcoR I(12u/μl) 各 1μl， 加灭菌 蒸馏水至 40μl， 置 37℃水浴酶切过夜。 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收 ： PCR 产物及载体 pBVIL1 经双酶切后， 用 1.2％琼脂糖凝胶进行纯化， 具体方法按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行。 纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收 ： 即在紫外灯下分 别切下含质粒和目的基因的琼脂糖， 放于 Eeppendorf 离心管中， 各加入 S1 液， 置 55℃水浴 10 分钟使胶溶解， 加入等量异丙醇， 混匀， 55℃温浴 1 分钟， 然后分别移入吸附柱后， 按试剂 盒说明书进行纯化。
1.2.2 连接 ： 于灭菌 Eeppendorf 离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因 各 1μl、 10×T4DNA Ligase buffer 1μl、 T4DNA Ligase(12u/ul)1μl， 加灭菌蒸馏水至 10μl， 置 16℃过夜。
1.2.3 转化 ： 在超净工作台中， 用无菌吸头取 100μl 感受态细胞 ( 感受态细胞按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行 ) 悬液于 Eppendorf 中， 加入上述连接物 5μl， 轻轻旋转混匀， 冰浴 30 分。立即转移到 42℃水浴中放置 2 分钟， 每管加入 0.5ml LB 培养基 ( 不加抗生素 )， 30℃水浴摇床培养 60 分钟后， 各取 0.2ml 分别涂于 LB 琼脂培养基 平皿上 ( 含抗生素 )， 室温晾干后， 置 37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落， 分别接种 于 LB 中 (5ml/ 管 )， 培养过夜， 次日各取 0.1ml 转移到 LB 中 (2ml/ 管 )， 32℃培养 3 小时， 42℃水浴摇床中诱导培养 4h， 收菌， 用 SDS-PAGE 鉴定， 选择目的基因获得高表达菌株， 并测 序鉴定。
2. 抗原的表达与纯化
2.1 表达菌株的培养 ： 取 -70℃保存的表达菌株 20μl 接种于 LB 培养基中 (100ml LB/500ml 三角瓶 )， 30℃空气摇床培养过夜， 次日按 5％的比例转种于 LB 培养基 ( 同上 )， 30℃空气摇床培养约 3 小时， 当 OD600 值达到 0.7 时， 立即将培养瓶转到 42℃水浴摇床中， 诱导培养 4 小时。将菌液合并， 6000rpm 离心 20 分钟， 弃上清， 收集沉淀部分。
2.2 提取包涵体 ： 将沉淀称湿重， 用 10 倍体积的 20mmol/L pH8.0TE 缓冲液将沉淀 悬起， 加入溶菌酶 (1mg/ml 悬液 )， 在室温下磁力搅拌 10 分钟。 在冰浴中超声波破碎菌， 每次
超 30 秒钟， 间隔 30 秒钟， 共超 10 次。8℃， 1,2000rpm， 离心 20 分钟， 弃上清， 沉淀用 1mol/ L NaCl( 用 TE 配制 ) 洗一次， 再用 TE 洗 2 次， 收集沉淀。沉淀用 8M 脲 ( 用 PH8.0TE 配制 ) 溶解， 加 1％ β- 巯基乙醇。再于 20℃， 1,2000rpm， 离心 10 分钟， 去沉淀取上清。
2.3 纯化 ： 将上述溶解的包涵体溶液过 Q-Sepharose FF 阴离子交换柱， 用平衡液 (pH8.0， 20mmol/L TE 含 6mol/L 脲， 0.1％ β- 巯基乙醇 ) 清洗后， 用不同浓度的 NaCl( 用 平衡液配制 ) 洗脱， 收集各洗脱峰， 经 SDS-PAGE 鉴定， 收集 0.05mol/L NaCl 洗脱峰。再过 Sephardex G-50 凝胶过滤柱， 收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用 SDS-PAGE 鉴 定， 结果如附图 3。
步骤 3 嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原在血清分型检测中的应用
分别采用嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原包被酶联板， 形成 HCV-1b 孔板条和 2a 孔板 条， 将待测 HCV 血清分别加入两孔内， 利用间接 ELISA 法检测 HCV 血清于上述两种抗原的反 应性， 根据每份血清与 HCV-1b 和 2a 抗原孔反应的 OD 比值判断 HCV 的血清型。当 OD-1b/ OD-2a 之间的比值大于等于 1 为 1b 型， 否则为 2a 型。
采用上述方法对 34 份 HCV-1b 和 9 份 2a 血清进行血清分型， 结果如表 1 所示 ： HCV 的血清分型检测试剂能正确检测中 29 份 HCV-1b 血清和 9 份 HCV-2a 血清， 仅有 2 份 1b 血 清和 3 份 2a 血清未进行分型， 总体分型率达到 90％ (45/50)， 正确率为 85％ (38/45)， 均高 于或接近国外报道， 提示本发明提出的 HCV 的血清分型检测试剂具有较高的正确率和分型 率， 在我国 HCV 临床治疗评价具有一定的应用价值。
背景技术 丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus， HCV) 是引起输血后病毒性非甲非乙型肝炎的 主要病原， 主要通过输血、 静脉吸毒传播， 也可通过密切接触和母婴传播。目前全世界约有 1.7 亿 HCV 感染者。一般地， 15 ～ 20％左右的 HCV 感染者为自限性感染， 超过 80 ～ 85％的 感染者发展为慢性丙型肝炎， 其中又有 20％的可发展为肝纤维化， 最终有 4 ～ 5％的肝纤维 化患者发生肝细胞性肝癌， 危害十分严重。
HCV 基因组全长 9400nt， 共编码 C、 E1、 E2、 NS3、 NS4、 NS5 等蛋白。目前， 慢性丙型 肝炎主要治疗方案是干扰素加利巴韦林联合治疗。治疗前应进行 HCV RNA 基因分型 (1 型 和非 1 型 ) 和血中 HCV RNA 定量， 以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量。因此， HCV 基因型的检测在慢性丙型肝炎的治疗中具有重要作用。
由于 HCV 基因组具有极高的变异性， 根据选择的区段的不同， 不同学者采用不同 的 HCV 分型方法， 命名也不尽相同。一般说， 国际上通常采用的分型方法有两种， 一种是 Simmonds 基因分型法， 主要是采用测序法分析 NS5 区 222bp 的变异情况， 将 HCV 基因型分为 1a、 1b、 1c、 2a、 2b、 2c、 3a、 3b、 4a、 5a、 6a 等 6 个主要的基因型和 11 个亚型， 伴随大量新 HCV 基 因的克隆测序工作的进行， 目前， HCV 已经发现有 30 多个亚型 ； 另一种是 Okamoto 基因分型 法， 主要采用型特异性引物扩增 C 区基因， 根据扩增片断的长度， 将 HCV 分为 I-IV 四个主要 的基因型。 不同分型方法之间有一定的关联性， 象 Simmonds 确定的 1b 亚型相当于 Okamoto 分型的 II 型 ； 而 2a 亚型相当于 III 型。除此以外， 对 E1 区的测序分析可以正确的区分 I/1a、 II/1b、 III/2a、 IV/2b、 2c(V)、 3a、 4a、 4b、 4c、 4d、 5a、 6a 共 12 种不同的基因型或亚型。 临床研究显示 ： 1b 型 HCV 感染者 IFN 疗效较差， 而 2a 型感染者 IFN 敏感性较好。来自流行 病学的研究显示， 在我国， 1b、 2a 两种亚型感染率接近 97％， 因此， 如何区分 1b、 2a 感染在我 国临床 HCV 治疗中具有独特的重要作用。
目前， 对 HCV 基因分型的方法除了序列分析法外， 还增加了型特异性引物 PCR 扩增 法、 型特异性探针杂交法、 限制酶切多态性分析等方法， 尽管后续方法降低了测序费用及缩 短了检测时间， 但仍需要 HCV 基因提取等过程， 一般实验室难以开展。另外， 当 HCV-RNA 阴 性或由于保存不当及处理过程中 HCV-RNA 遭到破坏时， 则不能进行基因分型。
鉴于上述情况， 有些学者提出了血清学分型， 即筛选 HCV 各基因型特异性抗原表 位， 合成相应多肽， 采用间接酶联免疫技术， 根据患者体内型特异性抗体的存在情况， 进行 HCV 的血清学分型。目前， 日本学者根据不同 HCV 基因型中 C 区氨基酸序列的差异， 人工合 成 2 条多肽， 血清 1 型多肽代表 Okamoto 分型的 I 和 II 型 (Simmonds 分型的 1a、 1b)， 血清 2 号多肽代表 Okamoto 分型的 III 和 IV 型 (Simmonds 分型的 2a、 2b)， 基于 C 区的血清分型 与基因分型具有较高的符合率， 但分型率只有 45％， 但具有很高的特异性 ； 基于 NS4 血清分
HCV 基因组全长 9400nt， 共编码 C、 E1、 E2、 NS3、 NS4、 NS5 等蛋白。目前， 慢性丙型 肝炎主要治疗方案是干扰素加利巴韦林联合治疗。治疗前应进行 HCV RNA 基因分型 (1 型 和非 1 型 ) 和血中 HCV RNA 定量， 以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量。因此， HCV 基因型的检测在慢性丙型肝炎的治疗中具有重要作用。
由于 HCV 基因组具有极高的变异性， 根据选择的区段的不同， 不同学者采用不同 的 HCV 分型方法， 命名也不尽相同。一般说， 国际上通常采用的分型方法有两种， 一种是 Simmonds 基因分型法， 主要是采用测序法分析 NS5 区 222bp 的变异情况， 将 HCV 基因型分为 1a、 1b、 1c、 2a、 2b、 2c、 3a、 3b、 4a、 5a、 6a 等 6 个主要的基因型和 11 个亚型， 伴随大量新 HCV 基 因的克隆测序工作的进行， 目前， HCV 已经发现有 30 多个亚型 ； 另一种是 Okamoto 基因分型 法， 主要采用型特异性引物扩增 C 区基因， 根据扩增片断的长度， 将 HCV 分为 I-IV 四个主要 的基因型。 不同分型方法之间有一定的关联性， 象 Simmonds 确定的 1b 亚型相当于 Okamoto 分型的 II 型 ； 而 2a 亚型相当于 III 型。除此以外， 对 E1 区的测序分析可以正确的区分 I/1a、 II/1b、 III/2a、 IV/2b、 2c(V)、 3a、 4a、 4b、 4c、 4d、 5a、 6a 共 12 种不同的基因型或亚型。 临床研究显示 ： 1b 型 HCV 感染者 IFN 疗效较差， 而 2a 型感染者 IFN 敏感性较好。来自流行 病学的研究显示， 在我国， 1b、 2a 两种亚型感染率接近 97％， 因此， 如何区分 1b、 2a 感染在我 国临床 HCV 治疗中具有独特的重要作用。
目前， 对 HCV 基因分型的方法除了序列分析法外， 还增加了型特异性引物 PCR 扩增 法、 型特异性探针杂交法、 限制酶切多态性分析等方法， 尽管后续方法降低了测序费用及缩 短了检测时间， 但仍需要 HCV 基因提取等过程， 一般实验室难以开展。另外， 当 HCV-RNA 阴 性或由于保存不当及处理过程中 HCV-RNA 遭到破坏时， 则不能进行基因分型。
鉴于上述情况， 有些学者提出了血清学分型， 即筛选 HCV 各基因型特异性抗原表 位， 合成相应多肽， 采用间接酶联免疫技术， 根据患者体内型特异性抗体的存在情况， 进行 HCV 的血清学分型。目前， 日本学者根据不同 HCV 基因型中 C 区氨基酸序列的差异， 人工合 成 2 条多肽， 血清 1 型多肽代表 Okamoto 分型的 I 和 II 型 (Simmonds 分型的 1a、 1b)， 血清 2 号多肽代表 Okamoto 分型的 III 和 IV 型 (Simmonds 分型的 2a、 2b)， 基于 C 区的血清分型 与基因分型具有较高的符合率， 但分型率只有 45％， 但具有很高的特异性 ； 基于 NS4 血清分
型试剂可以检测 1-6 型， 分型率为 83％ ； 与基因分型的符合率为 87％， 目前， Murex 已经推 出 NS4 血清分型的商品化试剂， 但价格昂贵， 且结果判断复杂。
造成血清分型率低的原因主要在于单独使用 C 区、 NS4 抗原进行血清学分型， 其抗 体检出率偏低。事实上， HCV 感染者体内针对 HCV 病毒产生的抗体情况十分复杂， 存在针对 多个不同区的抗体， 因此， HCV 诊断通常通过采用多抗体联合诊断的手段提高 HCV 抗体的检 出率。而近些年对膜区 E1、 E2 抗原的研究进展， 超过 90％以上的 HCV 慢性感染者体内都存 在针对膜区的抗体， 但由于 E1、 E2 抗原难以大量纯化， 直接影响膜区抗体在 HCV 检测中的应 用， 也影响其在 HCV 血清分型中的进一步应用。
C 区型别特异性抗原表位的位置主要位于 65-81aa 区间， 但不同研究中选择的序 列并不相同， 缺少进一步核实 ； NS4 型别特异性抗原表位的位置并不固定， 其大体范围位于 1690-1711 范围类， 有 15-21 个氨基酸组成， 尚需要对其型别特异性表位进行精确分析。而 关于膜区型别特性抗原的鉴定至今未见报道。
为了提高 HCV 血清分型的分型率， 本研究在对 C、 NS4、 E1 型别特异性抗原表位进行 分析鉴定的基础上， 利用基因序列拼接技术， 克隆表达含有 C、 NS4、 E1 三个区段的融合型别 特异性抗原， 并再此基础上采用双孔测试酶联法对 HCV 血清进行分型。 发明内容 为了解决 HCV 基因分型技术难以用于临床的目的， 本发明提供一种建立在免疫酶 联检测技术基础之上的 HCV 血清分型技术。为了提高 HCV 血清分型的分型率， 本发明公开 了一种基于嵌合多区段型别特异性抗原进行多表位 HCV 血清分型的方法， 克服了原有技术 中单独使用 C 区、 NS4 抗原造成的检出率偏低的问题。本发明除了对现有 HCV 血清分型通 常采用的 C、 NS4 型别特异性抗原表位进行分析鉴定外， 还增加了对 E1 型别特异性抗原表位 筛选， 利用基因序列拼接技术， 克隆表达含有 C、 NS4、 E1 三个区段的嵌合型别特异性抗原， 并在此基础上建立多表位 HCV 血清分型技术， 提高 HCV 血清分型的分型率。
本发明提供一种丙型肝炎病毒 (HCV) 的 1b、 2a 型别特异性的多表位嵌合抗原， 其 特征在于， 所述 1b 型别抗原 E1 区段包含氨基酸序列 1、 3、 5， 同时所述 2a 型别抗原 E1 区段 包含氨基酸序列 2、 4、 6， 即，
1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS
2VEVRNISSSYYATNDCSNN
3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA
4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT
5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT
6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH
所述 1b 型别抗原 NS4 区段包含氨基酸序列 7， 同时所述 2a 型别抗原 NS4 区段包含 序列 8， 即，
7VVAPDKEVLYEAFDEM
8AIIPDREVLYQEFDEM
所述 1b 型别抗原 C 区段包含氨基酸序列 9， 同时所述 2a 型别抗原序列 10， 即，
9KARRPEGRTWAQPGY
本发明提供一种丙型肝炎病毒 (HCV) 的 1b、 2a 型别特异性的多表位嵌合抗原， 其 特征在于， 所述 1b 型别抗原 E1 区段包含氨基酸序列 1、 3、 5， 同时所述 2a 型别抗原 E1 区段 包含氨基酸序列 2、 4、 6， 即，
1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS
2VEVRNISSSYYATNDCSNN
3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA
4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT
5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT
6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH
所述 1b 型别抗原 NS4 区段包含氨基酸序列 7， 同时所述 2a 型别抗原 NS4 区段包含 序列 8， 即，
7VVAPDKEVLYEAFDEM
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所述 1b 型别抗原 C 区段包含氨基酸序列 9， 同时所述 2a 型别抗原序列 10， 即，
9KARRPEGRTWAQPGY
10KDRRSTGKSWGKPGY。
本发明还提供一种一种利用如上所述抗原进行丙型肝炎病毒 (HVC) 血清分型检 测的方法， 利用所述 1b 型别抗原和 2a 型别抗原分别形成抗原包被酶联板， 并进一步分别形 成 HCV-1b 孔板条和 2a 孔板条， 将待测 HCV 血清分别加入两孔内， 利用间接 ELISA 法检测 HCV 血清于上述两种抗原的反应性， 根据每份血清与 HCV-1b 和 2a 抗原孔反应的 OD 比值判 断 HCV 的血清型， 当 OD-1b/OD-2a 之间的比值大于等于 1 肝炎病毒血清型为 1b 型， 否则为 2a 型。
本发明是建立在对 HCV 膜区抗原表位和分子进化分析的基础上
目前， HCV 血清分型试剂中主要采用的是 C 区和 NS4 区型别特异性抗原， 在至今未 见对 HCV-E1 区型别特异性抗原的报道。本发明在对 HCV 膜区抗原表位进行生物信息学分 析的基础上， 筛选主要的抗原表位区间 ； 进一步采用分子进化的方法对上述抗原序列进行 同源比较， 筛选其中的主序列， 并通过血清学检测验证筛选表位的抗原性。
同时， 本发明发明是建立在含有 HCV 联合多区段型别特异性嵌合抗原基础之上。
目前国际上广泛采用的 HCV 分型检测试剂均是建立在单抗原检测的基础上， 其试 剂盒包被抗原只有 C 区或 NS4 区中的一种， 由于感染者对 HCV 不同区段的抗体的产生情况 并不相同， 因此， 采用单一抗原对 HCV 型别特异性抗体进行检测存在检出率低的问题。故本 发明采用基因融合的方法， 将 C、 NS4、 E1 区进行多表位嵌合表达， 在此基础上建立 HCV 血清 分型技术， 获得较单一抗原检测更高的血清分型率。
本发明首先利用生物信息学软件分析丙型肝炎病毒 E1、 NS4 区型别特异性抗原表 位， 并利用多序列比较分析其中的共同序列， 作为型别特异性抗原表位 ； 由于 C 区型别特异 性表位明确， 可直接采用多序列比较分析获得其型别特异性抗原即可。HCV-C、 NS4、 E1 三个 区段的 1b、 2a 型别特异性抗原其氨基酸序列如序列 1- 序列 10 所示。
采用合成肽技术合成上述 E1 抗原表位， 分别包被酶联板， 采用 30 分阳性血清对其 抗原表位的抗原性进行分析， 选择其中高抗原活性的 E1 多肽。
将 1b 及 2a 型别特异性抗原按 C、 E1、 NS4 区的顺序进行串联后， 采用大肠杆菌优势 密码子获得嵌合 1b、 2a 型别特异性抗原基因序列， 采用退火延伸 PCR 法获得嵌合 1b、 2a 型 别特异性抗原基因， 插入 pGEX-4T-2 载体。 测序法鉴定阳性克隆， 并保存菌种。 大量培养后， IPTG 诱导后， 采用亲和层析法和葡聚糖凝胶法纯化相应的嵌合抗原。嵌合抗原的氨基酸序 列分别如序列表中序列 11、 12 所示， 即
11 ： AIIPDREVLYQEFDEMYEVRNVSGVYHVTNDCSNSKARRPEGRTWAQPGY
12 ： VVAPDKEVLYEAFDEMVEVRNISSSYYATNDCSNNKDRRSTGKSWGKPGY
以上述嵌合抗原包被酶联板， 检测每份 HCV 血清与 1b 及 2a 型别特异性抗原， 根据 OD-1b 与 OD-2a 的双孔测试的比值判断 HCV 的血清型。
实验结果证明， 本发明所提供的 HCV 的血清分型检测试剂能正确检测 34 份 1b 血 清中 29 份， 16 份 2a 血清中的 9 份， 仅有 2 份 1b 血清和 3 份 2a 血清未进行分型， 总体分型 率达到 90％， 正确率为 85％， 均高于活接近国外报道。显示 HCV 的血清分型检测试剂具有 较高的正确率和分型率， 在我国 HCV 临床治疗评价具有一定的应用价值。附图说明
图 1 是 HCV-E1 区序列的抗原表位的生物信息学分析 图 2HCV-NS4 区序列的抗原表位的生物信息学分析 图 3HCV 纯化重组表位抗原 SDS-PAGE 鉴定结果具体实施方式
以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式。
本发明是通过以下技术方案得以实现的 ：
用生物信息学软件对 HCV 抗原 E1、 NS4 区表位进行预测， 确定 E1、 NS4 区主要的抗 原表位的氨基酸位置 ； 采用分子进化软件对比抗原序列， 获得相应的 1b、 2a 型别特异性序 列； 由于 C 区抗原表位明确， 直接采用分子进化软件分析其型别特异性抗原即可。 利用合成 多肽和 30 份 HCV 内质控血清对上述多肽的抗原性进行鉴定， 选择其中高抗原活性的 E1 多 肽， 并按 C、 E1、 NS4 区的顺序串联 1b、 2a 型别特异性嵌合抗原。
本发明为了有利于 1b、 2a 型别特异性嵌合抗原基因在 E.coli 中获得高效的表达， 选择大肠杆菌的偏性密码子设计并合成嵌合抗原基因 ； 为了便于基因克隆到表达载体， 在 连接臂的两端引入 BamHI 和 EcoRI 两个酶切位点， 以适合表达载体 pGEX-4T-2( 参见中国专 利 ZL00100695.9 ： 表达载体 pBVIL1 及其构建方法和用途 )。双酶切后插入载体 pGEX-4T-2 中， 构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合抗原表达质粒， 转化 E.coli HB101 后， 通过热诱导培 养， 取全菌液进行 SDS-PAGE 鉴定， 证明各表达质粒均已获得了高效的表达， 再经采用亲和 层析及凝胶过滤纯化， 均可获得电泳纯的 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合抗原纯品。用 ELISA 检测 HCV 感染者血清与上述 2 种抗原与之间的反应性， 并根据每份血清与 HCV1b、 2a 型别特 异性抗原之间双孔测试的比值判断 HCV 的血清型。
步骤 1、 HCV 型别特异性抗原表位的选择
我们通过生物信息学软件对 HCV-E1 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 1 所 示， 含有 192-207aa、 292-312aa 和 310-331aa 共 3 个主要的抗原区段， 采用 CLUSTAL W(1.8) multiple sequence alignment 对比获得其型别特异性序列分别如如下序列 1- 序列 6 所 示。
通过生物信息学软件对 HCV-NS4 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 2 所示， 其 抗原表位主要位于 1693-1708aa， 采用 CLUSTAL W(1.8)multiple sequencealignment 对比 获得其型别特异性序列分别如序列 7 和序列 8 所示 ； C 区抗原表位主明确位于 65-81aa， 直 接采用 CLUSTAL W 分析其型别特异性抗原序列如序列 9 和序列 10 所示。
序列 1-10 如下所示 ：
1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS
2VEVRNISSSYYATNDCSNN
3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA
4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT
5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT
6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH
7： VVAPDKEVLYEAFDFM
8： AIIPDREVLYQEFDEM
9： KARRPEGRTWAQPGY
10 ： KDRRSTGKSWGKPGY
采用合成肽技术合成上述 HCV-E1 区 6 条型别特异性多肽， 包被酶联板，
步骤 2、 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的克隆与表达
1.HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.1HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原基因的合成
根据上述 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的氨基酸序列， 采用大肠杆菌优 势密码子委托上海英骏生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。
1.2HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.2.1PCR 产物及表达载体 pGEX-4T-2 双酶切
取以上合成基因产物及 pGEX-4T-2 表达载体各 30μl 分别放于 Eeppendorf 离心 管中， 各加入 10×buffer(H)4μl、 BamH I(10u/μl) 和 EcoR I(12u/μl) 各 1μl， 加灭菌 蒸馏水至 40μl， 置 37℃水浴酶切过夜。 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收 ： PCR 产物及载体 pBVIL1 经双酶切后， 用 1.2％琼脂糖凝胶进行纯化， 具体方法按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行。 纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收 ： 即在紫外灯下分 别切下含质粒和目的基因的琼脂糖， 放于 Eeppendorf 离心管中， 各加入 S1 液， 置 55℃水浴 10 分钟使胶溶解， 加入等量异丙醇， 混匀， 55℃温浴 1 分钟， 然后分别移入吸附柱后， 按试剂 盒说明书进行纯化。
1.2.2 连接 ： 于灭菌 Eeppendorf 离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因 各 1μl、 10×T4DNA Ligase buffer 1μl、 T4DNA Ligase(12u/ul)1μl， 加灭菌蒸馏水至 10μl， 置 16℃过夜。
1.2.3 转化 ： 在超净工作台中， 用无菌吸头取 100μl 感受态细胞 ( 感受态细胞按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行 ) 悬液于 Eppendorf 中， 加入上述连接物 5μl， 轻轻旋转混匀， 冰浴 30 分。立即转移到 42℃水浴中放置 2 分钟， 每管加入 0.5ml LB 培养基 ( 不加抗生素 )， 30℃水浴摇床培养 60 分钟后， 各取 0.2ml 分别涂于 LB 琼脂培养基 平皿上 ( 含抗生素 )， 室温晾干后， 置 37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落， 分别接种 于 LB 中 (5ml/ 管 )， 培养过夜， 次日各取 0.1ml 转移到 LB 中 (2ml/ 管 )， 32℃培养 3 小时， 42℃水浴摇床中诱导培养 4h， 收菌， 用 SDS-PAGE 鉴定， 选择目的基因获得高表达菌株， 并测 序鉴定。
2. 抗原的表达与纯化
2.1 表达菌株的培养 ： 取 -70℃保存的表达菌株 20μl 接种于 LB 培养基中 (100ml LB/500ml 三角瓶 )， 30℃空气摇床培养过夜， 次日按 5％的比例转种于 LB 培养基 ( 同上 )， 30℃空气摇床培养约 3 小时， 当 OD600 值达到 0.7 时， 立即将培养瓶转到 42℃水浴摇床中， 诱导培养 4 小时。将菌液合并， 6000rpm 离心 20 分钟， 弃上清， 收集沉淀部分。
2.2 提取包涵体 ： 将沉淀称湿重， 用 10 倍体积的 20mmol/L pH8.0TE 缓冲液将沉淀 悬起， 加入溶菌酶 (1mg/ml 悬液 )， 在室温下磁力搅拌 10 分钟。 在冰浴中超声波破碎菌， 每次
超 30 秒钟， 间隔 30 秒钟， 共超 10 次。8℃， 1,2000rpm， 离心 20 分钟， 弃上清， 沉淀用 1mol/ L NaCl( 用 TE 配制 ) 洗一次， 再用 TE 洗 2 次， 收集沉淀。沉淀用 8M 脲 ( 用 PH8.0TE 配制 ) 溶解， 加 1％ β- 巯基乙醇。再于 20℃， 1,2000rpm， 离心 10 分钟， 去沉淀取上清。
2.3 纯化 ： 将上述溶解的包涵体溶液过 Q-Sepharose FF 阴离子交换柱， 用平衡液 (pH8.0， 20mmol/L TE 含 6mol/L 脲， 0.1％ β- 巯基乙醇 ) 清洗后， 用不同浓度的 NaCl( 用 平衡液配制 ) 洗脱， 收集各洗脱峰， 经 SDS-PAGE 鉴定， 收集 0.05mol/L NaCl 洗脱峰。再过 Sephardex G-50 凝胶过滤柱， 收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用 SDS-PAGE 鉴 定， 结果如附图 3。
步骤 3 嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原在血清分型检测中的应用
分别采用嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原包被酶联板， 形成 HCV-1b 孔板条和 2a 孔板 条， 将待测 HCV 血清分别加入两孔内， 利用间接 ELISA 法检测 HCV 血清于上述两种抗原的反 应性， 根据每份血清与 HCV-1b 和 2a 抗原孔反应的 OD 比值判断 HCV 的血清型。当 OD-1b/ OD-2a 之间的比值大于等于 1 为 1b 型， 否则为 2a 型。
采用上述方法对 34 份 HCV-1b 和 9 份 2a 血清进行血清分型， 结果如表 1 所示 ： HCV 的血清分型检测试剂能正确检测中 29 份 HCV-1b 血清和 9 份 HCV-2a 血清， 仅有 2 份 1b 血 清和 3 份 2a 血清未进行分型， 总体分型率达到 90％ (45/50)， 正确率为 85％ (38/45)， 均高 于或接近国外报道， 提示本发明提出的 HCV 的血清分型检测试剂具有较高的正确率和分型 率， 在我国 HCV 临床治疗评价具有一定的应用价值。
表 1HCV 抗体分型检测8101942021 A CN 101942026序列 序列表表1/4 页
本发明还提供一种一种利用如上所述抗原进行丙型肝炎病毒 (HVC) 血清分型检 测的方法， 利用所述 1b 型别抗原和 2a 型别抗原分别形成抗原包被酶联板， 并进一步分别形 成 HCV-1b 孔板条和 2a 孔板条， 将待测 HCV 血清分别加入两孔内， 利用间接 ELISA 法检测 HCV 血清于上述两种抗原的反应性， 根据每份血清与 HCV-1b 和 2a 抗原孔反应的 OD 比值判 断 HCV 的血清型， 当 OD-1b/OD-2a 之间的比值大于等于 1 肝炎病毒血清型为 1b 型， 否则为 2a 型。
本发明是建立在对 HCV 膜区抗原表位和分子进化分析的基础上
目前， HCV 血清分型试剂中主要采用的是 C 区和 NS4 区型别特异性抗原， 在至今未 见对 HCV-E1 区型别特异性抗原的报道。本发明在对 HCV 膜区抗原表位进行生物信息学分 析的基础上， 筛选主要的抗原表位区间 ； 进一步采用分子进化的方法对上述抗原序列进行 同源比较， 筛选其中的主序列， 并通过血清学检测验证筛选表位的抗原性。
同时， 本发明发明是建立在含有 HCV 联合多区段型别特异性嵌合抗原基础之上。
目前国际上广泛采用的 HCV 分型检测试剂均是建立在单抗原检测的基础上， 其试 剂盒包被抗原只有 C 区或 NS4 区中的一种， 由于感染者对 HCV 不同区段的抗体的产生情况 并不相同， 因此， 采用单一抗原对 HCV 型别特异性抗体进行检测存在检出率低的问题。故本 发明采用基因融合的方法， 将 C、 NS4、 E1 区进行多表位嵌合表达， 在此基础上建立 HCV 血清 分型技术， 获得较单一抗原检测更高的血清分型率。
本发明首先利用生物信息学软件分析丙型肝炎病毒 E1、 NS4 区型别特异性抗原表 位， 并利用多序列比较分析其中的共同序列， 作为型别特异性抗原表位 ； 由于 C 区型别特异 性表位明确， 可直接采用多序列比较分析获得其型别特异性抗原即可。HCV-C、 NS4、 E1 三个 区段的 1b、 2a 型别特异性抗原其氨基酸序列如序列 1- 序列 10 所示。
采用合成肽技术合成上述 E1 抗原表位， 分别包被酶联板， 采用 30 分阳性血清对其 抗原表位的抗原性进行分析， 选择其中高抗原活性的 E1 多肽。
将 1b 及 2a 型别特异性抗原按 C、 E1、 NS4 区的顺序进行串联后， 采用大肠杆菌优势 密码子获得嵌合 1b、 2a 型别特异性抗原基因序列， 采用退火延伸 PCR 法获得嵌合 1b、 2a 型 别特异性抗原基因， 插入 pGEX-4T-2 载体。 测序法鉴定阳性克隆， 并保存菌种。 大量培养后， IPTG 诱导后， 采用亲和层析法和葡聚糖凝胶法纯化相应的嵌合抗原。嵌合抗原的氨基酸序 列分别如序列表中序列 11、 12 所示， 即
11 ： AIIPDREVLYQEFDEMYEVRNVSGVYHVTNDCSNSKARRPEGRTWAQPGY
12 ： VVAPDKEVLYEAFDEMVEVRNISSSYYATNDCSNNKDRRSTGKSWGKPGY
以上述嵌合抗原包被酶联板， 检测每份 HCV 血清与 1b 及 2a 型别特异性抗原， 根据 OD-1b 与 OD-2a 的双孔测试的比值判断 HCV 的血清型。
实验结果证明， 本发明所提供的 HCV 的血清分型检测试剂能正确检测 34 份 1b 血 清中 29 份， 16 份 2a 血清中的 9 份， 仅有 2 份 1b 血清和 3 份 2a 血清未进行分型， 总体分型 率达到 90％， 正确率为 85％， 均高于活接近国外报道。显示 HCV 的血清分型检测试剂具有 较高的正确率和分型率， 在我国 HCV 临床治疗评价具有一定的应用价值。附图说明
图 1 是 HCV-E1 区序列的抗原表位的生物信息学分析 图 2HCV-NS4 区序列的抗原表位的生物信息学分析 图 3HCV 纯化重组表位抗原 SDS-PAGE 鉴定结果具体实施方式
以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式。
本发明是通过以下技术方案得以实现的 ：
用生物信息学软件对 HCV 抗原 E1、 NS4 区表位进行预测， 确定 E1、 NS4 区主要的抗 原表位的氨基酸位置 ； 采用分子进化软件对比抗原序列， 获得相应的 1b、 2a 型别特异性序 列； 由于 C 区抗原表位明确， 直接采用分子进化软件分析其型别特异性抗原即可。 利用合成 多肽和 30 份 HCV 内质控血清对上述多肽的抗原性进行鉴定， 选择其中高抗原活性的 E1 多 肽， 并按 C、 E1、 NS4 区的顺序串联 1b、 2a 型别特异性嵌合抗原。
本发明为了有利于 1b、 2a 型别特异性嵌合抗原基因在 E.coli 中获得高效的表达， 选择大肠杆菌的偏性密码子设计并合成嵌合抗原基因 ； 为了便于基因克隆到表达载体， 在 连接臂的两端引入 BamHI 和 EcoRI 两个酶切位点， 以适合表达载体 pGEX-4T-2( 参见中国专 利 ZL00100695.9 ： 表达载体 pBVIL1 及其构建方法和用途 )。双酶切后插入载体 pGEX-4T-2 中， 构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合抗原表达质粒， 转化 E.coli HB101 后， 通过热诱导培 养， 取全菌液进行 SDS-PAGE 鉴定， 证明各表达质粒均已获得了高效的表达， 再经采用亲和 层析及凝胶过滤纯化， 均可获得电泳纯的 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合抗原纯品。用 ELISA 检测 HCV 感染者血清与上述 2 种抗原与之间的反应性， 并根据每份血清与 HCV1b、 2a 型别特 异性抗原之间双孔测试的比值判断 HCV 的血清型。
步骤 1、 HCV 型别特异性抗原表位的选择
我们通过生物信息学软件对 HCV-E1 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 1 所 示， 含有 192-207aa、 292-312aa 和 310-331aa 共 3 个主要的抗原区段， 采用 CLUSTAL W(1.8) multiple sequence alignment 对比获得其型别特异性序列分别如如下序列 1- 序列 6 所 示。
通过生物信息学软件对 HCV-NS4 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 2 所示， 其 抗原表位主要位于 1693-1708aa， 采用 CLUSTAL W(1.8)multiple sequencealignment 对比 获得其型别特异性序列分别如序列 7 和序列 8 所示 ； C 区抗原表位主明确位于 65-81aa， 直 接采用 CLUSTAL W 分析其型别特异性抗原序列如序列 9 和序列 10 所示。
序列 1-10 如下所示 ：
1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS
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3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA
4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT
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步骤 1、 HCV 型别特异性抗原表位的选择
我们通过生物信息学软件对 HCV-E1 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 1 所 示， 含有 192-207aa、 292-312aa 和 310-331aa 共 3 个主要的抗原区段， 采用 CLUSTAL W(1.8) multiple sequence alignment 对比获得其型别特异性序列分别如如下序列 1- 序列 6 所 示。
通过生物信息学软件对 HCV-NS4 区序列的抗原表位进行预测， 结果如图 2 所示， 其 抗原表位主要位于 1693-1708aa， 采用 CLUSTAL W(1.8)multiple sequencealignment 对比 获得其型别特异性序列分别如序列 7 和序列 8 所示 ； C 区抗原表位主明确位于 65-81aa， 直 接采用 CLUSTAL W 分析其型别特异性抗原序列如序列 9 和序列 10 所示。
序列 1-10 如下所示 ：
1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS
2VEVRNISSSYYATNDCSNN
3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA
4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT
5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT
6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH
7： VVAPDKEVLYEAFDFM
8： AIIPDREVLYQEFDEM
9： KARRPEGRTWAQPGY
10 ： KDRRSTGKSWGKPGY
采用合成肽技术合成上述 HCV-E1 区 6 条型别特异性多肽， 包被酶联板，
步骤 2、 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的克隆与表达
1.HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.1HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原基因的合成
根据上述 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的氨基酸序列， 采用大肠杆菌优 势密码子委托上海英骏生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。
1.2HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.2.1PCR 产物及表达载体 pGEX-4T-2 双酶切
取以上合成基因产物及 pGEX-4T-2 表达载体各 30μl 分别放于 Eeppendorf 离心 管中， 各加入 10×buffer(H)4μl、 BamH I(10u/μl) 和 EcoR I(12u/μl) 各 1μl， 加灭菌 蒸馏水至 40μl， 置 37℃水浴酶切过夜。 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收 ： PCR 产物及载体 pBVIL1 经双酶切后， 用 1.2％琼脂糖凝胶进行纯化， 具体方法按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行。 纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收 ： 即在紫外灯下分 别切下含质粒和目的基因的琼脂糖， 放于 Eeppendorf 离心管中， 各加入 S1 液， 置 55℃水浴 10 分钟使胶溶解， 加入等量异丙醇， 混匀， 55℃温浴 1 分钟， 然后分别移入吸附柱后， 按试剂 盒说明书进行纯化。
1.2.2 连接 ： 于灭菌 Eeppendorf 离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因 各 1μl、 10×T4DNA Ligase buffer 1μl、 T4DNA Ligase(12u/ul)1μl， 加灭菌蒸馏水至 10μl， 置 16℃过夜。
1.2.3 转化 ： 在超净工作台中， 用无菌吸头取 100μl 感受态细胞 ( 感受态细胞按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行 ) 悬液于 Eppendorf 中， 加入上述连接物 5μl， 轻轻旋转混匀， 冰浴 30 分。立即转移到 42℃水浴中放置 2 分钟， 每管加入 0.5ml LB 培养基 ( 不加抗生素 )， 30℃水浴摇床培养 60 分钟后， 各取 0.2ml 分别涂于 LB 琼脂培养基 平皿上 ( 含抗生素 )， 室温晾干后， 置 37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落， 分别接种 于 LB 中 (5ml/ 管 )， 培养过夜， 次日各取 0.1ml 转移到 LB 中 (2ml/ 管 )， 32℃培养 3 小时， 42℃水浴摇床中诱导培养 4h， 收菌， 用 SDS-PAGE 鉴定， 选择目的基因获得高表达菌株， 并测 序鉴定。
2. 抗原的表达与纯化
2.1 表达菌株的培养 ： 取 -70℃保存的表达菌株 20μl 接种于 LB 培养基中 (100ml LB/500ml 三角瓶 )， 30℃空气摇床培养过夜， 次日按 5％的比例转种于 LB 培养基 ( 同上 )， 30℃空气摇床培养约 3 小时， 当 OD600 值达到 0.7 时， 立即将培养瓶转到 42℃水浴摇床中， 诱导培养 4 小时。将菌液合并， 6000rpm 离心 20 分钟， 弃上清， 收集沉淀部分。
2.2 提取包涵体 ： 将沉淀称湿重， 用 10 倍体积的 20mmol/L pH8.0TE 缓冲液将沉淀 悬起， 加入溶菌酶 (1mg/ml 悬液 )， 在室温下磁力搅拌 10 分钟。 在冰浴中超声波破碎菌， 每次
超 30 秒钟， 间隔 30 秒钟， 共超 10 次。8℃， 1,2000rpm， 离心 20 分钟， 弃上清， 沉淀用 1mol/ L NaCl( 用 TE 配制 ) 洗一次， 再用 TE 洗 2 次， 收集沉淀。沉淀用 8M 脲 ( 用 PH8.0TE 配制 ) 溶解， 加 1％ β- 巯基乙醇。再于 20℃， 1,2000rpm， 离心 10 分钟， 去沉淀取上清。
2.3 纯化 ： 将上述溶解的包涵体溶液过 Q-Sepharose FF 阴离子交换柱， 用平衡液 (pH8.0， 20mmol/L TE 含 6mol/L 脲， 0.1％ β- 巯基乙醇 ) 清洗后， 用不同浓度的 NaCl( 用 平衡液配制 ) 洗脱， 收集各洗脱峰， 经 SDS-PAGE 鉴定， 收集 0.05mol/L NaCl 洗脱峰。再过 Sephardex G-50 凝胶过滤柱， 收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用 SDS-PAGE 鉴 定， 结果如附图 3。
步骤 3 嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原在血清分型检测中的应用
分别采用嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原包被酶联板， 形成 HCV-1b 孔板条和 2a 孔板 条， 将待测 HCV 血清分别加入两孔内， 利用间接 ELISA 法检测 HCV 血清于上述两种抗原的反 应性， 根据每份血清与 HCV-1b 和 2a 抗原孔反应的 OD 比值判断 HCV 的血清型。当 OD-1b/ OD-2a 之间的比值大于等于 1 为 1b 型， 否则为 2a 型。
采用上述方法对 34 份 HCV-1b 和 9 份 2a 血清进行血清分型， 结果如表 1 所示 ： HCV 的血清分型检测试剂能正确检测中 29 份 HCV-1b 血清和 9 份 HCV-2a 血清， 仅有 2 份 1b 血 清和 3 份 2a 血清未进行分型， 总体分型率达到 90％ (45/50)， 正确率为 85％ (38/45)， 均高 于或接近国外报道， 提示本发明提出的 HCV 的血清分型检测试剂具有较高的正确率和分型 率， 在我国 HCV 临床治疗评价具有一定的应用价值。
表 1HCV 抗体分型检测8101942021 A CN 101942026序列 序列表表1/4 页
<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 <120> 一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用 <160>12 <210>1 <211>19 <212>PRT <213> 人类 <400>1 Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Ser Asn Ser <210>2 <211>19 <212>PRT <213> 人类 <400>2 Val Glu Val Arg Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr Asn Asp Cyx 1 5 10 15 Ser Asn Asn <210>3 <211>22 <212>PRT <213> 人类 <400>3 Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn 1 5 10 15 Trp Ser Pro Thr Thr Ala 20 <210>4 <211>22 <212>PRT <213> 人类9101942021 A CN 101942026
8： AIIPDREVLYQEFDEM
9： KARRPEGRTWAQPGY
10 ： KDRRSTGKSWGKPGY
采用合成肽技术合成上述 HCV-E1 区 6 条型别特异性多肽， 包被酶联板，
步骤 2、 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的克隆与表达
1.HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.1HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原基因的合成
根据上述 HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原的氨基酸序列， 采用大肠杆菌优 势密码子委托上海英骏生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。
1.2HCV-1b、 2a 型别特异性嵌合多表位抗原表达质粒的构建
1.2.1PCR 产物及表达载体 pGEX-4T-2 双酶切
取以上合成基因产物及 pGEX-4T-2 表达载体各 30μl 分别放于 Eeppendorf 离心 管中， 各加入 10×buffer(H)4μl、 BamH I(10u/μl) 和 EcoR I(12u/μl) 各 1μl， 加灭菌 蒸馏水至 40μl， 置 37℃水浴酶切过夜。 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收 ： PCR 产物及载体 pBVIL1 经双酶切后， 用 1.2％琼脂糖凝胶进行纯化， 具体方法按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行。 纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收 ： 即在紫外灯下分 别切下含质粒和目的基因的琼脂糖， 放于 Eeppendorf 离心管中， 各加入 S1 液， 置 55℃水浴 10 分钟使胶溶解， 加入等量异丙醇， 混匀， 55℃温浴 1 分钟， 然后分别移入吸附柱后， 按试剂 盒说明书进行纯化。
1.2.2 连接 ： 于灭菌 Eeppendorf 离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因 各 1μl、 10×T4DNA Ligase buffer 1μl、 T4DNA Ligase(12u/ul)1μl， 加灭菌蒸馏水至 10μl， 置 16℃过夜。
1.2.3 转化 ： 在超净工作台中， 用无菌吸头取 100μl 感受态细胞 ( 感受态细胞按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行 ) 悬液于 Eppendorf 中， 加入上述连接物 5μl， 轻轻旋转混匀， 冰浴 30 分。立即转移到 42℃水浴中放置 2 分钟， 每管加入 0.5ml LB 培养基 ( 不加抗生素 )， 30℃水浴摇床培养 60 分钟后， 各取 0.2ml 分别涂于 LB 琼脂培养基 平皿上 ( 含抗生素 )， 室温晾干后， 置 37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落， 分别接种 于 LB 中 (5ml/ 管 )， 培养过夜， 次日各取 0.1ml 转移到 LB 中 (2ml/ 管 )， 32℃培养 3 小时， 42℃水浴摇床中诱导培养 4h， 收菌， 用 SDS-PAGE 鉴定， 选择目的基因获得高表达菌株， 并测 序鉴定。
2. 抗原的表达与纯化
2.1 表达菌株的培养 ： 取 -70℃保存的表达菌株 20μl 接种于 LB 培养基中 (100ml LB/500ml 三角瓶 )， 30℃空气摇床培养过夜， 次日按 5％的比例转种于 LB 培养基 ( 同上 )， 30℃空气摇床培养约 3 小时， 当 OD600 值达到 0.7 时， 立即将培养瓶转到 42℃水浴摇床中， 诱导培养 4 小时。将菌液合并， 6000rpm 离心 20 分钟， 弃上清， 收集沉淀部分。
2.2 提取包涵体 ： 将沉淀称湿重， 用 10 倍体积的 20mmol/L pH8.0TE 缓冲液将沉淀 悬起， 加入溶菌酶 (1mg/ml 悬液 )， 在室温下磁力搅拌 10 分钟。 在冰浴中超声波破碎菌， 每次
1.2.2 连接 ： 于灭菌 Eeppendorf 离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因 各 1μl、 10×T4DNA Ligase buffer 1μl、 T4DNA Ligase(12u/ul)1μl， 加灭菌蒸馏水至 10μl， 置 16℃过夜。
1.2.3 转化 ： 在超净工作台中， 用无菌吸头取 100μl 感受态细胞 ( 感受态细胞按 《分子克隆》 ( 科学出版社， 第二版 ) 的方法进行 ) 悬液于 Eppendorf 中， 加入上述连接物 5μl， 轻轻旋转混匀， 冰浴 30 分。立即转移到 42℃水浴中放置 2 分钟， 每管加入 0.5ml LB 培养基 ( 不加抗生素 )， 30℃水浴摇床培养 60 分钟后， 各取 0.2ml 分别涂于 LB 琼脂培养基 平皿上 ( 含抗生素 )， 室温晾干后， 置 37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落， 分别接种 于 LB 中 (5ml/ 管 )， 培养过夜， 次日各取 0.1ml 转移到 LB 中 (2ml/ 管 )， 32℃培养 3 小时， 42℃水浴摇床中诱导培养 4h， 收菌， 用 SDS-PAGE 鉴定， 选择目的基因获得高表达菌株， 并测 序鉴定。
2. 抗原的表达与纯化
2.1 表达菌株的培养 ： 取 -70℃保存的表达菌株 20μl 接种于 LB 培养基中 (100ml LB/500ml 三角瓶 )， 30℃空气摇床培养过夜， 次日按 5％的比例转种于 LB 培养基 ( 同上 )， 30℃空气摇床培养约 3 小时， 当 OD600 值达到 0.7 时， 立即将培养瓶转到 42℃水浴摇床中， 诱导培养 4 小时。将菌液合并， 6000rpm 离心 20 分钟， 弃上清， 收集沉淀部分。
2.2 提取包涵体 ： 将沉淀称湿重， 用 10 倍体积的 20mmol/L pH8.0TE 缓冲液将沉淀 悬起， 加入溶菌酶 (1mg/ml 悬液 )， 在室温下磁力搅拌 10 分钟。 在冰浴中超声波破碎菌， 每次
超 30 秒钟， 间隔 30 秒钟， 共超 10 次。8℃， 1,2000rpm， 离心 20 分钟， 弃上清， 沉淀用 1mol/ L NaCl( 用 TE 配制 ) 洗一次， 再用 TE 洗 2 次， 收集沉淀。沉淀用 8M 脲 ( 用 PH8.0TE 配制 ) 溶解， 加 1％ β- 巯基乙醇。再于 20℃， 1,2000rpm， 离心 10 分钟， 去沉淀取上清。
2.3 纯化 ： 将上述溶解的包涵体溶液过 Q-Sepharose FF 阴离子交换柱， 用平衡液 (pH8.0， 20mmol/L TE 含 6mol/L 脲， 0.1％ β- 巯基乙醇 ) 清洗后， 用不同浓度的 NaCl( 用 平衡液配制 ) 洗脱， 收集各洗脱峰， 经 SDS-PAGE 鉴定， 收集 0.05mol/L NaCl 洗脱峰。再过 Sephardex G-50 凝胶过滤柱， 收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用 SDS-PAGE 鉴 定， 结果如附图 3。
步骤 3 嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原在血清分型检测中的应用
分别采用嵌合 HCV-1b、 2a 多表位抗原包被酶联板， 形成 HCV-1b 孔板条和 2a 孔板 条， 将待测 HCV 血清分别加入两孔内， 利用间接 ELISA 法检测 HCV 血清于上述两种抗原的反 应性， 根据每份血清与 HCV-1b 和 2a 抗原孔反应的 OD 比值判断 HCV 的血清型。当 OD-1b/ OD-2a 之间的比值大于等于 1 为 1b 型， 否则为 2a 型。
采用上述方法对 34 份 HCV-1b 和 9 份 2a 血清进行血清分型， 结果如表 1 所示 ： HCV 的血清分型检测试剂能正确检测中 29 份 HCV-1b 血清和 9 份 HCV-2a 血清， 仅有 2 份 1b 血 清和 3 份 2a 血清未进行分型， 总体分型率达到 90％ (45/50)， 正确率为 85％ (38/45)， 均高 于或接近国外报道， 提示本发明提出的 HCV 的血清分型检测试剂具有较高的正确率和分型 率， 在我国 HCV 临床治疗评价具有一定的应用价值。
表 1HCV 抗体分型检测8101942021 A CN 101942026序列 序列表表1/4 页
<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 <120> 一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用 <160>12 <210>1 <211>19 <212>PRT <213> 人类 <400>1 Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Ser Asn Ser <210>2 <211>19 <212>PRT <213> 人类 <400>2 Val Glu Val Arg Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr Asn Asp Cyx 1 5 10 15 Ser Asn Asn <210>3 <211>22 <212>PRT <213> 人类 <400>3 Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn 1 5 10 15 Trp Ser Pro Thr Thr Ala 20 <210>4 <211>22 <212>PRT <213> 人类9101942021 A CN 101942026
序列表2/4 页<400>4 Gln Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Leu Asn 1 5 10 15 Trp Ser Pro Thr Leu Thr 20 <210>5 <211>21 <212>PRT <213> 人类 <400>5 Ile Val Ser Pro Gln His His Trp Phe Val Gln Glu Cys Asn Cys Ser 1 5 10 15 Ile Tyr Pro Gly Thr 20 <210>6 <21 1>21 <212>PRT <213> 人类 <400>6 Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser 1 5 10 15 Ile Tyr Pro Gly His 20 <210>7 <211>16 <212>PRT <213> 人类 <400>7 Val Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met 1 5 10 15 <210>810101942021 A CN 101942026
序列表3/4 页<211>16 <212>PRT <213> 人类 <400>8 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met 1 5 10 15 <210>9 <211>15 <212>PRT <213> 人类 <400>9 Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr 1 5 10 15 <210>10 <211>15 <212>PRT <213> 人类 <400>10 Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Tyr 1 5 10 15 <210>11 <21 1>50 <212>PRT <213> 人类 <400>11 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe 1 5 10 Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Thr 20 25 Ser Asn Ser Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp 35 40 45 Gly Tyr 5011Asp Glu Met 15 Asn Asp Cys 30 Ala Gln Pro101942021 A CN 101942026
序列表4/4 页<210>12 <211>50 <212>PRT <213> 人类 <400>12 Val Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe 1 5 10 Val Glu Val Arg Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr 20 25 Ser Asn Asn Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp 35 40 45 Gly Tyr 50Asp Glu Met 15 Asn Asp Cys 30 Gly Lys Pro